CN114306726A - 一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水凝胶技术领域，具体涉及一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法和使用方法，本发明通过复合蛋白的交联合成、VE、VC客体包结物的制备、配制抗氧化水凝胶的方法，构建一种可注射仿生抗氧化水凝胶，它可模拟细胞抗氧化防御体系构建伤口敷料，清除伤口组织中活性氧自由基（ROS）的过量表达，降低过表达ROS对细胞、组织和器官的损伤，不仅可以对皮肤组织的细胞外活性氧清除，更能对皮肤组织细胞内的活性氧进行有效清除；它的组织粘附性和自愈合能力有助于伤口敷料抵抗肢体运动引起的机械变形，有效解决敷料接触时间不足、耐久性低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶技术领域，具体涉及一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法和使用方法。
背景技术
氧化应激损伤是烧伤早期患者多器官功能损伤的重要机制之一。严重烧伤早期机体液体大量丢失。烧伤早期产生的大量活性氧（reactive oxygen species ROS）可损伤组织和细胞的脂质、蛋白和核酸等成分，并与炎症因子和血管活性物质等协同作用，引起细胞结构和功能改变造成严重的氧化损伤。
目前，传统创口处理和修复方式主要为创面敷料覆盖，如专利CN111265710A公开了一种基于MAP/PRF复合的新型仿生皮肤创口敷料的制备方法，以贻贝粘合蛋白MAP为基材进行粘合材料MAP的仿生合成，进行PRF生物提取，修饰MAP粘合材料。
但创面敷料覆盖存在不易固定，使用时需注意防水、需进行创面换药等，或固定伤口使得正常活动受限、无法保持创面的湿润，存在诸多应用局限，往往限制伤者难以进行正常活动，且存在再次感染的风险。而且创面敷料覆盖治疗主要集中与皮肤组织的细胞外活性氧清除，而不能对皮肤组织细胞内的活性氧进行有效清除。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种使用方便、可有效降低感染风险、又可以对皮肤组织细胞内的活性氧进行有效清除的可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法和使用方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法，它包括以下步骤：
步骤（1）复合蛋白的交联合成：取0.4-0.6g贻贝粘蛋白、0.2-0.3g丝素蛋白、0.07-0.09g透明质酸钠、0.15-0.17g乙酰半胱氨酸，加入到100ml水中搅拌均匀得到均相溶液，然后将均相溶液使用旋转蒸发法得到浓缩液，然后将浓缩液放置透析袋，将透析袋放置灭菌蒸馏水中进行透析，透析完成进行冷冻干燥，得到复合蛋白粉末；
步骤（2）配制VE、VC客体包结物的制备：将步骤（1）的复合蛋白粉末0.005-0.015g在无菌条件下使用100mL无菌水溶解，搅拌得到复合蛋白溶液；然后将10ml体积浓度为0.1%的 VE-乙醇溶液逐滴滴入该复合蛋白溶液中，放置40-50℃的摇床震荡20-28h后将该溶液40-50℃减压蒸馏，得到粘稠水溶液50ml，加入0.1-0.2gVC、0.002-0.003g黄酮、0.16-0.17g超氧化物歧化酶，加入酚酸调节pH至6.2~6.3，然后进行冷冻干燥，得到VE、VC客体包结物；
步骤（3）配制抗氧化水凝胶：将步骤（2）中的VE、VC客体包结物0.012-0.013g溶于100ml质量分数0.5%的脱乙酰壳多糖水溶液中，将氧化再生纤维按0.0205g/ml加入到脱乙酰壳多糖水溶液中，酚酸调节pH值为6.2~6.3，得到原位凝胶，然后用体积分数为50%的异丙醇水溶液洗涤凝胶4~5次，再用纯的异丙醇冲洗2~3次，得到一种可注射仿生抗氧化水凝胶。
优选的，步骤（1）旋转蒸发的温度是40-50度，时间为20-28小时。
优选的，步骤1所述透析的时间为24-48小时，透析袋的截留分子量为14000，容量6.4ml/cm。
