BR112019022698A2

BR112019022698A2 - formulações estáveis de anticorpos anti-tigit isolados e em combinação com anticorpos do receptor de morte programada 1 (pd-1) e métodos de uso das mesmas

Info

Publication number: BR112019022698A2
Application number: BR112019022698A
Authority: BR
Inventors: De Arnab; Nachu Narasimhan Chakravarthy
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2018-05-01
Publication date: 2020-05-19
Also published as: US20200354453A1; AU2018261080A1; CL2019003145A1; SG10202111905PA; JP2020518600A; IL270175B2; IL270175B1; JP7402693B2; CA3061050A1; MX2019013033A; EP3618855A4; IL270175A; EP3618855A1; SG11201909941QA; WO2018204405A1; US20240182573A1; JP2024016177A; KR20190142394A; RU2019138519A3; RU2019138519A

Abstract

a presente invenção se refere a formulações estáveis de anticorpos contra imunorreceptor de célula t com domínios ig e itim (tigit), opcionalmente contendo ainda um anticorpo anti-receptor de morte programada 1 (pd-1) humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. também são fornecidos métodos de tratamento de vários cânceres e infecções crônicas com as formulações da invenção.

Description

FORMULAÇÃO DE ANTICORPOS TERAPÊUTICOS E USO DA MESMA

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere a formulações de anticorpos terapêuticos e seu uso no tratamento de vários transtornos. Em um aspecto, a invenção se refere a formulações que compreendem anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam a imunorreceptor de célula T com domínios Ig e ITIM (TIGIT). Em um outro aspecto, tal formulação compreende ainda um anticorpo anti-receptor de morte programada (PD-1) humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Também são fornecidos métodos de tratamento de vários cânceres e infecções crônicas com as formulações da invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica o benefício de U.S.S.N 62/500.278, depositado em 2 de maio de 2017, cujo conteúdo do mesmo está incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[003] A listagem de sequências do presente pedido é submetida eletronicamente por meio da EFS-Web como uma listagem de sequências formatada ASCII com o nome de arquivo 24453WOPCT-SEQTXT01MAY2018.TXT, data de criação de 1 de maio de 2018, e um tamanho de 227 Kb. Esta listagem de sequências submetida por meio da EFS-Web é parte do relatório descritivo e está no presente documento incorporada a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Os fármacos de anticorpos para uso em humanos podem diferir um pouco na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes, ou em suas sequências estruturais dentro dos domínios variáveis, mas eles diferem tipicamente de modo mais drástico nas sequências de CDR. Até os anticorpos

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2/145 que se ligam à mesma proteína, ao mesmo polipeptídeo ou até mesmo potencialmente ao mesmo epítopo podem compreender sequências de CDR totalmente diferente. Os anticorpos terapêuticos para uso em seres humanos também podem ser obtidos de sequência de anticorpos da linha germinativa humana ou de sequências de anticorpo da linha germinativa não humana (por exemplo, roedores), como em anticorpos humanizados, levando ainda a uma maior diversidade nas sequências de CDR potenciais. Essas diferenças de sequências resultam em diferentes estabilidades na solução e diferentes capacidades de resposta a parâmetros de solução. Além disso, pequenas mudanças na disposição de aminoácidos ou mudanças em um ou em poucos resíduos de aminoácidos podem resultar em estabilidade de anticorpo drasticamente diferente e suscetibilidade a trajetórias de degradação específicas da sequência. Como consequência, não é possível atualmente prever as condições de solução necessárias para otimizar a estabilidade de anticorpos. Cada anticorpo deve ser estudado individualmente para determinar a formulação de solução ótima. Bhambhani et al. (2012) J. Pharm. Sei.101:1120.

[005] Os anticorpos também são proteínas de peso molecular relativamente alto (~150.000 Da), por exemplo, em comparação com outras proteínas terapêuticas como hormônios e citocinas. Como consequência, é frequentemente necessário dosar com quantidades de peso relativamente alto de fármacos de anticorpo para alcançar as concentrações molares desejadas de fármaco. Além disso, é muitas vezes desejável administrar subeutaneamente os fármacos de anticorpo, visto que isso permite a autoadministração. A autoadministração evita o tempo e as despesas associados a visitas a instalações médicas para administração, por exemplo, por via intravenosa. A liberação subeutânea é limitada pelo volume de solução que pode ser praticamente entregue no local da injeção em uma única injeção, que geralmente é de cerca

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3/145 de 1 a 1,5 mL. A autoadministração subcutânea é tipicamente realizada usando uma seringa pré-cheia ou autoinjetor preenchido com uma formulação de solução líquida do fármaco, em vez de uma forma liofilizada, para evitar a necessidade de o paciente suspender novamente o fármaco antes da injeção. Os fármacos de anticorpos devem ser estáveis durante o armazenamento para garantir eficácia e dosagem consistente, por isso, é fundamental, que qualquer formulação escolhida suporte propriedades desejáveis, como alta concentração, clareza e viscosidade aceitável, e que também mantenha essas propriedades e eficácia do fármaco em uma vida em prateleira aceitavelmente longa sob condições típicas de armazenamento.

[006] TIGIT (imunorreceptor de célula T com domínios Ig e ITIM) é um receptor imunomodulador expresso principalmente em células T e células NK ativadas. TIGIT é também conhecido como VSIG9; VSTM3; e WUCAM. Sua estrutura mostra um domínio de imunoglobulina extracelular, uma região de transmembrana tipo 1 e dois motivos ITIM. TIGIT forma parte de uma rede coestimulante que consiste em receptores imunomoduladores positivos (CD226) e negativos (TIGIT) em células T e ligantes expressos em APCs (CD155 e CD112).

[007] Uma característica importante na estrutura de TIGIT é a presença de um motivo de inibição à base de imunorreceptor tirosina (ITIM) em seu domínio de cauda citoplasmática. Assim como com PD-1 e TIGIT, o domínio ITIM na região citoplasmática deTIGITestá previsto para recrutar tirosina fosfatases, como SHP1 e SHP-2, e a subsequente desfosforilação de resíduos de tirosina nos motivos de ativação à base de imunorreceptor tirosina (ITAM) em subunidades do receptor de células T (TCR). Consequentemente, a ligação de TIGIT por ligantes de receptor CD155 e CD112 expressos por células tumorais ou TAMS pode contribuir para a supressão de sinalização de TCR e ativação de células T, o que é essencial para a montagem da imunidade antitumoral eficaz. Desse modo, um

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4/145 anticorpo antagonista específico para TIGIT poderia inibir a supressão induzida por CD155 e CD112 de respostas de células T e melhorar a imunidade antitumoral.

[008] Existe a necessidade de formulações estáveis de anticorpos anti-TIGIT para uso farmacêutico, por exemplo, para tratar vários cânceres e doenças infecciosas, bem como de formulações estáveis de anticorpos anti-TIGIT coformulados com anticorpos anti-PD-1 humana. De preferência, essas formulações irão exibir uma vida em prateleira longa, serão estáveis quando armazenadas e transportadas e, de preferência, irão exibir estabilidade ao longo de meses a anos sob condições típicas para armazenamento de fármacos para autoadministração, isto é, em temperatura de geladeira em uma seringa, resultando em uma longa vida em prateleira para o produto de fármaco correspondente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Em um aspecto, a invenção inclui uma formulação de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) um tampão, (iii) um açúcar não redutor; (iv) um tensoativo não iônico; e (v) um antioxidante. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma outra modalidade, a formulação compreende um quelante.

[010] Em uma modalidade da invenção, a formulação compreende (i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão; (iii) cerca de 6% a cerca de 8% em peso/volume (p/v) de açúcar não redutor; (iv) cerca de 0,01% a cerca de 0,10% (p/v) de tensoativo não iônico; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante. Em uma modalidade, a formulação

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5/145 compreende ainda um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, a formulação tem um pH entre 4,5 a 6,5. Em modalidades particulares, o pH da formulação é de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,2. Em uma modalidade adicional, o pH da formulação é de cerca de pH 5,6 a cerca de pH 6,0. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 5,7. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 5,8. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 5,9. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 6,0. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 6,1. Em uma outra modalidade, o pH da formulação é cerca de 6,2.

[011] Em uma modalidade da formulação, o tampão é tampão de L-histidina ou acetato de sódio, o açúcar não redutor é sacarose, o tensoativo não iônico é polissorbato 80, e o antioxidante é metionina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade, o antioxidante é L-metionina. Em uma outra modalidade, o antioxidante é um sal farmaceuticamente aceitável de Lmetionina, como, por exemplo, HCI de metionina.

[012] Em uma outra modalidade, a formulação compreende (i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão de L-histidina ou cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão de acetato de sódio; (iii) cerca de 6% a cerca de 8% em p/v de sacarose; (iv) cerca de 0,01% a cerca de 0,10% (p/v) de polissorbato 80; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina. Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PD-1, por exemplo, pembrolizumabe ou nivolumabe. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma outra modalidade, o

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6/145 quelante é EDTA. Em uma modalidade, o tampão é tampão de L-histidina. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão de L-histidina. Em uma outra modalidade, a formulação compreende cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina. Em uma modalidade adicional, a formulação compreende polissorbato 80 em uma razão de peso de aproximadamente 0,02% (p/v). Em uma modalidade, a formulação anti-TIGIT compreende sacarose em uma razão de peso de cerca de 7% (p/v). Em qualquer uma dessas modalidades, a metionina é L-metionina.

[013] Em modalidades da formulação, a concentração do anticorpo antiTIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL, 12.5 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL ou 100 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 20 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 25 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 50 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 75 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 100 mg/mL.

[014] Em um aspecto, é fornecida uma formulação que compreende cerca de 20 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[015] Em um aspecto, é fornecida uma formulação que compreende cerca

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7/145 de 25 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[016] Em um aspecto, é fornecida uma formulação que compreende cerca de 50 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[017] Em um aspecto, é fornecida uma formulação que compreende cerca de 75 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[018] Em um aspecto, é fornecida uma formulação que compreende cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80, e cerca de 10 mM de L-metionina.

[019] Em um aspecto de qualquer uma das formulações acima, a formulação tem um pH de cerca de 5,4 a cerca de 6,2. Em um outro aspecto, a formulação tem um pH de cerca de 5,5 a 6,2. Em uma outra modalidade, a formulação tem um pH de cerca de 5,8 a 6,1. Em uma outra modalidade, o pH é cerca de 5,8. Em uma modalidade, o pH é 5,9. Em uma outra modalidade, o pH é 6,0. Em uma modalidade adicional, o pH é 6,1.

[020] Em um aspecto de qualquer uma das formulações acima, a formulação compreende um anticorpo anti-PDl ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PDl é pembrolizumabe. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-PDl é nivolumabe.

[021] Em um outro aspecto, a formulação pode compreender ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade, o

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8/145 quelante é EDTA. Em um aspecto, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 20 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 25 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 30 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 35 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 40 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 45 μΜ do quelante. Em uma modalidade, formulação compreende cerca de 50 μΜ do quelante. Em uma modalidade, o agente quelante é DTPA, que está presente em qualquer uma das quantidades estabelecidas acima. Em uma outra modalidade, o agente quelante é EDTA que está presente em qualquer uma das quantidades estabelecidas acima.

[022] Em uma modalidade, a formulação está contida em um frasco de vidro. Em uma outra modalidade, a formulação está contida em um dispositivo de injeção. Em uma outra modalidade, a formulação é uma formulação líquida. Em um aspecto, a formulação é congelada a pelo menos abaixo de -70°C. Em uma outra modalidade, a formulação é uma solução reconstituída de uma formulação liofilizada.

[023] Em certas modalidades, a formulação é estável em temperatura refrigerada (2 a 8°C) por pelo menos 3 meses, de preferência 6 meses, e com mais preferência 1 ano, e com ainda mais preferência até por 2 anos. Em uma modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a % do monômero do anticorpo anti-TIGIT é > 90% como determinado pela cromatografia de exclusão de tamanho. Em uma outra modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a %

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9/145 do monômero do anticorpo anti-TIGIT é > 95% como determinado pela cromatografia de exclusão de tamanho. Em uma outra modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a % da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-TIGIT é > 90% como determinado por CE-SDS redutor. Em uma outra modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a % da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-TIGIT é > 95% como determinado por CE-SDS redutor. Em uma outra modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a % de IgG intacta do anticorpo anti-TIGIT é > 90% como determinado por CE-SDS não redutor. Em uma outra modalidade da formulação, após 12 meses a 5°C, a % de IgG intacta do anticorpo anti-TIGIT é > 95% como determinado por CE-SDS não redutor.

[024] Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 111 ou variante da mesma, CDRL2 de SEQ ID NO: 112 ou variante da mesma, CDRL3 de SEQ ID NO: 113 ou variante da mesma e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 108 ou variante da mesma, CDRH2 de SEQ ID NO: 154 ou variante da mesma, e CDHR3 de SEQ ID NO: 110 ou variante da mesma. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 111, CDRL2 de SEQ ID NO: 112, CDRL3 de SEQ ID NO: 113 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 108, CDRH2 de SEQ ID NO: 154 e CDHR3 de SEQ ID NO: 110. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que

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10/145 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 ou variante da mesma e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152 ou variante da mesma. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152. Em um aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:291 ou variante da mesma e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 ou variante da mesma. Em um aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:291 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de lgG4 humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:292 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de lgG4 humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:292 ou variante da mesma e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 ou variante da mesma.

[025] Em um aspecto, a invenção fornece uma coformulação de um

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11/145 anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humana, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, (ii) um tampão, (iii) um açúcar não redutor; (iv) um tensoativo não iônico; e (v) um antioxidante. Em uma modalidade, a coformulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante é EDTA. Em uma outra modalidade, o quelante é DTPA. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 1:2. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 1:1. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 2:1.

[026] Em uma modalidade da invenção, a coformulação compreende (i) cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-PD-1 humana; (iii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão; (iv) cerca de 6% a cerca de 8% em peso/volume (p/v) de açúcar não redutor; (v) cerca de 0,01 % a cerca de 0,10% (p/v) de tensoativo não iônico; e (vi) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante. Em uma modalidade, a coformulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma outra modalidade, o quelante é EDTA. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 1:2. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 1:1. Em uma modalidade da coformulação, a razão entre o anticorpo anti-PD-1 humana e o anticorpo anti-TIGIT é 2:1. Em uma modalidade, a coformulação tem um pH

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12/145 entre 4,5 a 6,5. Em modalidades particulares, o pH da formulação é de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,2. Em uma modalidade adicional, o pH da formulação é de cerca de pH 5,8 a 6,0.

[027] Em uma modalidade da coformulação, o tampão é tampão de Lhistidina ou tampão de acetato de sódio, o açúcar não redutor é sacarose, o tensoativo não iônico é polissorbato 80, e o antioxidante é L-metionina. Em uma outra modalidade, a coformulação compreende (i) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (ii) cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; (iii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de L-histidina ou cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão de acetato de sódio; (iv) cerca de 6% a cerca de 8% em p/v de sacarose; (v) cerca de 0,01% a cerca de 0,10% (p/v) de polissorbato 80; e (vi) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina. Em uma modalidade, a coformulação compreende opcionalmente um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é DTPA. Em uma outra modalidade, o quelante é EDTA. Em uma modalidade da coformulação, o tampão é tampão de L-histidina. Em uma modalidade, a coformulação compreende cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão de L-histidina. Em uma outra modalidade, a coformulação compreende cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina. Em uma modalidade adicional, a coformulação compreende polissorbato 80 em uma razão de peso de aproximadamente 0,02% em p/v. Em uma modalidade, a coformulação compreende sacarose em uma razão de peso de cerca de 7% (p/v).

[028] Em modalidades da coformulação, a concentração do anticorpo antiTIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é de cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em modalidades da coformulação, a concentração do

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13/145 anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 12,5 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 20 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 25 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 50 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de 75 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é cerca de ou 100 mg/mL.

[029] Em algumas modalidades da coformulação, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humana é de cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma modalidade da coformulação, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humana é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humana é 20 mg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração do anticorpo anti-PD-1 humana é 25 mg/mL.

[030] Em uma modalidade, a coformulação compreende cerca de 20 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 20 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[031] Em uma modalidade, a coformulação compreende cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10

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14/145 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[032] Em uma modalidade, a coformuIação compreende cerca de 50 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 50 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% em p/v de sacarose, cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.

[033] Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 111 ou variante da mesma, CDRL2 de SEQ ID NO: 112 ou variante da mesma, CDRL3 de SEQ ID NO: 113 ou variante da mesma e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 108 ou variante da mesma, CDRH2 de SEQ ID NO: 154 ou variante da mesma, e CDHR3 de SEQ ID NO: 110 ou variante da mesma. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 111, CDRL2 de SEQ ID NO: 112, CDRL3 de SEQ ID NO: 113 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 108, CDRH2 de SEQ ID NO: 154, e CDHR3 de SEQ ID NO: 110. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 ou variante da mesma e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152 ou variante da mesma. Em um outro aspecto, a formulação compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende

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SEQ ID NO: 148 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152. Em um aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:291 ou variante da mesma e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 ou variante da mesma. Em um aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:291 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de lgG4 humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:292 ou variante da mesma e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 ou variante da mesma. Em um outro aspecto, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de lgG4 humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:292 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293.

[034] Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 1 ou variante da mesma, CDRL2 de SEQ ID NO:2 ou variante da mesma, CDRL3 de SEQ ID NO:3 ou variante da mesma e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 6 ou

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16/145 variante da mesma, CDRH2 de SEQ ID NO: 1 ou variante da mesma e CDHR3 de SEQ ID NO: 8 ou variante da mesma. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 1, CDRL2 de SEQ ID NO:2, CDRL3 de SEQ ID NO:3 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 6, CDRH2 de SEQ ID NO: 7 e CDHR3 de SEQ ID NO: 8. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 4 ou variante da mesma e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 9 ou variante da mesma. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 9. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 10. Em um outro aspecto, as formulações compreendem um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 5 ou variante da mesma e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 10 ou variante da mesma. Em um aspecto de qualquer uma das formulações descritas acima, o anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é pembrolizumabe. Em um outro aspecto, o anticorpo antiPD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é nivolumabe.

[035] Em um aspecto de qualquer uma das coformulações descritas acima,

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17/145 a formulação compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 111, CDRL2 de SEQ ID NO:112, CDRL3 de SEQ ID NO:113 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 108, CDRH2 de SEQ ID NO: 154 e CDHR3 de SEQ ID NO: 110 e (ii) um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada, em que as CDRs de cadeia leve compreendem CDRL1 de SEQ ID NO: 1, CDRL2 de SEQ ID NO:2, CDRL3 de SEQ ID NO:3 e as CDRs de cadeia pesada compreendem CDRH1 de SEQ ID NO: 6, CDRH2 de SEQ ID NO: 7 e CDHR3 de SEQ ID NO: 8.

[036] Em um aspecto de qualquer uma das coformulações acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152 e (ii) um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 9.

[037] Em um outro aspecto de qualquer uma das coformulações acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e que compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152 e que compreende ainda um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 e (ii)

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18/145 um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 10.

[038] Em um outro aspecto de qualquer uma das coformulações acima, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e que compreende ainda um domínio constante de cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152 e que compreende ainda um domínio constante de cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:293 e (ii) um anticorpo anti-PDl humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende uma cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 10.

[039] Em uma modalidade de qualquer uma das formulações descritas acima, a formulação está contida em um frasco de vidro. Em uma outra modalidade, a formulação está contida em um dispositivo de injeção. Em uma outra modalidade, a formulação é uma formulação líquida. Em um aspecto, a formulação é congelada a pelo menos abaixo de -70°C. Em uma outra modalidade, a formulação é uma solução reconstituída de uma formulação liofilizada.

[040] A presente invenção fornece um método de tratamento de infecção crônica ou câncer em um indivíduo mamífero (por exemplo, um humano) em necessidade do mesmo que compreende: administrar uma quantidade eficaz da formulação de anti-TIGIT ou da coformulação apresentada na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[041] A Figura 1 mostra a estabilidade do pH das formulações ao longo de 9

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19/145 meses em várias condições de armazenamento.

[042] A Figura 2 mostra a estabilidade de concentração de polissorbato 80 das formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[043] A Figura 3 mostra a potência por dados de estabilidade de ELISA para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[044] A Figura 4 mostra o monômero (%) por dados de estabilidade de UPSEC para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[045] A Figura 5 mostra as espécies (%) de alto peso molecular (HMW) por dados de estabilidade de UP-SEC para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[046] A Figura 6 mostra as espécies (%) de baixo peso molecular (LMW) por dados de estabilidade de UP-SEC para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[047] A Figura 7 mostra a pureza de cadeia pesada + cadeia leve (%) por dados de estabilidade de CE-SDS redutor para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

[048] A Figura 8 mostra a pureza de IgG intacta (%) por dados de estabilidade de CE-SDS não redutor para as formulações ao longo de 9 meses em várias condições de armazenamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[049] Em um aspecto, a invenção fornece formulações que compreendem anticorpos anti-TIGIT e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que compreendem metionina. Também são fornecidas coformulações de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende metionina. Em cada caso, a formulação e coformulação

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20/145 compreendem opcionalmente um agente quelante.

I. Definições e Abreviaturas

[050] Como usado em todo o relatório descritivo e reivindicações anexas, as abreviaturas a seguir se aplicam:

API ingrediente farmacêutico ativo

CDR região determinante de complementaridade nas regiões variáveis de imunoglobulina, definida usando o sistema de numeração Kabat, exceto se indicado o contrário

CHO ovário de hamster chinês

Cl intervalo de confiança

DTPA ácido dietilenotriaminopentacético

EC50 concentração resultando em 50% de eficácia ou ligação

ELISA ensaio de imunoabsorção enzimática

FFPE fixado em formalina, embebido em parafina

FR região de estrutura

HRP peroxidase de rábano silvestre

HNSCC carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço

IC50 concentração resultando em 50% de inibição

IgG imunoglobulina G

IHC imuno-histoquímica ou imuno-histoquímico mAb anticorpo monoclonal

MES ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico

NCBI Centro Nacional para Informações de Biotecnologia

NSCLC câncer pulmonar de células não pequenas

PCR reação em cadeia da polimerase

PD-1 morte programada 1 (mais conhecido como receptor de morte celular programada 1 e receptor de morte programada 1)

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PD-L1 ligante 1 de morte celular programada 1

PD-L2 ligante 2 de morte celular programada 1

PS80 polissorbato 80

TNBC câncer de mama triplo-negativo

Vh região variável de cadeia pesada de imunoglobulina

VK região variável de cadeia leve kappa de imunoglobulina

Vl região variável de cadeia leve de imunoglobulina v/v volume por volume

WFI água para injeção p/v peso por volume

[051] Para que a invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. Exceto se definido especificamente em outro lugar neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado comumente entendido por um indivíduo versado na técnica ao qual esta invenção pertence.

[052] Como usado em todo o relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma e o/a incluem a referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[053] A referência a ou indica uma ou duas possibilidades, a menos que o contexto dite claramente uma das possibilidades indicadas. Em alguns casos, e/ou foi empregado para destacar ambas as possibilidades.

[054] Tratar ou tratamento de um câncer como usado na presente invenção significa administrar uma formulação da invenção a um indivíduo que tem uma condição imune ou condição cancerosa, ou diagnosticado com um câncer ou infecção patogênica (por exemplo, viral, bacteriana, fúngica), para alcançar pelo menos um efeito terapêutico positivo, como, por exemplo, número

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22/145 reduzido de células cancerígenas, tamanho reduzido do tumor, taxa reduzida de infiltração de células cancerígenas nos órgãos periféricos ou taxa reduzida de metástase ou crescimento tumoral. Tratamento pode incluir um ou mais dos seguintes: induzir/aumentar uma resposta imunológica antitumoral, estimular uma resposta imunológica a um patógeno, toxina e/ou autoantígeno, estimular uma resposta imunológica a uma infecção viral, diminuir o número de um ou mais marcadores tumorais, inibir o crescimento ou sobrevivência de células tumorais, eliminar ou reduzir o tamanho de uma ou mais lesões ou tumores cancerígenos, diminuir o nível de um ou mais marcadores tumorais, melhorar, reduzir a gravidade ou duração de câncer, prolongar a sobrevivência de um paciente em relação à sobrevida esperada em um paciente não tratado semelhante.

