CN103096900B - 抗氧化剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的抗氧化剂组合物，用于治疗由皮肤中的活性氧类产生导致的或者涉及皮肤中的活性氧类产生的皮肤疾病或者病症，涉及一种包含所述组合的水凝胶以及包含所述水凝胶的创伤敷料和它在溃疡、创伤、烧伤和烫伤中的用途。

Description

抗氧化剂组合物

技术领域

本发明涉及抗氧化剂组合物和它们在治疗影响皮肤的疾病、紊乱以及病症的应用，特别是涉及人皮肤中活性氧类（ReactiveOxygenSpecies,ROS）的产生的皮肤病症，例如光老化和其他年龄相关的皮肤损伤。它还涉及创伤敷料和特别地用于将活性剂递送至伤口的组合物。

背景技术

近年来人口老龄化和慢性代谢疾病例如高血压或者糖尿病的增加促进了慢性溃疡的存在。

有时，由于患者（糖尿病）的健康病症或者组织内大量损伤（严重烧伤）的存在，会出现改变发生愈合必定经历的一系列进程的现象，从而形成慢性溃疡。

慢性溃疡的形成与过度炎症性过程相关，其改变涉及调节愈合发生进程的信号分子的合成。最近的研究直接地将慢性溃疡的生理病理学与创面床中存在的氧化应激相关联，作为创伤区域的促炎症反应环境的结果。

当氧化应激发生时，有机体有能够控制产生的活性氧类过量的解毒机制，相反地，当缺少有机体的解毒能力和创面床中的自由基之间的调节时，愈合进程减慢，引起慢性溃疡。

活性氧代谢产物的解毒机制中调节的缺乏是慢性溃疡的主要原因之一。

慢性创伤的愈合可以通过使用抗氧剂创伤敷料来诱导，其特别地与过量活性氧类反应，并因此减少氧化应激的水平。在该技术中，描述了用于愈合目的的不同例子的材料。

例如，US6406712中，创伤敷料材料已有描述，其通过混合包含在密封包装的干的水胶体聚合物粉末和水而形成，所述密封包装具有一个临时的或者用手除去的屏障，这样干聚合物和水可以彼此之间分开地储存在包装中。

另一个描述，专利申请WO01/49258A2，包含组织接触材料，例如包含不可胶化的多糖（例如瓜尔胶）的生物相容的聚合物，其使氧进入能够在被调节组织位置提供或者维持最佳氧张力，并同时在需要时吸收过量液体和优化微环境以促使组织修复和再生的闭室泡沫样材料中。

专利申请EP0781550A1，描述了生物粘附药物组合物用于抗溃疡等等活性成分的控制释放，该活性成分由醋酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮的共聚物以及一个其他成分（例如刺槐豆胶等等）组成。

半乳糖甘露聚糖在减少遭受UVA辐射的系统的脂质过氧化作用方面的抗氧化活性也在最近被描述。它们增加不同混合物的水凝胶的弹性的能力以及它们吸收水的能力，能够给创面床提供愈合进程中所需的必要湿度，也是已知的。

国际申请WO2005/084650A1请求保护药物活性成分的储存稳定且干燥的活性成分递送系统，用于创伤愈合目的的皮肤使用。递送系统包含干凝胶，其中凝胶形成材料是多糖，例如半乳糖甘露聚糖衍生物。当干凝胶与液体接触时，它再水化并形成水凝胶，借此应用的活性成分得到溶解并以控制的速率从水凝胶中释放产生局部高的浓度。

固体，用作创伤敷料的生物可吸收材料在专利申请EP0792653中被描述，其中这样的固体由黄原胶和至少一种半乳糖甘露聚糖例如瓜尔胶或者刺槐豆胶的混合物形成。材料还包含治疗剂，其中特别优选地是有效地促进创伤愈合的那些例如葡糖氨基聚糖。

如上所述的相似操作中，国际申请WO99/25395请求保护一种用于愈合目的的创伤敷料，其中基质包含生物相容的交联聚合物和不可胶化的多糖，半乳糖甘露聚糖，其还包括一种或多种活性成分，例如，创伤愈合剂像生长因子、粘多糖和蛋白质。

其他类型的创伤愈合敷料被国际申请WO2004/112850和WO2005/049101所描述，其中材料普遍地由生物可吸收基底形成，其可以是用抗氧化染料染色的半乳糖甘露聚糖，其可以与活性氧类反应，以这种方式减少创伤的氧化应激的水平。

N-乙酰半胱氨酸是已知的抗氧化分子，其通过增加细胞内谷胱甘肽（GSH）的合成而起作用。GSH的降低效果促成直接地消除活性氧类，并且还促成已经使用的抗氧化剂的重复利用。它在慢性溃疡中的用途将减少其氧化应激，从而有利于它们的愈合(马尼勘丹,P.等，分子和细胞生物化学，2006，290，87-96；拉尼泰克,S.等，药物学在线，2009，1，369-376（Manikandan,P.etal,MolecularandCellularBiochemistry,2006,290,87-96；RaniThaakur,S.etal,Pharmacologyonline,2009,1,369-376）)。

姜黄素的抗氧化活性是已知的。姜黄素是姜黄的根的粗提取物的纯化状态，其中姜黄是一种主要在东南亚种植的植物并且在传统医药中广泛用于治疗皮肤相关的疾病。Gopinath,D.（Biomaterials,2004,25,1911-1917）证明了由姜黄素抗氧化剂产生的改善的创伤愈合能力，当它加入到胶原基质中时，其还作为再生组织的支撑基质。

尽管半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的抗氧化特性被很好地记载在现有技术中，但是没有迹象表明这两种成分的组合有特别的好处，特别是，在遭受广泛的氧化应激的细胞培养物中提供抗氧化剂协同作用。

发明内容

本发明的作者已发现半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的组合提供了两组分的抗氧化能力的协同作用，其导致在治疗由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的疾病或者紊乱或者涉及受治疗者皮肤中活性氧类产生的疾病或者病症的用途中有出乎意料的优点。

实验性试验已显示，当半乳糖甘露聚糖例如刺槐豆胶，和N-乙酰半胱氨酸的组合给药培养细胞时，易受氧化应激的人皮肤细胞（成纤维细胞）经受了细胞存活能力/保护的增加。

其他实验也已显示，当与单独地刺槐豆胶或者N-乙酰半胱氨酸相比较时，所述组合使得在存在过氧化氢下，易受氧化应激的成纤维细胞培养物中的活性氧代谢产物的细胞内水平显著减少。

进一步地，当姜黄素（或者姜黄根Turmeric）加入到半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的组合中时，已观察到甚至更高的协同作用。

因此，本发明的第一个方面涉及一种抗氧化剂组合物，包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸，用于治疗或预防由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症或者涉及受治疗者皮肤中活性氧类产生的皮肤疾病或者病症的用途。

特别优选的是使用刺槐豆胶作为本发明组合物中的半乳糖甘露聚糖。

在一个特别的实施方式里，如上所定义的抗氧化剂组合物进一步包含姜黄素（姜黄根）作为额外的抗氧化剂成分。

本发明还涉及一种治疗或者预防由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症或者涉及受治疗者皮肤中活性氧类产生的皮肤疾病或者病症的方法，该方法包含给予治疗有效量的包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的组合物。

本发明的另一个方面涉及一种包含半乳糖甘露聚糖、N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的抗氧化剂组合物。

本发明的另一个方面涉及如上所定义的抗氧化剂组合物用作药物。

本发明的另一个方面涉及一种包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的水凝胶，其中半乳糖甘露聚糖是以交联基质的形式，N-乙酰半胱氨酸结合到所述的半乳糖甘露聚糖的交联基质中。在一个特别的实施方式里，半乳糖甘露聚糖借由交联剂而交联，优选地交联剂是戊二醛。

