CN105497025B - 联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种联氨基姜黄素的新用途，联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。本发明首次提出了联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。联氨基姜黄素通过抑制STAT3信号通路的活化及该信号通路靶基因STAT3的表达来降低皮肤鳞状细胞癌A431细胞的侵袭性。联氨基姜黄素易溶于水，生物利用度高，能替代姜黄素在临床上广泛地应用。

Description

联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
背景技术
近30年来，我国癌症发病率及死亡率一直呈持续增长的趋势。皮肤鳞状细胞癌是发病率较高的皮肤恶性肿瘤，其在皮肤恶性肿瘤中占有较大比例，一般为80％至90％，其发病率有逐年增高趋势，在老年人中尤其明显。该类癌症因其恶性程度高，西医治疗目前无有效且经济的手段。
信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activatoroftranscription3，STAT3)是多种致癌性信号通路的关键分子，其下游调控着许多与肿瘤细胞生长、凋亡、血管生成和转移有关的关键分子，如CyclinD1，Survivin，Bcl-2等。STAT3参与细胞生长、分化、分裂及发育等多种生理过程，并在细胞恶性转化中起重要作用。STAT3是转录信号传导子与激活子家族(STAT)的重要成员。STAT3作为转录因子在没有特异性的刺激时定位于胞质内，当细胞受到刺激时，STAT3上的SH2结构域与受体上被磷酸化的酪氨酸的残基结合，同时自身被JAK磷酸化。STAT3是EGFR，IL-6/JAK等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚焦点，STAT3激活后诱导与细胞增殖、分化、生存、凋亡密切相关的关键基因的异常表达，通过各种途径促进细胞增殖，恶性转化，阻碍细胞凋亡表达出致癌作用，目前被定义为一种癌基因。
其中，姜黄素作为一种中药在抗癌应用中被广泛应用。姜黄素是一种天然植物多酚类色素，从姜科植物姜黄中提取，也存在其它姜科植物中。姜黄素广泛存在于我国传统中药姜黄的根茎中。近年来研究表明，姜黄素在抗肿瘤、抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿等方面具有很好的药理作用。姜黄素在动物模型上对皮肤癌、肝细胞癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有明显地抑制作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡，但是姜黄素水溶性差，生物利用度低等缺点严重制约了临床的应用。
发明内容
为了解决现有技术中姜黄素不能在临床上广泛应用的缺陷，本发明提供了联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
本发明提供了一种联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
其中，质量浓度大于15μmol/L的联氨基姜黄素能明显抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的生长。
其中，联氨基姜黄素通过抑制STAT3信号通路及STAT3基因表达来降低人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的侵袭性。
本发明的有益效果：本发明首次提出了联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。联氨基姜黄素通过抑制STAT3信号通路的活化及该信号通路靶基因STAT3的表达来降低皮肤鳞状细胞癌A431细胞的侵袭性。联氨基姜黄素易溶于水，生物利用度高，能替代姜黄素在临床上广泛地应用。
附图说明
图1是联氨基姜黄素对A431细胞体外侵袭能力的影响，A：阴性对照组；B：5μmol/L联氨基姜黄素处理组；C：10μmol/L联氨基姜黄素处理组；D：15μmol/L联氨基姜黄素处理组；
图2是Western blot检测联氨基姜黄素处理后A431细胞中STAT3和P-STAT3蛋白的相对表达量；
图3是Western blot检测姜黄素处理后A431细胞中STAT3和P-STAT3蛋白的相对表达量；
图4是联氨基姜黄素对A431细胞中STAT3和P-STAT3蛋白表达的影响；
