JP2012527246A - 合成ポリペプチドライブラリーおよび天然で多様化されたポリペプチドバリアントを作製するための方法 - Google Patents

合成ポリペプチドライブラリーおよび天然で多様化されたポリペプチドバリアントを作製するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリーを作製するための組成物および方法、ならびに天然で多様化されたポリペプチドバリアントを同定するための前記ライブラリーの使用を提供する。本発明は、１つまたはいくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、天然供給源から捕捉された対応するＣＤＲのコレクションにより置き換えられた合成抗体断片のコレクションを作製するための組成物および方法も提供する。本発明は、さらに、元のポリペプチドコード配列を改変する必要なく、合成または天然起源の多様化された配列を挿入することにより、ポリペプチドの部分を多様化するための組成物および方法を提供する。

Description

関連出願
本願は、２００９年５月２０日に出願された米国仮特許出願６１／１７９，８５０号、２００９年１２月１７日に出願された米国仮特許出願６１／２８７，３３６号、２０１０年３月１７日に出願された米国仮特許出願６１／３１４，７９４号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリーの作製と、そのようなライブラリーの使用とに関する。本発明は、特に、１またはいくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、天然供給源から捕捉された対応するＣＤＲのコレクションにより置き換えられた合成抗体断片のコレクションの作製に関する。本発明は、さらに、免疫した動物に由来するＣＤＲを含有する抗体断片のコレクションの作製と、高い親和性の抗体断片を導くためのよりよい供給源としてのそれらの使用とに関する。本発明は、さらに、元のポリペプチドコード配列を改変する必要なく、合成または天然の起源の多様化された配列を挿入することによる、ポリペプチドの部分の多様化に関する。
発明の背景
抗体は、４つのポリペプチド：２つの重鎖と２つの軽鎖で構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とにより形成される。これらのドメインの一方の端部にて、６つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域（ＣＤＲ）ともよばれる。３つのＣＤＲがＶＨドメイン上に位置し（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）、他の３つがＶＬドメイン上にある（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）。Ｂ細胞の発生中に、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして公知の体細胞組み換えにより、ユニーク免疫グロブリン領域が形成される。免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域は、異なる遺伝子セグメントによりコードされる。重鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）セグメントとよばれる３つのセグメントによりコードされ、軽鎖の可変は、２つのセグメントＶおよびＪだけの組換えにより形成される。多数の抗体パラトープを、ゲノム中に存在するＶ、ＤおよびＪセグメントの複数のコピーの１つ同士の組換えにより作製できる。ＶセグメントはＣＤＲ１およびＣＤＲ２をコードし、ＣＤＲ３は、組換え事象により作製される。免疫応答の経過中に、さらなる多様性が、体細胞超変異（ＳＨＭ）とよばれるプロセスにより抗原結合部位に導入される。このプロセス中に、点突然変異が、重鎖および軽鎖の可変遺伝子、特にＣＤＲをコードする領域に導入される。このさらなる多様性が、それらの同族抗原への親和性が改良された抗体バリアントを発現するＢ細胞の選択および拡張を可能にする。
近年、いくつかのディスプレイ技術が出現し、タンパク質またはペプチドの大きいコレクションのスクリーニングを可能にしている。これらは、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイおよびリボソームディスプレイを含む（Ｓｍｉｔｈ ＧＰ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８５年６月１４日；２２８巻（４７０５号）：１３１５〜７頁；Ｈａｎｅｓ ＪおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９７年５月１３日；９４巻（１０号）：４９３７〜４２頁；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ＰＳら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １９９８年９月；１１巻（９号）：８２５〜３２頁；Ｂｏｄｅｒ ＥＴおよびＷｉｔｔｒｕｐ ＫＤ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７年６月；１５巻（６号）：５５３〜７頁）。特に、これらの方法は、抗体およびその断片に対して広範囲に用いられている。ポリペプチドのライブラリーを作製し、所望の結合特性を有するメンバーをスクリーニングするためのいくつかの方法が記載されている。
第１のアプローチは、遺伝子増幅により、再構成された免疫グロブリン遺伝子を、遺伝子多様性の供給源としてヒトもしくはその他の哺乳動物からの組織または細胞を用いて天然のレパートリーから捕捉することである。これらの再構成された重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）のコレクションを、次いで組み合わせて、バクテリオファージまたは細菌、酵母もしくは哺乳動物細胞のようなその他のディスプレイパッケージ上にディスプレイできる結合対のライブラリーを作製する。この場合、ドナーで見出される免疫グロブリンレパートリーの大きい画分が捕捉される。よって、ドナーの生殖系列遺伝子によりコードされるフレームワークの全てを、このようなレパートリー、ならびにＶ（Ｄ）Ｊ組換えおよび体細胞超変異の両方により作製される多様性で見出すことができる（Ｍａｒｋｓ ＪＤら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９１年１２月５日；２２２巻（３号）：５８１〜９７頁；ＭｃＣａｆｆｅｔｙ 特許文献１）。
天然のレパートリーの制限は、天然に存在する抗体は、それらの発現レベル、有効期間および試薬または療法用分子としてのそれらの有用性を制限する低い固有の安定性を有するフレームワークに基づき得ることである。これらの制限を克服するために、合成抗体ライブラリーを作製するためのいくつかの方法が開発されている。これらのアプローチにおいて、これらの対応する生殖系列遺伝子によりコードされる選択された抗体フレームワークのユニークまたは制限された数が選択される。これらのフレームワークの選択は、それらの生化学的安定性および／または天然抗体レパートリーにおけるそれらの発現頻度に一般的に基づく。結合タンパク質のコレクションを作製するために、次いで、ＣＤＲの全てまたは部分集合に合成多様性を導入する。典型的には、ＣＤＲの全体または部分を、異なる方策を用いて多様化する。いくつかの場合において、多様性は、ＣＤＲ内の選択された部分に導入された（Ｋｎａｐｐｉｋ Ａら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００年２月１１日；２９６巻（１号）：５７〜８６頁）。抗原接触に頻繁に関与する残基、天然抗体レパートリーにおいて最大の多様性を表示する残基、または天然の親和性成熟プロセス中の体細胞超変異の発生に関与する細胞機構により優先的に標的にされる残基でさえも標的残基になることができる（Ｂａｌｉｎｔ ＲＦ， Ｌａｒｒｉｃｋ ＪＷ． Ｇｅｎｅ． １９９３年１２月２７日；１３７巻（１号）：１０９〜１８頁）。
抗体ＣＤＲを多様化するためにいくつかの方法が用いられている。縮重オリゴヌクレオチドを用いるオーバーラップＰＣＲが、フレームワークおよびＣＤＲエレメントを組み立て、抗体遺伝子を再構築するために広範囲に用いられている。別のアプローチにおいて、ユニーク制限酵素部位を、各ＣＤＲの境界にてフレームワーク領域内に工学的に作製して、制限酵素媒介クローニングによる多様化されたＣＤＲの導入を可能にしている。いずれの場合においても、ライブラリーの全てのメンバーは、選択された好ましい特徴を有するフレームワークに基づくので、これらのレパートリーに由来する抗体はより安定であり、有用な試薬のよりよい供給源を提供すると予想される（Ｋｎａｐｐｉｋ、米国特許第６６９６２４８号；Ｓｉｄｈｕ ＳＳら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０００年；３２８巻：３３３〜６３頁；Ｌｅｅ ＣＶら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００４年７月２３日；３４０巻（５号）：１０７３〜９３頁）。