[055] Condição imunológica ou transtorno imunológico abrange, por exemplo, inflamação patológica, um transtorno inflamatório e um transtorno ou doença autoimune. Condição imunológica também se refere a infecções, infecções persistentes e condições proliferativas, como câncer, tumores, e angiogênese, incluindo infecções, tumores e cânceres que resistem à erradicação pelo sistema imunológico. Condição cancerosa inclui, por exemplo, câncer, células cancerígenas, tumores, angiogênese e condições pré-cancerosas como displasia.

[056] Os efeitos terapêuticos positivos em câncer devem ser medidos de vários modos (Consulte, W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:15 a 105 (2009)). Por exemplo, em relação à inibição de crescimento tumoral, de acordo com os padrões NCI, um T/C = 42% é o nível mínimo de atividade antitumoral. Um T/C < 10% é considerado um nível de atividade antitumoral alto, com T/C (%) = volume de tumor médio do volume do tumor tratado/médio do controle x 100. Em algumas modalidades, o tratamento alcançado por administração de uma

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23/145 formulação da invenção é qualquer sobrevivência livre de progressão (PFS), sobrevivência livre de doença (DFS) ou sobrevivência geral (OS). PFS, também referida como Tempo para Progressão do Tumor indica o período de tempo durante e após o tratamento que o câncer não cresce, e inclui a quantidade de tempo que os pacientes tiveram uma resposta completa ou parcial, bem como a quantidade de tempo que os pacientes experimentaram uma doença estável. DFS se refere ao período de tempo durante e após o tratamento em que o paciente permanece livre de doença. OS se refere a um prolongamento da expectativa de vida em comparação com indivíduos ou pacientes ingênuos ou não tratados. Embora uma modalidade das formulações, métodos de tratamento e usos da presente invenção possa não ser eficaz na obtenção de um efeito terapêutico positivo em todos os pacientes, isso deve ser feito em um número estatisticamente significativo de indivíduos como determinado por qualquer teste estatístico conhecido na art como o teste t de Student, o teste chi², o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste Kruskal-Wallis (teste Η), o teste Jonckheere-Terpstra e o teste Wilcoxon.

[057] O termo paciente (alternativamente chamado de indivíduo ou indivíduo na presente invenção) se refere a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, cachorro, gato, coelho) capaz de ser tratado com as formulações da invenção, com maior preferência um humano. Em algumas situações, o paciente é um paciente adulto. Em outras modalidades, o paciente é um paciente pediátrico.

[058] O termo anticorpo se refere a qualquer forma de anticorpo que exibe a atividade biológica desejada. Assim, é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente, mas não se limita a, anticorpos monoclonais (incluindo monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos e anticorpos quiméricos.

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Anticorpos parentais são anticorpos obtidos pela exposição de um sistema imunológico a um antígeno antes da modificação dos anticorpos para o uso pretendido, como a humanização de um anticorpo para uso como anticorpo terapêutico humano.

[059] Em geral, a unidade estrutural básica de anticorpos compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50 a 70 kDa). A porção aminoterminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação de anticorpo. Assim, em geral, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. A porção carboxi-terminal da cadeia pesada pode definir uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Tipicamente, cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. Adicionalmente, cadeias pesadas humanas são tipicamente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon, e definem o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variável e constante são unidas por uma região J de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região D de cerca de 10 mais aminoácidos. Consulte geralmente, Fundamental Immunology Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2- ed. Raven Press, N.Y. (1989).

[060] Tipicamente, os domínios variáveis de ambas as cadeias pesada e leve compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que estão localizadas dentro de regiões de estrutura relativamente conservada (FR). As CDRs são tipicamente alinhadas pelas regiões de estrutura, permitindo a ligação a um epítopo

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25/145 específico. No geral, do N-terminal ao C-terminal, ambos os domínios variáveis de cadeias leve e pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é, geralmente, de acordo com as definições de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5^ ed.; Publ. NIH n° 91 a 3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1 a 75; Kabat, etal., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609 a 6616; Chothia, etal., (1987) J Mol. Biol. 196:901 a 917 ou Chothia, et al., (1989) Nature 342:878 a 883.

[061] Um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína-alvo especificada é um anticorpo que exibe ligação preferencial a esse alvo em comparação com outras proteínas, mas essa especificidade não requer especificidade de ligação absoluta. Um anticorpo é considerado específico para o alvo pretendido se a sua ligação for determinante da presença da proteína-alvo em uma amostra, por exemplo, sem produzir resultados indesejados como falsos positivos. Os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos úteis na presente invenção se ligarão à proteína-alvo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, de preferência pelo menos dez vezes maior, com mais preferência pelo menos 20 vezes maior, e com máxima preferência pelo menos 100 vezes maior que a afinidade com proteínas não-alvo. Como usado na presente invenção, um anticorpo é dito que se liga especificamente a um polipeptídeo que compreende uma dada sequência de aminoácidos, por exemplo, a sequência de aminoácidos de um TIGIT humano maduro ou PD-1 humano, se ele se ligar a polipeptídeos que compreendem essa sequência, mas não se liga a proteínas que não possuem essa sequência.

[062] Anticorpo quimérico se refere a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em um anticorpo derivado de uma espécie particular (por

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26/145 exemplo, humana) ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em um anticorpo derivado de outra espécie (por exemplo, camundongo) ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[063] Coformulado ou coformulação como usado na presente invenção se refere a pelo menos dois diferentes anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que são formulados juntos e armazenados como um produto combinado em um único frasco ou recipiente (por exemplo, um dispositivo de injeção), em vez de serem formulados e armazenados individualmente e depois misturados antes da administração ou administrados separadamente. Em uma modalidade, a coformulação contém dois anticorpos diferentes ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.

[064] O termo quantidade farmaceuticamente eficaz ou quantidade eficaz significa uma quantidade através da qual uma composição ou formulação terapêutica suficiente é introduzida a um paciente para tratar a doença ou condição. Um elemento versado na técnica reconhece que esse nível pode variar de acordo com as características do paciente como idade, peso etc.

[065] O termo cerca de, quando modifica a quantidade (por exemplo, mM, ou M) de uma substância ou composição, a percentagem (v/v ou p/v) de um componente da formulação, o pH de uma solução/formulação ou o valor de um parâmetro que caracteriza uma etapa em um método ou semelhante se refere a uma variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através da medição típica, procedimentos de manuseamento e amostragem envolvidos na preparação, caracterização e/ou uso da substância ou composição; através de erro instrumental nesses procedimentos; através de diferenças na fabricação,

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27/145 fonte ou pureza dos ingredientes empregados para fazer ou usar as composições ou realizar os procedimentos; e similares. Em certas modalidades, cerca de pode significar uma variação de ± 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% ou 10%.

[066] Como usado na presente invenção, x% (p/v) é equivalente a x g/100 mL (por exemplo, 5% em p/v equivale 50 mg/mL).

[067] As formulações da presente invenção incluem anticorpos e fragmentos dos mesmos que são biologicamente ativos quando reconstituídos ou na forma líquida.

[068] Os termos câncer, cancerígeno ou maligno se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma e sarcoma. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem carcinoma de células escamosas, mieloma, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, glioma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer gastrointestinal (trato), câncer renal, câncer de ovário, câncer de fígado, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer renal, câncer de próstata, câncer de tireoide, melanoma, condrossarcoma, neuroblastoma, câncer de pâncreas, glioblastoma multiforme, câncer cervical, câncer de cérebro, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama , carcinoma do cólon e câncer de cabeça e pescoço.

[069] Chothia significa um sistema de numeração de anticorpos descrito em Al-Lazikani et al., JMB 273: 927 a 948 (1997).

[070] Kabat, como usado na presente invenção, significa um sistema de alinhamento e numeração de imunoglobulinas, pioneiro por Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^ Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.).

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[071] Um agente inibidor de crescimento, quando usado na presente invenção, se refere a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente da célula cancerosa que superexpressa qualquer um dos genes identificados na presente invenção, in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento é aquele que reduz significativamente a porcentagem de células que expressam esses genes na fase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), como agentes que induzem a parada G1 e a parada na fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem os vincanos (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores do topo II, como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina e etoposídeo. Os agentes que pausam G1 também se espalham para a parada na fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, como dacarbazina, mecloretamina e cisplatina. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995).

[072] Os termos fragmento de ligação do TIGIT, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fragmento de ligação do mesmo ou fragmento do mesmo abrangem um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda retém substancialmente sua atividade biológica de ligação ao antígeno (TIGIT humano) e inibe sua atividade (por exemplo, bloquear a ligação doTIGIT humano aos seus ligantes nativos). Portanto, o termo fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação a TIGIT se refere a uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a ligação ao antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo TIGIT incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Tipicamente, um fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 10% de sua atividade inibidora de TIGIT. Em algumas modalidades, um

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29/145 fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (ou mais) de sua atividade inibitória TIGIT, embora qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado seja útil. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno se liga ao seu antígeno com uma afinidade pelo menos duas vezes maior, preferencialmente pelo menos dez vezes maior, mais preferencialmente pelo menos 20 vezes maior e mais preferencialmente pelo menos 100 vezes maior que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade superior a cerca de 10⁹ litros/mol, como determinado, por exemplo, por análise Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107: 220 a 239. Também se pretende que um fragmento de ligação a TIGIT possa incluir variantes com substituições de aminoácidos conservadoras que não alteram substancialmente a sua atividade biológica.

[073] Os termos fragmento de ligação a PD-1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fragmento de ligação do mesmo ou fragmento do mesmo abrangem um fragmento ou um derivado de um anticorpo que ainda retém substancialmente sua atividade biológica de ligação ao antígeno (PD-1 humano) e inibe sua atividade (por exemplo, bloqueando a ligação de PD-1 a PDL1 e PDL2). Portanto, o termo fragmento de anticorpo ou fragmento de ligação a PD-1 se refere a uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a ligação ao antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Tipicamente, um fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 10% de sua atividade inibidora de PD-1. Em algumas modalidades, um fragmento ou derivado de ligação retém pelo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (ou mais) de sua atividade inibidora de PD-1, embora seja útil qualquer fragmento de ligação com afinidade suficiente para exercer o efeito biológico

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30/145 desejado. Em algumas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno se liga ao seu antígeno com uma afinidade pelo menos duas vezes maior, preferencialmente pelo menos dez vezes maior, mais preferencialmente pelo menos 20 vezes maior e mais preferencialmente pelo menos 100 vezes maior que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade superior a cerca de 10⁹ litros/mol, como determinado, por exemplo, por análise Scatchard. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem 107: 220 a 239. Também se pretende que um fragmento de ligação a PD-1 possa incluir variantes com substituições de aminoácidos conservadoras que não alteram substancialmente sua atividade biológica.

[074] Anticorpo humano se refere a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteínas da imunoglobulina humana. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carboidratos murinos se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Da mesma forma, anticorpo de camundongo ou anticorpo de rato se refere a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulinas de camundongo ou rato, respectivamente.

[075] Anticorpo humanizado se refere a formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), bem como anticorpos humanos. Tais anticorpos contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos do pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de

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31/145 imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. As formas humanizadas de anticorpos de roedores geralmente compreendem as mesmas sequências CDR dos anticorpos parentais de roedores, embora certas substituições de aminoácidos possam ser incluídas para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado ou por outras razões.

[076] Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para fornecer funções efetoras alteradas. Consulte, por exemplo, Patentes n^os 5.624.821; W02003/086310; W02005/120571; W02006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58: 640-656. Essa modificação pode ser usada para melhorar ou suprimir várias reações do sistema imunológico, com possíveis efeitos benéficos no diagnóstico e na terapia. As alterações da região Fc incluem alterações de aminoácidos (substituições, deleções e inserções), glicosilação ou desglicosilação e adição de Fc múltiplo. As alterações no Fc também podem alterar a meia-vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos, e uma meia-vida mais longa resultaria em doses menos frequentes, com a concomitante maior conveniência e menor uso de material. Consulte, Presta (2005)7. Allergy Clin. Immunol. 116: 731 em 734-35.

[077] Anticorpo totalmente humano se refere a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteínas da imunoglobulina humana. Um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de carboidratos murinas se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Da mesma forma, anticorpo de camundongo se refere a um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de camundongo. Um anticorpo totalmente humano pode ser gerado em um ser humano, em um animal transgênico com sequências de linha germinativa de imunoglobulina humana, por exibição de fagos ou outros métodos biológicos moleculares.

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[078] Região hipervariável se refere aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade ou CDR (por exemplo, resíduos 24 a 34 (CDRL1), 50 a 56 (CDRL2) e 89 a 97 (CDRL3) no domínio variável da cadeia leve e resíduos 31 a 35 (CDRH1), 50 a 65 (CDRH2) e 95 a 102 (CDRH3) no domínio variável da cadeia pesada, como medido pelo sistema de numeração Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^ Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de um laço hipervariável (isto é, resíduos 26 a 32 (Ll), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26 a 32 (Hl), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada (Chothia e Lesk (1987) J. Mol.Biol. 196: 901 a 917). Como usado na presente invenção, o termo resíduos de estrutura ou FR se refere aos resíduos de domínio variável que não sejam os resíduos da região hipervariável na presente invenção definidos como resíduos de CDR. Os resíduos de CDR e FR são determinados de acordo com a definição de sequência padrão de Kabat. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^ Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

[079] Variantes conservativamente modificadas ou substituição conservadora se refere a substituições de aminoácidos conhecidas dos elementos versados nesta técnica e podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade biológica da molécula resultante, mesmo em regiões essenciais do polipeptídeo. Tais substituições exemplificadoras são preferencialmente feitas de acordo com aquelas estabelecidas na Tabela 1 da seguinte maneira:

Tabela 1. Substituições de Aminoácidos Conservadoras Exemplificadoras

Resíduo original	Substituição conservadora
Ala (A)	Gly; Ser

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Arg (R)	Lys; His
Asn (N)	Gin; His
Asp (D)	Glu; Asn
Cys(C)	Ser; Ala
Gin (Q)	Asn
Glu (E)	Asp; Gin
Gly (G)	Ala
His (H)	Asn; Gin
lie (1)	Leu; Vai
Leu (L)	He; Vai
Lys (K)	Arg; His
Met (M)	Leu; He; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe
Vai (V)	He; Leu

[080] Além disso, os elementos versados nesta técnica reconhecem que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica. Consulte, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224 (4^ Edição).

[081] A frase consiste essencialmente em ou variações como consistir essencialmente em ou consistindo essencialmente em, como usada em todo o relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de quaisquer elementos

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34/145 ou grupos de elementos recitados e a inclusão opcional de outros elementos de natureza semelhante ou diferente dos elementos citados, que não alteram materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem, método ou composição especificado. Como um exemplo não limitativo, um composto de ligação que consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos recitada também pode incluir um ou mais aminoácidos, incluindo substituições de um ou mais resíduos de aminoácidos, que não afetam materialmente as propriedades do composto de ligação.

[082] Compreender ou variações como compreendem, compreende ou compreendido de são usadas em todo o relatório descritivo e reivindicações em um sentido inclusivo, ou seja, para especificar a presença dos recursos declarados, mas não para impedir a presença ou adição de características adicionais que podem melhorar materialmente a operação ou utilidade de qualquer uma das modalidades da invenção, a menos que o contexto exija de outra forma devido à linguagem expressa ou implicação necessária.

[083] Anticorpo isolado e fragmento de anticorpo isolado referem-se à situação de purificação e, nesse contexto, significa que a molécula nomeada está substancialmente livre de outras moléculas biológicas, como ácidos nucleicos, proteínas, lipídios, carboidratos ou outros materiais, como detritos celulares e meios de crescimento. Geralmente, o termo isolado não pretende se referir a uma ausência completa desse material ou a uma ausência de água, tampões ou sais, a menos que estejam presentes em quantidades que interfiram substancialmente no uso experimental ou terapêutico do composto de ligação como descrito na presente invenção.

[084] Anticorpo monoclonal ou mAb ou Mab, como usado na presente invenção, se refere a uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, as moléculas de anticorpo que compõem a população são

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35/145 idênticas na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Em contrapartida, as preparações convencionais de anticorpos (policlonais) incluem tipicamente uma infinidade de anticorpos diferentes com sequências de aminoácidos diferentes em seus domínios variáveis, particularmente suas CDRs, que geralmente são específicas para diferentes epítopos. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (consulte, por exemplo, Patente n° US 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos fágicos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352: 624 a 628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581 a 597, por exemplo. Consulte também Presta (2005j J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731.

[085] Tumor, como se aplica a um indivíduo diagnosticado ou com suspeita de câncer, se refere a uma neoplasia maligna ou potencialmente maligna ou massa de tecido de qualquer tamanho e inclui tumores primários e neoplasias secundárias. Um tumor sólido é um crescimento ou massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados para o tipo de células que os formam. Exemplos de tumores sólidos são sarcomas, carcinomas e linfomas. As leucemias (câncer do sangue) geralmente não formam tumores sólidos (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

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[086] O termo tamanho do tumor se refere ao tamanho total do tumor que pode ser medido como o comprimento e a largura de um tumor. O tamanho do tumor pode ser determinado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, medindo as dimensões do tumor (ou tumores) após a remoção do indivíduo, por exemplo, usando pinças ou enquanto estiver no corpo usando técnicas de imagem, por exemplo, varredura óssea, ultrassonografia, tomografia computadorizada ou ressonância magnética.

[087] Regiões variáveis ou região V, como usado na presente invenção, significa o segmento de cadeias de IgG que é variável em sequência entre diferentes anticorpos. Estende-se ao resíduo Kabat 109 na cadeia leve e 113 na cadeia pesada.

[088] O termo tampão abrange os agentes que mantêm o pH da solução das formulações da invenção em uma faixa aceitável ou, para formulações liofilizadas da invenção, fornecem um pH da solução aceitável antes da liofilização.

[089] Os termos liofilização, liofilizado e seco por congelamento referem-se a um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e, em seguida, o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em um ambiente de vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações préliofilizadas para aumentar a estabilidade do produto liofilizado no armazenamento.

[090] O termo formulação farmacêutica se refere a preparações que estão na forma de permitir que os ingredientes ativos sejam eficazes e que não contêm componentes adicionais que sejam tóxicos para os indivíduos aos quais a formulação seria administrada. O termo formulação e formulação farmacêutica são usados de forma intercambiável.

[091] Farmaceuticamente aceitável se refere a excipientes (veículos,

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37/145 aditivos) e composições que podem ser administradas razoavelmente a um indivíduo para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado e que são geralmente considerados seguros, por exemplo, fisiologicamente toleráveis e tipicamente não produzem uma reação desagradável alérgica ou semelhante, como transtornos gástricos e similares, quando administrados a um ser humano. Em uma outra modalidade, esse termo se refere a entidades e composições moleculares aprovadas por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listada na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.

[092] Uma formulação reconstituída é aquela que foi preparada dissolvendo-se uma formulação de proteína liofilizada em um diluente, de modo que a proteína seja dispersa na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração, por exemplo, administração parentérica) e pode opcionalmente ser adequada para administração subcutânea.

[093] Tempo de reconstituição é o tempo necessário para reidratar uma formulação liofilizada com uma solução para uma solução clarificada sem partículas.

[094] Uma formulação estável é aquela em que a proteína na mesma retém essencialmente sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica no armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteínas estão disponíveis na técnica e são revisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247 a 301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, NY, Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.10: 29 a 90 (1993). A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Por exemplo, em uma modalidade, uma formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas a uma

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38/145 temperatura refrigerada (2 a 8°C) por pelo menos 12 meses. Em uma outra modalidade, uma formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas a uma temperatura refrigerada (2 a 8°C) por pelo menos 18 meses. Em uma outra modalidade, a formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas à temperatura ambiente (23 a 27°C) por pelo menos 3 meses. Em uma outra modalidade, a formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas à temperatura ambiente (23 a 27°C) por pelo menos 6 meses. Em uma outra modalidade, a formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas à temperatura ambiente (23 a 27°C) por pelo menos 12 meses. Em uma outra modalidade, a formulação estável é uma formulação sem alterações significativas observadas à temperatura ambiente (23 a 27°C) por pelo menos 18 meses. Os critérios de estabilidade para uma formulação de anticorpo são os seguintes. Tipicamente, não mais do que 10%, preferencialmente 5%, de monômero de anticorpo é degradado como medido por SEC-HPLC. Tipicamente, a formulação é incolor ou transparente a levemente opalescente por análise visual. Tipicamente, a concentração, pH e osmolaridade da formulação não têm mais que +/-10% de mudança. A potência está tipicamente dentro de 60 a 140%, preferencialmente 80 a 120% do controle ou referência. Tipicamente, não é observado mais do que 10%, preferencialmente 5% do corte do anticorpo, isto é, % de espécies de baixo peso molecular, como determinado, por exemplo, por HP-SEC. Tipicamente, não é observado mais do que 10%, preferencialmente não mais do que 5% da agregação do anticorpo, ou seja, % de espécies de alto peso molecular, como determinado, por exemplo, por HP-SEC.

[095] Um anticorpo retém sua estabilidade física em uma formulação farmacêutica se não mostrar aumento significativo de agregação, precipitação e/ou desnaturação após exame visual de cor e/ou clareza, ou como medido por

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39/145 espalhamento de luz UV, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e dispersão dinâmica da luz. As alterações da conformação da proteína podem ser avaliadas por espectroscopia de fluorescência, que determina a estrutura terciária da proteína, e por espectroscopia FTIR, que determina a estrutura secundária da proteína.

[096] Um anticorpo retém sua estabilidade química em uma formulação farmacêutica se não mostrar alteração química significativa. A estabilidade química pode ser avaliada através da detecção e quantificação de formas quimicamente alteradas da proteína. Os processos de degradação que frequentemente alteram a estrutura química da proteína incluem hidrólise ou recorte (avaliado por métodos como cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE), oxidação (avaliada por métodos como o mapeamento de peptídeos em conjunto com espectroscopia de massa ou MALDI/TOF/MS), desamidação (avaliada por métodos como cromatografia de troca iônica, foco isoelétrico capilar, mapeamento de peptídeos, medição de ácido isoaspártico) e isomerização (avaliada medindo o teor de ácido isoaspártico, mapeamento de peptídeos, etc.).

[097] Um anticorpo retém sua atividade biológica em uma formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo em um determinado momento estiver dentro de uma faixa predeterminada da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada. A atividade biológica de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de ligação ao antígeno.

[098] O termo isotônico significa que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As formulações isotônicas geralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 270 a 328 mOsm. A pressão ligeiramente hipotônica é 250 a 269 e a pressão

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40/145 ligeiramente hipertônica é 328 a 350 mOsm. A pressão osmótica pode ser medida, por exemplo, usando um osmômetro de pressão de vapor ou de congelamento de gelo.

II. Formulações e Coformulações da invenção.

[099] Em um aspecto, a invenção fornece formulações biológicas que compreende anticorpos anti-TIGIT ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TIGIT humano como ingrediente farmacêutico ativo. A inclusão de metionina nessas formulações reduz a oxidação dos resíduos de metionina na região Fc do anticorpo anti-TIGIT e, no exemplo de um anticorpo anti-TIGIT que compreende uma CDRH3 da SEQ ID NO: 110, o triptofano. Tais formulações podem ainda compreender um quelante, como DTPA, que pode reduzir ainda mais a oxidação.

[0100] Em um aspecto, a invenção também fornece uma coformulação de um anticorpo anti-TIGIT com um anticorpo anti-PD-1. As principais vias de degradação do pembrolizumabe incluíram a oxidação da metionina 105 (Metl05) na cadeia pesada CDR3 (por exemplo, M105 da SEQ ID NO: 10) após estresse com peróxido e oxidação dos resíduos de metionina Metl05 e Fc quando expostos à luz. O pembrolizumabe manteve sua bioatividade na maioria das condições de estresse para os níveis de degradação testados. No entanto, foi observada redução na afinidade para PD-1 para amostras estressadas por peróxido por Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR). Um resíduo de metionina exposto ou um resíduo de metionina na CDR de um anticorpo tem o potencial de impactar a atividade biológica do anticorpo por oxidação. A adição de metionina é capaz de reduzir a oxidação de Metl05 na CDR da cadeia pesada de pembrolizumabe.