在另一个方面，本发明涉及如上所定义的水凝胶，其中半乳糖甘露聚糖基质进一步包含姜黄素结合在内。

此外，本发明还涉及如上所定义的水凝胶，其进一步包含细胞。特别优选的是细胞选自成纤维细胞、角质化细胞、内皮细胞、分化或未分化的间质干细胞、角膜细胞、上皮细胞、来自白细胞系统的细胞、来自造血系统的细胞、分化或未分化的干细胞、软骨形成细胞、成骨细胞、肌细胞、脂细胞和来自外周或者中枢神经系统的神经元或者其他细胞。

本发明的另一个方面设计制备如上所定义的水凝胶的方法，其包括：

a)将半乳糖甘露聚糖溶解在水溶液中；

b)通过将交联剂加入到半乳糖甘露聚糖的水溶液中使半乳糖甘露聚糖接受化学交联从而获得包含交联葡甘露聚糖基质的水凝胶；

c)将N-乙酰半胱氨酸以及可选地姜黄素结合到交联葡甘露聚糖基质中。

本发明的另一个方面涉及包含如上所定义的水凝胶的创伤敷料。

本发明的另一个方面涉及如上所定义的水凝胶用作药物。

本发明的另一个方面涉及如上所定义的水凝胶用于治疗和/或治愈急性外科的和外伤性创伤、烧伤、烫伤、瘘、静脉溃疡、动脉溃疡、压疮（pressuresores）（也称为褥疮（decubitusulcers））、糖尿病性溃疡、混合病因的溃疡，以及其他慢性或者坏死性创伤和炎性病变和紊乱。

本发明的另一个方面涉及包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的化妆品组合物。

在另一个方面，本发明涉及如上所定义的化妆品组合物，其进一步包含姜黄素。

本发明的另一个方面涉及如上所定义的化妆品组合物用于治疗年龄相关的皮肤损伤的用途。

本发明的另一个方面涉及如上所定义的化妆品组合物用作UV辐射防护剂的用途。

附图说明

图1显示：(a)MTT比色测定得到的成纤维细胞中的细胞增殖的结果，使用不同浓度的NAC；以及(b)相较于对照的IC₅₀值。

图2显示：(a)MTT比色测定得到的成纤维细胞中的细胞增殖的结果，使用不同浓度的姜黄根；以及(b)相较于对照的IC₅₀值。

图3显示了当成纤维细胞培养物处于氧化的环境时以及当它与1%LBG、1mMNAC、1μM姜黄根及其组合接触时，根据MTT比色测定得到的结果。

图4显示了处于1mMH₂O₂的氧化环境的成纤维细胞的细胞内ROM水平，以及当成纤维细胞与1%LBG、5mMNAC、5μM姜黄根及其组合接触时的水平，通过用探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐标记而获得的荧光单位的方式得到。

图5显示了从用(a)0%wt、(b)0.5%wt、(c)1%wt和(d)2.5%wt的戊二醛交联的刺槐豆胶水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）中得到的照片。

图6显示了在愈合动物模型猪的背部上的外科手术产生的皮肤病变的10-天进展的活组织检查的肉眼可见的视图。

图7显示了在愈合动物模型猪的背部上的外科手术产生的皮肤病变的3-天进展的照片。

具体实施方式

用于本发明的抗氧化剂组合物包含两种抗氧化剂，即半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸。这些成分在组合物中是物理混合，没有任何化学键或者相互作用的键合。

如实验性试验中所示的，半乳糖甘露聚糖例如刺槐豆胶和N-乙酰半胱氨酸的组合提供了对受氧化应激的成纤维细胞培养物的抗氧化协同作用，改善了细胞存活能力，同时减少了活性氧代谢产物的细胞内水平。

半乳糖甘露聚糖是包含甘露糖骨干与半乳糖侧基的多糖，更具体地说(1-4)-连接的β-D-甘露吡喃糖骨干于它们6位分支点连接到α-D-半乳糖，即1-6连接的α-D-吡喃半乳糖。半乳糖甘露聚糖胶包括刺槐豆胶（LBG）、瓜尔胶、肉桂胶、塔拉胶、牧豆树胶和香豆胶。

在一个特别的实施方式里，半乳糖甘露聚糖选自由瓜尔胶、刺槐豆胶、肉桂胶、塔拉胶、牧豆树胶、香豆胶和白三叶草豆胶。更优选地，半乳糖甘露聚糖是刺槐豆胶。刺槐豆胶是一种由甘露吡喃糖骨干于它们6位分支点连接到α-D半乳糖残基组成的半乳糖甘露糖聚糖多糖。刺槐豆胶中每一个半乳糖残基就有大约4个甘露糖残基（甘露糖/半乳糖比率为大约4）。

半乳糖甘露聚糖可以衍生自重组体或者合成来源。例如，半乳糖甘露聚糖可以由GDP-甘露糖和UDP-半乳糖通过甘露聚糖合酶和半乳糖基转移酶等酶类体内合成。编码这些蛋白的DNA已得到分离和表征（US公开2004/0143871），以及用这些酶改造的重组植物以显示出表达升高的半乳糖甘露聚糖水平。此外，甘露吡喃糖骨干的半乳糖基化程度可以由体内α-半乳糖苷酶的存在（或缺乏）所影响（参见Edwardsetal.PlantPhysiology(2004)134:1153-1162）。α-半乳糖苷酶将半乳糖残基从甘露吡喃糖骨干中移除。例如，带有较低程度的半乳糖基化作用的天然表达半乳糖甘露聚糖的种子可以表达（或者表达更多）α-半乳糖苷酶，其将半乳糖基从这些类型的植物中的甘露吡喃糖骨干中移除。在以天然产生半乳糖甘露聚糖胶为表征的实验室处理中，α-半乳糖苷酶可以用于减少天然产生半乳糖甘露聚糖胶的甘露吡喃糖骨干中存在的半乳糖。本发明的实施方式包括半乳糖甘露聚糖胶，其已用α-半乳糖苷酶，以降低甘露吡喃糖骨干中存在的半乳糖。本发明的实施方式包括半乳糖甘露聚糖胶，其已用α-半乳糖苷酶或其他酶处理或者化学处理，以“调准（tune）”胶而在细胞培养物表面得到期望特性的胶。

本发明组合物中的半乳糖甘露聚糖的重量比范围是占组合物总重量的1-5%。

N-乙酰半胱氨酸是一个抗氧化分子，其介入细胞内谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽是一个促成在细胞内直接地消除氧自由基以及促成已使用的抗氧化剂的再循环的化合物。

N-乙酰半胱氨酸优选地在本发明组合物中的浓度范围是1-10mM，更优选地1-5mM。

在一个优选的实施方式里，本发明所用的抗氧化剂组合物适合于局部应用于皮肤。局部抗氧化剂组合物可以是任何的品种多样的形式，并包括，例如敷料（dressings）、洗液、溶液、喷雾剂、霜剂、凝胶、软膏等等。

洗液是用于皮肤表面而不带摩擦的制剂，而且典型地是液态或半液态制剂，其中固体颗粒（包括活性成分）存在于水或乙醇基质中。洗液通常是固体的混悬液，并优选地包含水包油型的液态油性乳剂。洗液是用于治疗大身体面积的优选的制剂，因为应用更加液态组合物容易。通常优选的是在洗液（水凝胶）中不溶性物质被很好地分散。洗液包含大约0.001%至大约30%的活性成分，1%至25%的软化剂和适量的水。软化剂的例子是烃蜡类和油类例如矿物油、矿脂、石蜡、地蜡、微晶蜡、聚乙烯和全氢化角鲨烯（perhydrosqualene）；硅油类例如二甲基聚硅氧烷类、甲苯基聚硅氧烷类和水溶性和醇溶性乙二醇-硅酮共聚物类；甘油三酯类，例如动物和植物脂肪和油；具有10-20个碳原子的脂肪酸的烷基酯，具有10-20个碳原子的脂肪酸的烯基酯；具有10-20个碳原子的脂肪酸，例如壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻酸、花生四烯酸、山嵛酸和芥酸；具有10-20个碳原子的脂肪族醇类，例如月桂醇、肉豆蔻醇、棕榈醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟硬脂醇、油醇、蓖麻醇、山嵛醇、瓢儿菜醇和2-辛基十二醇是脂肪醇的适当例子；脂肪醇酯，例如包括月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、异硬脂醇、油醇的具有10-20个碳原子的乙氧基脂肪醇，以及连接有1-50个环氧乙烷基团或者1-50个环氧丙烷基团的胆固醇；羊毛脂及其衍生物；蜡例如蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻酰肉豆蔻酸盐和硬脂酰硬脂酸盐；蜂蜡衍生物，例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡；植物蜡，包括，但不限于棕榈腊和小烛树蜡；磷脂类例如卵磷脂及其衍生物；甾醇类例如胆固醇和胆固醇的酰酯；以及酰胺类，例如脂肪酸酰胺类，乙氧基酰基酰胺类和固体脂肪酸烷醇酰胺类。