しかし、これらの合成ライブラリーの重要な制限は、ランダムに多様化された配列がタンパク質の正確な発現および／または折り畳みを可能にしないので、ライブラリーメンバーのかなりの割合が発現されないことである。この問題は、重鎖のＣＤＲ３についてより重要である。実際に、このＣＤＲは、しばしば、抗原との結合エネルギーのほとんどに寄与し、長さおよび配列が非常に多様である。その他のＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）は、正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）折り畳みとして公知の制限された数の３次元立体構造しか採用できないが、重鎖ＣＤＲ３が採用できる立体構造の数は、予測するには非常に多様なままである（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７年１１月７日；２７３巻（４号）：９２７〜４８頁）。さらに、長いＣＤＲ Ｈ３をカバーするために用いられる長い縮重オリゴヌクレオチドの使用は、しばしば、単独塩基対欠失を導入する。これらの因子は、合成レパートリーの機能的サイズを著しく低減する。
天然および合成のレパートリーはともに、利点および制限を有する。一方、天然に再構成された抗体の可変遺伝子の捕捉に依存する方策は、これらが、ライブラリー内に好ましいフレームワークを潜在的に含む可能性がより少ないので、最適ではない。肯定的な観点は、これらの再構成された可変遺伝子が、これらが天然抗体の状況において発現されているので、正確なドメイン折り畳みに適合性のＣＤＲを含むことである。一方、フレームワークを選択し、合成多様性を挿入することに基づく方策は、フレームワークの安定性が改良されるという利点を有するが、折り畳みおよび／または発現に適合性でなく、全体的なドメインを不安定化できる多数のＣＤＲ配列により制限される（図１Ａ）。よって、所望の特徴を有する選択されたフレームワークを用いることの利益を組み合わせることができ、それらを、例えば天然レパートリーに由来する正確に折り畳まれたＣＤＲと組み合わせることができる新規なアプローチが必要とされている。
天然に再構成された抗体配列を捕捉することまたは合成手段により多様性を作製することのいずれかにより抗体ライブラリーを作製するための全ての記載したアプローチは、非機能的抗体配列を導くフレームシフト変異の出現により制限される。これらの変異は、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ断片組み立てのような抗体をコードするＤＮＡの分子的取り扱いの複数のステップならびに分子クローニングにて現れることがある。抗体ライブラリーにおける非機能的メンバーの頻度は、典型的に、抗体多様性を捕捉または作製するために採用した方策に依存して、１５％〜４５％の範囲である（Ｐｅｒｓｓｏｎ ＭＡら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９１年３月１５日；８８巻（６号）：２４３２〜６頁；Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ Ｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５年５月１９日；３３巻（９号）：ｅ８１頁；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ Ｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００年８月；１８巻（８号）：８５２〜６頁；Ｒｏｔｈｅら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００８年２月２９日；３７６巻（４号）：１１８２〜２００頁）。非機能的抗体をコードする配列の頻度は、抗体同定プロセスに対して大きな影響を有する。まず、ライブラリーの機能的サイズが低減され、そして、非機能的クローンは、ライブラリーの増殖中に成長の利点をしばしば有するので、これらは、より速く拡張し、抗体候補の同定プロセスを損ない得る（Ｄｅ Ｂｒｕｉｎ Ｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９年４月１７日：３９７〜３９９頁）。これらの問題は、抗体ライブラリーの可能性を完全に活用することについての深刻な制限として認識されている。高度に機能的なライブラリーの作製は、当該分野において難題のままであり、プロセスを改良するための多くの努力を促進している。例えば、天然ＣＤＲ配列で見出されるアミノ酸使用を模倣することを目的とする複数の多様化方策が、合成ＣＤＲによりコードされる可能性のある配列組み合わせの膨大な多様性をより効率的に標本抽出するために用いられている（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ Ｊら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９５年４月２１日；２４８巻（１号）：９７〜１０５頁；Ｓｉｄｈｕ ＳＳら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００４年４月２３日；３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁）。別のアプローチは、多様性の喪失をおそらく犠牲にして、非機能的クローンを除去するために最初のライブラリーを一掃することである。このことは、抗体ライブラリーを包括的なリガンドと結合させることによる合成ライブラリーの予備選択に用いられている。このステップにより、発現でき、正確に折り畳むことができ、かつより機能的なライブラリーを再創出するために用いることができるライブラリーメンバーを富化することが可能になる（ＷｉｎｔｅｒおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ、特許文献２）。アプローチにかかわらず、いずれのライブラリーの質も、ライブラリーを作製するために用いた分子生物学的方法の効率に依存し、一般的に、１５％〜４５％のライブラリーの非機能的メンバーを導く。よって、分子クローニングステップ中に導入されるフレームシフトによる非機能的遺伝子の頻度を最小限にし、所望の特性を有する抗体フレームワークに正しく折り畳まれる傾向が高いＣＤＲ領域を捕捉することによりライブラリーの機能性を最大限にする、新規で高度に効率的なアプローチが必要とされている。さらに、高い親和性の抗体の作製プロセスを改良するために、動物免疫レパートリーからのＣＤＲ配列を、ヒト抗体フレームワークのような療法上有用な状況に捕捉することを可能にするアプローチが必要とされている。
米国特許第５，９６９，１０８号明細書 米国特許第６，６９６，２４５号明細書
発明の概要
本発明は、安定なフレームワーク選択と、天然にコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）または抗体のような機能的ポリペプチドの天然の状況において選択されたＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列の挿入との利点を組み合わせた核酸配列のライブラリーを作製する方法を提供する。この方法は、合成アプローチを用いてはコードするのが非常に困難である長いＣＤＲまたはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列の回復を可能にする。本発明は、安定なフレームワークと、正確に折り畳まれたＣＤＲまたはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列とを組み合わせることにより、ライブラリー中の機能的抗体の割合を最大限にし、よって、選択プロセスの性能および選択されるクローンの質を最大限にする。本発明は、異なる種からの天然に発現されるＣＤＲを捕捉し、それらをヒト抗体フレームワークに挿入する方法を提供する。このことにより、ヒトレパートリーと比較した場合に、長さおよび組成が著しく異なるＣＤＲ Ｈ３レパートリーの使用が可能になる。本発明は、その他の種に由来する構造レパートリーと、よって異なる構造空間を標本抽出する能力を特徴とするヒト抗体断片の作製を可能にする。本方法は、合成起源のＣＤＲまたはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列を、代替法よりも高い成功頻度で、コード配列中にフレームシフトを引き起こす誤りの導入をより少なくして導入するためにも用いられる。本方法を用いて作製されるライブラリーは、機能的バリアントの頻度が高い。この方法に従って作製されるバリアントのライブラリーは、いずれの記載されたディスプレイ、選択およびスクリーニング技術を用いる選択ならびにスクリーニングのためにも用いられる。
異なる発生段階での異なる種またはある種のうちでの免疫レパートリーの分析により、ＣＤＲ Ｈ３の組成および長さの特徴におけるいくつかの著しい違いが明らかになっている。例えば、ヒトにおける平均のＣＤＲＨ３の長さは、胎児期または新生児と比較して、成体においてより長い（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｊｒ， ＨＷら、２００１年Ｂｌｏｏｄ ９８巻；２７４５〜２７５１号）。興味深いことに、ヒトおよび霊長類の抗体生殖系列遺伝子は大きく類似するにもかかわらず、発生中のＣＤＲＨ３の長さの進展は異なる（Ｌｉｎｋ ＪＭら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５年４２巻；９４３〜９５５頁）。マウスおよびヒトにおいて見出されたＣＤＲ Ｈ３配列の比較は、平均長さがマウスにおいて著しくより短いことを示す（Ｒｏｃｋ ＥＰら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９４年１７９巻；３２３〜３２８頁）。骨髄における初期Ｂ細胞発生中に、平均のＣＤＲ Ｈ３の長さはマウスにおいて増加するが、ヒトにおいては減少する傾向にあり、さらに、マウスおよびヒトのＣＤＲＨ３レパートリーのアミノ酸組成は異なる（Ｚｅｍｌｉｎ Ｍら、２００３年Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４巻；７３３〜７４９頁；Ｉｖａｎｏｖ Ｉら、２００５年Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４巻；７７７３〜７７８０頁）。これらの例は、異なる種が、それらが類似のクラスの抗原に全体的に曝露されるという事実にもかかわらず、異なる範囲のＣＤＲ Ｈ３レパートリーを発現することを示し、これらの観察結果の生物学的重要性はまださらに研究されなければならない。ハプテンまたはペプチドのような小型抗原を指向する抗体の組み合わせ部位の形状が、大型タンパク質を指向するものとは異なり、組み合わせ部位の形状が、ＣＤＲの長さおよび組成により指図されることが証明されている（Ｃｏｌｌｉｓ Ａら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００３年３２５巻；３３７〜３５４頁）。これらの知見から、異なる種により発現されるＣＤＲ Ｈ３レパートリーが、異なる標的クラスに対して効率的に反応するための多様な傾向を有すると予想できる。