Anticorpos Anti-PD-1 e Fragmentos de Ligação ao Antígeno dos mesmos

[0101] Em um aspecto, a invenção fornece formulações biológicas estáveis

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41/145 que compreende anticorpos anti-TIGIT ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, coformuladas com anticorpos anti-PD-1 humanas ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a PD-1 humana (por exemplo, um ser humano ou anticorpo anti-PD-1 humanizado) como ingrediente farmacêutico ativo (API PD-1), bem como métodos para usar as formulações da invenção. Qualquer anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser usado nas coformulações e métodos da invenção. Em modalidades particulares, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, que é selecionado entre pembrolizumabe e nivolumabe. Em modalidades específicas, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizumabe. Em modalidades alternativas, o anticorpo anti-PD-1 é o nivolumabe. A Tabela 2 fornece sequências de aminoácidos para anticorpos anti-PD-1 humana exemplificadores pembrolizumabe e nivolumabe. Os anticorpos PD-1 e fragmentos de ligação ao antígeno alternativos que são úteis nas formulações e métodos da invenção são mostrados na Tabela 3.

[0102] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso nas coformulações da invenção compreende três CDRs de cadeia leve CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e/ou três CDRs de cadeia pesada de CDRH1, CDRH2 e CDRH3.

[0103] Em uma modalidade da invenção, CDRL1 é SEQ ID NO: 1 ou uma variante de SEQ ID NO: 1, CDRL2 é SEQ ID NO: 2 ou uma variante de SEQ ID NO: 2 e CDRL3 é SEQ ID NO: 3 ou uma variante da SEQ ID NO: 3.

[0104] Em uma modalidade, CDRH1 é SEQ ID NO: 6 ou uma variante de SEQ ID NO: 6, CDRH2 é SEQ ID NO: 7 ou uma variante de SEQ ID NO: 7 e CDRH3 é SEQ ID NO: 8 ou uma variante de SEQ ID NO: 8.

[0105] Em uma modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 6,

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SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0106] Em uma modalidade alternativa da invenção, CDRL1 é SEQ ID NO: 11 ou uma variante da SEQ ID NO: 11, CDRL2 é SEQ ID NO: 12 ou uma variante da SEQ ID NO: 12 e CDRL3 é SEQ ID NO: 13 ou uma variante da SEQ ID NO: 13.

[0107] Em uma modalidade, CDRH1 é SEQ ID NO: 16 ou uma variante de SEQ ID NO: 16, CDRH2 é SEQ ID NO: 17 ou uma variante de SEQ ID NO: 17 e CDRH3 é SEQ ID NO: 18 ou uma variante de SEQ ID NO: 18.

[0108] Em uma modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0109] Em uma modalidade alternativa, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.

[0110] Em uma modalidade adicional da invenção, CDRL1 é SEQ ID NO: 21 ou uma variante da SEQ ID NO: 21, CDRL2 é SEQ ID NO: 22 ou uma variante da SEQ ID NO: 22 e CDRL3 é SEQ ID NO: 23 ou uma variante da SEQ ID NO: 23.

[0111] Em ainda outra modalidade, CDRH1 é SEQ ID NO: 24 ou uma variante de SEQ ID NO: 24, CDRH2 é SEQ ID NO: 25 ou uma variante de SEQ ID NO: 25 e CDRH3 é SEQ ID NO: 26 ou uma variante da SEQ ID NO: 26.

[0112] Em uma outra modalidade, as três CDRs de cadeia leve são SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23 e as três CDRs de cadeia pesada são SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.

[0113] Alguns anticorpos anti-PD-1 humana e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção compreendem uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma variante da SEQ ID NO: 4, e a região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 9 ou uma variante da

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SEQ ID NO: 9. Em outras modalidades, a região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 14 ou uma variante da SEQ ID NO: 14, e a região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 19 ou uma variante da SEQ ID NO: 19. Em outras modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 27 ou uma variante da SEQ ID NO: 27 e a região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 28 ou uma variante da SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou uma variante da SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30 ou uma variante da SEQ ID NO: 30. Em tais modalidades, uma sequência variável de região variável de cadeia leve ou cadeia pesada é idêntica à sequência de referência, exceto tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, as substituições estão na região da estrutura (ou seja, fora das CDRs). Em algumas modalidades, uma, duas, três, quatro ou cinco das substituições de aminoácidos são substituições conservadoras.

[0114] Em uma modalidade das coformulações da invenção, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consiste em SEQ ID NÃO: 9. Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consistindo na SEQ ID NO: 14 e uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consistindo na SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade das formulações da invenção, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consistindo em SEQ ID NO: 28 e uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consistindo SEQ ID NO: 27. Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno

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44/145 compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consistindo em SEQ ID NO: 29 e uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consistindo em SEQ ID NO: 27. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que compreende ou consistindo em SEQ ID NO: 30 e uma região variável da cadeia pesada que compreende ou consistindo em SEQ ID NO: 27.

[0115] Em uma outra modalidade, as coformulações da invenção compreendem um anticorpo anti-PD-1 humana ou proteína de ligação ao antígeno que possui um domínio Vl e/ou um domínio Vh com pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 50% de homologia de sequência com um dos domínios Vl ou Vh descritos acima e exibe ligação específica a PD-1. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 humana ou a proteína de ligação ao antígeno das coformulações da invenção compreende domínios Vlc Vh com até 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais substituições de aminoácidos e exibe ligação específica a PD-1.

[0116] Em qualquer uma das modalidades acima, o API PD-1 pode ser um anticorpo anti-PD-1 de comprimento total ou um fragmento de ligação ao antígeno que se ligue especificamente à PD-1 humana. Em certas modalidades, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 de comprimento total selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. De preferência, o anticorpo é um anticorpo IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser usado, incluindo IgGi, IgGz, IgGs e IgGzi. Diferentes domínios constantes podem ser anexados às regiões Vl e Vh fornecidas na presente invenção. Por exemplo, se um uso pretendido particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção exigir funções efetoras alteradas, um domínio constante da cadeia pesada diferente de IgGl pode ser usado. Embora os anticorpos IgGl proporcionem meia-vida longa e funções efetoras, como ativação do complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos, essas

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45/145 atividades podem não ser desejáveis para todos os usos do anticorpo. Em tais casos, um domínio constante de lgG4, por exemplo, pode ser usado.

[0117] Nas modalidades da invenção, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 que compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos, como estabelecido na SEQ ID NO: 10. Em modalidades alternativas, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 que compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia pesada que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos, como estabelecido na SEQ ID NO: 20. Em outras modalidades, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 que compreende uma cadeia leve que compreende ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 32 e uma cadeia pesada que compreende ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácidos, como estabelecido na SEQ ID NO: 31. Em modalidades adicionais, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 que compreende uma cadeia leve que compreende ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada que compreende ou consistindo em uma sequência de resíduos de aminoácidos, como estabelecido na SEQ ID NO: 31. Em modalidades ainda adicionais, o API PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 que compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos como estabelecido na SEQ ID NO: 34 e uma cadeia pesada que compreende ou consiste em uma sequência de resíduos de aminoácidos, como estabelecido na SEQ ID NO: 31. Em algumas coformulações da invenção, o API PD-1 é pembrolizumabe ou um biossimilar do pembrolizumabe. Em algumas formulações da invenção, o

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API PD-1 é nivolumabe ou um biossimilar do nivolumabe.

[0118] Tipicamente, as variantes da sequência de aminoácidos dos anticorpos anti-PD-1 e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção e os anticorpos anti-TIGIT e fragmentos de ligação ao antígeno terão uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve, Vh, Vl ou sequência humanizada), mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95, 98 ou 99%. A identidade ou homologia com relação a uma sequência é definida na presente invenção como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de anti-PD-1, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequência. Nenhuma extensão N-terminal, C-terminal ou extensões internas, deleções ou inserções na sequência de anticorpos devem ser interpretadas como afetando a identidade ou homologia da sequência.

[0119] A identidade de sequência se refere ao grau em que os aminoácidos de dois polipeptídeos são os mesmos em posições equivalentes quando as duas sequências estão alinhadas de maneira ideal. A identidade da sequência pode ser determinada usando um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência. As seguintes referências referem-se a algoritmos BLAST frequentemente utilizados para análise de sequência: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 410; Gish, W., et al.,

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47/145 (1993) Nature Genet.3: 266 a 272; Madden, T.L. etal., (1996) Meth. Enzymol.266: 131 a 141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7: 649 a 656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17: 149 a 163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67 a 70; SISTEMAS DE PONTUAÇÃO DE ALINHAMENTO: Dayhoff, M.O., etal., A model of evolutionary change in proteins. Em Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) volume 5, suppl.3. M.O. Dayhoff (org.), Páginas 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., Matrices for detecting distant relationships. Em Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) volume 5, suppl.3. M.O. Dayhoff (ed.), páginas 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol.219: 555-565; States, DJ. et al., (1991) Methods 3: 66-70; Henikoff, S. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; ESTATÍSTICAS DE ALINHAMENTO: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:58735877; Dembo, A. et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; e Altschul, S.F. Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments. Em Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) páginas 1-14, Plenum, Nova York.

[0120] Da mesma forma, qualquer classe de cadeia leve pode ser usada nas composições e métodos descritos na presente invenção. Especificamente, kappa, lambda ou variantes dos mesmos são úteis nas presentes composições e métodos.

Tabela 2. Sequências de Anticorpos PD-1 Exemplificadoras

Característica do Anticorpo	Sequência de Aminoácidos	SEQ ID NO
Cadeia leve de Pembrolizumabe
CDR1	RASKGVSTSGYSYLH	1

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Característica do Anticorpo	Sequência de Aminoácidos	SEQ ID NO
CDR2	LASYLES	2
CDR3	QHSRDLPLT	3
Região Variável	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWY QQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK	4
Cadeia Leve	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWY QQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTH QG LSSPVTKSFN RG EC
Cadeia Pesada de Pembrolizumabe
CDR1	NYYMY	6
CDR2	GINPSNGGTNFNEKFKN	7
CDR3	RDYRFMGFDY	8
Região Variável	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWV RQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSST TTAY Μ E LKS LQF D DTAVYYCA RRDYRFDMGF D Y WG QG TTVTVSS	9
Cadeia Pesada	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWV RQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSST TTAY Μ E LKS LQF D DTAVYYCA RRDYRFDMGF D Y WG QG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSGK	10
Cadeia Leve de Nivolumabe
CDR1	RASQSVSSYLA	11
CDR2	DASNR AT	12
CDR3	QQSSNWPRT	13
Região Variável	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPE DFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK	14

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Característica do Anticorpo	Sequência de Aminoácidos	SEQ ID NO
Cadeia Leve	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPE D FAVYYCQQSSN WP RTFG QGTKVE1KRTVAAPSVF1F P PS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC	15
Cadeia pesada de Nivolumabe
CDR1	NSGMH	16
CDR2	VIWYDGSKRYYADSVKG	17
CDR3	NDDY	18
Região Variável	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVR QAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSK NTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS	19
Cadeia Pesada	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVR QAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSK NTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTY TCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK	20

Tabela 3. Anticorpos de PD-1 Adicionais e Fragmentos de Ligação ao

Antígeno Úteis nas Coformulações, Métodos e Usos da Invenção.

A. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem CDRs de cadeia leve e pesada de hPD-1.08A em WO2008/156712
CDRL1	SEQ ID NO: 21
CDRL2	SEQ ID NO: 22
CDRL3	SEQ ID NO: 23
CDRH1	SEQ ID NO: 24
CDRH2	SEQ ID NO: 25
CDRH3	SEQ ID NO: 26
C. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem a região variável de cadeia pesada hlO9A madura e uma das regiões variáveis de cadeia

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leve K09A madura em WO 2008/156712
VR de cadeia pesada	SEQ ID NO: 27
VR de cadeia leve	SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 30
D. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem a cadeia pesada 409 madura e uma das cadeias leves K09A maduras em WO 2008/156712
Cadeia pesada	SEQ ID NO: 31
Cadeia leve	SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:33 ou SEQ ID NO:34

[0121] Em algumas modalidades da coformulação da invenção, o API PD-1 (ou seja, o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) está presente em uma concentração de cerca de 25 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em modalidades alternativas, o API está presente em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 75 mg/mL ou cerca de 100 mg/mL.

Anticorpos Anti-TIGIT e Fragmento de Ligação ao Antígeno do mesmo

[0122] Em um aspecto, a invenção fornece formulações biológicas que compreende anticorpos anti-TIGIT ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente ao TIGIT humano (por exemplo, um anticorpo anti-TIGIT humano ou humanizado) como ingrediente farmacêutico ativo (API TIGIT), bem como métodos para usar as formulações da invenção.

[0123] Em um outro aspecto, a invenção também fornece coformulações biológicas que compreendem (i) anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao TIGIT humano (por exemplo, um anticorpo anti-TIGIT humano ou humanizado) e (ii) um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a PD-1 humana. Qualquer anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser usado na formulação, incluindo a coformulação e métodos da invenção. As sequências de anticorpos anti-TIGIT exemplificadoras são apresentadas abaixo nas Tabelas 4 e 5.

TABELA 4. Anticorpos anti-TIGIT exemplificadores

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
14A6 H - CDR1	35	SDYWG
14A6 H - CDR2	36	FITYSGSTSYNPSLKS
14A6 H - CDR3	37	MPSFITLASLSTWEGYFDF
14A6 L-CDR1	38	KASQSIHKNLA
14A6 L - CDR2	39	YANSLQT
14A6 L-CDR3	40	QQYYSGWT
14A6 VH PARENTAL	41	EVQLQESG PG LVKPSQSLSLTCSVTGSSIA SDYWGWIRKFPGNKMEWMGFITYSGSTS YNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLHSVTTD DTATYSCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GPGTMVTVSS
14A6 VL PARENTAL	42	D1QMTQS PS LLSASVG D R VTLN CKASQSI HKNLAWYQQKLG E A P K FLIYYANSLQTG IPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDVATYF CQQYYSGWTFGGGTKVELK
HU14A6VH. 1	43	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSG GSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
HU14A6VH. Ia	44	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSG GSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCA RMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
HU14A6VH.lb	45	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSG GSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY N PSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCA RMPSFITLASLSTWEGYFDFW

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		GQGTMVTVSS
HU14A6VH. lc	46	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWMGFITYSGSTS YNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.ld	47	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSG GSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLHSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.le	48	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSG GSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLHSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.lf	49	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLHSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
HU14A6VH.lg	50	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWMGFITYSGSTS YNPSLKSRITISVDTSKNQFSLKLHSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hui4A6VH.2	51	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSG YSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2a	52	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSG YSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2b	53	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSG YSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		N PSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2c	54	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWMGFITYSGSTS YNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2d	55	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSG YSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLHSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2e	56	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSG YSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLHSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2f	57	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLHSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
Hul4A6VH.2e	58	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCAVSGSSIS SDYWGWIRQPPGKGLEWMGFITYSGSTS YNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLHSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
Hul4A6Vk. 1	59	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKAPKLLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
Hul4A6Vk. Ia	60	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKAPKFLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
Hul4A6Vk. lb	61	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQK P G K A P K F L1YYANSLQTG1

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
Hul4A6Vk.2	62	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKVPKLLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
Hul4A6Vk.2a	63	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKVPKFLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
Hul4A6Vk.2b	64	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQK P G K V P K F L1YYANSLQTG1 PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
16AHA_tigit_l 4a6_humaniza doVHl LB155.14A6.G 2.A8 VH1	65	EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSSIA SDYWGWIRQP PG KG LEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSSAS
18AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH2 LB155.14A6.G 2.A8 VH2	66	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSIA SDYWGWIRQPPG KG LEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
20AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH3 LB155.14A6.G 2.A8 VH3	67	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSI A SDYWGWIRKPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
21AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH4 LB155.14A6.G 2.A8 VH4	68	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSI A SDYWGWIRQPPGKKLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
19AHA_tigit	69	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSI A

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
_14a6_hum anized_ VH5 LB155.14A6.G 2.A8 VH5		SDYWGWIRQPPGKGMEWIGFITYSGSTS YNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
22AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH6 LB155.14A6.G 2.A8 VH6	70	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSIA SDYWGWIRKPPGKKMEWIGFITYSGSTS YNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
23AHA_tigit 14a6 humanizado VH7 LB155.14A6. G2. A8 VH7	71	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSI A SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTADD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
24AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH8 LB155.14A6. G2. A8 VH8	72	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCTVSGSSI A SDYWGWIRKPPGKKMEWIGFITYSGSTS YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA A DTAVYYCA RMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
25AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH9 LB155.14A6. G2. A8 VH9	73	EVQLQESG PG LVKPSETLSLTCSVTGSSIA SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDFW GQGTMVTVSS
26AHA_tigit _14a6_hum anized_ VH10 LB155.14A6.G 2.A8 VH10	74	EVQLQQSGAG LLKPSETLSLTCSVTGSSIA SDYWGWIRQPPGKGLEWIGFITYSGSTSY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARMPSFITLASLSTWEGYFDF WGQGTMVTVSS
27AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VH11	75	EVQLQESG PG LVKPPGTLSLTCSVTGSSIA SDYWGWVRQPPGKGLEWIGFITYSGSTS YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA A DTAVYYCA RMPSFITLASLSTWEGYFDF

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 62/158

56/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
LB155.14A6.G 2.A8 VH11		WGQGTMVTVSS
09AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VL1 LB155.14A6.G 2.A8 VL1	76	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKAPKLLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
llAHA_tigit 14a6 humanizado VL2 LB155.14A6.G 2.A8 VL2	77	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSIH KNLAWYQQK P G K A P K F L1YYANSLQTG V PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
12AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VL3 LB155.14A6.G 2.A8 VL3	78	D1QMTQS PSS LSASVG D RVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKAPKLLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
13AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VL4 LB155.14A6.G 2.A8 VL4	79	D1 QMTQS PSS LSASVG D RVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPGKAPKFLIYYANSLQTGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
15AHA_tigit _14a6_hum anizado_ VL5 LB155.14A6.G 2.A8 VL5	80	D1 QMTQS PSS LSASVG D RVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPG KAPKLLIYYANSLQTG1 PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQYYSGWTFGGGTKVEIK
28H5 H - CDR1	81	GYSITSDYAWN
28H5 H - CDR2	82	YISNSGSASYNPSLKS
28H5 H - CDR3	83	LIYYDYGGAMNF
28H5 L- CDR1	84	KASQGVSTTVA

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 63/158

57/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
28H5 L- CDR2	85	SASYRYT
28H5 L- CDR3	86	QHYYSTPWT
28H5 VH PARENTAL	87	DVQLQESG PG LVKPSQSLSLTCTVTG YSI TSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISNSGS ASYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVT TEDTATYYCATLIYYDYGGAMNFWGQG TSVTVSS
28H5 VL PARENTAL	88	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQG VSTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQSEDLAV YYCQHYYSTPWTFGGGTKLEIK
14H6 L variante de CDR2	89	YASNLQT
14H6 L variante de CDR2	90	YASSLQT
14H6 L variante de CDR2	91	YASTLQT
14H6 L variante de CDR2	92	YATTLQT
14H6 L variante de CDR2	93	YASYLQT
14H6 L variante de CDR2	94	YANQLQT
14H6 L variante de CDR2	95	Y AG SLQT
14H6 L variante de CDR2	96	YASQLQT
14H6 L variante de	97	YADSLQT

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 64/158

58/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
CDR2
14H6 L variante de CDR3	98	QQYYSGFT
14H6 L variante de CDR3	99	QQYYSGYT
14H6 L variante de CDR3	100	QQYYSGIT
14H6 L variante de CDR3	101	QQYYSGVT
14H6 L variante de CDR3	102	QQYYSGLT
14H6 L variante de CDR3	103	MPSFITLASLSTFEGYFDF
14H6 L variante de CDR3	104	MPSFITLASLSTYEGYFDF
14H6 L variante de CDR3	105	MPSFITLASLSTIEGYFDF
14H6 L variante de CDR3	106	MPSFITLASLSTVEGYFDF
14H6 L variante de CDR3	107	MPSFITLASLSTLEGYFDF
31C6 H -CDR1	108	SYVMH
31C6 H -CDR2	109	YIDPYNDGAKYNEKFKG
31C6 H-CDR3	110	GGPYGWYFDV
31C6 L-CDR1	111	RASEHIYSYLS

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 65/158

59/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
31C6 L — CDR2	112	NAKTLAE
31C6 L — CDR3	113	QHHFGSPLT
31C6 VH PARENTAL (com CDRs sublinhadas)	114	EVQLQQSGPELVKPGSSVKMSCKASGYT FSSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIDPYND GAKYNEKFKGKATLTS D KSSSTAY M E LS SLTSEDSAVYYCARGGPYGWYFDVWGA GTTVTVSS
31C6 VL PARENTAL (com CDRs sublinhadas)	115	D1QMTQS P AS LSASVG ETVTITCRASEHIY SYLSWYQQKQG KSPQLLVYNAKTLAEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYY CQHHFGSPLTFGAGTTLELK
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56R)	116	YIDPYNrGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56L)	117	YIDPYN1GAKYNEKG F
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56K)	118	YIDPYNkGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56F)	119	YIDPYNfGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56S)	120	YIDPYNsGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56Y)	121	YIDPYNyGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (D56V)	122	YIDPYNvGAKYNEKFG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57R)	123	YIDPYNDrAKYNEKFKG

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 66/158

60/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
31C6 H VARIANTE DE CDR2(G57N)	124	YIDPYNDnAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57Q)	125	YIDPYNDqAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57E)	126	YIDPYNDeAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57L)	127	YIDPYNDIAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57K)	128	YIDPYNDkAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57S)	129	YIDPYNDsAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57Y)	130	YIDPYNDyAKYNEKFKG
31C6 H VARIANTE DE CDR2 (G57V)	131	YIDPYNDvAKYNEKFKG
31C6 L variante de CDR2 (N50A)	132	AAKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (N50Y)	133	YAKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (N50W)	134	WAKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (N50S)	135	SAKTLAE

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 67/158

61/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
31C6 L variante de CDR2 (N5 OT)	136	TAKTLAE
31C6 L variante de CDR2(N500)	137	IAKTLAE
31C6 L variante de CDR2(N50V)	138	VAKTLAE
31C6 L variante de CDR2(A51N)	139	NNKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (A510)	140	NIKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (A51L)	141	NLLTLAE
31C6 L variante de CDR2 (A51T)	142	NTKTLAE
31C6 L variante de CDR2 (A51V)	143	NVKTLAE
31C6HUMZV Hl (com CDRs sublinhadas)	144	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FSSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYIDPYND G AKYSQKFQG RVTLTRDTSASTAYM E LS SLRSEDTAVYYCARGGPYGWYFDVWGQ GTTVTVSS
31C6HUMZV H2 (com CDRs sublinhadas)	145	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FSSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYIDPYND G AKYSQKFQG RVT LTS D KS ASTAY M E LS SLRSEDTAVYYCARGGPYGWYFDVWGQ GTTVTVSS
31C6HUMZV H3 (com CDRs sublinhadas)	146	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FSSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYIDPYND G AKYAQKFQG RVTLTRDTSTSTVYM E LS SLRSEDTAVYYCARGGPYGWYFDVWGQ

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 68/158

62/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		GTTVTVSS
31C6_HUMZ_ VH4(com CDRs sublinhadas)	147	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYIDPYND G AKYAQKFQG RVTLTSD KSTSTVYM E LS SLRSEDTAVYYCARGGPYGWYFDVWGQ GTTVTVSS
31C6_HUMZ_ VH5(com CDRs sublinhadas)	148	EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYT FSSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYIDPYND G AKYAQKFQG RVTLTS D KSTSTAYM E LS SLRSEDTAVYYCARGGPYGWYFDVWGQ GTTVTVSS
31C6_HUMZ_ VH6 (com CDRs sublinhadas)	149	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FSSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYIDPYND GAKYAQKFQGRVTLTSDKSISTAYM E LS R LRS D DTVVYYCARGGPYGWYFDVWG Q GTTVTVSS
31C6_Humz_ LI (com CDRs sublinhadas)	150	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEHIY SYLSWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHHFGSPLTFGQGTRLEIK
31C6_Humz_ L2 (com CDRs sublinhadas)	151	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEHIY SYLSWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGV PSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPEDFATYYC QHHFGSPLTFGQGTRLEIK
31C6_Humz_L 3 (com CDRs sublinhadas)	152	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEHIY SYLSWYQQKPGKVPKLLIYNAKTLAEGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QHHFGSPLTFGQGTRLEIK
31C6_Humz_L 4 (com CDRs sublinhadas)	153	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEHIY SYLSWYQQKPGKVPKLLIYNAKTLAEGV PSRFSGSGSGTQFTLTIS SLQPEDVATYYC QHHFGSPLTFGQGTRLEIK
31C6 H variante de CDR2	154	YIDPYNDGAKYAQKFQG
31C6 H variante de CDR2	155	YIDPYNDGAKYSQKFQG