本发明的洗液将进一步包含1%-30%的乳化剂。乳化剂可以是阴离子、阳离子或者非离子型。非离子型乳化剂的例子包括，但不限于，具有10-20个碳原子的脂肪醇，与2-20摩尔的环氧乙烷或环氧丙烷缩合的具有10-20个碳原子的脂肪醇，与2-20摩尔环氧乙烷缩合的烷基链上有6-12个碳的烷基酚类，乙二醇的单-和二-酰基酯，其中脂肪酸包含10-20个碳，单脂肪酸甘油酯其中脂肪酸包含10-20个碳，二甘醇，分子量200-6000的聚乙烯二醇类，分子量200-3000的聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，脱水山梨糖醇，聚氧乙烯山梨醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇和亲水性蜡酯。适合的阴离子乳化剂包括，但不限于，用钾、钠或者三乙醇胺皂化（肥皂）的脂肪酸，其中脂肪酸包含10-20个碳。其他适合的阴离子乳化剂包括，但不限于，在烷基链具有10-30个碳并形成1-50个环氧乙烷单元的烷基硫酸盐、烷基芳基磺酸盐和烷基乙氧基乙醚磺酸盐的碱金属、铵或者取代铵。适合的阳离子乳化剂包括季铵和吗啉正离子和吡啶嗡化合物。

组合物中剩余是水。洗液是将所有成分简单混合在一起而制备得到的。优选地，活性成分溶解在软化剂中，而所得的混合物加到水中。

本发明的组合物还可以制成溶液的形式。溶液是通过将活性成分溶解在液体中而制得的均相混合物，这样溶解成分的分子分散在溶剂中。溶液包含0.001%-30%的抗氧化活性成分以及适量的有机溶剂。用作溶剂的有机物质是丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇、异丙醇、酒石酸二乙酯、丁二醇及其混合物。这样的溶剂体系也可以包含水。

这些组合物以溶液的形式应用于皮肤，或者溶液被制成气雾剂的形式并以喷雾剂应用于皮肤。

气雾形式的组合物还包含25%至80%的适合的推进剂。推进剂的例子包括，但不限于氯化的、氟化的和氟氯化的低分子量的烃类。氧化亚氮和二氧化碳也可以用作推进剂气体。推进剂使用足以排出药筒的内容物的量。

本发明的组合物还可以制成霜剂的形式。例如，药物和化妆品制剂领域公知的霜剂是水包油或者油包水的粘稠液或者半固体乳剂。霜剂基质是可水洗的，并且包含油相、乳化剂和水相。油相通常包含矿脂和脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇。水相经常，尽管不是必须地，在体积上超过油相，并且通常包含润湿剂。霜剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂，并且可以选自上述用于洗液的乳化剂或其混合物。

凝胶是半固体、悬浮型系统。单相凝胶包含基本上均匀地分散在整个载液中的有机大分子，载液典型地是水性的，但是也优选地包含醇，以及可选地包含油。优选地有机大分子，即胶凝剂，可以是化学交联的聚合物例如交联丙烯酸聚合物，例如“卡波姆”族的聚合物，例如羧基聚烷撑类（arboxypolyalkylenes），其可以商业上获得且商品名还优选的可以是亲水聚合物例如聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维质的聚合物例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素和乙基纤维素；胶例如黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。

本领域公知的软膏是半固体制剂，其典型地基于矿脂或其他石油衍生物。本领域技术人员可以理解的是，将被使用的具体的软膏基质是将提供许多期望特性例如软化性等等的。软膏基质可以分为4类：油性基质、可乳化的基质、乳剂基质和水溶性基质。油性基质包括，例如，植物油、从动物中获得的脂肪，和从石油中获得的半固体烃类。可乳化的软膏基质，也称为吸收性的软膏基质，包含少或没有水，以及包含例如硫酸羟基甘油三硬脂酸酯、无水羊毛脂和亲水矿脂。乳剂软膏制剂是油包水乳剂或者水包油乳剂，并且包括，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油脂、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏基质从不同分子量的聚乙烯二醇类中制备得到。

药学上可接受的赋形剂还可以加入到组合物中，并且可以是本领域常用的任何赋形剂。例子包括水、低级醇、高级醇、多元醇、单糖类、二糖类、多糖类、烃油类、蜡类、脂肪酸类、硅油类、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、硅酮表面活性剂，以及所述赋形剂的水基混合物和乳剂基化合物。

上述的局部用的组合物可以定期应用于任何需要频繁治疗的皮肤区域，并以必需量以达到预期的结果。治疗的频率取决于皮肤疾病或者病症的性质，即由皮肤中活性氧类的产生导致的皮肤疾病或者病症，以及皮肤损伤或者恶化的程度。

由于半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的组合的抗氧化特性，它可以用于治疗或预防由受治疗者皮肤中的活性氧类产生导致的皮肤疾病或病症，或者涉及受治疗者皮肤中的活性氧类产生的皮肤疾病或者病症，尤其是在皮肤成纤维细胞和角化细胞中。

这个治疗包括通过直接将上文所述的局部用制剂应用于皮肤而接触受治疗者的皮肤，以这种方式影响受治疗者，和/或受治疗者的皮肤组织和/或一个或多数细胞，以获得期望的药理学效果和/或生理学效果。该效果可以是预防的，完全地或部分地预防疾病或者紊乱例如由皮肤中活性氧类产生导致的病症或者涉及皮肤中活性氧类产生的病症，或其迹象或者症状；和/或该效果可以是治疗的，减轻症状或迹象或者对这样的紊乱或者疾病提供部分或者完全的治疗和/或基本上削弱紊乱或疾病引起的有害作用。

相关的实施方式，期待通过实施例的方式：

(i)预防疾病或者紊乱（例如由活性氧类产生导致的皮肤病症或者涉及活性氧类产生的皮肤病症）在受治疗者中发生，所述受治疗者可能易感染疾病或者紊乱，但是还没有被诊断为患有上述疾病或者紊乱；

(ii)抑制疾病或者紊乱，即，阻止它的发展；或者

(iii)减轻或者改善疾病或者紊乱，即，使复元。

在一个特别的实施方式里，由活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症的治疗包括皮肤损伤位置的损伤或者受伤组织或者细胞的修复和再生。这种损伤可以是受治疗者受到可促进皮肤中的氧自由基的产生的氧化应激源的影响的结果，例如阳光辐射（光损伤）、化学试剂（包括其他局部试剂例如医疗、药物或者美容化合物）、放射治疗或者化疗。它还包括预防性治疗以防止这样的损伤，例如，在受治疗者暴露于可促进皮肤中的氧自由基的产生的氧化应激源之前，例如UV辐射、化学试剂（包括其他局部试剂例如医疗、药物或者美容化合物），或者在放射治疗或者化疗之前。

更特别地，由受阳光影响而引起的皮肤疾病或者病症，更特别地是暴露于UVA、UVB和UVC型的UV辐射。暴露于这样的辐射的后果（或者由此加剧，或者包括在危险因素中）的直接地或者间接地病症包括直接和即时效应，以及更长期的效应，以及由较长时期的直接损伤引起的并发症和后遗症。