本明細書で提供される方法および抗体ライブラリーは、療法用抗体の作製のために、異なる種により発現される種々のレパートリーを活用するために設計されている。異なる３次元空間を探索するこれらのレパートリーは、より広い種類の標的クラスおよびエピトープに対する抗体の作製を可能にすると考えられる。ナイーブまたは免疫した動物からライブラリーを作製する方法は、詳細に記載され、これらの方法は、対応するレパートリーの捕捉および抗体の作製を可能にする。しかし、これらのライブラリーに由来する抗体は、ヒト起源のものではなく、よって、ヒト化のようなさらなる工学的作業を行うことなしではヒトへの療法のために十分に適切ではない。よって、異なる種からのレパートリーにおいて発現される多様性を利用し、この多様性を、ヒト抗体の療法として有用な状況において活用するための新規な方法が必要とされている。
本明細書で提供される方法および抗体ライブラリーは、上記の制限のいくつかに対処し、現在の技術を超える改良である。まず、本明細書で提供される方法は、安定なフレームワーク選択と、機能的抗体の天然の状況において選択された天然にコードされるＣＤＲの挿入との利点を組み合わせている。第２に、上記の方法は、合成または天然のＣＤＲを抗体フレームワークに高い効率で挿入することを可能にし、このことは、ライブラリーにおけるフレームシフトの数を著しく最小限にし、よって、その質を改良する。最後に、本発明は、異なる種からの天然に発現されたＣＤＲ Ｈ３レパートリーを捕捉することにより天然に存在する抗体構造多様性を使用し、それらをヒト抗体フレームワークに挿入するための新規な方式を可能にする。よって、これらの構造的に多様なレパートリーを、生産的な方式で、ヒト療法のための抗体の作製のために活用することが可能である。
本明細書で提供される方法は、安定なフレームワークと、正しく折り畳まれたＣＤＲまたはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列とを含有する抗体を作製する。上記の方法は、安定なフレームワーク内の配列の天然の多様性を捕捉する。
本明細書で提供される方法において、フレームワーク領域１、２および３（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）についての生殖系列配列は、所望の生物から、例えばヒトゲノムから選択される（例えば図２および６を参照されたい）。本方法のある実施形態において、選択された抗体可変ドメインは、多様化された配列の組み込み部位として貢献するスタッファー配列を導入することにより改変される。制限酵素認識部位、例えばＩＩｓ型制限部位を、可変重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ Ｈ３）、可変軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ Ｌ３）、可変重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｈ１）、可変軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｌ１）、可変重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ Ｈ２）または可変軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ Ｌ２）のような所望の場所にて導入することにより、多様性を免疫グロブリンコード領域の外側の配列中に導入する。本明細書で提供される例は、ＣＤＲ３の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性を証明するが、多様性は、それらに限定されないが、ＣＤＲ１の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）またはＣＤＲ２の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）のような任意の所望の場所にて達成できることが理解される。多様化されたＤＮＡ配列は、ＩＩｓ型制限部位を含むフランキング配列とともに作製される。本明細書で提供される方法において、制限酵素により作製される付着末端は適合性であり、リーディングフレームは維持されるので、多様化されたＤＮＡ断片を、アクセプターフレームワーク内にライゲーションすることが可能になる。
本明細書で提供される方法は、多様化された領域がその中にコードされたアミノ酸配列を作製するためにも有用である。例えば、本明細書で提供される方法において、コードされるアミノ酸の多様化されない部分についての配列は、所望の生物、例えばヒト配列から選択される。コードされるアミノ酸配列の部分は、多様化された配列の組み込み部位として貢献するスタッファー配列を導入することにより改変される。制限酵素認識部位、例えばＩＩｓ型制限部位を、コードされるアミノ酸配列内の所望の場所にて導入することにより、多様性を所望の場所（複数可）にて配列内に導入する。多様化されたＤＮＡ配列は、ＩＩｓ型認識部位を含むフランキング配列とともに作製される。本明細書で提供される方法において、制限酵素により作製される付着末端は適合性であり、リーディングフレームは維持されるので、多様化されたＤＮＡ断片を、アクセプターフレームワーク内にライゲーションすることが可能になる。
本明細書で提供される方法において、「アクセプターフレームワーク」は、２つのＩＩｓ型制限酵素部位を含有し、好ましくはこれらが境をなすＤＮＡの「スタッファー配列」を用いて作製される（例えば図６を参照されたい）。好ましくは、これらの２つのＩＩｓ型制限酵素部位は、例えばＣＤＲ Ｈ３領域、ＣＤＲ Ｌ３領域、ＣＤＲ Ｈ１領域、ＣＤＲ Ｌ１領域、ＣＤＲ Ｈ２領域またはＣＤＲ Ｌ２領域のような多様性が所望される部位の境界にて配列を消化する。本明細書で用いる場合、「アクセプターフレームワーク」との用語は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域をコードする核酸配列と、２つのＣＤＲまたはこれらのＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸をコードする核酸配列と、多様化された核酸配列の組み込みの部位として貢献する「スタッファー断片」とを含む核酸配列のことをいう。例えば、ＣＤＲ３の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、アクセプターフレームワークは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域をコードする核酸配列と、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の領域をコードする核酸配列と、多様化された核酸配列の組み込みの部位として貢献する「スタッファー断片」とを含む。例えば、ＣＤＲ２の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、アクセプターフレームワークは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域をコードする核酸配列と、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３の領域をコードする核酸配列と、多様化された核酸配列の組み込みの部位として貢献する「スタッファー断片」とを含む。ＣＤＲ１の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、アクセプターフレームワークは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域をコードする核酸配列と、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域をコードする核酸配列と、多様化された核酸配列の組み込みの部位として貢献する「スタッファー断片」とを含む。
「スタッファー断片」、「スタッファーＤＮＡ断片」および「スタッファー配列」の用語またはその任意の文法上の活用形は、少なくとも２つのＩＩｓ型認識部位と多様化された配列とを含む核酸配列のことをいうために、本明細書において交換可能に用いられる。アクセプターフレームワークは、可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワークまたは可変軽鎖（ＶＬ）アクセプターフレームワークであり得る。本明細書に含まれるアクセプターフレームワークおよびスタッファー断片の使用は、ＣＤＲ配列（天然または合成）またはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列を、アクセプターフレームワーク内に、ドナーフレームワークヌクレオチドまたはそこに含有されるかもしくは組み込みのために必要とされる残基なしで、組み込むことを可能にする。例えば、本明細書に含まれるアクセプターフレームワークおよびスタッファー断片の使用は、ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｈ１およびＣＤＲ Ｌ１から選択されるＣＤＲ配列（天然または合成）、またはＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｈ１およびＣＤＲ Ｌ１から選択されるＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列を、アクセプターフレームワーク内に、ドナーフレームワークヌクレオチドまたはそこに含有されるかもしくは組み込みのために必要とされる残基なしで、組み込むことを可能にする。つまり、組み込みにより、スタッファー断片は全体が除去され、アクセプタータンパク質のコード領域および挿入されるタンパク質断片（すなわちＣＤＲ）は、インタクトである。