优选的，步骤1所述冷冻干燥的温度为-35℃-60℃。
优选的，步骤2所述冷冻干燥的温度为-25℃-55℃。
所述的可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，上述可注射仿生抗氧化水凝胶采用注射的方法进行使用。
优选的，将仿生抗氧化水凝胶置于1ml的注射器内，采用5~25kGy钴射线进行辐照灭菌，使用时注射到受损部位。采用水凝胶注射方式，按照一定的规格进行水凝胶贮存，也方便医生使用，免去医生再定容的操作。
本发明的有益效果：本发明通过复合蛋白的交联合成、VE、VC客体包结物的制备、配制抗氧化水凝胶的方法，构建一种抗氧化剂可吸收的伤口敷料，用于治疗和抵抗烧伤皮肤的纤维化结疤，可以获得良好的皮肤组织再生，具体的：
（1）本发明制备的水凝胶可模拟细胞抗氧化防御体系构建伤口敷料，清除伤口组织中活性氧自由基（ROS）的过量表达，降低过表达ROS对细胞、组织和器官的损伤，不仅可以对皮肤组织的细胞外活性氧清除，更能对皮肤组织细胞内的活性氧进行有效清除。
（2）本发明制备的水凝胶的组织粘附性和自愈合能力有助于伤口敷料抵抗肢体运动引起的机械变形，有效解决敷料接触时间不足、耐久性低的问题。
（3）烧伤、刀伤等受损部位往往是不规则的，采用水凝胶注射的方式可克服这些困难，将水状的聚合物注射到受损部位，液体就会充盈任何性状的受损部分，在相变信号的刺激下形成凝胶，将受损部位填满，达到和周围组织密切结合和支撑的作用。此外，注射水凝胶是以最小的创伤面来进行治疗与恢复，可以降低患者痛苦。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
步骤（1）复合蛋白的交联合成：取0.4g贻贝粘蛋白、0.2g丝素蛋白、0.07g透明质酸钠、0.15g乙酰半胱氨酸，加入到100ml水中搅拌均匀得到均相溶液，然后将均相溶液使用旋转蒸发法得到浓缩液，然后将浓缩液放置透析袋，将透析袋放置灭菌蒸馏水中进行透析，透析完成进行冷冻干燥，得到复合蛋白粉末；
步骤（2）配制VE、VC客体包结物的制备：将步骤（1）的复合蛋白粉末0.005g在无菌条件下使用100mL无菌水溶解，搅拌得到复合蛋白溶液；然后将10ml体积浓度为0.1%的 VE-乙醇溶液逐滴滴入该复合蛋白溶液中，放置40℃的摇床震荡28h后将该溶液40℃减压蒸馏，得到粘稠水溶液50ml，加入0.1gVC、0.002g黄酮、0.16g超氧化物歧化酶，加入酚酸调节pH至6.2，然后进行冷冻干燥，得到VE、VC客体包结物；
步骤（3）配制抗氧化水凝胶：将步骤（2）中的VE、VC客体包结物0.012g溶于100ml质量分数0.5%的脱乙酰壳多糖水溶液中，将氧化再生纤维按0.0205g/ml加入到脱乙酰壳多糖水溶液中，酚酸调节pH值为6.2，得到原位凝胶，然后用体积分数为50%的异丙醇水溶液洗涤凝胶4次，再用纯的异丙醇冲洗2次，得到一种可注射仿生抗氧化水凝胶。
步骤（1）旋转蒸发的温度是40度，时间为28小时。
步骤（1）所述透析的时间为24小时，透析袋的截留分子量为14000，容量6.4ml/cm。
步骤1所述冷冻干燥的温度为-35℃-60℃。
步骤2所述冷冻干燥的温度为-25℃-55℃。
所述的可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，上述可注射仿生抗氧化水凝胶采用注射的方法进行使用。
将仿生抗氧化水凝胶置于1ml的注射器内，采用5kGy钴射线进行辐照灭菌，使用时注射到受损部位。
实施例2
一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法，它包括以下步骤：
步骤（1）复合蛋白的交联合成：取0.5g贻贝粘蛋白、0.25g丝素蛋白、0.08g透明质酸钠、0.16g乙酰半胱氨酸，加入到100ml水中搅拌均匀得到均相溶液，然后将均相溶液使用旋转蒸发法得到浓缩液，然后将浓缩液放置透析袋，将透析袋放置灭菌蒸馏水中进行透析，透析完成进行冷冻干燥，得到复合蛋白粉末；