UV辐射被认为是通过直接和间接的机制影响皮肤。直接的损伤是指直接暴露于辐射而引起的，而间接效应包括那些在损伤的生物分子的产生和高度活性氧类的产生之后，然后动态产生其他生物和病理过程。活性氧类可能在产生它们的直接位置如皮肤中产生有害作用，或者在远的位置产生有害作用，这样的活性氧类在远的位置可能有更广泛的全身效应，其可以表现为“氧化应激”。因此，有效地减少活性氧类水平而具有抗氧化作用的干预可能减慢、改善或停止大范围疾病的发展。

与暴露于UV辐射有关的健康问题包括皮肤病症或疾病，但是更广布且全身性病症也可以出现，或者是作为这样的皮肤病症或者疾病引起的并发症的一部分。相应地，这样的病症，全体地，可以包括晒伤、光敏感性、免疫抑制、过早衰老、银屑病、一些类型的皮肤癌和各种免疫疾病，以及局部或者广布的炎症、各种细菌或者真菌感染、皮疹，以及由UV辐射暴露和饮食引起的全身性氧化应激。光化性角化病，例如，是一种在阳光曝晒许多年后发展起来的癌前病变，其被理解为涉及皮肤局部过敏。与受阳光影响相联系的皮肤癌类型包括，按严重性增加的顺序，基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑色素瘤。

在另一个特别实施方案里，涉及受治疗者皮肤中的活性氧类产生的皮肤疾病或者病症选自急性外科的和外伤性创伤、烧伤、烫伤、瘘、静脉溃疡、动脉溃疡、压疮（pressuresores）（也称为褥疮（decubitusulcers））、糖尿病性溃疡、混合病因的溃疡，以及其他慢性或者坏死性创伤和炎性病变和紊乱。

在本发明的一个特别的实施方式里，本发明的抗氧化剂组合物进一步包含姜黄素作为额外的活性成分。已发现半乳糖甘露聚糖与N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的组合提供甚至更高的协同抗氧化作用，如本申请提供的实施例所示。

姜黄素，也称为姜黄根，是一个天然存在的o-对甲氧酚衍生物，具有化学式：

它是从姜黄（CurcumaLonga）的根茎中获得的黄色颜料，并且它几个世纪来在本土医学中被用于治疗各种炎性病症。姜黄素还充当自由基清除剂和抗氧化剂，抑制脂质过氧化作用和氧化性DNA损伤。

姜黄素在本发明组合物中优选的浓度范围是1-大约7.5μM，更优选地1-5μM。

因此，本发明的另一个方面涉及包含半乳糖甘露聚糖、N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的抗氧化剂组合物。

所述抗氧化剂组合物还适用于皮肤上的局部应用，并且可以是任何品种多样的形式，包括，例如敷料、洗液、溶液、喷雾剂、霜剂、凝胶、软膏等等，例如上所述的那些。

此外，本发明涉及包含半乳糖甘露聚糖、N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的抗氧化剂组合物用作药物。

抗氧化剂组合物还可以用于治疗或者预防由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的疾病或者紊乱，或者涉及受治疗者皮肤中活性氧类产生的疾病或者病症，例如上述的那些。

在另一个特别的实施方式里，本发明涉及水凝胶，其包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸，其中半乳糖甘露聚糖是交联基质的形式，以及N-乙酰半胱氨酸结合到所述的半乳糖甘露聚糖的交联基质中。

术语“水凝胶”是指聚合物链的网络构造，其包括水不溶但水溶胀的交联的半乳糖甘露聚糖链，即，水是分散介质。

本发明的水凝胶提供了可靠且有效的方式用于递送N-乙酰半胱氨酸至感兴趣的位置，例如创伤、溃疡、烧伤或者烫伤，同时改善抗氧化剂和活性成分的愈合特性。实际上，实验性试验已显示了半乳糖甘露聚糖例如刺槐豆胶和N-乙酰半胱氨酸的联合在成纤维细胞培养物中诱导抗氧化协同作用，改善细胞存活能力，同时降低活性氧代谢产物的细胞内水平。水凝胶还提供很好的水分条件能力以促进创伤愈合。

本发明的水凝胶包含半乳糖甘露聚糖的聚合链，半乳糖甘露聚糖的所述链被交联，以使半乳糖甘露聚糖具有水不溶性但水溶胀性。交联度决定水凝胶的流变性质，以及它的可溶胀性，并且允许获得利于N-乙酰半胱氨酸的控制递送的孔隙率。

特别地，半乳糖甘露聚糖选自由瓜尔胶、刺槐豆胶、肉桂胶、塔拉胶、牧豆树胶、香豆胶和白三叶草豆胶组成的组。更优选地，半乳糖甘露聚糖是刺槐豆胶。

在一个特别的实施方式里，半乳糖甘露聚糖是通过交联剂的方式交联的。化学试剂例如硼砂（硼氢化钠）、戊二醛和环氧衍生物可以被使用。特别地，最优选的交联剂是戊二醛。

交联剂含量决定了基质的孔径，并进而决定了结合其中的活性成分的递送性质。

半乳糖甘露聚糖在本发明的水凝胶中的量为相对于水凝胶的总重量以重量计至少50%，优选地至少75%重量计。更优选地，以由半乳糖甘露聚糖组成的水凝胶的以重量计至少90%。

水凝胶中剩余包含水（高达20%重量计）、活性成分（N-乙酰半胱氨酸）和，可选地，盐或其他结构性化合物，其改善水凝胶的流变性质。

在可选地存在于水凝胶的结构性化合物中，蛋白质例如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白或其组合，以及葡糖氨基聚糖类例如透明质酸、硫酸肝素或者硫酸软骨素是优选的。

优选地，本发明的水凝胶将吸收水或者伤口液体，并因此变湿、溶胀或者变成胶凝状团块，但不会自发地溶解或者分散在其中。低溶解度使材料特别适合用作创伤敷料以除去伤口液体中的活性氧类。

N-乙酰半胱氨酸可以直接地结合到交联的半乳糖甘露聚糖基质中。活性成分可以通过基质对试剂的吸收或者通过在交联之前将试剂加入到初始配方的基质中而掺入。

在本发明的优选实施方式里，N-乙酰半胱氨酸结合到半乳糖甘露聚糖基质中是通过干凝胶的形成而实现的。

术语“干凝胶”是指通过不被阻碍的缩水干燥水凝胶而形成的固体基底。它保持高度孔隙率（至少25%）和巨大的表面积（150-900m²/g）连同非常小的孔径（1-10nm）。

获得的干凝胶被引入到包含N-乙酰半胱氨酸的水溶液中，然后这个活性成分逐渐地结合到基质的孔中或者分散在其中直到达到平衡状态。

N-乙酰半胱氨酸在水凝胶中优选的浓度范围是1-10mM，更优选地1-5mM。

本发明的另一个方面涉及本发明上述的水凝胶，其进一步包含姜黄素作为抗氧化活性成分被结合到半乳糖甘露聚糖基质中。已发现半乳糖甘露聚糖例如刺槐豆胶和N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的组合提供甚至更高的协同抗氧化作用。

正如N-乙酰半胱氨酸的情况，姜黄素也可以通过基质对这个化合物的吸收，或者通过在交联半乳糖甘露聚糖之前将它与N-乙酰半胱氨酸一起加入到初始配方的基质中，而结合到半乳糖甘露聚糖基质。