本明細書で提供される方法は、多様性が所望される部位、例えばＣＤＲ Ｈ３領域、ＣＤＲ Ｌ３領域、ＣＤＲ Ｈ２領域、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｈ１領域またはＣＤＲ Ｌ１領域の境界にてＩＩｓ型制限酵素の切断部位を含有するように設計されたプライマーを用いる。ランダムな天然に存在するＣＤＲクローン（例えば図１０を参照されたい）もしくは合成ＣＤＲ配列（例えば実施例６を参照されたい）またはＣＤＲの役割を充足できるアミノ酸配列は、本明細書で用いるアクセプターフレームワークに捕捉される。例えば、ＣＤＲ３の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、ランダムな天然に存在するＣＤＲ３クローン（例えば図１０を参照されたい）もしくは合成ＣＤＲ３配列（例えば実施例６を参照されたい）またはＣＤＲ３の役割を充足できるアミノ酸配列が、本明細書で用いるアクセプターフレームワークに捕捉される。例えば、ＣＤＲ２の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、ランダムな天然に存在するＣＤＲ２クローン（例えば図１０に示す方法を参照されたい）もしくは合成ＣＤＲ２配列（例えば実施例６に示す方法を参照されたい）またはＣＤＲ２の役割を充足できるアミノ酸配列が、本明細書で用いるアクセプターフレームワークに捕捉される。例えば、ＣＤＲ１の領域（可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域中）での多様性が所望される実施形態において、ランダムな天然に存在するＣＤＲ１クローン（例えば図１０に示す方法を参照されたい）もしくは合成ＣＤＲ１配列（例えば実施例６に示す方法を参照されたい）またはＣＤＲ１の役割を充足できるアミノ酸配列が、本明細書で用いるアクセプターフレームワークに捕捉される。例として、免疫グロブリンのＣＤＲ Ｈ３をコードするＤＮＡ配列のフランキング領域に特異的、すなわち可変領域のＦＲ３およびＦＲ４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。例えば、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｈ２またはＣＤＲ Ｌ２のようなその他の領域をコードするＤＮＡ配列のフランキング領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーも設計できる。これらのオリゴヌクレオチドは、それらの５’末端にＩＩｓ型制限酵素の部位を含有し、一方、それらの３’部分は、標的にされるＤＮＡ配列と一致する。
いくつかの実施形態において、プライマーは、配列番号１２０〜２５４からなる群より選択される核酸である。
本明細書で提供される方法は、例えばＦｏｋＩのようなＩＩｓ型制限酵素を用いて、例えば天然ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｈ２またはＣＤＲ Ｌ２配列のような天然ＣＤＲ配列を、本明細書に記載されるアクセプターフレームワークに挿入する。本明細書で提供される方法は、例えばＦｏｋＩのようなＩＩｓ型制限酵素を用いて、例えば合成ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｈ２またはＣＤＲ Ｌ２配列のような合成ＣＤＲ配列を、本明細書に記載されるアクセプターフレームワークに挿入する。本明細書で提供される方法は、例えばＦｏｋＩのようなＩＩｓ型制限酵素を用いて、例えば天然もしくは合成ＣＤＲ Ｈ３、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｈ２またはＣＤＲ Ｌ２領域の役割を充足できるアミノ酸配列のような所望のＣＤＲ領域の役割を充足できるアミノ酸配列を、本明細書に記載されるアクセプターフレームワークに挿入する。ＩＩｓ型制限酵素は、それらの認識配列の一方の側への外側で切断する酵素である。これらの酵素は、中程度のサイズ、典型的には４００〜６５０アミノ酸の長さであり、これらは、連続的で非対称な配列を認識する。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼとして公知の適切なＩＩｓ型制限酵素とそれらが同定する配列は、例えばＳｚｙｂａｌｓｋｉら、「Ｃｌａｓｓ−ＩＩＳ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ − ａ Ｒｅｖｉｅｗ．」Ｇｅｎｅ、１００巻：１３〜２６頁（１９９１年）（その内容は、本明細書にその全体が参照により組み込まれる）に記載される。
１次ライブラリーは、ＶＨアクセプターフレームワークと固定ＶＬ配列（「ダミーＶＬ」配列ともいう）、またはＶＬアクセプターフレームワークと固定ＶＨ配列（「ダミーＶＨ」配列ともいう）を含む。つまり、１次ライブラリーは、重鎖または軽鎖の一方だけに多様性を示す。２次ライブラリーは、ＶＨアクセプターフレームワークとＶＬアクセプターフレームワークとを一緒にライゲーションすることにより作製される（例えば実施例７を参照されたい）。２次ライブラリーは、重鎖および軽鎖の両方に多様性を有する。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから単離された複数の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ Ｈ３）を含有するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含有する別個のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）非ヒト種の免疫グロブリンレパートリーから単離された重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ Ｈ３領域をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ Ｈ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ Ｈ３領域またはアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップを含む。
いくつかの実施形態において、上記のステップ（ｂ）は、非ヒト種からのＣＤＲ Ｈ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。いくつかの実施形態において、上記のステップ（ｂ）は、非ヒト種からのＣＤＲ Ｈ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。いくつかの実施形態において、非ヒト種は、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマまたはブタである。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、複数のアクセプターフレームワーク配列を発現させるために十分な条件下で培養するステップをさらに含む。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域が、前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する方法も提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップとをさらに含む。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域が、前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する方法も提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップとをさらに含む。