图5是联氨基姜黄素对A431细胞中STAT3基因mRNA转录水平的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
本发明中用到的主要仪器及试剂：
人皮肤鳞癌细胞A431由中国科学院上海细胞生物研究所提供；STAT3鼠单克隆抗体及P-STAT3鼠单克隆抗体由美国Cell Signaling Technologies公司提供；联氨基姜黄素购自中国药品生物制品检定所；MTT购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；Transwell小室购自Milliproe公司；PCR引物及BSA稀释液由上海生工合成，ReverTraAce-α-RT-PCR kit购自TOYOBO公司，蛋白干粉购自中国博士德公司。
细胞培养方法：A431细胞在含10％FBS的RPMI1640培养基，放置于细胞培养箱中(37℃、5％CO2)，当细胞生长至80％融合时，用0.25％胰酶传代。
实施例1
MTT法检测联氨基姜黄素对细胞的杀伤力：
取对数生长期细胞，按4×103个/孔接种于96孔板中，边缘孔加入无菌PBS，培养24h后，分别加入浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、50μmol/L联氨基姜黄素，同时设阴性对照组(0.1％二甲基亚砜DMSO)和空白对照组，每组设3个复孔，0.1％DMSO可抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖。培养24、48、72h后，1000r/min离心，弃去培养液，每孔加入180μl无血清RPMI1640培养基及20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h，1000r/min离心，弃去上清，每孔加入100μl DMSO，摇床振荡10min。酶标仪490nm波长处测定光密度A值，并按以下公式计算细胞生存率(％)。实验重复3次。
细胞生存率(％)＝(实验组A490-空白对照组A490)/实验对照组A490×100％。
SPSS13.0统计学软件处理，以均数±标准差表示数据，独立样本t检验用于各实验组组间均数分析，单因素方差分析多组数据，P＜0.05为在统计学有意义。
结果如表1所示，联氨基姜黄素浓度15μmol/L，作用时间24h为临界点，联氨基姜黄素浓度＞15μmol/L，作用时间＞24h细胞的生长抑制呈时间和剂量依懒性，差异在统计学上有意义(P＜0.001)；联氨基姜黄素浓度≤15μmol/L，作用时间≤24h时，联氨基姜黄素对细胞毒性作用无统计学意义，细胞存活率＞85％。所以以联氨基姜黄素浓度≤15μmol/L，作用时间为≤24h时为侵袭和粘附试验的条件。
表1不同浓度的联氨基姜黄素对A431细胞的抑制率
注：＊VS 5、10、15μmol/L,P<0.05；△VS 5、10μmol/L,P<0.0；◇VS 5、10、20、25μmol/L，P<0.05；#VS 5、15、20、25μmol/L,P<0.05；■VS 24h，P<0.05；●VS 48h,P<0.05
实施例2
Transwell小室侵袭试验法检测联氨基姜黄素对细胞侵袭能力影响。将对数生长期细胞分为以下四组：阴性对照组(0.1％DMSO)；联氨基姜黄素5μmol/L处理组；联氨基姜黄素10μmol/L处理组；联氨基姜黄素15μmol/L处理组。
结果如附图1所示，对照组及5、10、15μmol/L联氨基姜黄素处理组穿膜细胞数分别是(462.33±36.71)/视野，(310.33±37.66)/视野，(189.10±17.06)/视野和(126.33±8.62)/视野。与对照组相比，穿膜细胞数随着联氨基姜黄素药物浓度的增加而逐渐减少，以15μmol/L组实验效果最明显，实验各组之间差异统计学均有意义(F＝85.67，P﹤0.05)。
实施例3
粘附试验法检测联氨基姜黄素对细胞粘附能力影响。按以上分类的四组进行预处理细胞24h。配制终浓度为10μg/ml的纤维连接蛋白溶液，包被96孔细胞以每孔50μl于培养板，密封后4℃12h；PBS洗涤5次，加入含1％BSA的无血清的RPMI1640培养基，50μl/孔，37℃封闭2h；经0.25％胰酶消化细胞，细胞浓度调整至2×104个/孔，接种96孔板中，每组设3个复孔，孵育1.5h；PBS洗涤5次，加入2mg/ml MTT，50μl/孔，孵育3h；弃去MTT，加入DMSO每孔150μl，振荡15min，酶标仪490nm波长处测定A值，并按以下公式计算粘附细胞量：
粘附细胞量＝实验组A490-阴性对照组A490