但是，通过将半乳糖甘露聚糖的干凝胶引入到包含两种活性成分的水溶液中而结合姜黄素和N-乙酰半胱氨酸是优选的，从而允许它们逐渐结合到半乳糖甘露聚糖基质中。

姜黄素在水凝胶的优选浓度范围为大约1-大约7.5μM，更优选地1-5μM。

将可以理解地是，活性成分被结合到水凝胶中，导致试剂直接地从水凝胶中释放并进一步经皮或者经粘膜途径被递送。为了促进创伤愈合，结合的试剂可以在延长的一段时间内释放。

在一个特别的实施方式里，一旦活性成分结合且分散在整个葡甘露聚糖基质中，一部分试剂位于基质中，而试剂的其他部分溶解在游离液相中并在基质中自由移动。因为试剂溶解在游离液相中，所以在水凝胶基质和创伤本身的水分之间建立了活性试剂的浓度梯度。因此，当水凝胶放置在潮湿表面例如开放性伤口时，溶解的试剂将从游离液相移至无试剂的创伤水分中，导致试剂被递送至创伤。溶解的试剂的移动进一步扰乱溶解的和不溶的试剂之间的平衡状态，并引起更多试剂溶解到游离液相中，进而引起更多的试剂被递送至创伤。

活性成分的递送还可以通过基质中的交联度来控制。交联在一起的链的组合产生微腔，其中活性成分被包裹。通过控制交联剂的量和半乳糖甘露聚糖链的长度，有可能调节半乳糖甘露聚糖基质的微腔的大小。由较低交联度产生的较大的微腔允许活性成分更自由地移动和更快的递送，而较小的微腔增加递送时间。

本发明的水凝胶的制备方法包括：

a)将半乳糖甘露聚糖溶解在水溶液中；

b)通过将交联剂加入到半乳糖甘露聚糖的水溶液中而使半乳糖甘露聚糖进行化学交联，以获得包含交联葡甘露聚糖基质的水凝胶；

c)将N-乙酰半胱氨酸，和可选地姜黄素结合到交联的葡甘露聚糖基质中。

优选地，半乳糖甘露聚糖在室温下以相对于溶液的总重量的1%-5%重量计的量溶解在蒸馏水中。溶液持续搅拌大约2-3小时。为了促进半乳糖甘露聚糖的溶解可能需要提高温度。

在一个特别的实施方式里，半乳糖甘露聚糖是刺槐豆胶。在这种情况下，溶解应当在110-120℃之间的温度下进行。

交联步骤是为了形成能提供多孔或者腔的三维基质结构而进行，，在多孔或腔中活性成分将被装入。交联方法包括UV诱导交联和化学交联。化学试剂例如硼砂（硼氢化钠）、戊二醛、环氧衍生物和其他本领域已知的方法可以被使用。UV交联方法要求光敏引发剂，其在曝露于UV辐射下时开始胶凝作用或者交联进程。

交联度取决于加入到溶液中的交联剂的量并且它相对于水溶液的总重量是大约以重量计1%-5%。优选地，交联剂是戊二醛。

在一个特别的实施方式里，半乳糖甘露聚糖和交联剂的溶液持续搅拌至少30分钟。随后，溶液倒入模子中，保持在那里直到水凝胶形成。通过若干次洗涤除去未反应的交联剂。

N-乙酰半胱氨酸和姜黄素（当该活性成分存在于水凝胶配方中时）的掺入可以通过基质对试剂的吸收来进行。可选地，活性成分可以在其交联之前加入到半乳糖甘露聚糖的水溶液中。

在本发明的一个优选的实施方式里，N-乙酰半胱氨酸和可选地姜黄素的掺入包括以下步骤：

1)干燥步骤b)中获得的水凝胶以形成干凝胶；

2)通过将干凝胶引入到含N-乙酰半胱氨酸和可选地姜黄素的水溶液中使干凝胶再水化，以形成水凝胶，其中N-乙酰半胱氨酸和可选地姜黄素被结合到交联的葡甘露聚糖基质中。

3)部分地干燥步骤2)获得的水凝胶。

干燥的干凝胶或者薄膜基质可以根据本领域技术人员已知的工艺的通过冷冻干燥或者对流干燥方法由水凝胶而获得的。在一个优选的实施方式里，干燥的干凝胶是通过蒸发干燥方法由水凝胶而形成，优选地风干、真空干燥或者对流干燥。

随后，干凝胶再水化以形成水凝胶，其达到一个适当的释放动力学，同时，高浓度的活性成分在半乳糖甘露聚糖基质的释放侧掺入。

最终，水凝胶部分地干燥，以使其随后应用于感兴趣的位置。

在本发明的一个特别的实施方式里，水凝胶进一步包含掺入在半乳糖甘露聚糖基质中或者其表面上的细胞。细胞的掺入增强了水凝胶的再生活性和那些高度损害的组织或者没有可能得到来自患者的原位细胞供应的组织的组织修复进程，因为这个生物材料包含与损伤组织中存在的细胞类型相同的健康细胞。

优选地，结合到水凝胶的细胞选自成纤维细胞、角质化细胞、内皮细胞、分化或未分化的间质干细胞、角膜细胞、上皮细胞、来自白细胞系统的细胞、来自造血系统的细胞、分化或未分化的干细胞、软骨形成细胞、成骨细胞、肌细胞、脂细胞和来自外周或者中枢神经系统的神经元或者其他细胞组成的组。

在本发明的一个特别的实施方式里，水凝胶被结合到创伤敷料中。因此，本发明的另一个方面涉及包含本发明的水凝胶的创伤敷料。创伤敷料优选地是层片（sheet）的形式，并且包含根据本发明的水凝胶的活性层。活性层通常应当在使用时与伤口接触，但是在一些实施方式里，它和伤口可以被液态-可渗透的顶层分隔开。

创伤敷料可以包括其他成分。例如，为了降低创伤敷料材料的通透性，失水控制剂（waterlosscontrolagents）可以被加入。创伤敷料材料的通透性的下降控制伤口中液体的损失。优选地失水控制剂是糖脂类、神经酰胺类、游离脂肪酸类、胆固醇、甘油三酯类、硬脂酸酯和硅油。

如果想要，增塑剂也可以加入到创伤敷料中。目前优选的增塑剂是甘油和水，但是，丙二醇和丁醇也可以使用。

如果想要，水合控制剂也可以加入到创伤敷料中。优选的水合控制剂是异丙醇，但是，乙醇、甘油、丁醇和丙二醇也可以使用。

优选地，创伤敷料进一步包含背衬层，其延伸覆盖活性层的伤口侧的反面的活性层。优选地，背衬层是大于活性层，致使边缘区域延伸包围活性层以形成所谓的岛状敷料。这样的情况下，背衬层优选地至少在其边缘区域用压敏药用级粘合剂涂覆。

优选地，背衬层对水汽是可透过的，但是对于液态水或者创伤渗出液是不能透过的。优选地，背衬层还是微生物不能透过的。这允许敷料材料下的创伤处于潮湿的条件，但不引起创伤周围的皮肤被浸软。

用于形成背衬层的合适的聚合物包括聚氨基甲酸脂类和聚烷氧烷基丙烯酸盐类和甲基丙烯酸盐类，例如GB-A-1280631中公开的那些。

粘合剂（如果存在）层应当是湿气传送和/或被图案化以允许水汽通过其中的通道。胶粘层（adhesivelayer）优选地是通常用于岛型创伤敷料的连续传送湿气的压敏胶粘层类型，例如，压敏粘合剂基于丙烯酸酯共聚物、聚乙烯乙基醚和聚氨酯，如例如GB-A-1280631所述的。

敷料的面对创伤的表面优选地用可移去的保护层（coversheet）保护。保护层常规地由柔韧的热塑性材料形成。合适的材料包括聚酯类和聚烯烃类。优选地，保护层中面对粘合剂的表面是剥离表面（releasesurface）。换句话说，表面只是弱粘附于活性层和背衬层上的胶粘层，以帮助从保护层上剥下胶粘层。例如，保护层可以由非粘附的塑料例如氟聚合物形成，或者它可以由剥离涂层例如聚硅酮或者氟聚合物剥离涂层提供。