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、ステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつ完全免疫グロブリン可変遺伝子コード配列が復元するように、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする前記消化された核酸配列を発現ベクターにクローニングし、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする前記消化された核酸配列を前記アクセプターフレームワークにライゲーションするステップと、（ｅ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記複数のアクセプターフレームワーク配列を発現させるために十分な条件下で培養するステップと、（ｆ）前記宿主細胞を、標的抗原と接触させるステップと、（ｇ）どの発現されたアクセプターフレームワーク配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップとにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製する方法も提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｉ）前記標的抗原と結合する前記免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、ステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域が、前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつ完全免疫グロブリン可変遺伝子コード配列が復元するように、前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする前記消化された核酸配列を発現ベクターにクローニングし、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする前記消化された核酸配列を前記アクセプターフレームワークにライゲーションするステップと、（ｅ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記複数のアクセプターフレームワーク配列を発現させるために十分な条件下で培養するステップと、（ｆ）前記宿主細胞を、標的抗原と接触させるステップと、（ｇ）どの発現されたアクセプターフレームワーク配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップとにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製する方法も提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｉ）前記標的抗原と結合する前記免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
本発明は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域が、前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップと（ｇ）ステップ（ｆ）の複数の免疫グロブリン可変ドメインを、標的抗原と接触させるステップと、（ｈ）どの発現された免疫グロブリン可変ドメインコード配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップとにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸はＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、天然に存在する配列または免疫した動物に由来する配列を含む。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
ある実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
別の実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｉ）前記標的抗原と結合する前記免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
本発明は、核酸のライブラリーを生成する方法であって、各核酸が、免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。これらの方法は、（ａ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）からなる群より選択される単独相補性決定領域（ＣＤＲ）にて多様性の供給源が導入された複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク配列が、少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を含み、前記多様性の供給源が、前記ＣＤＲ領域の外側にＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有する天然に存在するＣＤＲ配列から選択されるＣＤＲであるステップと、（ｂ）前記多様性の供給源を、各Ｉｇアクセプターフレームワーク内に、前記多様性の供給源と前記Ｉｇアクセプターフレームワークとの両方を、ＩＩｓ型制限酵素を用いて消化することにより導入するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、前記消化された多様性の供給源を、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク内にライゲーションするステップを含む。
天然に存在するＣＤＲ領域配列は、それらの野生型、すなわち天然状態から実質的に変更されていない。これらの天然に存在するＣＤＲ領域配列は、２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有するように工学的に操作された（またはそうでなければ人工的に操作された）アミノ酸配列に挟まれて、天然に存在するＣＤＲ領域配列のそれぞれの側に１つずつのＩＩｓ型制限酵素認識部位を有する。ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＣＤＲコード領域の外側である。ＣＤＲ領域の配列は、ＣＤＲコード領域の境界で変更されない−−制限酵素は、ＣＤＲコード領域の境界までの領域にて認識してスプライシングするが、ＣＤＲコード領域内ではスプライシングしない。
いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあって天然に存在するＣＤＲ配列を挟むＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあって天然に存在するＣＤＲ配列を挟むＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、Ｉｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ３の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ１の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ２の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、または特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖（ＶＬ）アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップとをさらに含む。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
本発明は、核酸のライブラリーを生成する方法であって、各核酸が、免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。これらの方法は、（ａ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）からなる群より選択される単独相補性決定領域（ＣＤＲ）にて多様性の供給源が導入された複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク配列が、少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を含み、前記多様性の供給源が、前記ＣＤＲ領域の外側にＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有する合成的に生成されたＣＤＲ配列から選択されるＣＤＲであるステップと、（ｂ）前記多様性の供給源を、各Ｉｇアクセプターフレームワーク内に、前記多様性の供給源と前記Ｉｇアクセプターフレームワークとの両方を、ＩＩｓ型制限酵素を用いて消化することにより導入するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、前記消化された多様性の供給源を、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク内にライゲーションするステップを含む。
いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあるＩＩｓ型制限酵素認識部位および合成的に生成されたＣＤＲ配列は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあるＩＩｓ型制限酵素認識部位および合成的に生成されたＣＤＲ配列は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、Ｉｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップとをさらに含む。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。例えば、ファージミドベクターは、ｐＮＤＳ１である。