对照组及5、10、15μmol/L联氨基姜黄素处理组的细胞粘附量分别是(1.355±0.094)，(0.876±0.022)，(0.478±0.031)和(0.303±0.026)。与对照组相比，细胞粘附能力随着联氨基姜黄素药物浓度的增加而呈现逐渐下降的趋势，15μmol/L处理组作用效果最明显，各实验组之间差异在统计学上均有意义(F＝378.72，P﹤0.01)。
实施例4
Western blot法检测联氨基姜黄素对细胞STAT3、P-STAT3蛋白表达影响。将A431细胞按1×104个/cm2接种到培养瓶中，贴壁后按下列四组加入相应的药物：阴性对照组(0.1％DMSO)，联氨基姜黄素(5、10、15μmol/L)处理组。培养24h后提取各组细胞总蛋白，经10％SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，经5％脱脂牛奶室温封闭1h，封闭后用TBST洗5次，每次5min，敷一抗后4℃12h，后TBST洗5次，每次10min，敷二抗，室温摇床振荡1h，TBST洗5次，每次10min。ECL成像系统成像，拍照。
结果如图2、图4所示：P-STAT3表达随着联氨基姜黄素浓度的增加，抑制作用逐渐增强，且与剂量呈高度相关性，其中15μmol/L组效果最明显，各实验组之间差异在统计学上均有意义(F＝116.67，P﹤0.05)，而总STAT3蛋白水平差异在统计学上无意义。结合图3，联氨基姜黄素对P-STAT3表达的抑制作用要强于姜黄素。
实施例5
RT-PCR法检测联氨基姜黄素对细胞中STAT3基因mRNA转录水平的影响。将A431细胞按2×105个/cm2接种至6孔板中，贴壁后，按下列四组加入相应的药物：阴性对照组(0.1％DMSO)；联氨基姜黄素5μmol/L处理组；联氨基姜黄素10μmol/L处理组；联氨基姜黄素15μmol/L处理组。培养24h后，提取各细胞总RNA并进行测定，再取10μg总RNA，用ReverTra Ace-α-RT-PCR kit将其逆转录成cDNA，总体系20μl，99℃5min，4℃5min，cDNA引物于-20℃保存备用。引物序列见表2，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以β-action基因为内参物。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s(STAT355℃)，72℃延伸2min，进行26个循环；72℃再延伸10min，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，成像系统采集图像并进行分析。
表2 RT-PCR引物序列
结果如图5所示：联氨基姜黄素对STAT3基因mRNA转录水平的抑制作用随着药物浓度的增加而增强，与联氨基姜黄素剂量呈高度相关性，5、10、15μmol/L联氨基姜黄素处理组细胞中STAT3基因mRNA转录水平分别为(0.514±0.175)，(0.278±0.058)，(0.045±0.003)。与对照组(0.780±0.135)比较，转录水平明显降低，以15μmol/L实验组效果最明显(t＝9.466，P＜0.01)，各实验组间的差异在统计学上均有意义(F＝24.132，P＜0.05)。
综上，联氨基姜黄素浓度＞15μmol/L，作用时间＞24h时，对细胞的生长抑制呈时间和剂量依懒性(P＜0.001)，当联氨基姜黄素浓度≤15μmol/，作用时间为24h时，对细胞无明显毒性作用，细胞存活率＞85％。细胞侵袭能力和粘附能力随着联氨基姜黄素浓度的增加而逐渐降低，以15μmol/L联氨基姜黄素浓度处理效果最明显(P＜0.05)。联氨基姜黄素可明显抑制STAT3基因mRNA转录水平，其抑制作用与剂量呈高度依懒性(P＜0.05)。联氨基姜黄素通过抑制STAT3信号通路的活化及此信号通路靶基因STAT3的表达来降低人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的侵袭性。
本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.联氨基姜黄素在制备抗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用，联氨基姜黄素通过抑制STAT3信号通路及STAT3基因表达来降低人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的侵袭性；质量浓度大于15μmol/L的联氨基姜黄素能明显抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的生长。
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