步骤（2）配制VE、VC客体包结物的制备：将步骤（1）的复合蛋白粉末0.01g在无菌条件下使用100mL无菌水溶解，搅拌得到复合蛋白溶液；然后将10ml体积浓度为0.1%的 VE-乙醇溶液逐滴滴入该复合蛋白溶液中，放置45℃的摇床震荡24h后将该溶液45℃减压蒸馏，得到粘稠水溶液50ml，加入0.15gVC、0.0025g黄酮、0.165g超氧化物歧化酶，加入酚酸调节pH至6.3，然后进行冷冻干燥，得到VE、VC客体包结物；
步骤（3）配制抗氧化水凝胶：将步骤（2）中的VE、VC客体包结物0.0126g溶于100ml质量分数0.5%的脱乙酰壳多糖水溶液中，将氧化再生纤维按0.0205g/ml加入到脱乙酰壳多糖水溶液中，调节pH值为6.3，得到原位凝胶，然后用体积分数为50%的异丙醇水溶液洗涤凝胶5次，再用纯的异丙醇冲洗3次，得到一种可注射仿生抗氧化水凝胶。
步骤1旋转蒸发的温度是45度，时间为24小时。
步骤1所述透析的时间为24小时，透析袋的截留分子量为14000，容量6.4ml/cm。
步骤1所述冷冻干燥的温度为-35℃-60℃。
步骤2所述冷冻干燥的温度为-25℃-55℃。
所述的可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，上述可注射仿生抗氧化水凝胶采用注射的方法进行使用。
将仿生抗氧化水凝胶置于1ml的注射器内，采用15kGy钴射线进行辐照灭菌，使用时注射到受损部位。
实施例3
步骤（1）复合蛋白的交联合成：取0.6g贻贝粘蛋白、0.3g丝素蛋白、0.09g透明质酸钠、0.17g乙酰半胱氨酸，加入到100ml水中搅拌均匀得到均相溶液，然后将均相溶液使用旋转蒸发法得到浓缩液，然后将浓缩液放置透析袋，将透析袋放置灭菌蒸馏水中进行透析，透析完成进行冷冻干燥，得到复合蛋白粉末；
步骤（2）配制VE、VC客体包结物的制备：将步骤（1）的复合蛋白粉末0.015g在无菌条件下使用100mL无菌水溶解，搅拌得到复合蛋白溶液；然后将10ml体积浓度为0.1%的 VE-乙醇溶液逐滴滴入该复合蛋白溶液中，放置50℃的摇床震荡20h后将该溶液50℃减压蒸馏，得到粘稠水溶液50ml，加入0.2gVC、0.003g黄酮、0.17g超氧化物歧化酶，加入酚酸调节pH至6.3，然后进行冷冻干燥，得到VE、VC客体包结物；
步骤（3）配制抗氧化水凝胶：将步骤（2）中的VE、VC客体包结物0.013g溶于100ml质量分数0.5%的脱乙酰壳多糖水溶液中，将氧化再生纤维按0.0205g/ml加入到脱乙酰壳多糖水溶液中，酚酸调节pH值为6.3，得到原位凝胶，然后用体积分数为50%的异丙醇水溶液洗涤凝胶5次，再用纯的异丙醇冲洗3次，得到一种可注射仿生抗氧化水凝胶。
步骤（1）旋转蒸发的温度是50度，时间为20小时。
步骤（1）所述透析的时间为48小时，透析袋的截留分子量为14000，容量6.4ml/cm。
步骤1所述冷冻干燥的温度为-35℃-60℃。
步骤2所述冷冻干燥的温度为-25℃-55℃。
所述的可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，上述可注射仿生抗氧化水凝胶采用注射的方法进行使用。
将仿生抗氧化水凝胶置于1ml的注射器内，采用25kGy钴射线进行辐照灭菌，使用时注射到受损部位。
实验
一、原理：
DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获（“清除”）其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由基在已517nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长517nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示。抑制率越大，抗氧化性越强。
二、实验步骤
1、称量DPPH试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol/L DPPH贮备液，置于4℃冰箱避光冷藏，备用。