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 69/158

63/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
18G10 - sequência de VH	156	QVQLM ESG PG LVQPSQTLSLTCTVSG FPL TSYTVHWVRQPPGKGLEWIGAIWSSGST DYNSALKSRLNINRDSSKSQVFLKMNSLQ TEDTAIYFCTKSGWAFFDYWGQGVMVT VSS
18G10 - sequência de VL	157	DIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCIASQNIY KSLAWYQLKLG EAP KLLIYNANSLQAG1P SRFSGSGSGTDFALTISGLQPEDVATYFCQ QYSGGYTFGAGTKLELK
11A11 - sequência de VH	158	EVQLVESGG DLVQPG RSLKISCVASG FTF SDYYMAWVRLAPQKGLEWVASISYEGS RTHYGDSVRGRFIISRDNPKNILYLQMNS LGSEDTATYFCARHTGTLDWLVYWGQG TLVIVSS
11A11 - sequência de VL	159	NIVMAQSPKSMSISAGDRVTMNCKASQN VDNNIAWYQQKPGQSPKLLIFYASNRYS GVPDRFTGGGYGTDFTLTIKSVQAEDAAF YYCQRIYNFPTFGSGTKLEIK
14A6 H - CDR3 CONSENSO	160	MPSFITLASLSTXEGYFDF X= W, F, Y, 1, V, L
14A6 L-CDR2 CONSENSO	161	YAX1X2LQT Xi= N, S, T, G, D X₂= S, N, S, T, Y, Q
14A6 L-CDR3 CONSENSO	162	QQYYSGXT X= W, F, Y, 1, V, L
14A6 VH PARENTAL CONSENSO	163	EVQLQX1SGX2G LX3KPX4X5X6LSLTCX7V X8GX30SIX31SDYWGWX9RX10X11PGX12X13 X14EWX15GFITYSGSTSYNPSLKSRX16X17I X18X19DTSKNQFX20LX21LX22SVTX23X24DT AX25Y

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 70/158

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		X26CARMPSFITLASLSTX27EGYFDFWGX32 GTX28X29TVSS Xi=E ou Q X₂= P ou A X₃= V ou L X4= S ou P Xs = Q ou E ou G Xê=S ou T X?= S ou T ou A Xs= T ou S X₉= 1 ou V Xio= K ou Q Xn= F ou P Xi2= N ou K Xi3= K ou G Xi4= M ou L Xi5= M ou 1 X16= 1 ou V X17= S ou T X18= T ou S Xi9= R ou V XzcF F ou S X₂i=Qou K X₂₂= H ou S X23= T OU A X24= D OU A X₂5= T ou V X₂6= S ou Y, X₂7= W, F, Y, 1, V ou L X₂8= Μ, V, L, A, R, N, P, Q, E, G, 1, Η, K, F,

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 71/158

65/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		S, T, W ou Y X29 = V, T ou L X3o= S ou G ou Y Xsi⁼ A ou S X3i= P ou Q
14A6 VH HUMANIZADA CONSENSO	164	EVQLQX1SGX2G LX3KPX4X5TLSLTCX6VX7 GX3SIX9SDYWGWX10RX11X12PG KX13X14E WX15GFITYSGSTSYNPSLKSRX16TISX17D TSKNQFSLKLX18SVTAX19DTAVYYCARM PSFITLASLSTX20EGYFDFWGQGTX21X22T vss Xi=E ou Q X₂= P ou A X₃ = V ou L X4 = S ou P X₅= E ou G Xg = T ou A ou S X₇ = S ou T Xs = G ou Sou Y X9 = S ou A Χιο= 1 ou V Xn=Q ou K Xi2= P ou F Xi3 = G ou K Xi4 = L ou M Xis = 1 ou M X16 = V ou 1 Xi7 = V ou R Xis = S ou H Xi9 = A ou D

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 72/158

66/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		X20 = W, F, Y, 1, V, L X21 = Μ, V, L, A, R, N, P, Q, E, G, 1, Η, K, F, S, T. W ou Y X22 = V, T ou L
14A6 VL PARENTAL CONSENSO	165	D1 QMTQS PSXi LSASVG D R VTX2X3C KASQ SIHKNLA WYQQKX4GX5X15 P KX₆LIYYAX7 X8LQTGX9PSRFSGSGSGTDFTLTISX10LQP EDX11ATYX12CQQYYSGX13TFGGGTKVE X14K Xi =L ou S X2 = L ou 1 X₃=N ouT X₄ = L ou P X₅= E ou K X₆ = F ou L X₇= N, S, T, G ou D X₈ = S, N, T, You Q X₉ = 1 ou V X10 = G ou S X11 = V ou F X12 = F ou Y Xi3 = W, F, Y, 1, V ou L Xi4 = L ou 1 X15 = A ou V
14A6 VL HUMANIZADA CONSENSO	166	D1 QMTQS PSS LSASVG D RVTITCKASQSIH KNLAWYQQKPG KX₆PKXiLI YYAX2X3LQ tgx₄psrfsgsgsgtdftltisslqpedx₇a TYYCQQYYSGX5TFGGGTKVEIK Xi = L ou F X2 = N, S, T, G ou D

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 73/158

67/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		X3 = S, N, T, Y ou Q X₄ = V ou 1 X₅ = W, F, Y, 1, V ou L X₆= A ou V X₇ = F ou V
31C6 H -CDR2 CONSENSO	167	Yl DPYNX1X2AKYX3X4KFX5G Xi= D, R, L, K, F, S, You V X₂= G, R, N, Q, E, L K, S. You V X₃= N, A ou S X₄= E ou Q X₅= K ou Q
31C6 L— CDR2 CONSENSO	168	X1X2KTLAE Xi= N, A, V, W, S, T R, H G, 1 ou V X₂= A, N, 1, L, T ou V
31C6 VH PARENTAL CONSENSO	169	EVQLXiQSGX₂EX₃X₄KPGX5SVKX₆SCKAS GYTFSSYVMHWVX7QX8PGQX9LEWIGYI DPYN XioXiiAKYXi2Xi₃KFXi₄GXisXi6TLTXi₇DXi8SXi9STX2oYME LSX2iLX22SX2.₃DX2₄X2sVYYCARGGPYGX26YFDVWGX2₇GT TVTVSS Xi= Qou V X₂= P ou A X₃ =V ou L X₄= V ou K Xs=S ou A X₆= M ou V X₇= K ou R X₈= K ou A Xg= G OU R Xio= D, R, L, K, F, S, You V

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 74/158

68/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		Xn= G, R, N, Q, E, L K, S, Y ou V Xi2= N, A ou S Xi3= E ou Q Xi4 = K ou Q Xi5= R ou K Xi6= A ou V Xi7 = S ou R X18 = K ou T X19 = S, 1, A ou T X20 = A ou V X21 = R ou S X22 = T ou R X23 = D ou E X24 = S ou T X25 = A ou V X26 = W, A, D, E, F, G, 1, K, N, Q, R, S, T, V ou Y X27 = A ou Q
31C6 VH HUMANIZADA CONSENSO	170	EVQLVQSGAEVKKPGXiSVKVSCKASGY TFSSYVMHWVRQAPGQX2LEWIG YIDPYNX3X4AKYX5X5KFX7GRVTLTX8DX9 SX10STX11YMELSX12LRSX13DT X14VYYCARGGPYGX15YFDVWGQGTTVT vss Xi= A ou S X2= R ou G X₃= D, R, L, K, F, S, You V X₄= G, R, N, Q, E, L K, S, Y ou V X₅= N, A ou S Xõ= E ou Q X₇= K ou Q

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 75/158

69/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		Xs= R ou S X₉=T ou K Xio= A, T ou 1 Xn= A ou V Xi2= S ou R Xi3= E ou D Xi4= A ou V Xis = W, A, D, E, F, G, 1, K, N, Q, R, S, T V ou Y
31C6 VL PARENTAL CONSENSO	171	DIQMTQSPX1SLSASVGX2X.3VTITCRASEH IYSYLSWYQQKX₄G KX5PX6LLX7YX8X9KT LAEGVPSRFSGSGSGTX10FX11LX12IX13SL QP E DXuXisTYYCQH H FGSPLTFGXigGTXu LEXisK Xi= A ou S X₂= E ou D X₃ = Tou R X₄= Q ou P X₅= S, Aou V X₆= Q ou K X₇= V ou 1 X₈= n, A, Y, W, S, T, 1 ou V X₉= A, N, 1, L, T ou V Xio= Q ou D Xn= S ou T X12= K ou T Xi3= N ou S Xu = F ou V Xi5= G ou A Xi6= A ou Q Xi7 = T ou R

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 76/158

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Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
		Xis = L ou 1
31C6 L - VL HUMANIZADA CONSENSO	172	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEHIY SYLSWYQQKPGKXiPKLLIY X2X₃KTLAEGVPSRFSGSGSGTX₄FTLTISS LQP E DXsATYYCQHHFGSPLTFG QGTR LE IK Xi= A ou V X₂= N, A, Y, W, S, T, 1 ou V X₃ = A, N, 1, L, T ou V X₄ = D ou Q X₅= F ou V
31C6 H -CDR3 CONSENSO	173	GGPYGXYFDV Xis = W, A, D, E, F, G, 1, K, N, Q, R, S, T, V ou Y
31C6 H -CDR3 VARIANTE	174	GGPYGAYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	175	GGPYGDYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	176	GGPYGEYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	177	GGPYGFYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	178	GGPYGGYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	179	GGPYGIYFDV
31C6 H -CDR3 VARIANTE	180	GGPYGKYFDV
31C6 H - CDR3 VARIANTE	181	GGPYGNYFDV
31C6 H -CDR3	182	GGPYGQYFDV
VARIANTE	183	GGPYGRYFDV

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 77/158

71/145

Descrição	SEQ ID NO:	SEQUÊNCIA
31C6 H -CDR3	184	GGPYGSYFDV
VARIANTE	185	GGPYGTYFDV
31C6 H -CDR3	186	GGPYGVYFDV
VARIANTE	187	GGPYGYYFDV

[0124] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs da cadeia leve CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e/ou três CDRs da cadeia pesada CDRH1, CDRH2 e CDRH3.

[0125] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 35, uma CDRH2 que compreende SEQ ID NO: 36, uma CDRH3 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 37, 103, 104, 105, 106, 107 ou 160, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 38, uma CDRL2 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 39, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ou 69, e uma CDRL3 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 40, 98, 99, 100, 101, 102 ou 162.

[0126] Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 81, uma CDRH2 que compreende SEQ ID NO: 82, uma CDRH3 que compreende SEQ ID NO: 83, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 84, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 85 e uma CDRL3 que compreende SEQ ID NO: 86.

[0127] Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 108, uma CDRH2 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 109, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 154, 155 ou 167, uma CDRH3 que compreende uma das SEQ ID NOs : 110, 173,

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174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 111, uma CDRL2 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs : 112, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 ou 168 e uma CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113.

[0128] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 35, uma CDRH2 que compreende SEQ ID NO: 36, uma CDRH3 que compreende SEQ ID NO: 37, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 38, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 39 e uma CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0129] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 108, uma CDRH2 que compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 109, 154 ou 145, uma CDRH3 que compreende SEQ ID NO: 110, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 111, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 112 e um CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.

[0130] Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, uma CDRH2 que compreende SEQ ID NO: 154, uma CDRH3 que compreende SEQ ID NO: 110, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 111, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 112 e uma CDRL3 que compreende SEQ ID NO: 113.

[0131] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável

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73/145 da cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 41 e uma região variável da cadeia leve que compreende a SEQ ID NO: 42.

[0132] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 87 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 88.

[0133] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 114 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 115.

[0134] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-58, 65-75 e 87 e uma região variável da cadeia leve que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 59-64, 76-80 e 88.

[0135] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 144-149 e uma região variável da cadeia leve que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 150-153.

[0136] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 152.

[0137] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 147 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 150.

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[0138] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 148 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 153.

[0139] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 163 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 165.

[0140] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 169 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 171.

[0141] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 164 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 166.

[0142] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 170 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 172.

TABELA 5: Sequências Exemplificadoras de anticorpos anti-TIGIT

Descrição	SEQ ID NO	SEQUÊNCIA
14D7 H - CDR1	188	GAWMD
14D7 H - CDR2	189	EIRTKVNNHATNYGESVKG
14D7 H - CDR3	190	ALYDGFYFDY
14D7 L -	191	SASSSVSSGYLY

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
CDR1
14D7 L - CDR2	192	GTSTLAS
14D7 L - CDR3	193	HQWSSFPYT
14D7 VH PARENTAL	194	EVKLE ESGGG LVQPGGSM KLSCVASG FTFSG AWM DWVRQSP E KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGR FTIS R D DS KSSVY LQ Μ N N LRAE DSGIYYCRGALYDGFYFDYWG QGTTLTVSS
14D7 VL PARENTAL	195	QI VLTQSPAIMSASPG EKVN LTCSASSSVSSGYLYWYQQKPGSS PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAASYF CHQWSSFPYTFGG GTKLE Μ K
Hul4D7 VH sequência consenso humaniza da	196	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAX1X2DWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVN N Η ATN YG ESVKG RFTISRDX3SKX4X5V YLQX6X7X8LRAEDX9AVYYCRGALYX10X11FYFDYWGQGTLVT VSS Xi= W, A, R, N, D, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, Y, V X₂= Μ, V, L, 1, G, A, S, T X₃= D, A, R, N, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, S, T, Y, V X₄= S, N X₅= T, S X₆= M, L X₇= N, S X₈= S, N X₉= T, s Xio= D, A, R, N, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V Xii= G, A, R, N, D, Q, E, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V
Hul4D7 VH1 (cadeia VH humaniza da)	197	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEI RTKVN NHATNYGESVKGRFTISRDDSKSTVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDGFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH2 (cadeia VH humaniza da)	198	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEI RTKVN NHATNYGESVKGRFTIS R D DS KSSVY L QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDGFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7	199	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
VH3 (cadeia VH humaniza da)		G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKNTVYL QM NSLRAEDTAVYYCRGALYDGFYFDYWG QGTLVTVSS
Hul4D7 VL Sequência consenso humaniza da	200	EIVLTQSPATLSLSPGERAXiLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQ APX7LX2IYGTSTLASGX8PARFSGSGSGTDYTLTISSX3EPEDX4A VYYCHQXsSSFPYTFGQGTKLEXgK Xi= T, S X₂= W, A, R, N, D, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, Y, V X₃= L, V, 1 X₄= F, V, L, 1, T X₅= W, A, R, N, D, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, Y, V X₆= 1, L X₇= K, R X₈= V, 1
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da)	201	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQWSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L2 (cadeia VL humaniza da)	202	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQWSSFPYTFGQGTKLEI K
HU14D7V L3 (cadeia VL humaniza da)	203	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSFPYTFGQGTKLEIK
26B10 H - CDR1	204	EFTMH
26B10 H - CDR2	205	GLKPDNGGISYNQKFKG
26B10 H - CDR3	206	GAYYRYDADY
26B10 L -	207	KASQDVKTAVA

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
CDR1
26B10 L- CDR2	208	SASYRNT
26B10 L- CDR3	209	QQHYSTPFT
26B10 VH PARENTAL	210	EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQSHG KSLEWIGGLKPDNGGISYNQKFKGRATLAVDKSSNTAYMELR SLTSEDSAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTTLTVSS
26B10 VL PARENTAL	211	D1VLTQS H KF M STSVG D RVSITCKASQDVKTAVAWYQQKSG Q SPKLLIYSASYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTIDSVQAEDLAVY FCQQHYSTPFTFGTGTKLELK
26B10 VH Sequência CONSENS 0 HUMANIZ ADA	212	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKX1SGYTFTEFTX2HWVX3QAP G KG LEWIGGLKPDX4X5GISYNQKFKGRATLTVDX6STX7TAYX8 ELSSLRSEDX9AVYYCARGAYYRYX10X11DYWGQGTLVTVSS Xi= T, V X₂= Μ, V, L, 1, G, A, S, T X₃= K, R X₄= N, A, R, D, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V X₅= G, A, R, N, D, Q, E, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V Xê= k, t, d, s X₇= N, S X₈= Μ, V, L, 1, G, A, S, T X₉= T, S Xio= D, A, R, N, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V χ₁₁₌ a, R, N, D, Q, E, G, Η, 1, L, K, F, P, S, T, W, Y, V, M
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)	213	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDNGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYMELS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)	214	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10	215	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
VH3 (cadeia VH humaniza da)		KG LEWIGGLKPDNGGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
26B10 VL Sequência CONSENS 0 HUMANIZ ADA	216	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVKTAVAWYQQKPGKA PKLLIYSASYRX1X2GVP X₃ R FSG SG SGTD FTX4TI SS LQP E D F ATYYCQQHYSTPFTFG QGT KLEIK Xi= N, Q, D, E X₂= T, S, A X₃= D, S X₄= F, L
Hu26B10 VL1 (cadeia VL humaniza da)	217	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVKTAVAWYQQKPG KA PKLLIYSASYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYC QQHYSTPFTFGQGTKLEIK
Hu26B10 VL2 (cadeia VL humaniza da)	218	D1QLTQS PSS LSASVG D RVTITCKASQDVKTAVAWYQQKPG K APKLLIYSASYRNTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYC QQHYSTPFTFGQGTKLEIK
Hu26B10 VL3 (cadeia VL humaniza da)	219	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVKTAVAWYQQKPG KA PKLLIYSASYRNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYSTPFTFGQGTKLEIK
14D7 H - CDR3 (D104E)	220	ALYEGFYFDY
14D7 H - CDR3 (G105A)	221	ALYDAFYFDY
14D7 H - CDR3 (G105S)	222	ALYDSFYFDY
Hul4D7	223	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
VH1 (cadeia VH humanizad a) (D104E)		GKGLEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSTVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYEGFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH1 (cadeia VH humanizad a) (G105A)	224	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSTVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDAFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH1 (cadeia VH humanizad a) (G105S)	225	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSTVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDSFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH2 (cadeia VH humanizad a) (D104E)	226	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSSVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDEFYFDYVVGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH2 (cadeia VH humanizad a) (G105A)	227	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSSVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDAFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH2 (cadeia VH humanizad a) (G105S)	228	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKSSVYL QMNSLRAEDTAVYYCRGALYDSFYFDYWGQGTLVTVSS
Hul4D7 VH3 (cadeia VH humaniza da) (D104E)	229	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKNTVYL QM NSLRAEDTAVYYCRGALYEGFYFDYWG QGTLVTVSS
Hul4D7 VH3	230	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKNTVYL

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
(cadeia VH humaniza da) (G105A)		QM NSLRAEDTAVYYCRGALYDAFYFDYWG QGTLVTVSS
Hul4D7 VH3 (cadeia VH humaniza da) (G105S)	231	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGAWMDWVRQAP G KG LEWVAEIRTKVNNHATNYGESVKGRFTISRDDSKNTVYL QM NSLRAEDTAVYYCRGALYDSFYFDYWG QGTLVTVSS
14D7 L - CDR3 (W92A)	232	HQASSFPYT
14D7 L CDR3(W9 2D)	233	HQDSSFPYT
14D7 L CDR3(W9 2E)	234	HQESSFPYT
14D7 L CDR3(W9 2F)	235	HQFSSFPYT
14D7 L CDR3(W9 2G)	236	HQGSSFPYT
14D7 L - CDR3 (W92H)	237	HQHSSFPYT
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da) (W92A)	238	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQASSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V LI (cadeia	239	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
VL humaniza da) (W92D)		CHQDSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da) (W92E)	240	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQESSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da) (W92F)	241	E1VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQFSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da) (W92G)	242	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQGSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V LI (cadeia VL humaniza da) (W92H)	243	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PKLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQHSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L2 (cadeia VL humaniza da) (W92A)	244	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQASSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L2 (cadeia VL humaniza	245	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQDSSFPYTFGQGTKLEIK

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
da) (W92D)
HU14D7V L2 (cadeia VL humaniza da) (W92E)	246	E1VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQESSFPYTFGQGTKLEIK
Hul4D7V L2 (cadeia VL humaniza da) (W92F)	247	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQFSSFPYTFGQGTKLEIK
Hul4D7V L2 (cadeia VL humaniza da) (W92G)	248	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQGSSFPYTFGQGTKLEIK
Hul4D7V L2 (cadeia VL humaniza da) (W92H)	249	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYY CHQHSSFPYTFGQGTKLEIK
Hul4D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92A)	250	E1 VLTQSPATLSLSPG E RATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPG QA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQASSFPYTFGQGTKLEIK
Hul4D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92D)	251	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQDSSFPYTFGQGTKLEIK

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
HU14D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92E)	252	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQESSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92H)	253	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQFSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92G)	254	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQGSSFPYTFGQGTKLEIK
HU14D7V L3 (cadeia VL humaniza da) (W92H)	255	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSGYLYWYQQKPGQA PRLWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQHSSFPYTFGQGTKLEIK
26B10 H - CDR2 (N55Q)	256	GLKPDQGGISYNQKFKG
26B10 H CDR2(N55 D)	257	GLKPDDGGISYNQKFKG
26B10 H CDR2(N56 A)	258	GLKPDNAGISYNQKFKG
26B10 H CDR2(N55 T)	259	GLKPDTGGISYNQKFKG
26B10 H CDR2(N55	260	GLKPDSGGISYNQKFKG

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
S)
26B10 H CDR2(N55 G)	261	GLKPDGGGISYNQKFKG
26B10 H - CDR2 (G56S)	262	GLKPDNSGISYNQKFKG
26B10 H CDR2(G56 T)	263	GLKPDNTGISYNQKFKG
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(N55Q	264	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDOGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYME LS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(N55D)	265	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDDGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYM E LS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(G56A)	266	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDNAGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYMELS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(N55T)	267	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDTGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYM E LS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(N55S)	268	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDSGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1	269	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDGGGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYMELS

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
(cadeia VH humaniza da)(N55G)		SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(G56S)	270	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDNSGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(G56T)	271	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVKQAPG KG LEWIGGLKPDNTGISYNQKFKGRATLTVDKSTNTAYM E LS SLRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(N55Q)	272	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDQGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(N55D)	273	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDDGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH1 (cadeia VH humaniza da)(G56A)	274	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNAGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(N55T)	275	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDTGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVS S
Hu26B10 VH2	276	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDSGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS

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Descrição	SEQ. ID NO	SEQUÊNCIA
(cadeia VH humaniza da)(N55S)		LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(N55G)	277	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDGGGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(G56S)	278	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNSGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH2 (cadeia VH humaniza da)(G56T)	279	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKTSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNTGISYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(N55Q)	280	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDQGGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(N55D)	281	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDDGGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(G56A)	282	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNAGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10	283	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG

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Descrição	SEQ ID NO	SEQUÊNCIA
VH3 (cadeia VH humaniza da)(N55T)		KG LEWIGG LKPDTGGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYM ELSS LRS E DTAVYYCARGAYYRYDADYWG QGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(N55S)	284	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDSGGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(N55G)	285	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGG LKPDGGG ISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYM E LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(G56S)	286	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGG LKPDNSG ISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYM ELSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
Hu26B10 VH3 (cadeia VH humaniza da)(G56T)	287	EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTFTEFTMHWVRQAPG KG LEWIGGLKPDNTGISYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYME LSS LRSEDTAVYYCARGAYYRYDADYWGQGTLVTVSS
hTIGIT epítopo (24-41)	288	SSTTAQVNWEQQDQL
hTIGIT epítopo (85-93)	289	IYHTYPDGT
hTIGIT epítopo (96-100)	290	GRIFL

[0143] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 188, uma

CDRH2 que compreende SEQ ID NO: 189, uma CDRH3 que compreende qualquer

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88/145 uma das SEQ ID NOs: 190, 220, 221 ou 222, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 191, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 192 e uma CDRL3 que compreende qualquer um dos SEQ ID NOs: 193, 232, 233, 234, 235, 236 ou 237.

[0144] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma CDRH1 que compreende SEQ ID NO: 204, uma CDRH2 que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 205, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 ou 263, uma CDRH3 que compreende SEQ ID NO: 206, uma CDRL1 que compreende SEQ ID NO: 207, uma CDRL2 que compreende SEQ ID NO: 208 e uma CDRL3 que compreende SEQ ID NO: 209.

[0145] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 194 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 195.

[0146] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 196 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 200.