本発明は、免疫グロブリンポリペプチドを作製する方法も提供する。これらの方法は、（ａ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）からなる群より選択される単独相補性決定領域（ＣＤＲ）にて多様性の供給源が導入された複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク配列が、少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を含み、前記多様性の供給源が、前記ＣＤＲ領域の外側にＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有する天然に存在するＣＤＲ配列から選択されるＣＤＲであるステップと、（ｂ）前記多様性の供給源を、各Ｉｇアクセプターフレームワーク内に、前記多様性の供給源と前記Ｉｇアクセプターフレームワークとの両方を、ＩＩｓ型制限酵素を用いて消化することにより導入するステップと、（ｃ）完全免疫グロブリン可変遺伝子コード配列が復元するように、前記消化された多様性の供給源を前記Ｉｇアクセプターフレームワーク内にライゲーションするステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）からの前記完全免疫グロブリン可変遺伝子コード配列を、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない前記完全免疫グロブリン遺伝子コード配列を発現させるために十分な条件下で培養するステップとを含む。
これらの実施形態において、天然に存在するＣＤＲ領域配列は、それらの野生型、すなわち天然状態から実質的に変更されていない。これらの天然に存在するＣＤＲ領域配列は、２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有するように工学的に操作された（またはそうでなければ人工的に操作された）アミノ酸配列に挟まれ、天然に存在するＣＤＲ領域配列のそれぞれの側に１つずつのＩＩｓ型制限酵素認識部位を有する。
いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあって天然に存在するＣＤＲ配列を挟むＩＩｓ型制限酵素認識部位は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあって天然に存在するＣＤＲ配列を挟むＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ３の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ１の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、天然に存在する核酸の組は、ＣＤＲ２の領域をコードし、天然に存在する核酸の組は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、または特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、前記宿主細胞を標的抗原と接触させるステップと、どの発現された完全Ｉｇ可変遺伝子コード配列が前記標的抗原と結合するかを決定することにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその部分を同定するステップも含む。いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｉ）前記標的抗原と結合する前記免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
本発明は、免疫グロブリンポリペプチドを作製する方法も提供する。これらの方法は、（ａ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）からなる群より選択される単独相補性決定領域（ＣＤＲ）にて多様性の供給源が導入された複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記Ｉｇアクセプターフレームワーク配列が、少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を含み、前記多様性の供給源が、前記ＣＤＲ領域の外側にＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有する合成的に生成されたＣＤＲ配列から選択されるＣＤＲであるステップと、（ｂ）前記多様性の供給源を、各Ｉｇアクセプターフレームワーク内に、前記多様性の供給源と前記Ｉｇアクセプターフレームワークとの両方を、ＩＩｓ型制限酵素を用いて消化することにより導入するステップと、（ｃ）完全免疫グロブリン可変遺伝子コード配列が復元するように、前記消化された多様性の供給源を前記Ｉｇアクセプターフレームワーク内にライゲーションするステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）からの前記ライゲーションしたＩｇアクセプターフレームワークを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない前記完全免疫グロブリン遺伝子コード配列を発現させるために十分な条件下で培養するステップとを含む。
いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあるＩＩｓ型制限酵素認識部位および合成的に生成されたＣＤＲ配列は、同じＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸配列内にあるＩＩｓ型制限酵素認識部位および合成的に生成されたＣＤＲ配列は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＦｏｋＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位および／またはＢｓｍＢＩ認識部位である。
いくつかの実施形態において、Ｉｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のＩｇアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、前記宿主細胞を標的抗原と接触させるステップと、どの発現された完全Ｉｇ可変遺伝子コード配列が前記標的抗原と結合するかを決定することにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその部分を同定するステップも含む。いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｉ）前記標的抗原と結合する前記免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。
いくつかの実施形態において、非ヒト種は、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、（ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）前記哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）領域をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列が、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップを含む。これらのステップは、哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を用いて行ってもよい。これらのステップは、哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を用いて行ってもよい。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、哺乳動物種からのＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするアクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における配列を改変して、適合性の付着末端を介する、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするアクセプターフレームワークへの効率的なライゲーションを可能にするように設計される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３の領域を挟む哺乳動物ＤＮＡ配列は、ＩＩｓ型制限酵素による切断により、消化されたアクセプターフレームワークの付着末端に適合性の付着末端を生じないことがある。このような場合、ＩＩｓ型制限酵素での切断の後に付着末端が適合性であり効率的なライゲーションが生じ得るように標的哺乳動物配列を改変するように、増幅に用いるオリゴヌクレオチドを設計する。これらのステップは、哺乳動物種からのＣＤＲ２配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。これらのステップは、哺乳動物種からのＣＤＲ１配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、哺乳動物種からのＣＤＲ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。これらのステップは、非ヒト種からのＣＤＲ２配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。これらのステップは、哺乳動物種からのＣＤＲ１配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ２配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ Ｈ２）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ２配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ Ｌ２）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｌ１）配列をコードする。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分を含むか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分に由来する。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分を含むか、またはそれに由来する。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップも含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドまたはファージベクターである。いくつかの実施形態において、宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物もしくは非ヒト種からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法を提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。本発明は、核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする方法も提供する。