2、VC对照组：配制1mg/ml的VC水溶液，然后再稀释至浓度分别为0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml；因为 VC为水溶性抗氧化剂，也是血浆中最有效的抗氧化剂。作为一种强抗氧化剂，VC的最大特性是还原性，通过还原作用消除有害自由基的毒性，其抗氧化作用表现在可以与O2 -、HOO-、及OH-迅速反应，生成半脱氢抗坏血酸，清除单线态氧，还原硫自由基。因此，选用VC作为对照。
3、样品组：配制1mg/ml本发明实施例2的抗氧化水凝胶水溶液，然后稀释至浓度分别为0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml；
4、上板（避光操作，上完板后，室温避光30min，测吸光度）
96孔板，三组，每孔加入量及96孔板分布如下：
样品组：样品溶液50μl+DPPH溶液50μ1（每个浓度5个孔）
空白组：样品溶液50μl+无水乙醇50μ1（每个浓度5个孔）
VC对照组：VC溶液50μl+ DPPH溶液50μ1（每个浓度5个孔）
阳性试验组：DPPH醇溶液50μ1+纯化水50μ1（每个浓度5个孔）
吸光值为酶标仪设备检测后显示的吸光值的读数。清除率是按照以下公式计算出来的。样品清除率= (1-(A样品-A空白)/A阳性试验)*100%；VC对照组清除率=（1-（AVC对照-A空白）/A阳性试验）*100%。
通过以上实验数据可以看出，本发明的抑制率明显好于VC对照组，抑制率越大，抗氧化性越强，说明本发明的抗氧化性强。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种可注射仿生抗氧化水凝胶的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤（1）复合蛋白的交联合成：取0.4-0.6g贻贝粘蛋白、0.2-0.3g丝素蛋白、0.07-0.09g透明质酸钠、0.15-0.17g乙酰半胱氨酸，加入到100ml水中搅拌均匀得到均相溶液，然后将均相溶液使用旋转蒸发法得到浓缩液，然后将浓缩液放置透析袋，将透析袋放置灭菌蒸馏水中进行透析，透析完成进行冷冻干燥，得到复合蛋白粉末；
步骤（2）配制VE、VC客体包结物的制备：将步骤（1）的复合蛋白粉末0.005-0.015g在无菌条件下使用100mL无菌水溶解，搅拌得到复合蛋白溶液；然后将10ml体积浓度为0.1%的VE-乙醇溶液逐滴滴入该复合蛋白溶液中，放置40-50℃的摇床震荡20-28h后将该溶液40-50℃减压蒸馏，得到粘稠水溶液50ml，加入0.1-0.2gVC、0.002-0.003g黄酮、0.16-0.17g超氧化物歧化酶，加入酚酸调节pH至6.2~6.3，然后进行冷冻干燥，得到VE、VC客体包结物；
步骤（3）配制抗氧化水凝胶：将步骤（2）中的VE、VC客体包结物0.012-0.013g溶于100ml质量分数0.5%的脱乙酰壳多糖水溶液中，将氧化再生纤维按0.0205g/ml加入到脱乙酰壳多糖水溶液中，酚酸调节pH值为6.2~6.3，得到原位凝胶，然后用体积分数为50%的异丙醇水溶液洗涤凝胶4~5次，再用纯的异丙醇冲洗2~3次，得到一种可注射仿生抗氧化水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种可注射仿生抗氧化水凝胶，其特征在于：步骤（1）旋转蒸发的温度是40-50度，时间为20-28小时。
3.根据权利要求1所述的一种可注射仿生抗氧化水凝胶，其特征在于：步骤（1）所述透析的时间为24-48小时，透析袋的截留分子量为14000，容量6.4ml/cm。
4.根据权利要求1所述的一种可注射仿生抗氧化水凝胶，其特征在于： 步骤1所述冷冻干燥的温度为-35℃-60℃。
5.根据权利要求1所述的一种可注射仿生抗氧化水凝胶，其特征在于： 步骤2所述冷冻干燥的温度为-25℃-55℃。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，其特征在于：上述可注射仿生抗氧化水凝胶采用注射的方法进行使用。
7.根据权利要求6所述的一种可注射仿生抗氧化水凝胶的使用方法，其特征在于：将仿生抗氧化水凝胶置于1ml的注射器内，采用5~25kGy钴射线进行辐照灭菌，使用时注射到受损部位。
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