[0147] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 210 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 211.

[0148] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 212 e uma região variável da cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 216.

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[0149] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 197, 198, 199, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 e 231 e uma região de cadeia leve variável que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254 e 255.

[0150] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 213, 214, 215, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 e 286 e uma região de cadeia leve variável que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 217, 218 e 219.

[0151] Os anticorpos anti-TIGIT adicionais que podem ser utilizados nas formulações na presente invenção descritas incluem aqueles divulgados, por exemplo, no Pedido Internacional PCT n° WO 2016/106302; WO 2016/011264; e WO 2009/126688.

TABELA 6: Sequências de cadeia pesada exemplificadoras

Domínio constante de cadeia pesada IgGl	291	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ G N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K
Domínio constante de cadeia pesada lgG4 S228P	292	TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSN KG LPSSIE KTISKA

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Domínio constante de cadeia leve kappa	293	VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0152] Em qualquer uma das modalidades mencionadas acima, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo que compreende qualquer uma das cadeias pesadas variáveis descritas acima e qualquer domínio constante da cadeia pesada humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção é do isotipo IgG e compreende um domínio constante humano da cadeia pesada de IgGl, lgG2, lgG3 ou lgG4 humanas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia pesada de IgGl humana (SEQ ID NO: 291) ou uma variante da mesma, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácidos modificadas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção é um anticorpo que compreende um domínio constante da cadeia pesada de IgGl humana que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 291. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia pesada de IgGl humana em que o domínio constante de IgGl é afucosilado. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia pesada de lgG4 humana ou uma variante do mesmo, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácidos modificadas. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia pesada de lgG4 humana, em que o aminoácido na posição 228 (usando o esquema de numeração da UE) foi substituído de Ser para Pro. Em uma modalidade, o

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91/145 anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia pesada de lgG4 humana que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 292.

[0153] Em qualquer uma das modalidades mencionadas acima, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode compreender qualquer uma das cadeias leves variáveis descritas acima e o domínio constante da cadeia leve humana. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia leve kappa humana ou uma variante do mesmo, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácidos modificadas. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia leve lambda humana ou uma variante do mesmo, em que a variante compreende até 20 substituições de aminoácidos modificadas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende um domínio constante da cadeia leve kappa humana que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 293.

Formulações

[0154] As formulações da invenção minimizam a formação de agregados de anticorpos (espécies de alto peso molecular) e partículas, espécies de alto e baixo peso molecular, minimizam a oxidação de resíduos de metionina e asseguram que o anticorpo retenha atividade biológica ao longo do tempo.

[0155] Em um aspecto, a presente invenção inclui várias formulações de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, a presente invenção inclui formulações que compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (ii) um tampão (por exemplo, L-histidina ou acetato), (iii) um açúcar não redutor (por

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92/145 exemplo, sacarose); (iv) um tensoativo não iônico (por exemplo, polissorbato 80); e (v) um antioxidante (por exemplo, L-metionina). Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um anticorpo anti-PDl. Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA). Em uma outra modalidade, o quelante é EDTA.

[0156] Em um outro aspecto, a presente invenção também inclui várias coformulações de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, a formulação compreende (i) um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (ii) um anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, (iii) um tampão (por exemplo, L-histidina ou acetato), (iv) um açúcar não redutor (por exemplo, sacarose), (v) um tensoativo não iônico (por exemplo, polissorbato 80) e (vi) um antioxidante (por exemplo, L-metionina). Em uma modalidade, a formulação compreende ainda um quelante. Em uma modalidade, o quelante está presente em uma quantidade de cerca de 1 μΜ a cerca de 50 μΜ. Em uma modalidade, o quelante é o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA). Em uma outra modalidade, o quelante é EDTA.

[0157] As formulações farmacêuticas da presente invenção podem incluir tampões.

[0158] Os tampões que são úteis nas formulações e métodos farmacêuticos da invenção incluem succinato (sódio ou potássio), L-histidina, fosfato (sódio ou potássio), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietanolamina, citrato (sódio), acetato (sódio) e similares. Em uma modalidade da invenção, o tampão está presente na formulação em uma concentração de cerca de 1 a 20 mM (1, 2, 3, 4,

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5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 mM). Em modalidades específicas da invenção, o tampão é histidina, por exemplo, tampão de Lhistidina.

[0159] O tampão dessa invenção tem um pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 6,5; cerca de 5,0 a 6,2; cerca de 5,5 a 6,0; e preferencialmente tem um pH de cerca de 5,8. Para chegar à formulação exemplificadora, os tampões de histidina e acetato na faixa de pH de 5,0 a 6,0 foram explorados para adequação. Quando uma faixa de valores de pH é recitada, como um pH entre pH 5,5 e 6,0, a faixa deve incluir os valores recitados. Por exemplo, um intervalo de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 inclui 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 e 6,0. Salvo indicação em contrário, o pH se refere ao pH após reconstituição das formulações liofilizadas da presente invenção. O pH é tipicamente medido a 25°C usando o medidor de pH padrão de bulbo de vidro. Como usado na presente invenção, uma solução que compreende tampão histidina em pH X se refere a uma solução em pH X e que compreende o tampão histidina, ou seja, o pH se destina a se referir ao pH da solução.

[0160] Em uma modalidade da invenção, a formulação anti-TIGIT e a coformulação de anti-TIGIT e anti-PD-1 humana compreendem um açúcar não redutor. Conforme usado neste documento, açúcar não redutor é um açúcar que não é capaz de atuar como agente redutor porque não contém ou não pode ser convertido para conter um grupo aldeído livre ou um grupo cetona livre. Exemplos de açúcares não redutores incluem, mas não estão limitados a, dissacarídeos, como sacarose e trealose. Em uma modalidade da invenção, o açúcar não redutor está presente em uma quantidade de cerca de 1 a 10% (p/v) (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10%). Em uma outra modalidade, o açúcar não redutor está presente em uma quantidade de cerca de 6% a cerca de 8% (p/v) (6, 7 ou 8%). Em uma outra modalidade, o açúcar não redutor está presente em uma

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94/145 quantidade de cerca de 6% (p/v). Em uma outra modalidade, o açúcar não redutor está presente em uma quantidade de cerca de 7% (p/v). Em uma outra modalidade, o açúcar não redutor está presente em uma quantidade de cerca de 8% (p/v). Em uma modalidade, a sacarose, trealose ou rafinose não redutora de açúcar. Em uma outra modalidade, o açúcar não redutor é sacarose. Em uma outra modalidade, a sacarose está presente em 6 a 8% em p/v. Em uma modalidade, a sacarose está presente em cerca de 6% (p/v). Em uma modalidade, a sacarose está presente em cerca de 7% (p/v). Em uma modalidade, a sacarose está presente em cerca de 8% (p/v).

[0161] As formulações da invenção também compreendem um tensoativo. Como na presente invenção utilizado, um tensoativo é um agente ativo de superfície que é de natureza anfipática. Os tensoativos podem ser adicionados às formulações deste documento para fornecer estabilidade, reduzir e/ou impedir a agregação ou para prevenir e/ou inibir danos às proteínas durante condições de processamento, como purificação, filtração, liofilização, transporte, armazenamento e entrega. Na presente invenção, um tensoativo pode ser útil para proporcionar estabilidade adicional ao ingrediente ativo (ou ingredientes ativos).

[0162] Os tensoativos não iônicos que podem ser úteis nas formulações, incluindo a coformulação da invenção, incluem, entre outros, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano (Polissorbatos, vendidos sob o nome comercial Tween® (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE)) incluindo Polissorbato 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano), Polissorbato 40 (monopalmitato de polioxietileno sorbitano), Polissorbato 60 (monoestearato de polioxietileno sorbitano) e Polissorbato 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitano); éteres alquil de polioxietileno como Brij® 58 (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE) e Brij® 35; poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton® X-100 (Union

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Carbide Corp., Houston, TX) e Triton® X-114; NP40; Span 20, Span 40, Span 60, Span 65, Span 80 e Span 85; copolimeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, a série pluronic® de tensoativos não iônicos, como pluronic® F68, pluronic® 10R5, pluronic® F108, pluronic® F127, pluronic® F38, pluronic® L44, pluronic® L62 (BASF Corp., Ludwigshafen, Alemanha) e dodecilsulfato de sódio (SDS). Em uma modalidade, o tensoativo não iônico é o polissorbato 80 ou ο polissorbato 20. Em uma modalidade, o tensoativo não iônico é o polissorbato 20. Em uma outra modalidade, o tensoativo não iônico é o polissorbato 80.

[0163] A quantidade de tensoativo não iônico a ser incluída nas formulações da invenção é uma quantidade suficiente para desempenhar a função desejada, ou seja, uma quantidade mínima necessária para estabilizar o ingrediente farmacêutico ativo (ou seja, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) na formulação. Todas as porcentagens para o tensoativo não iônico são listadas em % em p/v. Tipicamente, o tensoativo está presente em uma concentração de cerca de 0,008% a cerca de 0,1% em p/v. Em algumas modalidades desse aspecto da invenção, o tensoativo está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,09%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,08%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,07%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,06%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,05%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,04%; de cerca de 0,01% a cerca de 0,03%, de cerca de 0,01% a cerca de 0,02%, de cerca de 0,015% a cerca de 0,04%; de cerca de 0,015% a cerca de 0,03%, de cerca de 0,015% a cerca de 0,02%, de cerca de 0,02% a cerca de 0,04%, de cerca de 0,02% a cerca de 0,035% ou de cerca de 0,02% a cerca de 0,03%. Em modalidades específicas, o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,02%. Em modalidades alternativas,

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96/145 o tensoativo está presente em uma quantidade de cerca de 0,01%, cerca de 0,015%, cerca de 0,025%, cerca de 0,03%, cerca de 0,035% ou cerca de 0,04%.

[0164] Em modalidades exemplificativas da invenção, o tensoativo é um tensoativo não iônico selecionado do grupo que consiste em: Polissorbato 20 e Polissorbato 80. Em modalidades preferenciais, o tensoativo é o Polissorbato 80.

[0165] Em modalidades específicas, as formulações, incluindo as coformulações, da invenção compreendem cerca de 0,01% a cerca de 0,04% em p/v de polissorbato 80. Em outras modalidades, as formulações na presente invenção descritas compreendem polissorbato 80 em uma quantidade de cerca de 0,008% em p/v, cerca de 0,01% em p/v. Em uma modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,015% p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,02% em p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,025% em p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,03% em p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,035% em p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,04% em p/v. Em uma outra modalidade, a quantidade de polissorbato 80 é de cerca de 0,045% em p/v. Em modalidades particulares, as formulações da invenção compreendem cerca de 0,02% em p/v de polissorbato 80.

[0166] As formulações, incluindo as coformulações, da presente invenção também compreendem metionina, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, como um antioxidante. Em uma modalidade, a metionina é L- metionina. Em uma outra modalidade, a metionina é um sal farmaceuticamente aceitável de Lmetionina, tal como, por exemplo, HCL de metionina. Em uma modalidade da invenção, a metionina está presente na formulação em uma concentração de cerca de 1 a 20 mM (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 mM). Em uma outra modalidade, a metionina está presente de cerca de 5 mM

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97/145 a cerca de 10 mM (5, 6, 7, 8, 9 e 10 mM). Em uma outra modalidade, a metionina está presente em cerca de 10 mM.

[0167] As formulações, incluindo as coformulações, da presente invenção também podem compreender ainda um agente quelante. Em uma modalidade da invenção, o agente quelante está presente na formulação a uma concentração de cerca de 5 a 30 μΜ (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 μΜ). Em uma modalidade, o agente quelante é DTPA. Em uma outra modalidade, o agente quelante é EDTA.

Composições farmacêuticas liofilizadas

[0168] As formulações liofilizadas de proteínas terapêuticas fornecem várias vantagens.

[0169] As formulações liofilizadas em geral oferecem melhor estabilidade química do que as formulações em solução e, assim, meia-vida aumentada. Uma formulação liofilizada também pode ser reconstituída em diferentes concentrações, dependendo de fatores clínicos, como via de administração ou dosagem. Por exemplo, uma formulação liofilizada pode ser reconstituída em uma alta concentração (isto é, em um pequeno volume) se necessário para administração subcutânea ou em uma concentração mais baixa se administrada por via intravenosa. Também podem ser necessárias altas concentrações se for necessária alta dosagem para um indivíduo em particular, particularmente se administrada por via subcutânea onde o volume de injeção deve ser minimizado. Uma dessas formulações de anticorpos liofilizados é divulgada na patente US 6.667.958, que está incorporada na presente invenção por referência na sua totalidade. As formulações liofilizadas de outra proteína terapêutica são divulgadas na patente US 7.247.707, que está incorporada no presente documento por referência na sua totalidade.

[0170] Tipicamente, a formulação liofilizada é preparada em antecipação à

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98/145 reconstituição em alta concentração de medicamento (DP, em uma modalidade exemplificativa anticorpo anti-PD-1 humanizado de pembrolizumabe, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), ou seja, em antecipação à reconstituição em um baixo volume de água. A diluição subsequente com água ou tampão isotônico pode ser prontamente usada para diluir o DP para uma concentração mais baixa. Tipicamente, os excipientes são incluídos em uma formulação liofilizada da presente invenção em níveis que resultarão em uma formulação aproximadamente isotônica quando reconstituídos em alta concentração de DP, por exemplo, para administração subcutânea. A reconstituição em um volume maior de água para obter uma concentração mais baixa de DP reduzirá necessariamente a tonicidade da solução reconstituída, mas essa redução pode ter pouco significado na administração não subcutânea, por exemplo, intravenosa. Se a isotonicidade for desejada em menor concentração de DP, o pó liofilizado pode ser reconstituído no baixo volume padrão de água e depois diluído com diluente isotônico, como cloreto de sódio a 0,9%.

[0171] As formulações liofilizadas da presente invenção são formadas por liofilização (liofilização) de uma solução de pré-liofilização. A liofilização é realizada congelando a formulação e sublimitando a água a uma temperatura adequada para a secagem primária. Sob essa condição, a temperatura do produto está abaixo do ponto eutético ou da temperatura de colapso da formulação. Tipicamente, a temperatura da prateleira para a secagem primária varia de cerca de -30 a 25°C (desde que o produto permaneça congelado durante a secagem primária) a uma pressão adequada, variando tipicamente de cerca de 50 a 250 mTorr. A formulação, tamanho e tipo do recipiente que contêm a amostra (por exemplo, frasco de vidro) e o volume de líquido determinam o tempo necessário para a secagem, que pode variar de algumas horas a vários dias (por exemplo, 40 a 60 horas). Uma etapa de secagem secundária pode ser

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99/145 realizada a cerca de 0 a 40°C, dependendo principalmente do tipo e tamanho do recipiente e do tipo de proteína utilizada. 0 tempo de secagem secundário é determinado pelo nível de umidade residual desejado no produto e tipicamente leva pelo menos cerca de 5 horas. Tipicamente, o teor de umidade de uma formulação liofilizada é inferior a cerca de 5% e preferencialmente inferior a cerca de 3%. A pressão pode ser a mesma que a empregada durante a etapa de secagem primária. As condições de liofilização podem variar, dependendo da formulação e tamanho do frasco.

[0172] Em alguns casos, pode ser desejável liofilizar a formulação de proteína no recipiente em que a reconstituição da proteína deve ser realizada, a fim de evitar uma etapa de transferência. O recipiente neste caso pode, por exemplo, ser um frasco de 3, 5, 10, 20, 50 ou 100 cc.

[0173] As formulações liofilizadas da presente invenção são reconstituídas antes da administração. A proteína pode ser reconstituída em uma concentração de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 ou 100 mg/mL ou concentrações mais altas, como 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL ou 300 mg/mL até cerca de 500 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 10 a 300 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 20 a 250 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 150 a 250 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 180 a 220 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 50 a 150 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 100 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 75 mg/mL. Em uma modalidade, a concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 50 mg/mL. Em uma modalidade, a

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100/145 concentração de proteína após reconstituição é de cerca de 25 mg/mL. Altas concentrações de proteína são particularmente úteis quando se pretende a liberação subcutânea da formulação reconstituída. No entanto, para outras vias de administração, como administração intravenosa, podem ser desejadas concentrações mais baixas da proteína (por exemplo, de cerca de 5 a 50 mg/mL).

[0174] A reconstituição geralmente ocorre a uma temperatura de cerca de 25°C para garantir a hidratação completa, embora outras temperaturas possam ser empregadas como desejado. O tempo necessário para a reconstituição dependerá, por exemplo, do tipo de diluente, quantidade de excipiente (ou excipientes) e proteína. Diluentes exemplificativas incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

Composições farmacêuticas líquidas

[0175] Uma formulação líquida de anticorpo pode ser feita tomando a substância do fármaco (por exemplo, anti-PD-1 humanizado) que está na forma líquida (por exemplo, pembrolizumabe em uma formulação farmacêutica aquosa) e trocando-a para o tampão desejado como a última etapa do processo de purificação. Não há etapa de liofilização nesta modalidade. A substância do fármaco no tampão final é concentrada até uma concentração desejada. Excipientes como sacarose e polissorbato 80 são adicionados à substância farmacológica e são diluídos usando o tampão apropriado até a concentração final de proteína. A substância medicamentosa final formulada é filtrada usando filtros de 0,22 pm e colocada em um recipiente final (por exemplo, frascos de vidro).

III. Métodos de Uso

[0176] A invenção também se refere a um método de tratamento de câncer

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101/145 em um indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de qualquer uma das formulações da invenção; isto é, qualquer formulação na presente invenção descrita, para o indivíduo. Em algumas modalidades específicas desse método, a formulação é administrada ao indivíduo via administração intravenosa. Em outras modalidades, a formulação é administrada ao indivíduo por administração subcutânea. Em uma modalidade, a invenção compreende um método de tratamento de câncer em um paciente humano que compreende a administração de qualquer formulação da invenção ao paciente.

[0177] Em qualquer um dos métodos da invenção, o câncer pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: melanoma, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer gastrointestinal, mieloma múltiplo, câncer hepatocelular, linfoma, câncer renal, mesotelioma, câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer anal, câncer do trato biliar, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de tireoide, câncer salivar, câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônio), câncer de pâncreas, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de fígado, tireoide câncer, glioblastoma, glioma e outras malignidades neoplásicas.

[0178] Em algumas modalidades, o câncer de pulmão no câncer de pulmão de células não pequenas.

[0179] Em modalidades alternativas, o câncer de pulmão é um câncer de células pequenas.

[0180] Em algumas modalidades, o linfoma é linfoma de Hodgkin.

[0181] Em outras modalidades, o linfoma é um linfoma não Hodgkin. Em modalidades particulares, o linfoma é um linfoma mediastinal de células B grandes.

[0182] Em algumas modalidades, o câncer de mama é um câncer de mama

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102/145 triplo negativo.

[0183] Em outras modalidades, o câncer de mama é o câncer de mama ER +/HER2-.

[0184] Em algumas modalidades, o câncer de bexiga é câncer urotelial.

[0185] Em algumas modalidades, o câncer de cabeça e pescoço é câncer nasofaríngeo. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de tireoide. Em outras modalidades, o câncer é câncer salivar. Em outras modalidades, o câncer é carcinoma espinocelular da cabeça e pescoço.

[0186] Em uma modalidade, a invenção compreende um método de tratamento de câncer de pulmão metastático de células não pequenas (NSCLC) em um paciente humano que compreende a administração de uma formulação da invenção ao paciente. Em modalidades específicas, o paciente tem um tumor com alta expressão de PD-L1 [(Pontuação de Proporção de Tumor (TPS) >50%)]] e não foi tratado anteriormente com quimioterapia contendo platina. Em outras modalidades, o paciente tem um tumor com expressão de PD-L1 (TPS >1%) e foi tratado anteriormente com quimioterapia contendo platina. Em ainda outras modalidades, o paciente tem um tumor com expressão de PD-L1 (TPS >1%) e não foi tratado anteriormente com quimioterapia contendo platina. Em modalidades específicas, o paciente teve progressão da doença ou após receber quimioterapia contendo platina. Em certas modalidades, o PD-L1 TPS é determinado por um teste aprovado pela FDA. Em certas modalidades, o tumor do paciente não possui aberrações genômicas de EGFR ou ALK. Em certas modalidades, o tumor do paciente tem uma aberração genômica de EGFR ou ALK e teve progressão da doença após receber tratamento para as aberrações de EGFR ou ALK antes de receber o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0187] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer colorretal metastático com altos níveis de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

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[0188] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer colorretal metastático com altos níveis de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

[0189] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido com um alto nível de instabilidade de microssatélites (MSI-H).

[0190] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido com uma alta carga mutacional.

[0191] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas, linfoma de Hodgkin clássico reincidente ou refratário, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer urotelial, câncer de esôfago, câncer gástrico e câncer hepatocelular.

[0192] Em outras modalidades dos métodos de tratamento acima, o câncer é uma neoplasia heme. Em certas modalidades, a neoplasia Heme é leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), DLBCL EBV positivo , linfoma mediastinal primário de grandes células B, linfoma de células B grandes e rico em histiócitos, linfoma folicular, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma de células do manto (MCL), mieloma múltiplo (MM), proteína da leucemia celular 1 (Mcl-1), síndrome mielodisplásica (SMD), linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfoma linfocítico pequeno (SLL).

[0193] As malignidades que demonstram uma sobrevida livre de doença e geral melhorada em relação à presença de linfócitos infiltrantes de tumor na biópsia ou material cirúrgico, por exemplo, melanoma, colorretal, fígado, rim, estômago/esôfago, mama, pâncreas e câncer de ovário estão incluídos no métodos e tratamentos na presente invenção descritos. Sabe-se que esses subtipos de câncer são suscetíveis ao controle imune pelos linfócitos T. Além disso, estão incluídas malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento

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104/145 pode ser inibido usando os anticorpos na presente invenção descritos.

[0194] Os cânceres adicionais que podem se beneficiar do tratamento com as formulações descritas na presente invenção incluem aqueles associados à infecção persistente por vírus como o vírus da imunodeficiência, vírus da hepatite classe A, B e C, vírus Epstein Barr, vírus do papiloma humano que são conhecidos por causar causalidade, por exemplo, sarcoma de Kaposi, câncer de fígado, câncer nasofaríngeo, linfoma, colo uterino, vulvar, anal, pênis e câncer bucal.

[0195] As formulações também podem ser usadas para prevenir ou tratar infecções e doenças infecciosas. Assim, a invenção fornece um método para o tratamento de infecção crônica em um mamífero, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma formulação da invenção ao indivíduo. Em algumas modalidades específicas deste método, a formulação é administrada ao indivíduo via administração intravenosa. Em outras modalidades, a formulação é administrada ao indivíduo por administração subcutânea.

[0196] Esses agentes podem ser usados sozinhos ou em combinação com vacinas para estimular a resposta imune a patógenos, toxinas e autoantígenos. Os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser usados para estimular a resposta imune a vírus infecciosos para seres humanos, incluindo, entre outros: vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite classe A, B e C, vírus Epstein Barr, citomegalovírus humano, vírus do papiloma humano e vírus do herpes. Anticorpos anti-PD-1 antagonistas ou fragmentos de anticorpos podem ser usados para estimular a resposta imune à infecção por parasitas bacterianos ou fúngicos e outros patógenos. As infecções virais com hepatite B e C e HIV estão entre as consideradas infecções virais crônicas.

[0197] As formulações da invenção podem ser administradas a um paciente

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105/145 em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. O agente terapêutico adicional pode ser um agente bioterapêutico (incluindo, entre outros, anticorpos para os receptores VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF, outros receptores do fator de crescimento, CD20, CD40, CD-40L, OX-40, 4-1BB e ICOS), um agente imunogênico (por exemplo, células cancerígenas atenuadas, antígenos tumorais, células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas pulsadas com antígeno derivado de tumor ou ácidos nucleicos, citocinas estimuladoras do sistema imunológico (por exemplo, IL-2, IFNct2, GM-CSF) e células transfectadas com genes que codificam citocinas estimuladoras do sistema imunológico, tais como mas não limitadas a GM-CSF).

[0198] Como observado acima, em algumas modalidades dos métodos da invenção, o método compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional. Em modalidades particulares, o agente terapêutico adicional é um anticorpo anti-LAG3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-GITR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-CTL4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-CD27 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um vetor viral da doença de Newcastle que expressa IL-12. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico adicional é o dinaciclib. Em ainda outras modalidades, o agente terapêutico adicional é um agonista de STING.