いくつかの実施形態において、非ヒト種は、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである。
いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）前記免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）領域をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列が、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップを含む。これらのステップは、免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を用いて行ってもよい。これらのステップは、免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を用いて行ってもよい。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、免疫した非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするアクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における配列を改変して、適合性の付着末端を介する、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするアクセプターフレームワークへの効率的なライゲーションを可能にするように設計される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３の領域を挟む哺乳動物ＤＮＡ配列は、ＩＩｓ型制限酵素による切断により、消化されたアクセプターフレームワークの付着末端に適合性の付着末端を生じないことがある。このような場合、ＩＩｓ型制限酵素での切断の後に付着末端が適合性であり効率的なライゲーションが生じ得るように標的哺乳動物配列を改変するように、増幅に用いるオリゴヌクレオチドを設計する。これらのステップは、免疫した非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ２配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。これらのステップは、免疫した非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ１配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、前記非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ Ｈ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる。これらのステップは、前記非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ２配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。これらのステップは、前記非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ１配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行うこともできる。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。いくつかの実施形態において、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ２配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ Ｈ２）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ２配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ Ｌ２）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１配列をコードする多様化された核酸配列は、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｈ１）配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１配列をコードする多様化された核酸配列は、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ Ｌ１）配列をコードする。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分を含むか、またはそれに由来する。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分を含むか、またはそれに由来する。例えば、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列の少なくとも一部分を含むか、またはそれに由来する。例えば、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップも含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドまたはファージベクターである。
図１Ａは、フレームワークと、別のタンパク質または分子との接触を提供するループとを有するタンパク質ドメインの模式図である。いくつかの状況を示す：正確に折り畳まれたループ領域を有する安定タンパク質ドメイン；固有安定性が制限されたドメインに挿入された正確に折り畳まれたループ；安定性がループ領域により影響される、固有に安定なタンパク質ドメイン。図１Ｂは、異なる多様化方策を用いて作製されたタンパク質レパートリーのライブラリーの異なる型の模式図である。 図２は、抗体可変アクセプターフレームワークの模式図である。フレームワーク領域、ＣＤＲおよびＩＩＳ型−ＲＭ制限部位を示す図である。 図３は、天然レパートリーからＣＤＲＨ３配列を捕捉するために用いた方策の模式図である。 図４は、天然ＣＤＲ領域の増幅およびそのアクセプターフレームワークへの挿入のためにＩＩＳ型−ＲＭ制限酵素を含有するプライマーを用いることの利点についての模式図である。 図５は、アクセプターフレームワークの作製のために選択した可変重鎖および軽鎖ドメインの生殖系列遺伝子配列を示す図である。 図６は、生殖系列配列にスタッファー断片およびＦＲ４の領域を付加することによるアクセプターフレームワークの作製のために用いた増幅方策の模式図である。 図７の上のパネルは、ＶＨアクセプターフレームワークのスタッファー断片の配列の詳細を示す図である。制限酵素ＢｓｍＢＩにより認識され切断されるＤＮＡ配列を、それぞれ赤色および黒色の箱で囲み、図の下のパネルに示す。抗体可変配列に相当するリーディングフレームに下線を付す。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図８は、２０のアクセプターフレームワークの配列を示す図である。 図９は、単独またはダミー重鎖可変領域もしくはダミー軽鎖可変領域と組み合わせたｐＮＤＳ１ベクターの模式図である。 図１０は、ヒトｃＤＮＡ供給源から取得し、ヒトアクセプターフレームワークに挿入したＣＤＲＨ３配列の配列を示す表である。 図１１は、ＶＨ、ＶＫおよびＶλについての合成ＣＤＲ配列の設計を表す表である。位置は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って番号を付す。規定された多様化方策（ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＶＴ）を用いるＣＤＲの理論的多様性を示す。ＶＨ ＣＤＲ合成のために採用した方策を箱で囲む。 図１２は、アクセプターフレームワークへの合成ＣＤＲの挿入の模式図および配列の詳細である。 図１３は、１次ライブラリーと、２次ライブラリーを作製するために行った鎖組換えとの模式図である。 図１４は、ＶＬ合成ライブラリーと組み合わせたアクセプターＶＨライブラリーの作製と、ヒトまたは非ヒト起源のＣＤＲＨ３レパートリーの捕捉の模式図である。 図１５は、多様性の供給源としてナイーブマウスまたはｈＩＦＮγもしくはｈＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳで免疫化したマウスからのＣＤＲＨ３レパートリーを用いるＭｎＡ、ＭｉＢおよびＭｉＣライブラリー作製の模式図である。