典型地，本发明的创伤敷料是无菌的并包装在微生物不能透过的容器中。

因此，本发明的水凝胶可以用于受伤组织以及用于需要液体和分泌物的控制和处理的体液导流系统。术语“体液”包括，但不限于，唾液、牙龈分泌物、脑脊髓液、胃肠液、黏液、泌尿生殖的分泌物、滑液、血液、血清、血浆、尿、胆囊液、淋巴液、腹水、胸腔积液、间隙液、细胞内液、眼液、精液、乳腺分泌物、玻璃体液和鼻分泌物。

特别地，水凝胶优选地能应用于渗出性急性和慢性创伤，用于控制聚积的渗出液湿气、创面床和外周组织的支撑。

相应地，另外的方面，本发明提供本发明的水凝胶用于治疗和/或治愈急性外科的和外伤性创伤、烧伤、烫伤、瘘、静脉溃疡、动脉溃疡、压疮（pressuresores）（也称为褥疮（decubitusulcers））、糖尿病性溃疡、混合病因的溃疡，以及其他慢性或者坏死性创伤和炎性病变和紊乱。

本发明的水凝胶意图用于治疗感染的和非感染的创伤（即显示无感染的临床体征的创伤）。优选地，创伤是慢性的或者坏死的创伤。更优选地，慢性创伤选自由静脉、动脉或者混合病因的溃疡，压疮或者糖尿病性溃疡组成的组。优选地，水凝胶用作抗氧化剂以减少创伤环境中的氧化应激，并因此促进创伤愈合。

使用中，水凝胶或者包含它的创伤敷料被放置在直接接触创面床的放置。如果需要，它可以用例如如上所述的创伤敷料固定位置。如有必要，创伤敷料和水凝胶可以被移除，从而任何蓄积的坏死组织和渗出液被除去。该水凝胶可以用新鲜的水凝胶和其他合适的创伤敷料替换。

水凝胶可能经历溶胀作用，因为它吸收了渗出液湿气，但是，它们不会溶解。溶胀作用替换来自创伤面的坏死物质，并迫使物质进入水凝胶的基质中。通过水凝胶，创面床附近的满载湿度和保留湿气有助于刺激自溶清创进程，从而身体自身酶分解坏死组织和细胞碎片。

本发明的另一个方面涉及化妆品组合物，其包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸。

化妆品组合物包括任何液体组合物或者任何包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的组合，并以凝胶、霜剂、软膏或者香膏的形式用于局部给药的组合物。当所述组合物甚至缺少任何美容相关的活性分子时，可以以具有软化剂、保护剂和愈合特性为特征。

在本发明的变体中，化妆品组合物还包含活性分子，尽管他们没有治疗效果，它们具有作为美容试剂的特性。在这些可能结合到抗氧化剂组合物中的活性分子中，软化剂、防腐剂、芳香物质、抗痘剂、抗真菌药、抗氧化剂、除臭剂、止汗药、去头屑药、脱色剂、抗皮脂溢药、染料、美黑乳液、紫外光吸收剂、酶、芳香物质等等可以被引用。

化妆品组合物可以进一步包含pH控制剂，例如缓冲剂、其避免组合物的pH值降到5以下，以及防腐剂，其避免组合物中的重要的结构改变。本领域技术人员可以确定哪些其他的成分可以被使用，并且如果它们是必要的，它们中的许多共同以一般用法用在化妆品组合物中。

本发明的化妆品组合物可以用于治疗年龄相关的皮肤损伤。

年龄相关的皮肤损伤是指与内在衰老和/或外在衰老相关，或尤其引起或者影响的任何的皮肤病症或紊乱，其常常归因于氧自由基引起的损伤。氧自由基可以损伤细胞并被认为加速年龄相关的疾病。年龄相关的皮肤损伤还可能由于常年的太阳损伤、营养不良、高压力水平、暴露于环境污染以及某些生活方式选择例如吸烟、酒精或药物滥用而引起。

年龄相关的皮肤病症可能，例如，涉及皱纹、老人斑、太阳损伤（特别是UV辐射诱导的氧化应激）、瑕疵、色素沉着过度的皮肤、增加的皮肤厚度、皮肤弹性和胶原量的丢失和/或皮肤干燥。

在另一个方面，本发明涉及如上所述的化妆品组合物用作UV辐射保护剂的应用。

本发明进一步通过以下实施例进行说明，其不以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：NAC和姜黄根的极限浓度的估测

N-乙酰半胱氨酸（NAC）、刺槐豆胶（LBG）和姜黄素（姜黄根或者Tur）由Sigma提供。

在NAC和姜黄根的使用中，极限浓度是在用0.5mM至20mM的NAC和0.5μM至50μM的姜黄根对人成纤维细胞进行体外细胞毒性和增殖试验之后进行确定。

增殖试验使用MTT比色测定（Roche11465007001）来进行。MTT是一种黄色的四唑盐，其在活细胞中形成甲臜（formazan）结晶。甲臜结晶溶解，并且所得颜色用分光光度法在550nm下定量。

成纤维细胞以每孔4000细胞的密度接种在96-孔板中。细胞在孵育炉中保持37℃。第二天，NAC和姜黄根的处理组（treatments）以每孔200μL的体积被加入到细胞培养物中。细胞培养物被留下孵育24、48和74小时。

各个孵育时间之后，20μLMTT（最终浓度0.5mg/mL）加入到每个孔中。为了使甲臜结晶形成，板在孵育炉中保持4小时。随后，100μL的增溶剂加入到各个孔中，并且板留在孵育炉中直到第二天。然后，测量550nm下的吸光度数据。

图1a和2a显示了通过MTT比色测定从细胞毒性和增殖试验中得到的结果，使用不同浓度的NAC和姜黄根。

每个组分的IC₅₀，即相对于对照组引起减少50%细胞的浓度，被确定为毒性极限（图1b和2b）。

关于NAC的情况，被研究的浓度在72小时时都没有达到IC₅₀，尽管相对于对照组，10和20mM的浓度渐进地减少细胞增殖。NAC的浓度的最大极限可以被确定为10mM。基于实验获得的结果，选用NAC的1和5mM的浓度，因为它们导致成纤维细胞中增殖速率的改善。

在研究姜黄根的浓度的最大极限时，观察到20和50μM的浓度如何从最初的24小时有毒性，超过IC₅₀限度。10μM的浓度在72小时超过限度，以及7.5μM的浓度在72小时时达到IC₅₀。因此，7.5μM的浓度可以确定为混合物中使用姜黄素的最大极限。

选择浓度1和5μM的姜黄素用于实验，因为没有观察到毒性作用。

实施例2.本发明组合物的成分以及它们的组合对人成纤维细胞的存活能力的影响

本试验的目的是测定LBG、NAC、姜黄根及其组合在不利环境中对细胞的存活能力的影响，例如对创面床中的细胞。

为此，使用过氧化氢使成纤维细胞接受氧化环境1小时，并且让成纤维细胞与LBG、NAC、姜黄根及其组合接触。培养中的成纤维细胞的细胞存活能力通过如上所定义的MTT比色测定来分析。

测试用的细胞接种

测试的前一天，成纤维细胞以每孔11500细胞的密度接种到96-孔板中。所有测试重复三次。

测试

处理组（treatments）在实验的当天准备，并且过氧化氢就在测试之前加入。

在标准细胞生长培养基中1%刺槐豆胶的制备

制备蒸馏水中1%的刺槐豆胶溶液，并且100℃以上加热直到胶质完全溶化。然后，溶液在4000rpm下离心20分钟以除去混合物中的杂质。刺槐豆胶溶液冻干。冻干产品（liophilisate）以1%的浓度溶入细胞生长培养基（DMEM+10%FBS）。