[0199] As vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir administração parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea, bem como intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal. Os medicamentos podem ser administrados de várias maneiras convencionais, como injeção intraperitoneal, parentérica, intra-arterial ou intravenosa. Os modos de administração em que o volume da solução deve ser limitado (por exemplo,

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106/145 administração subcutânea) requerem uma formulação liofilizada para permitir a reconstituição em alta concentração.

[0200] A seleção de uma dosagem do agente terapêutico adicional depende de vários fatores, incluindo a taxa de renovação sérica ou tecidual da entidade, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade e acessibilidade das células, tecidos ou órgãos-alvo no indivíduo a ser tratado. A dosagem do agente terapêutico adicional deve ser uma quantidade que forneça um nível aceitável de efeitos colaterais. Por conseguinte, a quantidade de dose e a frequência de dosagem de cada agente terapêutico adicional (por exemplo, agente bioterapêutico ou quimioterápico) dependerão em parte do agente terapêutico específico, da gravidade do câncer sendo tratado e das características do paciente. Estão disponíveis orientações na seleção de doses apropriadas de anticorpos, citocinas e moléculas pequenas. Consulte, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nova York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nova York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341: 1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343: 15941602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57^ Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57^ edição (novembro de 2002). A determinação do regime de dosagem apropriado pode ser feita pelo clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica para afetar o tratamento ou com previsão de afetar o tratamento, e dependerá, por exemplo, da história clínica do paciente (por exemplo, terapia

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107/145 anterior), o tipo e estágio do câncer a ser tratado e biomarcadores de resposta a um ou mais agentes terapêuticos na terapia combinada.

[0201] Estão disponíveis várias referências da literatura para facilitar a seleção de veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o agente terapêutico adicional. Consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984); Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins, Nova York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosagem Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nova York, NY.

[0202] Uma formulação farmacêutica de anticorpo pode ser administrada por infusão contínua ou por doses em intervalos de, por exemplo, um dia, 1 a 7 vezes por semana, uma semana, duas semanas, três semanas, mensalmente, bimestralmente etc. Um protocolo de dose preferencial é um envolvendo a dose máxima ou a frequência da dose que evita efeitos colaterais indesejáveis significativos. Uma dose semanal total é geralmente de pelo menos 0,05 pg/kg, 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg de peso corporal ou mais. Consulte, por exemplo, Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349: 427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Liu et al. (1999)7. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji etal. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. A dose desejada de uma terapêutica de molécula pequena, por exemplo, um

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108/145 mimético peptídico, produto natural ou produto químico orgânico, é aproximadamente a mesma que para um anticorpo ou polipeptídeo, em moles/kg.

[0203] As modalidades da invenção também incluem uma ou mais das formulações biológicas na presente invenção descritas (i) para uso em, (ii) para uso como medicamento ou composição para, ou (iii) para uso na preparação de um medicamento para: (a) terapia (por exemplo, do corpo humano); b) medicamento; (c) indução ou aumento de uma resposta imunológica antitumoral (d) diminuição do número de um ou mais marcadores tumorais em um paciente; (e) interromper ou retardar o crescimento de um tumor ou câncer de sangue; (f) interromper ou retardar a progressão de uma doença relacionada a PD-1 ou de uma doença relacionada ao anti-TIGIT; (g) interromper ou retardar o câncer de progressão; (h) estabilização da doença relacionada a PD-1 ou de uma doença anti-TIGIT; (i) inibição do crescimento ou sobrevivência de células tumorais; (j) eliminar ou reduzir o tamanho de uma ou mais lesões ou tumores cancerígenos; (k) redução da progressão, início ou gravidade da doença relacionada a PD-1 ou de uma doença anti-TIGIT; (I) reduzir a gravidade ou a duração dos sintomas clínicos de doenças relacionadas a PD-1 ou relacionadas ao anti-TIGIT, como o câncer (m) prolongar a sobrevida de um paciente em relação à sobrevida esperada em um paciente não tratado semelhante n) induzir completa ou remissão parcial de uma condição cancerígena ou outra doença relacionada com PD-1 ou anti-TIGIT, o) tratamento de câncer, ou p) tratamento de infecções crônicas.

MÉTODOS GERAIS

[0204] Os métodos padrão em biologia molecular são descritos Sambrook, Fritsch e Maniatis (1982 & 1989 2- Edição, 2001 3^ Edição) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor

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Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning, 3^g ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, volume 217, Academic Press, San Diego, CA). Os métodos padrão também aparecem em Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, volumes 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que descreve a clonagem em células bacterianas e a mutagênese do DNA (Volume 1), clonagem em células de mamíferos e leveduras (volume 2), glicoconjugados e expressão de proteínas (Vol.3) e bioinformática (volume 4).

[0205] São descritos métodos para purificação de proteínas, incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, volume 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova York). As análises químicas, modificação química, modificação pós-traducional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de proteínas são descritas (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, volume 2, John Wiley and Sons, Inc., Nova York; Ausubel, etal. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, volume 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, páginas 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; páginas 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, NJ, páginas 384-391). A produção, purificação e fragmentação de anticorpos policlonais e monoclonais são descritas (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, volume 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra). Técnicas padrão para as caracterizações de interações ligando/receptor estão disponíveis (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, volume 4, John Wiley, Inc., Nova York).

[0206] Os anticorpos monoclonais, policlonais e humanizados podem ser

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110/145 preparados (ver, por exemplo, Sheperd e Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nova York, NY; Kontermann e Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nova York; Harlow e Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 139-243; Carpenter et al. (2000) J. Immunol. 165: 6205; He eta/. (1998)7. Immunol. 160:1029; Tang eta/. (1999)7. Biol. Chem. 274: 27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883; Foote e Winter (1992) 7. Mol. Biol. 224: 487-499; Patente 6.329.511).

[0207] Uma alternativa à humanização é usar bibliotecas de anticorpos humanos exibidas em fagos ou bibliotecas de anticorpos humanos em camundongos transgênicos (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 309314; Barbas (1995) Nature Medicine 1: 837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Hoogenboom e Chames (2000) Immunol. Today 21: 371377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin etal. (1999) Nature Biotechnol. 17: 397-399).

[0208] A purificação do antígeno não é necessária para a geração de anticorpos. Os animais podem ser imunizados com células portadoras do antígeno de interesse. Os esplenócitos podem então ser isolados dos animais imunizados, e os esplenócitos podem ser fundidos com uma linha celular de mieloma para produzir um hibridoma (ver, por exemplo, Meyaard et al. (1997) Immunity 7: 283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13: 233-242; Preston et al. supra; Kaithamana et al. (1999^7. Immunol. 163:5157-5164).

[0209] Os anticorpos podem ser conjugados, por exemplo, com pequenas moléculas de fármacos, enzimas, lipossomas, polietilenoglicol (PEG). Os

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111/145 anticorpos são úteis para fins terapêuticos, diagnósticos, kits ou outros fins e incluem anticorpos acoplados, por exemplo, a corantes, radioisótopos, enzimas ou metais, por exemplo, ouro coloidal (ver, por exemplo, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146: 169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160: 3891-3898; Hsing e Bishop (1999) J. Immunol. 162: 2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168: 883-889).

[0210] Os métodos para citometria de fluxo, incluindo a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), estão disponíveis (ver, por exemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2- Ed.; WileyLiss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Os reagentes fluorescentes adequados para modificação de ácidos nucleicos, incluindo iniciadores de ácido nucleico e sondas, polipeptideos e anticorpos, para uso, por exemplo, como reagentes de diagnóstico, estão disponíveis (Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

[0211] Os métodos padrão de histologia do sistema imunológico são descritos (ver, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nova York, NY; Hiatt etal. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila, PA; Louis et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nova York, NY).

[0212] Os pacotes de software e bancos de dados para determinar, por exemplo, fragmentos antigênicos, sequências líderes, dobra de proteínas, domínios funcionais, locais de glicosilação e alinhamentos de sequências, estão disponíveis (consulte, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); Pacote Wiscosin GCG (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16:

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741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16: 741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res.14: 46834690).

Métodos Analíticos

[0213] Os métodos analíticos adequados para avaliar a estabilidade do produto incluem cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), teste de espalhamento dinâmico de luz (DLS), calorímetro de varredura diferencial (DSC), quantificação iso-asp, potência, UV a 340 nm, espectroscopia UV e FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645 a 1650, (1994); Pharm. Res. 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal. 15: 1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14: 1133 a 1140 (1986)) mede a percentagem de monómero no produto e fornece informação da quantidade de agregados solúveis. DSC (Pharm. Res. 15: 200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982)) fornece informações da temperatura de desnaturação da proteína e da temperatura de transição vítrea. DLS (American Lab., novembro (1991)) mede o coeficiente de difusão médio e fornece informações sobre a quantidade de agregados solúveis e insolúveis. O UV a 340 nm mede a intensidade da luz dispersa a 340 nm e fornece informações sobre as quantidades de agregados solúveis e insolúveis. A espectroscopia de UV mede a absorbância a 278 nm e fornece informações sobre a concentração de proteínas. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45: 231 (1998); Pharm. Res. 12:1250 (1995); J. Pharm. Scien. 85:1290 (1996); J. Pharm. Scien., 87: 1069 (1998)) mede o espectro de IV na região da amida 1 e fornece informações da estrutura secundária da proteína.

[0214] O teor de iso-asp nas amostras é medido usando o Sistema de Detecção de Isoaspartato de Isoquant (Promega). O kit usa a enzima Proteína Isoaspartil Metiltransferase (PIMT) para detectar especificamente a presença de resíduos de ácido isoaspártico em uma proteína-alvo. A PIMT catalisa a

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113/145 transferência de um grupo metil da S-adenosil-L-metionina para o ácido isoaspártico na posição alfa-carboxila, gerando S-adenosil-L-homocisteína (SAH) no processo. Esta é uma molécula relativamente pequena e geralmente pode ser isolada e quantificada por HPLC de fase reversa usando os padrões SAH HPLC fornecidos no kit.

[0215] A potência ou bioidentidade de um anticorpo pode ser medida por sua capacidade de se ligar ao seu antígeno. A ligação específica de um anticorpo ao seu antígeno pode ser quantificada por qualquer método conhecido dos elementos versados na técnica, por exemplo, um imunoensaio, como o ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática).

[0216] Todas as publicações mencionadas na presente invenção são incorporadas por referência com o objetivo de descrever e divulgar metodologias e materiais que podem ser utilizados em conexão com a presente invenção.

[0217] Tendo descrito diferentes modalidades da invenção neste documento com referência aos desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não se limita a essas modalidades precisas e que várias alterações e modificações podem ser efetuadas por um elemento versado na técnica sem se afastar de o escopo ou espírito da invenção, como definido nas reivindicações apensas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Triagem de Tampão de Formulação Anti-TIGIT

[0218] Foi realizado um estudo de desenvolvimento de formulação de alto rendimento para três anticorpos anti-TIGIT, cada anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 de SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112 e LCDR3 da SEQ ID NO: 113, para avaliar (1) passivos biofísicos/bioquímicos; (2) condições de

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114/145 pré-formulação (pH, sal e tampão) e (3) compatibilidade com a formulação da plataforma. As amostras foram analisadas por espectrofotometria UV/Vis para turbidez (A350) como substituto de agregados maiores, cromatografia de exclusão por tamanho (UP-SEC) para detectar a formação de espécies de alto peso molecular, foco isoelétrico capilar (clEF) para medir o efeito do estresse na distribuição de cargas na superfície da molécula, reduzindo a eletroforese capilar de dodecilsulfato de sódio (CE-SDS) para detectar a divagem proteolítica das cadeias pesada ou leve, análise de partículas subvisíveis para detectar agregados subvisíveis.

[0219] A triagem da formulação de alto rendimento foi composta por 1 mg/mL de anticorpo anti-TIGIT formulado em uma seleção de três espécies de tampão: tampão de acetato com valores de pH variando de 5,0 a 6,2, tampão de citrato com valores de pH variando de 5,6 a 6,8 e tampão de L-histidina com valores de pH variando de 5,0 a 6,8. Assim, foram examinados valores de pH variando de 5,0 a 6,8 e força iônica de NaCI de 0 a 150 mM. As amostras foram estressadas a 50°C por 10 dias e analisadas quanto à estabilidade térmica por fluorescência de varredura diferencial (DSF), estabilidade coloidal por cromatografia de exclusão por tamanho (UP-SEC), propensão à agregação usando Guava (um ensaio de caracterização subvisível baseado em citometria de fluxo), turbidez (medições A350), perfil de variantes de carga (clEF) e perfil de fragmentação usando o Caliper.

[0220] Com base nos resultados obtidos do estudo, a formulação que conferiu a máxima estabilidade à proteína foi 10 mM de L-histidina na faixa de pH de 5,6 a 6,2. L-Histidina a 10 mM na faixa de pH de 5,6 a 6,2 mostrou agregação mínima monitorada por UP-SEC com ASEC principal variando entre 1,63 a -1,85% (em comparação com SEC principal variando de -2,0 a -5,0% em outras condições de tampão e pH) (dados não mostrados). O perfil do clEF

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115/145 mostrou diminuição da área relativa do pico das espécies principal e básica, e o aumento da área relativa do pico das variantes ácidas foi observado nas amostras após 10 dias a 50°C (clEF principal variando entre -9,0 e - 11,3%) (dados não mostrados). Uma diminuição de variantes básicas e aumento de variantes ácidas após exposição a temperaturas elevadas é uma ocorrência comum para mAbs. A adição de sal reduziu a estabilidade da proteína nas composições estudadas.

EXEMPLO 2

Estudo de faixa de pH de Formulação Anti-TIGIT

[0221] Neste estudo, um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112 e LCDR3 da SEQ ID NO: 113, foram testados na concentração de 50 mg/mL em 10 mM de tampão de Lhistidina. Adicionou-se sacarose a 7% (p/v) à formulação para aumentar a estabilidade do volume (como estabilizador e modificador de tonicidade não iônica) da molécula. O anticorpo anti-TIGIT foi formulado em tampão de Lhistidina a 10 mM, sacarose a 7% a pH 5,5, pH 6,0 e pH 6,5. A estabilidade de tais formulações foi avaliada da seguinte forma:

(1) A estabilidade da molécula foi monitorada sob condições térmicas e de estabilidade de armazenamento aceleradas (5°C, 25°C e 40°C por até 6 meses), protegidas da luz.

(2) Também foram realizados estudos de estabilidade para estresse por congelamento-descongelamento e estresse por agitação.

(3) Foi realizado um estudo de agitação em formulações contendo concentrações variadas de polissorbato 80 (PS-80) para avaliar a concentração de PS-80 na formulação.

(4) Um estudo de estresse leve foi conduzido para avaliar a necessidade de L-metionina nas formulações.

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Materiais e Métodos

Estudo de estabilidade térmica (3 meses)

[0222] Formulou-se 50 mg/mL de anticorpo anti-TIGIT em tampão de Lhistidina a 10 mM, sacarose a 7%, 0,2 mg/mL de polissorbato 80 a pH 5,5, pH 6,0 ou pH 6,5. As formulações resultantes foram filtradas estéril e preenchidas em frascos 2R, tapados com rolhas de clorobutila e tapados com tampas de alumínio com vedantes. O estudo de estabilidade foi realizado a 5°C (umidade ambiente), 25°C (60% de umidade relativa) e 40°C/ (75% de umidade relativa). As amostras foram analisadas usando UP-SEC, HP-IEX, clEF (amostras selecionadas), MFI, CESDS (NR não redutor e R redutor), mapeamento peptídico redutor (MFI e mapeamento peptídico redutor foi realizado em pontos selecionados no tempo).

[0223] Foi estabelecido um estudo de estabilidade térmica de 1 mês para 25 mg/mL de anticorpo anti-TIGIT formulado em tampão de L-histidina a 10 mM, sacarose a 7%, 0,2 mg/mL de PS-80, pH 6,0. A formulação resultante foi filtrada estéril e preenchida com frascos 2R, tapados com rolhas de clorobutila e tapados com vedantes de alumínio. O estudo de estabilidade foi realizado a 5°C (umidade ambiente), 25°C (60% de umidade relativa) e 40 ° C/(75% de umidade relativa) por um mês. As amostras foram analisadas usando UP-SEC, clEF e CE-SDS (NR e R).

Estudo de estabilidade da agitação

[0224] 50 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT foram formulados em tampão de L-histidina a 10 mM, sacarose a 7%, pH 6,0 com várias concentrações de polissorbato 80 (0, 0,1 e 0,2 mg/mL). As formulações resultantes foram filtradas estéreis e preenchidas em frascos de 2R (volume de enchimento de 1,2 mL), tapados com rolhas de clorobutila e tapadas com tampas de alumínio com vedantes. As amostras foram agitadas na posição horizontal a 300 RPM por até 7 dias a 18 a 22°C. As amostras foram analisadas usando UP-SEC, MFI, CE-SDS (NR

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117/145 e R).

Estabilidade de congelamento e descongelamento

[0225] Formulou-se 50 mg/mL de anticorpo anti-TIGIT em tampão de Lhistidina a 10 mM, sacarose a 7%, polissorbato 80 0,2 mg/mL, pH 6,0. A formulação resultante foi filtrada estéril e preenchida com frascos de 2R, tapados com rolhas de clorobutila e tapados com tampas de alumínio com vedantes. As amostras foram submetidas a 5 ciclos de congelamento e descongelamento de 80°C a 18 a 22°C (pelo menos 24 horas em condições congeladas e em temperatura ambiente até o descongelamento completo). As amostras foram analisadas usando UP-SEC, MFI, CE-SDS (NR e R).

Estudo da estabilidade do estresse luminoso

[0226] Os estudos de desenvolvimento inicial indicaram a presença de um resíduo de triptofano exposto, bem como de algumas metioninas que eram responsáveis pela oxidação sob estresse leve. Os estudos foram realizados sob condições de estresse luminoso ICH de luz visível (CWF, 0,lx ICH, 0,2x ICH, 0,5x ICH, lx ICH) em formulações com e sem L-metionina (Formulação 1: tampão de L-Histidina 1: 10 mM, 7% de Sacarose, 0,2 mg/mL de polissorbato 80, pH 6,0 e Formulação 2: 10 mM de tampão de L-histidina, L-metionina a 10 mM, sacarose a 7%, sacarose a 7%, polissorbato 80 a 0,2 mg/mL, pH 6,0). As amostras foram analisadas usando UP-SEC, clEF, CE-SDS (NR e R) e mapeamento peptídico redutor.

Resultados

Resultados de estabilidade térmica

[0227] Formulação de 50 mg/ml: Para todos os ensaios de estabilidade testados, não foram observadas alterações significativas a 5°C em todos os valores de pH após 3 meses (dados não mostrados). A 25°C e 40°C, pH 5,5 e pH 6,0 apresentaram estabilidade semelhante e essas condições foram mais estáveis que pH 6,5 (dados não mostrados). As taxas de degradação em pH 6,5 para os

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118/145 ensaios UP-SEC, CE-SDS (NR) e clEF a 25°C e 40°C foram relativamente maiores que as observadas em pH 5,5 e pH 6,0 e também quando comparadas à molécula de referência. Portanto, uma faixa de pH de 5,5 a 6,0 (pl de 8,7) foi considerada adequada. Não foi observada oxidação, desamidação ou isomerização para o anticorpo anti-TIGIT após 3 meses em todas as temperaturas e valores de pH.

[0228] Formulação de 25 mg/ml: Observou-se degradação a 25°C e 40°C para todos os ensaios testados. As taxas de degradação foram semelhantes às condições de 50 mg/mL (ver acima).

Estudo de estabilidade da agitação

[0229] As formulações que não continham polissorbato 80 mostraram partículas visíveis no final de 7 dias. A análise de partículas invisível mostrou que partículas de 10 pm ou mais foram significativamente reduzidas na formulação contendo 0,2 mg/mL de concentração de polissorbato 80. Não foram observadas diferenças significativas entre as amostras usando os outros ensaios.

Estabilidade de congelamento e descongelamento

[0230] Não foram observadas alterações na estabilidade da molécula após 5 ciclos de congelamento e descongelamento em todos os ensaios testados.

Estudo da estabilidade do estresse luminoso

[0231] A degradação foi observada quando as amostras de ambas as formulações foram expostas ao estresse luminoso igual ou superior a 0,5x ICH quando testadas por UP-SEC, clEF, CE-SDS (NR e R). As condições estabelecidas abaixo de 0,5x ICH não mostraram degradação significativa para ambas as formulações. Os dados de mapeamento de peptídeos reduzidos sob condições de estresse de luz 0,5x e acima mostraram oxidação dos resíduos de triptofano e metionina. L-metionina a 10 mM na formulação reduziu os níveis de oxidação dos resíduos de metionina, mas não afetou os níveis de oxidação do triptofano.

Conclusão

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[0232] Com base no exposto, considera-se adequado 10 mM de tampão de L-histidina, L-metionina a 10 mM, sacarose a 7%, polissorbato 80 0,2 mg/mL pH 5,5-6,0, adequado para conferir estabilidade para suportar a vida útil em condições refrigeradas.

EXEMPLO 3

Estudos de pH adicionais

[0233] Um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112 e a LCDR3 da SEQ ID NO: 113 e em um esqueleto de IgGl foi formulado em seis tampões de histidina a 10 mM com pH diferente (variando de 5,0 a 6,5). A estabilidade térmica em diferentes formulações foi estudada a 2 ~ 8°C, 25°C e 40°C ao longo de 8 semanas.

Formulação	Anticorpo anti-TIGIT	Tampão	PH	Sacarose (% p/v)	Polissorbato 80 (% p/v)
1	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,0	7%	0,02%
2	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,3	7%	0,02%
3	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,6	7%	0,02%
4	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,9	7%	0,02%
5	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=6,2	7%	0,02%
6	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=6,5	7%	0,02%

[0234] Os tampões de histidina de pH diferente (5,0 ~ 6,5) foram preparados por titulação de 10 mM de tampão de L-histidina em tampão de Lhistidina-HCI a 10 mM. O anticorpo anti-TIGIT foi trocado por tampão em seis tampões diferentes de histidina com pH diferente através de quatro a cinco ciclos de ultrafiltração usando o dispositivo de centrifugação sob a condição de 4°C e 4.500 rpm ~ 5.000 rpm (105 ~ 260 min em cada rodada). Após a troca de tampão, a quantidade específica de solução-mãe de sacarose e polissorbato 80 (1%, p/p) foi adicionada a soluções de pH diferentes para atingir a quantidade-alvo e a quantidade apropriada de tampão de histidina correspondente foi adicionada

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120/145 também para ajustar a concentração de anticorpos para cerca de 50 mg/mL.

[0235] As formulações foram então filtradas assepticamente com filtro de membrana de 0,22 μηη. 3 mL de cada amostra foram preenchidos assepticamente em frascos de vidro de 6 mL para o estudo de estabilidade térmica TO, 4 semanas (4 W) e 8 semanas (8 W). 1 mL de cada a amostra foi assepticamente preenchida em frascos de vidro de 6 mL para o estudo de estabilidade térmica de duas semanas (2 W). Os frascos cheios foram tapados e lacrados imediatamente após o enchimento. Todas as etapas acima foram realizadas no exaustor de biossegurança. Esses frascos foram colocados em caixas cobertas e armazenados em diferentes condições de temperatura para estudo de estabilidade térmica.

Resultados e discussão

[0236] A aparência de todas as amostras permaneceu a mesma dentro de quatro semanas em todas as condições. No entanto, após 8 semanas, as amostras a 2 ~ 8°C e 25°C apresentaram coloração ligeiramente amarelada e amostras a 40°C mostraram um amarelado mais profundo. Todas as amostras eram levemente opalescentes e livres de partículas visíveis durante o período de estudo. Uma mudança considerável na concentração de proteínas de todas as amostras não foi observada durante o estudo.

[0237] A estabilidade coloidal das amostras foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) quanto à pureza na qual a porcentagem de monômero, as porcentagens de espécies de alto peso molecular (HMW) e os picos de eluição tardia (espécies LMW). A análise foi realizada usando um sistema Agilent 1260 Infinity com a coluna de cromatografia de exclusão por tamanho TSKGel G3000SWXL (300 χ 7,8 mm, 5 μπι). A fase móvel foi de 50 mM PB, 300 mM de NaCI, pH 7,0 ± 0,2 e a taxa de fluxo foi ajustada em 1,0 ml/min. As amostras foram diluídas para 10 mg/mL para injeção e detectadas a 280 nm com

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121/145 um detector de UV.