NAC和姜黄素处理组和过氧化氢的准备

NAC和姜黄素处理组和过氧化氢就在开始测试之前准备。为了准备姜黄素储备液，有必要知道购得的姜黄根批次的纯度，并重新调整计算以加入必需的浓度。

处理组和过氧化氢同时加入并且保持孵育1小时。

孵育之后，移出处理组，并且加入标准生长培养基和10%MTT。增溶剂在4小时时加入。

然后，测量550nm下的吸光度数据。

为了研究成分的组合的协同或者相加作用，通过应用专门设计的公式来分析结果，以研究这些参数：

A.剂量改变系数（DMF）的适合的公式，称为组合因子（FC）。

原创公式分析了剂量改变系数，采用两个药物单独给药和组合给药导致的细胞抑制的百分比的数据（萨尔BD等，小鼠黑色素细胞的差异的敏感性和丁硫堇的黑色素瘤细胞和抗癌药，细胞研究1991；4：237-9（ThrallBDetal.Differentialsensitivitiesofmurinemelanocytesandmelanomacellstobuthioninesulfoximineandanticancerdrugs.Cell.Res.1991;4:237-9））。所述公式已被使用并公开在我们研究团队的后来的国际文章中。

此处所示的公式是改编自上述那个公式，同时参考相对于氧化对照组的存活细胞的百分比的增加，并且如下：

B.原创公式称为组合指数(IC)

此处所示的公式是本专利作者之一（T.Palomares）的原创公式，其分析了存在试剂，单独地或者与其他组合的情况下，存活细胞减去氧化对照组的存活细胞的数量后相对于原始细胞数量的百分比。因此，相对于没有被处理和暴露于氧化剂的存活细胞的数量的增加得到分析。公式如下：

$\mathrm{IC}=\frac{(\%\mathrm{Cs\; LBG}+\mathrm{NAC})-(\%\mathrm{Cs\; Cox})}{(\%\mathrm{Cs\; LBG}-\%\mathrm{Cs\; Cox})+(\%\mathrm{Cs\; NAC}-\%\mathrm{Cs\; Cox})}$

Cox:氧化对照组

Cs:相对于没有氧化作用的初始对照的存活细胞

在两个公式中，值>1表明协同作用（显著性越高则所述值就越大）以及<1表明相加作用且值越大就越接近1。

一旦适当的数值验证被做出，相同的结果从两个公式中获得。

根据实验测试的结果如图3所示，其中细胞接受氧化环境（1mMH₂O₂）以及用1%LBG、1mMNAC、1mM姜黄根及其组合处理。实验数据在氧化后1小时获得。这些数据表明三重组合LBG+NAC+Tur产生最好的保护作用，达到对照水平。相对于氧化对照组和相对于LBG、NAC、Tur、LBG+Tur和NAC+Tur处理组，组合LBG+NAC也增加了细胞的存活能力。

表I显示了相对于无氧化对照组、接受氧化应激的细胞的存活百分比。

表II显示了通过应用公式A和B获得的指数，其中可以得出结论：LBG+NAC的组合和LBG+NAC+姜黄根的三重组合中有协同作用。

这结果已经指出，LBG与NAC或者与NAC+Tur的组合在氧化应激状态下的细胞存活能力的增加中产生协同作用。但是，LBG+Tur和NAC+Tur的组合产生预料中的相加作用。

最显著的保护作用的测试显示了三种试剂的组合产生最大的保护作用（100%的存活细胞）。三种试剂的组合显示了相对于用LBG+NAC处理(77.77%)1.3倍的作用。

实施例3.本发明组合物的成分，单独地或者组合地，对处于氧化环境的人成纤维细胞中产生的氧活性代谢产物的减少的影响

活性氧代谢产物（ROMs）的增加是妨碍创伤愈合的主要原因之一。这个作用导致细胞的增殖能力的丢失以及金属蛋白酶的表达的增加，其降解形成的新的真皮基质并阻止愈合。

为了定量ROM-减少或者LBG、NAC和姜黄根的抗氧化能力，测定了高浓度的过氧化氢下的氧化成纤维细胞培养物时产生的ROMs的产量。

细胞内ROMs通过用荧光探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐（分子探针D399）标记的方式来定量。当这个探针被活性氧代谢产物氧化时能够在538nm下发出荧光。细胞氧化用1mM的过氧化氢来完成。

测试用的细胞接种

测试的前一天，成纤维细胞以每孔11500细胞的密度接种到96-孔板中。所有测试重复三次。

测试

处理组在实验当天准备，并且过氧化氢就在测试前加入。

常规细胞生长培养基中的1%刺槐豆胶的制备

制备蒸馏水中1%的刺槐豆胶溶液，并且于100℃以上加热直到胶质完全溶化。

然后，溶液在4000rpm下离心20分钟以除去混合物中的杂质。刺槐豆胶溶液冻干。冻干产品（liophilisate）以1%的浓度溶入细胞生长培养基（DMEM+10%FBS）。

用荧光探针标记细胞

加入处理组和过氧化氢之前，细胞在黑暗中用浓度50μM的荧光探针标记30分钟。

NAC和姜黄根处理组和过氧化氢的准备

NAC和姜黄素处理组和过氧化氢就在开始测试之前准备。为了准备姜黄素储备液，有必要知道购得的姜黄根批次的纯度，并重新调整计算以加入必需的浓度。

标记细胞之后，抗氧化剂处理组和过氧化氢被加入。

氧化开始20分钟后收集的探针在538nm处发出荧光。

图4显示了处于1mM的H₂O₂的氧化环境中，并且当成纤维细胞与1%LBG、5mMNAC、5μM姜黄根及其组合接触时的成纤维细胞的细胞内ROM水平，其通过用探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐标记中获得的荧光单位而得到。

表III显示了相对于氧化对照，当细胞接受1mM的过氧化氢以及与本发明的组合物的成分接触时，ROMs的减少的百分比数据。

如所观察到的，与LBG、NAC、姜黄根及其组合接触的细胞中细胞内ROM水平有显著的减少。

相对于单独地LBG，NAC添加到LBG溶液中产生细胞内ROM水平的显著减少。

但是，LBG+NAC+Tur的三重组合在细胞内ROM水平减少方面产生最大的利益，其与对照组（没有氧化作用）的那些类似。

为了证实不同成分的组合的协同或者相加作用，结果通过应用实施例2所述的公式A和B来进行分析。但是，这种情况，细胞内ROM水平相对于氧化对照的减少被采用作为一个参考。

结果如表IV所示：

公式A和B的应用清楚地显示了LBG+NAC和LBG+NAC+Tur组合产生了协同作用，而LBG+NAC和NAC+Tur组合产生了细胞内ROS的减少方面的相加作用。

实施例4.有N-乙酰半胱氨酸掺入其中的刺槐豆胶的水凝胶的制备

称量好的刺槐豆胶分散在蒸馏水中以形成包含1-5wt%的所述胶的溶液。为了利于水凝胶的合成，硫酸加入到溶液中直到获得pH值为2，目的是质子化刺槐豆胶的羟基。溶液在室温下搅拌2-3小时，随后，温度升至100-120℃。在这个温度下，溶液搅拌至少30分钟。

溶液以4000rpm离心20分钟以除去混合物中的杂质，因而纯的刺槐豆胶溶液在上清液中，且杂质以片状沉淀物留下。

刺槐豆胶溶液接受使用戊二醛作为交联剂的化学交联步骤。为了这个目的，戊二醛加入到刺槐豆胶溶液中，同时搅拌至少30分钟。戊二醛的量取决于想要的水凝胶的最终性质。如果需要快速递送的N-乙酰半胱氨酸，较低量的交联剂加入到刺槐豆胶溶液中以获得低交联度。相反地，如果需要增加N-乙酰半胱氨酸的递送时间，高量的交联剂加入到刺槐豆胶溶液中以获得高交联度。图5a-5d对应的是用扫描电子显微镜（SEM）拍摄的照片，其显示了当交联剂浓度从0至2.5%重量计的增加时，3%重量计的刺槐豆胶水凝胶的孔隙率的增加。