[0238] Os dados do UPSEC estão apresentados na tabela abaixo:

			2 a 8°C	25°C	40°C
	PH	T0	2W	4W	8W	2W	4W	8W	2W	4W	8W
% de Pico Principal	5	97,7	97,5	97,4	97,5	97,7	97,4	97	97,2	96	94,5
5,3	97,7	97,5	97,7	97,4	97,6	97,2	96,8	96,5	96,2	94,6
5,6	97,6	97,4	97,6	97,3	97,1	97,1	96,8	97	96,1	94,8
5,9	97,5	97,3	97,5	97,3	97,3	97	96,5	96,2	96	94,7
6,2	97,3	97,2	97,5	97,1	97,1	96,8	96,5	96,4	95,7	94,3
6,5	97,3	97,1	97,4	97,1	96,9	96,6	96,2	95,8	95,5	94,6

%de HMW %de LMW	5	2,3	2,5	2,6	2,5	2,3	2,4	2,8	2,4	2,8	3,4
5,3	2,3	2,5	2,3	2,6	2,4	2,5	2,9	2,8	2,9	3,7
5,6	2,4	2,6	2,4	2,7	2,7	2,7	3	2,8	3,2	3,9
5,9	2,5	2,7	2,5	2,7	2,7	2,8	3,2	3,3	3,3	4,1
6,2	2,7	2,8	2,5	2,9	2,9	3	3,3	3,3	3,6	4,6
6,5	2,7	2,9	2,6	2,9	3,1	3,2	3,5	3,7	3,9	4,3

5	N,D,	N,D„ N,D,	N,D,	N,D	0,2	0,3	0,4	1,3	2,1
5,3	N,D,	N,D,	N,D,	N,D,i	N,D	0,2	0,2	0,6	0,8	1,7
5,6	N,D,	N,D,	N,D,	N,D,	0,2	0,2	0,2	0,2	0,7	1,3
5,9	N,D,	N,D,	N,D,	N,D,	N,D	0,2	0,3	0,5	0,7	1,2
6,2	N,D,	N,D,	N,D,	N,D,	N,D	0,2	0,2	0,3	0,7	1,1
6,5	N,D,	N,D,	N,D,	N,D,	N,D	0,2	0,2	0,5	0,7	1,1

[0239] Como mostrado na tabela acima, a % de pico principal da SEC permaneceu estável entre 2 e 8°C em todas as amostras; no entanto, a 25°C e 40°C, foi observada uma redução significativa da % do pico principal. A taxa de redução da % do pico principal foi mais rápida em amostras a 40°C do que em 25°C. A 40°C por oito semanas, a % de HMW foi maior nas amostras de pH 6,2 e 6,5, enquanto a % de LMW foi maior nas amostras de pH 5,0 e 5,3.

[0240] Para avaliar a estabilidade química das formulações, foi realizada a focalização isoelétrica capilar (clEF) para avaliar a estabilidade química e monitorar a alteração no perfil da variante de carga ao longo do tempo. Em resumo, 20 μΙ (2,0 mg/mL) do padrão de referência ou a amostra foi misturada com 0,5 μΙ de marcador pl 5,85, 0,5 μΙ de marcador pl 9,77, 1 μΙ de Pharmalyte

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3-10, 0,5 μΙ de Pharmalyte 5-8, 0,5 μΙ de Pharmalyte 8-10,5, 35 μΙ de metil celulose a 1%, 37,5 μΙ de ureia 8 M. Água purificada foi adicionada para compor um volume final de 100 mL. A mistura foi então analisada com o analisador de foco isoelétrico capilar iCE-3 equipado com um capilar de detecção de coluna inteira revestido com fluorocarbono. A focagem foi realizada em duas etapas: (1) 1,5 kV por 1 min e (2) 3 kV por 8 min. Durante o experimento, a bandeja de amostrador automático foi mantida a 5°C.

[0241] Os dados do clEF para avaliar os níveis de variantes ácidas, % de pico principal e % de variantes básicas estão na tabela abaixo.

			2 a 8°C	25°C	40°C
	PH	T0	2W	4W	8W	2W	4W	8W	2W	4W	8W
% de Pico Principal	5	62,2	63	60	62,6	62,8	57,6	58,4	50,2	37,5	29,1
5,3	62,2	63	59,9	62,4	62,8	57,7	58,6	50,6	39,1	30,2
5,6	62,3	62,8	59,9	62,8	62,6	58,1	58,7	51,9	41,4	31
5,9	62	62,9	59,7	62,5	62,8	58,1	58,4	51,7	41,2	32,4
6,2	62,1	62,8	59,6	62,2	62,5	57,5	58,6	51,7	41,8	31,8
6,5	62,2	62,9	59,4	62,5	61,9	56,1	57,4	51,1	40,4	33,2

% de ácido	5	31,7	30,3	32,7	30,2	30,5	33,5	33,9	39,7	49,2	58,2
5,3	31,8	30,6	32,3	30,6	30,5	34	34,1	40,3	49,5	59,4
5,6	31,4	30,8	32,6	30,3	30,8	34,2	34,3	39,8	48,9	59,5
5,9	31,9	30,7	33,1	30,6	30,9	34,3	34,8	40,7	48,8	59,1
6,2	32,1	30,8	33,5	31,2	31,3	34,5	34,6	41	49	59,7
6,5	31,5	31	33,3	31	31,9	35,5	35,8	41,5	50,3	58,5

% de básico	5	6	6,7	7,3	7,2	6,8	8,9	7,7	10	13,3	12,6
5,3	6	6,4	7,7	7	6,7	8,3	7,3	9,1	11,3	10,3
5,6	6,2	6,5	7,5	6,8	6,5	7,6	7,2	8,2	9,6	9,5
5,9	6,1	6,4	7,3	6,9	6,3	7,5	6,7	7,6	9,9	8,4
6,2	5,9	6,4	6,9	6,6	6,3	8	6,8	7,2	9,3	8,6
6,5	6,3	6,2	7,2	6,4	6,2	8,4	6,8	7,3	9,4	8,3

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[0242] Como pode ser visto na tabela acima, a 2~8°C, a % de pico principal de CIEF, % de pico de ácido e % de pico básico foi relativamente estável e comparável em todas as amostras.

[0243] A 2 ~ 8°C, a % do pico básico principal de clEF também foi aumentada; o aumento nas amostras de tampão de pH 5,0 e 5,3 foi maior do que em outras amostras. A 25°C, a % de pico principal, % do pico ácido e % do pico básico permaneceu estável nas duas primeiras semanas, mas mudou ligeiramente após quatro semanas, em que a % do pico principal diminuiu enquanto a % do pico ácido aumentou correspondentemente. A taxa de variação em diferentes formulações foi comparável. A 40°C, uma redução significativa na % do pico principal e um aumento notável na % do pico ácido foram encontrados em todas as formulações, mesmo após duas semanas, mas a extensão da mudança foi semelhante em cada formulação. A % de pico básico também foi aumentada; o aumento nas amostras de tampão de pH 5,0 e 5,3 foi maior do que em outras amostras.

[0244] Para avaliar a pureza das formulações, foi realizada análise não redutora de Caliper. Em resumo, o tampão de amostra adquirido foi misturado com solução de 10% de dodecil sulfato de sódio (SDS) na proporção de volume de 20 para 1, e solução de N-etilmaleimida a 100 mM foi adicionada à solução misturada na razão de volume de 0,7 a 20 (referida à solução de desnaturação da amostra). O padrão ou amostra foi diluído para 1 mg/mL primeiramente e 2 μΙ de padrão ou amostra diluídos foram misturados com 7 μΙ de solução desnaturante da amostra. A mistura foi incubada a 70°C por 10 min. Foram adicionados 35 μΙ de água purificada à solução incubada e 42 μΙ da solução misturada foram transferidos para uma placa de 96 poços para análise. A placa da amostra foi analisada com o LabChip GX II HT, utilizando o ensaio HT Antibody Analysis 200.

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[0245] Os dados da análise do Caliper não redutor para avaliar a% de pureza são mostrados na tabela abaixo:

		2 a 8°C	25°C	40°C
	pH	TO	2 W	4 W	8 W	2 W	4 W	8 W	2 W	4 W	8 W
Caliper Não redutor
%de Pureza	5	96	95,2	94,6	94,9	94,9	93,6	94,1	91,4	87,8	84,4
5,3	96	95	94,7	94,9	94,8	93,8	94,1	92,7	89,5	86,4
5,6	96,1	95	94,6	94,9	94,8	93,9	94,1	93	90,7	88,5
5,9	96,3	94,9	94,5	94,9	94,8	93,9	94,2	93,4	91,1	89,3
6,2	96,2	94,9	94,5	95	94,8	93,7	94,5	93,3	91,3	88,7
6,5	96	95,1	94,4	94,9	94,7	93,4	94,1	93,2	90,7	89,3

[0246] Como mostrado na tabela acima a 2~8°C por oito semanas, a pureza redutor com Caliper_Non em cada formulação era relativamente estável. A 25°C durante oito semanas, a pureza em cada formulação diminuiu ligeiramente. A 40°C, a pureza diminuiu significativamente, especialmente quando as amostras estavam em tampão de pH 5,0 e 5,3, a diminuição foi muito mais rápida que a de outras. O tamanho molecular foi estável durante o estudo (dados não mostrados).

[0247] Para avaliar ainda mais a pureza das formulações, também foi realizada análise de Caliper redutor. Em resumo, o tampão de amostra adquirido foi misturado com solução de SDS a 10% na razão de volume de 20 para 1 e solução de ditiotreitol 1M foi adicionada à solução mista na razão de volume de 0,7 a 20 (referida à solução de desnaturação da amostra). O padrão ou amostra foi diluído para 1 mg/mL primeiramente e 2 μΙ de padrão ou amostra diluídos foram misturados com 7 μΙ de solução desnaturante da amostra. A mistura foi incubada a 70°C por 10 min. 35 μΙ de água purificada foram adicionados à solução incubada e 42 μΙ da solução misturada foram transferidos para uma placa de 96 poços para análise. A placa da amostra foi analisada com o LabChip GX II HT, utilizando o ensaio HT Antibody Analysis 200.

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[0248] Os dados de análise do Caliper redutor para avaliar a % de pureza são mostrados na tabela abaixo:

			2 a 8°C	25°C	40°C
pH	T0	2W	4W	8W	2W	4W	8W	2W	4W	8W
% de Pureza (Caliper R)	5	99,4	99,4	99,3	99,2	99,3	99,1	98,9	98	97,1	91,3
5,3	99,4	99,4	99,2	99,2	99,3	99	99	98,5	97,7	94,9
5,6	99,4	99,4	99,3	99,1	99,3	99,2	98,8	98,7	98,2	96,8
5,9	99,4	99,4	99,2	99,1	99,2	99,2	98,8	99,1	98,6	96,8
6,2	99,3	99,3	99,3	99,2	99,3	99,2	98,9	98,9	98,7	96,9
6,5	99,3	99,4	99,2	99,1	99,3	99,2	98,8	98,9	98,5	97,5

[0249] Como visto acima, a 2~8°C e 25°C por oito semanas, a pureza CaliperReduzida em cada formulação era relativamente estável. A 40°C, um declínio aparente na pureza de Caliper_R foi encontrado em todas as formulações. A pureza das amostras no tampão pH 5,0 teve a maior diminuição, seguida pelas amostras no tampão pH 5,3. A taxa de diminuição nos tampões de pH 5,6, 5,9 e 6,2 foi comparável, mas mais lenta. A pureza das amostras no tampão de pH 6,5 teve a diminuição mais lenta. O declínio da pureza provavelmente ocorreu devido à diminuição da % da cadeia pesada (HC) enquanto a % DA cadeia leve (LC) foi estável no estudo. A cadeia leve do anticorpo e o tamanho da cadeia pesada foram estáveis em todas as amostras acima de 8 S.

EXEMPLO 4

Formulação Anti-TIGIT sem Metionina

[0250] Um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112 e a LCDR3 da SEQ ID NO: 113, foi testado na concentração de 50 mg/mL em 10 mM de tampão de L-histidina, sacarose a 7%, 0,2 mg/mL PS-80 com pH variando de 5,0 a 6,5. A estabilidade da molécula foi monitorada sob condições térmicas e de estabilidade de armazenamento aceleradas, protegidas da luz. Além da estabilidade térmica, também foram

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126/145 realizados estudos de estabilidade por congelamento e descongelamento, estabilidade por agitação e estabilidade por estresse leve. A estabilidade foi testada incluindo UP-SEC, clEF, CE-SDS, MFI e mapeamento de peptídeos redutor.

Resultados

Estudo de estabilidade térmica (8 semanas)

[0251] Para todos os ensaios de indicação de estabilidade testados, o anticorpo anti-TIGIT foi estável a 5°C para todas as responsabilidades testadas. As taxas de degradação observadas usando UP-SEC, Caliper CE-SDS, clEF, MFI foram maiores a 40°C do que a 25°C. A 25°C e 40°C, os seguintes resultados foram notáveis:

[0252] UP-SEC: Foi observado um declínio na % de monômero para todos os valores de pH de 5,0 a 6,5. Nos valores mais baixos de pH (5,0 e 5,3), o principal declínio de pico ocorreu principalmente devido ao aumento em % de espécies de baixo peso molecular (LMW), enquanto a % de declínio de monômeros em pH 6,5 ocorreu principalmente devido ao aumento em % de espécies de alto peso molecular (HMW). A % de declínio do monômero foi maior em pH 6,5 após 8 semanas de estabilidade acelerada, (dados não mostrados)

[0253] clEF: o declínio do pico principal do clEF foi observado para todos os valores de pH de 5,0 a 6,5 a 25°C e 40°C. Nos valores mais altos de pH (6,3-6,5), o principal declínio do pico ocorreu principalmente devido ao aumento das variantes ácidas, enquanto que nos pH 5,0 e 5,3, o principal declínio do pico ocorreu devido ao aumento das variantes ácidas e básicas, (dados não mostrados)

[0254] CE-SDS (Caliper): O principal declínio do pico de CE-SDS não redutor foi observado principalmente a 40°C devido à presença de espécies fragmentadas. As formulações com valores mais baixos de pH (5,0 e 5,3) mostraram uma taxa de fragmentação relativamente mais alta que o restante

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127/145 dos valores de pH.

[0255] A análise redutora de CE-SDS (Caliper) revelou que a 5°C e 25°C por oito semanas, a pureza em cada formulação era relativamente estável. A 40°C, um declínio aparente na pureza foi encontrado em todas as formulações. A pureza das amostras no tampão pH 5,0 teve a maior diminuição, seguida pelas amostras no tampão pH 5,3.

[0256] MFI: Aumentos subvisíveis de partículas foram observados para todas as formulações a 40 ° C. pH 6,3 e 6,5 tiveram os aumentos mais altos em partículas subvisíveis em relação ao restante dos tampões.

[0257] Mapeamento peptídico redutor: Entre as desvantagens identificadas, apenas M254 mostrou um aumento relativo na oxidação após 8 semanas a 40°C em relação às amostras iniciais.

[0258] Conclusão: 10 mM de tampão de L-histidina, sacarose a 7%, 0,2 mg/mL PS-80, pH 5,6-6,3 suportou adequadamente a estabilidade de armazenamento do anticorpo anti-TIGIT por 8 semanas.

Estudo de estabilidade da agitação

[0259] Não foram observadas alterações em agregados solúveis, variantes carregadas, fragmentação ou partículas invisíveis quando a formulação antiTIGIT de 50 mg/mL (em tampão de L-histidina 10 mM, sacarose a 7%, pH 5,8 e 0, 0,1, 0,2 e 0,3 mg/mL PS-80) foi levemente agitado por até 7 dias 100 RPM a 18 a 22°C.

Estabilidade de congelamento e descongelamento

[0260] Não foram observadas alterações em agregados solúveis, variantes carregadas, fragmentação ou partículas invisíveis quando 50 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT (em 10 mM de tampão de L-histidina, sacarose a 7%, 0,2 mg/mL PS-80, pH 5,8) após 5 ciclos de congelamento/descongelamento (congelados a -80°C por 2 horas e descongelados à temperatura ambiente por 1

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128/145 hora).

Estudo da estabilidade do estresse luminoso

[0261] A formulação de 50 mg/mL foi submetida a 48 horas sob estresse por luz visível (5.000 Ix). Nessas condições, houve uma alteração mínima nos agregados solúveis, variantes carregadas, partículas invisíveis, pH, concentração, fragmentação e oxidação sob condições de ~ 0,2x ICH (exposição à luz de 12H). Sob condições de lx (exposição à luz de 48H), houve um aumento de agregados solúveis, variantes ácidas, fragmentação, partículas subvisíveis e oxidação de metionina.

Conclusão

[0262] Com base nesses estudos, o 10 mM de tampão de L-histidina, sacarose a 7%, PS-80 a 0,2 mg/mL, pH 5,3-6,3 foi capaz de suportar a estabilidade do anticorpo anti-TIGIT. A oxidação da metionina foi observada após a exposição ao estresse leve intenso. Como observado no Exemplo 2, a adição de L-metionina a 10 mM reduz a oxidação dos resíduos de metionina.

EXEMPLO 5

Triagem de Polissorbato 80

[0263] Um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112 e a LCDR3 da SEQ ID NO: 113, foi formulado em quatro (4) formulações de pH 5,8, 10 mM de tampão de L-histidina e com diferentes concentrações de PS-80 (como mostrado abaixo). A estabilidade da proteína em diferentes formulações foi estudada em condição de com ou sem agitação durante um período de 7 dias a 20°C.

Formulação	Anticorpo anti-TIGIT	Tampão	P	Sacarose (% p/v)	Polissorbato 80 (mg/mL)
1	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,8	7%	0 mg/ml

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2	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,8	7%	0,1 mg/ml
3	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,8	7%	0,2 mg/ml
4	50 mg/ml	10 mM de L-Histidina	pH=5,8	7%	0,3 mg/ml

[0264] As formulações foram formuladas em 10 mM de tampão de Lhistidina a pH 5,8 usando um sistema de troca de tampão TFF em escala laboratorial. As proteínas formuladas com diferentes teores de polissorbato 80 foram então filtradas assepticamente com filtro de membrana de 0,22 pm. 2 mL de cada amostra foram então preenchidos assepticamente em frascos de vidro de 6 mL. Os frascos cheios foram tapados e lacrados imediatamente após o enchimento. As amostras foram divididas em grupo de agitação e grupo de não agitação. No grupo de agitação, esses frascos foram transferidos para caixas cobertas e depois colocados no agitador do termostato e agitados a 100 rpm, 20°C por até 7 dias. No grupo de não agitação, esses frascos foram transferidos para caixas cobertas e colocados no agitador do termostato, mas o agitador foi mantido parado a 20°C por até 7 dias.

[0265] A estabilidade do anticorpo nas diferentes formulações com ou sem agitação foi estudada após 3 e 7 dias.

[0266] Os dados do UPSEC para avaliar os níveis de Espécies de Alto Peso Molecular (HMW ou agregados), % de monômero e LMW (espécies de Baixo Peso Molecular) estão na Tabela abaixo:

			3 dias	7 dias
	Formulação	T0	Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
% de Pico Principal	1	97,1	97,2	97,2	97,1	97,2
2	97	97,1	97,1	97	97
3	97	97,1	97,1	96,9	96,9
4	97,1	97,1	97,1	96,9	96,9

% de Peso Molecular	1	2,9	2,8	2,8	2,9	2,8
2	3	2,9	2,9	3	3

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Alto (HMW)	3	3	2,9	2,9	3,1	3,1
4	2,9	2,9	2,9	3,1	3,1

% de Peso Molecular Baixo (LMW)	1	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
2	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
3	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
4	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.

[0267] Como pode ser visto, o teor de polissorbato 80 não gerou um impacto significativo na pureza da SEC na condição de com ou sem agitação. O teor de polissorbato 80 não impactou significativamente o pl, a porcentagem de pico principal, pico ácido e pico básico no ensaio clEF na condição de com ou sem agitação por até 7 dias.

			3 dias	7 dias
		T0	Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
% de Pico Principal	1	61,5	61,4	61,4	62,4	62,3
2	61,5	61,5	61,9	61,9	62,1
3	61,2	60,8	60,5	61,5	61,6
4	61,9	61,4	61,5	62	61,8

% de ácido	1	30,9	31,1	30,5	31,1	30,6
2	31,2	31,6	30,5	31,3	31,1
3	31,5	32,2	32,3	31,5	31,6
4	31,1	31,8	31,4	31,4	31,5

% de básico	1	7,6	7,5	8,1	6,5	7,1
2	7,3	6,9	7,6	6,8	6,7
3	7,3	7	7,2	6,9	6,8
4	7	6,7	7	6,7	6,7

[0268] O teor de polissorbato 80 não teve impacto significativo na pureza com Caliper Não Redutor com ou sem agitação por até 7 dias, como mostrado na Tabela abaixo.

	Formulação	T0	3 dias	7 dias
Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
Caliper Não Redutor

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% de Pureza	1	94,9	94,8	95	94,4	94,5
2	94,9	94,8	94,6	94,7	94,4
3	94,7	94,8	94,8	94,3	94,4
4	94,9	94,8	94,6	94,3	94,3

[0269] Também foi realizada análise de Caliper redutor. O teor do PS-80 não teve impacto significativo na pureza Caliper_Redutor com ou sem agitação em 7 dias.

			3 days	7 days
	Formulação	T0	Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
Caliper Não Redutor
% de Pureza	1	99,2	99,2	99,2	99,2	99,2
2	99,2	99,3	99,2	99,2	99,2
3	99,1	99	99,2	99,2	99,2
4	99,2	99,1	99,2	99,2	99,1

[0270] Para medir as partículas invisíveis, foram retirados cerca de 1.500 μΙ de cada amostra do recipiente do frasco de vidro e testados por imageamento por microfluxo (MFI) de acordo com o manual do usuário. A concentração de partículas em diferentes faixas de tamanho, incluindo 1 ~ 2 pm, 2 ~ 5 pm, 5 ~ 10 pm, 10 ~ 25 pm e> 25 pm foram relatados (veja abaixo). O teor de polissorbato 80 não teve impacto significativo na concentração de partículas com ou sem agitação por até 7 dias.

			3 dias	7 dias
	Formulação	T0	Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
1 pm< ECD< 2 pm	1	8318	NA	9080	1205	2046
2	25396	10831	4429	7668	5898
3	8048	2660	15877	2952	4932
4	8867	2590	13115	9214	2728
2 pm< ECD<	1	1792	4516	2700	140	574
2	6068	4215	711	1137	806

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			3 dias	7 dias
	Formulação	T0	Sem agitação	100 rpm	Sem agitação	100 rpm
5 pm	3	818	363	3950	927	735
4	1321	297	3476	2418	310
5 pm< ECD< 10 pm	1	369	NA	486	27	52
2	770	647	79	237 63	63
3	121	63	379	121	94
4	104	80	253	167	61
10 pm< ECD< 25 pm	1	78	NA	103	2	22
2	135	73	7	59	5
3	39	13	66	20	8
4	14	25	34	16	8
ECD > 25 pm	1	0	NA	6	0	2
2	7	14	3	21	15
3	10	10	10
4	2	6	12	0	12

EXEMPLO 6

Adição de quelante

[0271] Este estudo comparou a estabilidade de um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 de SEQ ID NO: 112 e LCDR3 da SEQ ID NO: 113 em 10 mM de tampão de L-histidina (pH = 5,8), polissorbato 0,02% (p/v) 80, L-metionina a 10 mM (L-Met), 7% p/v de sacarose na presença ou ausência de 20 uM ou 50 uM de DTPA.

[0272] As três formulações foram colocadas em frascos e colocadas em estabilidade a 5°C (umidade ambiente), 25°C (60% de umidade relativa) e 40°C (75% de umidade relativa) por dezoito semanas protegidas da luz.