刺槐豆胶和戊二醛的混合物放置在培养皿上。交联反应在37℃下进行。

一旦水凝胶已经形成，它用5%的硫酸氢钠（Sigma13438）洗涤，然后为了移除不反应的戊二醛，用蒸馏水洗涤。随后，水凝胶在65℃的烤箱中干燥以形成干凝胶。

为了将N-乙酰半胱氨酸掺入到刺槐豆胶结构中，干凝胶加入到N-乙酰半胱氨酸和PBS的饱和溶液中再水化。最终，获得的水凝胶是部分干燥的，用于它随后的应用。

实施例5.包含LBG、LBG+NAC，和LBG+NAC+Tur的水凝胶对猪皮肤上的创伤愈合进程的影响的评价

4只25-35kg体重的雄性猪被选用。在操作开始之前，动物给予1周的环境适应期。

术前，动物通过肌内给予阿扎哌隆（4mg/kg）+氯胺酮（10mg/kg）使其镇静，以及气管插管，并且通过静脉注射丁丙诺啡（0.01mg/kg）给其止痛。麻醉用丙泊酚（4mg/kg）、异氟醚（1.5-2%，氧）诱导并维持。手术前的抗生素治疗是通过静脉注射头孢噻吩（22mg/kg）来进行的。

在每只猪的背部外科手术地产生4处皮肤伤口。3个不同的生物材料基质组合（LBG、LBG+NAC和LBG+NAC+Tur）被应用到4处伤口中的3处，以及生理盐水被应用在对照伤口上。敷料每3天换一次，当换敷料时清理创伤。

在手术后期间，在整个实验中进行组织愈合的肉眼检查评价。组织学评价的活组织检查在产生伤口后的第5、10和15天获得。所有皮肤活组织检查样品固定在10%的中性福尔马林缓冲剂中，常规地处理并用苏木精和伊红（H&E）染色用于组织病理学研究。在被处理和对照区域进行组织病理学评价。参数例如表皮再形成、真皮炎症的存在和肉芽组织形成的相和化脓被评价。

该结果显示了从最初的几天起更快的进展，主要在LBG+NAC和LBG+NAC+Tur处理的伤口。此外，显微镜分析显示相对于对照伤口在肉芽组织形成方面和在组织的化脓方面有改善。

图6显示了10天的进展的活组织检查的肉眼可见的视图，其中可以观察到在处理组中新组织形成有增加，特别地在用LBG+NAC+Tur处理的组中。

当创面的计算在3个组中进行时，创口闭合的能力的提高体现在3个组中。但是，该效果在LBG+NAC组有增强，并且更高的效果在LBG+NAC+Tur组中观察到。

表V显示了在不同处理组中的被评价的伤口面积以及表明这些组的创伤减少能力的指数。该指数还表明LBG+NAC+Tur的处理达到较高的效果。

图7显示了3天进展的照片，其中LBG+NAC和LBG+NAC+Tur处理与建立的胶原处理比较。正如所观察到的，相对于对照和胶原处理组，LBG+NAC和LBG+NAC+Tur组中的伤口面积都有减少，以及LBG+NAC+Tur再次地表现出更高的面积减少和最有质量的愈合进程。

Claims (27)

1.一种包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的抗氧化剂组合物在制备用于由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症的治疗或预防或者与受治疗者皮肤中活性氧类产生相关的皮肤疾病或者病症的治疗或预防的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中半乳糖甘露聚糖是刺槐豆胶。

3.根据权利要求1所述的应用，其中活性氧类产生起因于受治疗者受到阳光辐射、化学试剂、放射治疗或者化学治疗的作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其中由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症选自晒伤，光敏感性，过早衰老，银屑病，选自基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑色素瘤的皮肤癌，免疫性疾病，局部或者广布的炎症，细菌或者真菌感染，皮疹，全身性氧化应激和光化性角化病。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述免疫性疾病是免疫抑制。

6.根据权利要求1所述的应用，其中与受治疗者皮肤中活性氧类产生相关的皮肤疾病或者病症选自急性外科的和外伤性的创伤、烧伤、烫伤、瘘、静脉溃疡、动脉溃疡、压疮、糖尿病性溃疡以及混合病因的溃疡。

7.根据权利要求1所述的应用，其中与受治疗者皮肤中活性氧类产生相关的皮肤疾病或者病症选自慢性或者坏死性创伤和炎性病变和紊乱。

8.一种包含半乳糖甘露聚糖、N-乙酰半胱氨酸和姜黄素的抗氧剂组合物在制备用于由受治疗者的皮肤中活性氧类产生导致的皮肤疾病或者病症的治疗或预防或者与受治疗者皮肤中活性氧类产生相关的皮肤疾病或者病症的治疗或预防的药物中的应用。

9.一种抗氧化剂组合物，其包含半乳糖甘露聚糖、N-乙酰半胱氨酸和姜黄素。

10.如权利要求8所定义的抗氧化剂组合物在制备药物中的应用。

11.一种包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸的水凝胶，其中半乳糖甘露聚糖是以交联基质的形式，以及N-乙酰半胱氨酸结合到所述的半乳糖甘露聚糖的交联基质中。

12.根据权利要求11所述的水凝胶，其中半乳糖甘露聚糖是刺槐豆胶。

13.根据权利要求11所述的水凝胶，其中半乳糖甘露聚糖基质进一步包含掺入其中的姜黄素。

14.根据权利要求11所述的水凝胶，其进一步包含细胞。

15.根据权利要求14所述的水凝胶，其中细胞选自由成纤维细胞、角质化细胞、内皮细胞、上皮细胞、来自造血系统的细胞、分化或未分化的干细胞、软骨形成细胞、成骨细胞、肌细胞以及脂细胞构成的组。

16.根据权利要求15所述的水凝胶，其中所述成纤维细胞是角膜细胞，所述分化或未分化的干细胞是分化或未分化的间质干细胞，以及所述来自造血系统的细胞是来自白细胞系统的细胞。

17.根据权利要求14所述的水凝胶，其中细胞选自来自外周或者中枢神经系统的细胞。

18.一种制备如权利要求11所定义的水凝胶的方法，其包含：

a)将半乳糖甘露聚糖溶解在水溶液中；

b)通过将交联剂加入到半乳糖甘露聚糖的水溶液中，使半乳糖甘露聚糖接受化学交联，从而获得包含交联葡甘露聚糖基质的水凝胶；

c)将N-乙酰半胱氨酸结合以及可选地将姜黄素结合到交联葡甘露聚糖基质中。

19.根据权利要求18所述的方法，其中N-乙酰半胱氨酸以及可选地姜黄素进入交联葡甘露聚糖基质的结合包含以下步骤：

1)干燥步骤b)中获得的水凝胶以形成干凝胶；

2)通过将干凝胶引入到含N-乙酰半胱氨酸和可选的姜黄素的水溶液中使干凝胶再水化，以形成水凝胶，其中N-乙酰半胱氨酸和可选的姜黄素被结合到交联的葡甘露聚糖基质中；

3)部分地干燥步骤2)获得的水凝胶。

20.如权利要求11所定义的水凝胶在制备药物中的应用。

21.如权利要求11所定义的水凝胶在制备治疗和/或治愈急性外科的和外伤性创伤、烧伤、烫伤、瘘、静脉溃疡、动脉溃疡、压疮、糖尿病性溃疡以及混合病因的溃疡的药物中的应用。

22.如权利要求11所定义的水凝胶在制备用于治疗和/或治愈慢性或者坏死性创伤和炎性病变和紊乱的药物中的应用。

23.一种创伤敷料，其包含如权利要求11所定义的水凝胶。

24.一种包含半乳糖甘露聚糖和N-乙酰半胱氨酸组合物作为化妆品的应用。

25.如权利要求24所定义的应用，所述作为化妆品的组合物进一步包含姜黄素。

26.权利要求24所定义的应用，所述组合物在制备用于治疗年龄相关的皮肤损伤的化妆品中的应用。

27.权利要求24所定义的应用，所述组合物在制备作为UV辐射保护剂的化妆品中的应用。