Formulação	Anticorpo	Tampão de LHistidina	Sacarose	L-Met	Polissorbato
anti-TIGIT	(pH	%(p/v)		80 %(p/v)
		5,8)

DTPA

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133/145

1	50 mg/ml	10 mM	7%	10 mM	0,02%	0
2	50 mg/ml	10 mM	7%	10 mM	0,02%	20 uM de DTPA
3	50 mg/ml	10 mM	7%	10 mM	0,02%	50 uM de DTPA

[0273] A estabilidade coloidal das amostras foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) quanto à pureza na qual foi determinada a porcentagem de monômero, bem como as porcentagens de espécies de alto peso molecular (HMW) e picos de eluição tardia (espécies LMW). Os dados do UPSEC para avaliar os níveis de % de HMW (agregados), % de monômero e % de

LMW estão na tabela abaixo:

		5°C	25°C	40°C
	Form	T0	4W	8W	18W	4W	8W	18W	2W	4W	8W	18W
%de HMW	1	1,54	N/A	1,57	1,57	1,53	1,57	1,64	1,51	1,61	1,72	2,2
2	1,57	1,59	1,59	1,57	1,56	1,57	1,59	1,51	1,56	1,65	1,94
3	1,61	1,61	1,61	1,58	1,56	1,57	1,59	1,53	1,57	1,63	1,91
% de Monômero	1	98,2	N/A	98,2	98,2	98,1	98,0	97,8	97,9	97,6	97,2	95,7
2	98,2	98,1	98,1	98,2	98,1	98,0	97,9	98,0	97,7	97,3	96,1
3	98,1	98,1	98,1	98,2	98,1	98,0	97,9	98,0	97,7	97,4	96,2
%de LMW	1	0,30	N/A	0,28	0,22	0,36	0,42	0,54	0,55	0,82	1,11	2,07
2	0,28	0,28	0,27	0,22	0,35	0,40	0,55	0,53	0,77	1,02	1,94
3	0,25	0,27	0,26	0,23	0,35	0,41	0,56	0,51	0,77	1,02	1,92

[0274] Como mostrado na tabela acima, a 5°C, 25°C e 40°C, todas as três formulações mostraram uma tendência de aumento na % de pico de HMW e % de pico de LMW (e uma consequente diminuição na % de pico de monômero) por até um ponto no tempo de 18 semanas. A 25°C, ambas as formulações mostraram tendências semelhantes, mas mudanças menores, em comparação com 40°C. A 5°C, não foram observadas alterações substanciais. A Formulação 1 mostra um aumento maior em % de HMW e % de LMW em comparação com a Formulação 2 (20 uM de DTPA) e a Formulação 3 (50 uM de DTPA). Além disso, a Formulação 1 mostrou uma diminuição maior da % de monômero em

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 140/158

134/145 comparação com a Formulação 2 e 3. Resultados semelhantes foram observados na análise HP-IEX (dados não mostrados).

[0275] Para avaliar se o DTPA pode proteger as formulações do estresse oxidativo, as três formulações foram colocadas em frascos e expostas à luz (0,5X ICH e IX ICH). Como visto na tabela abaixo, a Formulação 1 mostra um aumento maior na % de oxidação de M254, M430 e W104 (as metioninas e triptofano que são suscetíveis à oxidação) em comparação com a Formulação 2 (DTPA 20 uM) e Formulação 3 (DTPA uM). Assim, o DTPA pode melhorar ainda mais a estabilidade da formulação de anticorpo anti-TIGIT.

	Formulação 1	Formulação 1	Formulação 2	Formulação 3
	Controle Escuro	0,5X ICH	IX ICH	0,5X ICH	IX ICH	0,5X ICH	IX ICH
LC_M4	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
HC_M34	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,4
HC_M81	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,3
HC_M254	3,6	16,3	30,2	13,7	27,5	15,9	21,5
HC_M430	1	10,9	19,2	9,3	18,3	8,6	16,2
HC_W104	0,6	8,8	17,7	7,3	16,7	6,9	12,1

		tn 0 η	25°C	40°C
	Form	TO	4	8W	18W	4 W	8 W	18W	2	4	8	18
Cone, de PS 80	1	0,24	0,23	0,23	0,22	0,20	0,18	0,16	0,19	0,17	0,16	0,13
2	0,24	0,23	0,23	0,21	0,20	0,18	0,16	0,19	0,16	0,16	0,14
3	0,22	0,22	0,22	0,21	0,19	0,17	0,15	0,18	0,16	0,15	0,13

EXEMPLO 7

Estabilidade a longo prazo de formulações de anticorpos anti-TIGIT

[0276] Esse exemplo descreve dados de estabilidade a longo prazo para um anticorpo anti-TIGIT formulado em um tampão de L-histidina, L-metionina, sacarose, polissorbato 80 e água para injeção, da seguinte maneira:

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 141/158

135/145

Ingredientes	Concentração (mg/mL)	Quantidade (mg/frasco)
Ativo	Anticorpo anti- TIGIT	50,0	100,0
Inativo (Excipientes)	L-Histidina	0,465	0,930
L-Histidina Mono-hidrato de monocloridrato	1,47	2,94
L-Metionina	1,49	2,98
Sacarose	70	140,0
Polissorbato 80	0,20	0,40
Água para Injeção	NA	Quantidade suficiente para 2,0 ml

[0277] As soluções foram preenchidas em um frasco de vidro USP Tipo 1 com rolha elastomérica e selo de alumínio. Os frascos foram então incubados em três condições diferentes de armazenamento: 5°C (umidade ambiente), 25°C (60% de umidade relativa) e 40°C (75% de umidade relativa). Os dados são coletados no tempo zero, 1 mês, 3 meses, 6 meses para todas as condições de armazenamento, 9 meses (condições de armazenamento de 5°C e 25°C), 12 meses (condições de armazenamento de 5°C e 25°C), 18 meses (condições de armazenamento a 5°C), 24 meses (condições de armazenamento a 5°C) e 36 meses (condições a 5°C).

Resultados

[0278] Os resultados demonstram estabilidade física e química geral do anticorpo anti-TIGIT quando armazenados nas condições recomendadas de longo prazo de 5°C por 18 meses. Não houve perda mensurável de potência observada e a pureza estava dentro das especificações nas condições de armazenamento recomendadas. Os resultados são apresentados nas seguintes tabelas:

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 142/158

136/145

5°C / Umidade ambiente
Atributo Medido	Ponto no Tempo (meses)
	Inicial	1	3	6	9	12	18
Potência Biológica por ELISA de ligação	96	92	100	94	101	92	99
Pureza por UPSEC %
Espécie de Alto Peso Molecular (%)	1,33	1,48	1,40	1,63	1,65	1,66	1,77
Monômero (%)	98,7	98,5	98,6	98,3	98,3	98,3	*
Espécie de Baixo Peso Molecular (%)	<QL	<QL	<QL	<QL	<QL	<QL	<QL
Variantes de Carga por % de HP-IEX
Variantes Ácidas	21,46	21,54	22,04	22,51	22,49	22,48	22,92
Principal total	68,8	68,4	67,9	67,3	67,1	67,3	67,1
Variantes Básicas	9,70	10,11	10,06	10,15	10,38	10,20	9,95
Pureza por % de CE-SDS não redutor	96,4	96,4	96,3	96,2	96,0	95,9	95,7
Pureza por % de CE-SDS Redutor	98,1	98,2	98,0	98,1	98,0	98,1	97,7
pH	6,1	6,1	6,1	6,0	6,0	6,0	6,0
Concentração de Proteína	51,7	51,4	51,2	51,0	51,5	50,9	51,5
UV A350	0,150	0,142	0,138	0,144	0,146	0,145	0,150
QL = Limite de Quantificação (0,4%) * valor é 98,2
25°C / 60% de Umidade Relativa
Atributo	Ponto no Tempo (meses)

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 143/158

137/145

Medido
	Inicial	1	3	6	9	12
Potência Biológica por ELISA de ligação	96	90	94	94	98	95
Pureza por UPSEC %
Espécie de Alto Peso Molecular (%)	1,33	1,57	1,48	1,72	1,77	1,83
Monômero (%)	98,7	98,4	98,3	97,9	97,7	97,4
Espécie de Baixo Peso Molecular (%)	< QL	< QL	< QL	< QL	< QL	<QL
Variantes de Carga por % de HP-IEX
Variantes Ácidas	21,46	23,19	28,74	34,16	39,86	44,04
Principal total	68,8	65,8	59,7	53,8	47,6	43,5
Variantes Básicas	9,70	11,06	11,51	12,02	12,55	12,44
Pureza por % de CE-SDS não redutor	96,4	96,0	95,2	94,4	93,2	92,1
Pureza por % de CE-SDS Redutor	98,1	98,0	97,8	97,4	96,7	96,1
pH	6,1	6,1	6,1	6,0	6,0	6,0
Concentração de Proteína	51,7	51,1	51,1	50,9	51,5	50,9
UV A350	0,150	0,150	0,163	0,179	0,196	0,209
QL = Limite de Quantificação (0,4%)

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 144/158

138/145

40°C / 75% de Umidade Relativa
Atributo Medido	Ponto no Tempo (meses)
	Inicial	1	3	6	9	12
Potência Biológica por ELISA de ligação	96	96	99	94	ND	ND
Pureza por UPSEC %
Espécie de Alto Peso Molecular (%)	1,33	1,64	1,78	2,63	ND	ND
Monômero (%)	98,7	97,9	96,9	93,8	ND	ND
Espécie de Baixo Peso Molecular (%)	< QL	< QL	< QL	< QL	< QL	< QL
Variantes de Carga por % de HP-IEX
Variantes Ácidas	21,46	38,03	61,62	80,02	ND	ND
Principal total	68,8	47,8	25,1	10,0	ND	ND
Variantes Básicas	9,70	14,14	13,29	9,95	ND	ND
Pureza por % de CE-SDS não redutor	96,4	93,6	88,9	79,6	ND	ND
Pureza por % de CE-SDS Redutor	98,1	96,9	94,2	87,7	ND	ND
pH	6,1	6,1	6,1	6,0	ND	ND
Concentração de Proteína	51,7	52,0	51,2	51,4	ND	ND
UV A350	0,150	0,188	0,251	0,453	ND	ND
QL = Limite de Quantificação (0,10%)

Concentração de proteínas

[0279] Os dados de estabilidade da concentração de proteínas para todos

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 145/158

139/145 os momentos e condições não apresentaram alterações notáveis em função do tempo ou condição de armazenamento e todos os resultados estavam dentro dos critérios de aceitação de 45 a 55 mg/mL.

J3H

[0280] Não houve alteração significativa no pH para as condições de 5°C, 25°C e 40°C. A Figura 1 apresenta os dados de pH do período de 0 a 9 meses.

Polissorbato 80

[0281] O teor de polissorbato 80 na condição de armazenamento recomendada de 5°C diminuiu ligeiramente para 0,13 mg/mL aos 9 meses e 18 meses (dados de 18 meses não mostrados). Foi observada uma tendência decrescente no polissorbato 80 a 25°C (acelerado) e 40°C (estressado). A 40°C, a concentração de polissorbato 80 diminuiu para 0,06 mg/mL em 6 meses e o teor de polissorbato 80 a 25°C diminuiu para 0,07 mg/mL em 9 meses. Os dados de concentração de polissorbato 80 por até 9 meses são apresentados na Figura 2.

Ligação de potência por ELISA

[0282] Não houve tendência evidente em nenhum momento ou condição nos resultados do ELISA obtidos. Os dados de potência de até 9 meses são apresentados na Figura 3.

Pureza pela UP-SEC

[0283] Os dados de pureza por UP-SEC são ilustrados abaixo na Figura 4 para % de monômero, Figura 5 para % de espécies de alto peso molecular e Figura 6 para % de espécies de baixo peso molecular, até 9 meses.

[0284] Nas condições recomendadas de armazenamento de 5°C, há uma ligeira diminuição na % de monômero com um ligeiro aumento correspondente na % de espécies de alto peso molecular ao longo de 18 meses de estabilidade. A % de espécies de baixo peso molecular do início até os 18 meses está abaixo do limite de quantificação (< QL), que é igual a 0,4%. Na condição de 25°C, a %

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 146/158

140/145 de monômero diminuiu do início até 12 meses com um aumento correspondente na % de espécies de alto peso molecular. Aos 9 e 12 meses, a % de espécies de baixo peso molecular foi relatada acima da QL.

[0285] Na condição estressada de 40°C, a % de monômero diminuiu de 98,7% para 93,8%, com aumentos correspondentes nas espécies de alto peso molecular de 1,33% para 2,63% e nas espécies de baixo peso molecular de < QL para 3,53%. Esse resultado não foi inesperado, dada a natureza da condição de armazenamento.

CD-SDS redutor e não redutor

[0286] As Figuras 7 e 8 mostram os dados de pureza por até 9 meses, como determinado por CD-SDS redutor e não redutor. Não houve tendências notáveis no CE-SDS redutor (% de cadeia pesada e leve) ou não redutor (% de IgG intacta) na condição de armazenamento a longo prazo de 5°C e os resultados estavam dentro dos critérios de aceitação de GMP de > 90,0%. Na condição acelerada de 25°C, foi observada uma tendência decrescente para a condição não redutora. Para a condição CE-SDS redutor, também foi observada uma tendência decrescente. Para o CE-SDS redutor e não redutor, todos os resultados até o período de nove meses estavam dentro dos critérios de aceitação das BPF. Na condição estressada a 40°C, em 6 meses, os resultados de CD-SDS redutor e não redutor estavam abaixo do critério de aceitação de 90,0% definido para o medicamento GMP. O resultado do CE-SDS não redutor saiu da especificação em 3 meses, com um resultado de 88,9% e depois diminuiu ainda mais em 6 meses, para 79,6%. Para o CE-SDS redutor, a % de cadeia pesada e % de cadeia leve diminuíram de 94,2% em 3 meses para 87,7% em 6 meses. Esta redução não foi inesperada a 40°C, considerando a natureza da condição.

Variantes de carga por HP-IEX

[0287] A 5°C (armazenamento de longo prazo), há um ligeiro aumento na %

Petição 870190127596, de 03/12/2019, pág. 147/158

141/145 de variantes ácidas do início em 21,46% até 9 meses em 22,49%, com uma ligeira diminuição correspondente no total principal de 68,8% para 67,1% em 9 meses. A % de variantes básicas começa a aumentar levemente aos 9 meses, passando de 10,15% aos 6 meses para 10,38% aos 9 meses. A 25°C (acelerado), o Total Principal caiu de 68,8% no momento inicial para 47,6% em 9 meses. Juntamente com uma redução no Total Principal, foi observado um aumento correspondente nas Variantes Ácidas de 21,46% para 39,86% e um ligeiro aumento nas Variantes Básicas de 9,70% para 11,51%. A 40°C (estressado), houve uma diminuição considerável no Total Principal para 10,1% em 6 meses, juntamente com um aumento considerável correspondente nas Variantes Ácidas para 80,02% e nas Variantes Básicas para 9,95%.

Material particulado

[0288] O material particulado foi medido por mHIAC. Os resultados na condição de 5°C foram bem abaixo dos critérios de aceitação de < 6.000 partículas por recipiente por > 10 pm e < 600 partículas por recipiente por > 25 pm desde o início até 9 meses. A 25°C, foi relatado um aumento de partículas >= 10 pm de 13 partículas por recipiente no momento inicial para 460 partículas por recipiente em 9 meses. Houve uma diminuição nas partículas para os particulados >= 25 pm com um resultado de 3 partículas por contêiner aos 9 meses. Todos os pontos de tempo para os dados a 25°C estavam dentro dos critérios de aceitação para as análises >= 10 pm e >= 25 pm. Os dados na condição de 40°C mostraram um aumento drástico de partículas >= 10 pm com 8.258 partículas por recipiente aos 9 meses. Este resultado estava fora dos critérios de aceitação de <= 600 partículas por recipiente. O resultado para partículas >= 25 pm aumentou no período de estabilidade de 9 meses para 124 partículas por contêiner, atendendo aos critérios de aceitação >= 25 pm (<= 600 partículas por contêiner).

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142/145

Turbidez

[0289] A turbidez foi determinada a partir da absorbância espectrofotométrica a 350 nm. Na condição de armazenamento de longo prazo a 5°C, não houve alterações notáveis até o período de 9 meses. Na condição de 25°C, há um ligeiro aumento em 3 meses com um resultado de 0,163 UA e continua a aumentar para 9 meses com um resultado de 0,196 UA. A 40°C, há um aumento mais pronunciado a partir de 1 mês com 0,188 UA e, em seguida, aumentando consideravelmente para 0,453 UA aos 9 meses.

Conclusões

[0290] Com base nos dados, na data do teste de 18 meses, nenhuma mudança ou tendência importante foi observada na condição de armazenamento de 5°C ao longo dos estudos de estabilidade para pH, concentração de proteínas, aparência e partículas visíveis (dados não mostrados) e potência e material particulado (dados não mostrados). Com exceção de um ligeiro aumento na cor e uma diminuição no teor do PS-80 para 0,13 mg/mL, não foram observadas mudanças ou tendências notáveis para qualquer teste de estabilidade a 5°C.

[0291] Com base nos dados para estabilidade a longo prazo de 5°C, a formulação anti-TIGIT contendo tampão de L-histidina, sacarose, polissorbato 80 e L-metionina tem um prazo de validade esperado de 30 meses. Espera-se que as formulações que compreende ainda um quelante reduzam a degradação do polissorbato 80 que foi observada.

EXEMPLO 8

Coformulação de um anticorpo anti-TIGIT e um anticorpo anti-PD-1.

[0292] A coformulação de dois anticorpos em uma única formulação é mais conveniente para os pacientes e aumenta a conformidade com a dosagem dos dois anticorpos juntos. A coformulação de dois anticorpos em uma única

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143/145 formulação é mais conveniente para os pacientes e aumenta a conformidade com a dosagem dos dois anticorpos juntos. Um anticorpo anti-TIGIT com as seguintes CDRs: HCDR1 da SEQ ID NO: 108, HCDR2 da SEQ ID NO: 154, HCDR3 da SEQ ID NO: 110, LCDR1 da SEQ ID NO: 111, LCDR2 da SEQ ID NO: 112, e a LCDR3 da SEQ ID NO: 113 em um esqueleto de IgGl foi coformulado com pembrolizumabe. Com base nas interações proteína-proteína (mostradas abaixo), a coformulação (mostrada abaixo) mostrou-se estável em pH 5,0-6,0. Portanto, a coformulação (P1T1) em pH 5,0, 5,5 e 6,0 foi escolhida e colocada em estabilidade térmica adicional a 5°C, 25°C e 40°C, juntamente com os dois controles (anticorpo PD1 e anticorpo anti-TIGIT).

Coformula- ções	Razão Pembrolizumabe/ Anticorpo Anti-TIGIT ÍEZel	Pembrolizumabe	Anticorpo Anti-TIGIT	Concentração Total
P1T1	1:1	20 mg/ml	20 mg/ml	40 mg/ml
PI (Controle)	1:0	20 mg/ml	Nenhum	20 mg/ml
TI (Controle)	0:1	Nenhum	20 mg/ml	10 mg/ml

[0293] As formulações foram preparadas como formulações líquidas da seguinte maneira:

Formulação	Tampão	PH	Crioprotetor/Modificador de Tonicidade	Tensoativ 0	Antioxidan te
P1T1	L- Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7%)	PS-80 (0,02%)	10 mM de L-Met
PI	L-	5,	Sacarose (7%)	PS-80	10 mM de

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144/145

Formulação	Tampão	PH	Crioprotetor/Modificador de Tonicidade	Tensoativ 0	Antioxidan te
(Controle)	Histidina (10 mM)	5,5, 6		(0,02%)	L-Met
TI (Controle)	L- Histidina (10 mM)	5, 5,5, 6	Sacarose (7%)	PS-80 (0,02%)	10 mM de L-Met

[0294] Cada formulação foi preenchida a 1 mL em frascos 2R. A estabilidade será medida por inspeção visual, concentração de proteínas, imageamento sob microfluxo (MFI) (avaliação de particulados), cromatografia de exclusão por tamanho de modo misto (SEC) (avaliação de agregação, IEX (avaliação de variantes de carga) e UP-SEC (avaliação de agregação). O protocolo de estabilidade térmica é o seguinte:

	T0	1 mês	2 meses	3 meses	5 meses	Extra
5°C (Umidade ambiente)	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono
25°C / 60% de Umidade Relativa		1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono
40°C / 75% de Umidade Relativa		1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono	1 combo + 2 mono

[0295] As interações proteína-proteína, que são indicativas da estabilidade coloidal e térmica das diferentes coformulações, foram medidas. Uma interação proteína-proteína repulsiva, como indicado por um valor de parâmetro de interação de difusão positivo (Kd) de Kd >0, indica uma formulação estável com baixa propensão à agregação. Verificou-se que o Kd para a coformulação tinha um valor Kd positivo, o que é indicativo de interação proteína-proteína repulsiva

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145/145 e estabilizadora, o que indicaria menor propensão a agregar e uma coformulação estável.

[0296] Com base no parâmetro de interação de difusão positiva (Kd) ou Kd >0, espera-se que os anticorpos quando coformulados se comportem bem quando coformulados em conjunto, semelhantes às formulações de anticorpo único.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão;

(iii) cerca de 6% a cerca de 8% peso/volume (p/v) de açúcar não redutor;

(iv) cerca de 0,01% a cerca de 0,10% (p/v) de tensoativo não iônico; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de antioxidante.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeias leves compreendendo CDRL1 de SEQ ID NO: 111, CDRL2 de SEQ ID NO: 112, CDRL3 de SEQ ID NO: 113 e três CDRs de cadeias pesadas compreendendo CDRH1 de SEQ ID NO: 108, CDRH2 de SEQ ID NO: 154 e CDRH3 de SEQ ID NO: 110.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 148 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 152.
4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-TIGIT compreende: (i) um domínio constante de cadeia pesada de IgG 1 humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 291 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 293; ou (ii) um domínio constante de cadeia pesada de lgG4 humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 292 e um domínio constante de cadeia leve kappa humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 293.
5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

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2/5 caracterizada pelo fato de que apresenta um pH entre 5,3 e 6,2.
6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o tampão é um tampão de L-histidina, o açúcar não redutor é a sacarose, o tensoativo não iônico é o polissorbato 80 e o antioxidante é L-metionina, a formulação compreendendo:

(i) cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de um anticorpo anti-TIGIT, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo;

(ii) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de um tampão de L-histidina;

(iii) cerca de 6% a cerca de 8% (p/v) de sacarose;

(iv) cerca de 0,01% a cerca de 0,10% (p/v) de polissorbato 80; e (v) cerca de 1 mM a cerca de 20 mM de L-metionina.
7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 8 mM a cerca de 12 mM de tampão de L-histidina.
8. Formulação de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 5 mM a cerca de 10 mM de L-metionina.
9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende polissorbato 80 a uma razão em peso de cerca de 0,02% p/v.
10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a concentração do anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é cerca de 10 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL ou 100 mg/mL.
12. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11,

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3/5 caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 25 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% p/v de sacarose, cerca de 0,02% de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.
13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 50 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% p/v de sacarose, cerca de 0,02% de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.
14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 75 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% p/v de sacarose, cerca de 0,02% de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.
15. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 100 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de L-histidina, cerca de 7% p/v de sacarose, cerca de 0,02% de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.
16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que tem um pH de cerca de 5,5 a 6,3.
17. Formulação de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que tem um pH de cerca de 5,8 a 6,0.
18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um anticorpo antiPDl ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
19. Formulação de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia leve de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e três CDRs de cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

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20. Formulação de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4, e uma região variável pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9.
21. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-PD-1 humana que é pembrolizumabe.
22. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que a razão do anticorpo anti-PDl para o anticorpo anti-TIGIT é 1:1.
23. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 20 mg/mL do anticorpo anti-PDl, cerca de 20 mg/mL do anticorpo anti-TIGIT, 10 mM de tampão de Lhistidina, cerca de 7% p/v de sacarose, cerca de 0,02% p/v de polissorbato 80 e cerca de 10 mM de L-metionina.
24. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um quelante.
25. Formulação de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o quelante é DTPA.
26. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que está contida em um frasco de vidro ou em um dispositivo de injeção.
27. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de ser uma formulação líquida, que é congelada a pelo menos abaixo de -70°C, ou é uma solução reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.

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28. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que após 12 meses a 5°C:

(i) a % de monômero do anticorpo anti-TIGIT é >95% como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho;

(ii) a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-TIGIT é >90% como medido por CE-SDS redutor;

(iii) a % de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo anti-TIGIT é >95%, como medido por CE-SDS redutor;

(iv) a % de IgG intacta do anticorpo anti-TIGIT é >90% como medido por CESDS não redutor; e/ou (v) a % de IgG intacta do anticorpo anti-TIGIT é >95% como medido por CESDS não redutor.
29. Uso da formulação definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para o tratamento de câncer ou para o tratamento de infecção crônica.
30. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.