ライブラリーのサイズは、上のパネルに示す。下のパネルは、これらのライブラリーで見出されたＣＤＲＨ３の長さの分布を示す。 図１６は、２次ライブラリーＡＤ１およびＡＥ１を用いたｈＩＦＮγに対する選択中のファージ産出量の滴定を示す一連のグラフである。 図１７は、２次ライブラリーＡＤ１およびＡＥ１を用いたモノクローナル抗体５Ｅ３に対する選択中のファージ産出量の滴定を示す一連のグラフである。 図１８は、ＡＥ１およびＡＤ１ライブラリー、ならびにモノクローナル抗体５Ｅ３に対する３回の選択の後に見出されたＣＤＲ Ｈ３の長さの頻度を示す一連のグラフである。異なるＶＨファミリー内の各ＣＤＲ Ｈ３の長さの分布を示す。しかし、ＣＤＲ Ｈ３が１６アミノ酸よりも長い場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームによりもたらされる７０ｂｐの配列は、ＶＨ１ファミリーを明確に同定するために十分なフレームワーク配列をカバーしないので、ＶＨファミリーは、未確認として示す。 図１９は、マウス５Ｅ３または無関係のマウス抗体１Ａ６に対する精製された６つのｓｃＦｖ調製物を用いる用量応答ＥＬＩＳＡを示す一連のグラフである。７つのクローンは、異なるｓｃＦｖをコードする。クローンＡ６は、ｈＩＦＮγに特異的なｓｃＦｖであり、陰性対照として用いた。 図２０は、ｈＩＦＮγに対する精製されたｓｃＦｖ調製物を用い、ｈＩＦＮγに特異的な陽性ｓｃＦｖ（Ａ６）と比較した用量応答ＥＬＩＳＡを示すグラフである。 図２１は、ｈＩＦＮγにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける、精製されたｓｃＦｖ調製物の阻害効果を示すグラフである。２つのｓｃＦｖ候補（ＡＤ１Ｒ４Ｐ１Ａ９およびＡＥ１４Ｒ３Ｐ２Ｅ４）の中和活性を、陽性対照ｓｃＦｖ（Ｇ９）および陰性対照ｓｃＦｖ（Ｄ１１）の活性と比較した。 図２２は、ｈＩＦＮγに応答するＭＨＣＩＩ誘導アッセイにおける精製されたｓｃＦｖ調製物の阻害効果を示すグラフである。２つのｓｃＦｖ候補（ＡＤ１Ｒ４Ｐ１Ａ９およびＡＥ１４Ｒ３Ｐ２Ｅ４）の中和活性を、陰性対照ｓｃＦｖ（Ｄ１１）の活性と比較した。 図２３は、ｈＩＦＮγにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける、ＩｇＧに再フォーマットした２つの候補ＡＤ１Ｒ４Ｐ１Ａ９およびＡＥ１４Ｒ３Ｐ２Ｅ４の阻害効果を示す一連のグラフである。２つのＩｇＧの中和活性を、ヒトＲＡＮＴＥＳを指向する無関係のＩｇＧ（ＮＩ−０７０１）の活性と比較した。 図２４は、マウス５Ｅ３、キメララット５Ｅ３ならびに対応するマウスおよびラットのアイソタイプ抗体に対する、ＩｇＧ Ｇ１１およびＤＡ４を用いる用量応答ＥＬＩＳＡを示す一連のグラフである。 図２５は、捕捉抗体として抗イディオタイプＩｇＧであるＧ１１およびＤＡ４を用いて異なる希釈のマウス血清におけるマウス５Ｅ３を検出するためのＥＬＩＳＡを示す一連のグラフである。 図２６は、ライブラリーＭｎＡおよびＭｉＢを用いるｈＩＦＮγに対する選択中のファージ産出量／投入量比を示すグラフである。 図２７は、ｈＩＦＮγに対する各回の選択の後のＭｎＡ、ＭｉＢおよびＭｉＣライブラリーに由来するクローンを用いるｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡスクリーニングで得られたヒットの比率を示すグラフである。閾値は、Ａ６対照ｓｃＦｖを用いて得られたシグナルの半分に設定した。 図２８は、ＭｎＡおよびＭｉＢライブラリーに由来するクローンを用いて得られたｈＩＦＮγに対する結合実験において異なるレベルのシグナルを与えるｓｃＦｖの分布頻度を表すグラフである。 図２９は、ｈＩＦＮγに対するＭｎＡおよびＭｉＢライブラリーに由来するクローンからの精製されたｓｃＦｖ調製物を用い、ｈＩＦＮγに特異的な陽性ｓｃＦｖ（Ａ６）と比較した用量応答ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
合成タンパク質ライブラリーおよび特に合成抗体ライブラリーは、ライブラリー作製プロセス中に、これらの合成タンパク質を構成する基礎単位を選択し、所望の特徴を含めることができるので、魅力的である。しかし、重要な制限は、バリアントのコレクションを作製するためのこれらの合成タンパク質の部分のランダム化が、しばしば、非機能的タンパク質を導き、よって、機能的ライブラリーのサイズとその性能とを劇的に減少させ得ることである。合成の多様性の別の制限は、ランダム化したアミノ酸のひと続きの理論的多様性をカバーするのに必要なライブラリーのサイズが、実際的な制限によりカバーできないことである。リボソームディスプレイのようなディスプレイシステムを用いても、１０１３〜１０１４の多様性を作製でき、かつ標本抽出でき、これは、９アミノ酸のひと続きの完全なランダム化を最大でカバーできる。天然ＣＤＲ Ｈ３（本明細書において重鎖ＣＤＲ３またはＶＨ ＣＤＲ３ともいう）の平均サイズは９を超え、２０アミノ酸の長さまでになり得るので、合成多様性は、このようなＣＤＲを作製するために実際的なアプローチではない。
ＤＮＡ取り扱いのために一般的に用いられる方法の組み合わせであって、タンパク質バリアントのライブラリーの作製の経過において用いられるものは、ＤＮＡ配列中に誤りを導入する。これらの誤りは、機能的ポリペプチドをもはやコードしないＤＮＡのリーディングフレーム中の変更を導き得る。典型的には、ＰＣＲおよび／または制限クローニングによるＤＮＡ断片の組み立てを用いて作製された抗体ライブラリーは、１５％と４５％との間のタンパク質翻訳のための正しいリーディングフレームにない配列を含有する。これらの非機能的ライブラリーメンバーは、抗体選択の効率および同定プロセスを損ない、よって当該分野における制限であると認識される。ここに記載される方法は、代替のクローニング方策を用いることにより、抗体ライブラリーへの多様性のより堅固な導入を可能にする。典型的には、インフレーム配列の頻度は、およそ９０％である。本発明の別の利点は、これが、選択されたアクセプター抗体可変フレームワークを、正しい折り畳みの可能性が高いＣＤＲループと組み合わせることである。このことにより、合成ランダム化アプローチを用いてカバーすることが困難な長いＣＤＲを捕捉することが可能になる。さらに、ここに記載される方法は、多様化された配列のクローニングのために、アクセプター抗体可変のコード領域内にいずれの改変も採用しない。この方法の別の利点は、多様性のいくつかの供給源を、同じ組のアクセプター抗体フレームワーク内に捕捉できることである。これらの供給源は、それらに限定されないが、ヒトもしくはその他の哺乳動物起源の天然抗体ＣＤＲ、ニワトリ抗体からのＣＤＲ、ラクダ科からのＶＨＨ、サメからのＩｇＮＡＲ、Ｔ細胞受容体からの可変ループのような抗体様分子のＣＤＲを含む。さらに、天然ＣＤＲは、ナイーブまたは免疫した動物に由来することができる。後者の場合、取得されたＣＤＲは、免疫化のために用いた抗原の認識に関与した配列が富化されている。
本明細書に記載される方法のユニークな特徴は、非ヒト種からの重鎖ＣＤＲ３コード配列の効率的な捕捉と、ヒト免疫グロブリンフレームワークへのそれらの挿入である。これらの方法を用いて、よって、別の種からの捕捉されたＣＤＲＨ３レパートリーにより形作られる異なる抗体組み合わせ部位を作製することができ、異なる３次元空間の標本抽出が可能になる。これらの方法は、ヒトＣＤＲＨ３レパートリーに近づくことができるものよりも異なる範囲の標的クラスおよびエピトープを標的にする新規な特異性を有するヒト抗体の作製を可能にする。さらに、これらの新規な抗体は、ヒトフレームワークならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２の領域をコードし、よって、ヒトの療法のために適切である。
この方法において、例えば抗体可変ドメインのような選択されたタンパク質ドメインは、多様化された配列の組み込み部位として貢献するスタッファー配列を導入することにより改変される。組み込みにより、スタッファー断片は全体が除去され、よって、アクセプタータンパク質と挿入されたタンパク質断片（すなわちＣＤＲ）のコード領域は、インタクトなままである。この組み込み事象は、ＤＮＡ配列の規定された部位を認識するが、その部位から規定された距離にあるＤＮＡを切断するＩＩｓ型制限酵素の使用により媒介される。このアプローチは、２つの主要な利点を有する：（１）これは、アクセプターフレームワークのコード配列に影響することなくこれらの消化を可能にし（サイレント制限部位を工学的に作製する必要がない）、（２）これは、定義により適合性の制限部位を本来所有しない天然に多様化された配列の消化およびクローニングを可能にする。
上記のように、抗体配列のライブラリーおよび／またはディスプレイを作製するための従来の試みは、本明細書で提供される方法とは異なる。例えば、いくつかの方法は、例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されるように、各ＣＤＲのグラフト化を必要とし、ここで、制限酵素部位は、ＣＤＲ Ｈ３領域だけでなく各ＣＤＲの境界にて工学的に作製される。他の方法では、例えば米国特許第６，９８９，２５０号に記載されるように、天然供給源からのＣＤＲ配列を増幅し、再構成する。米国特許出願第２００６０１３４０９８号に記載されるもののようないくつかの方法では、マウス（またはその他の哺乳動物）からの配列をヒトフレームワークに付加して、得られる抗体が、マウス起源のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の領域と、ヒト起源のＣＤＲ３の領域とを有するようにする。米国特許出願第２００３０２３２３３３号に記載されるもののようなその他の方法は、合成ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１／ＣＤＲ２の領域を天然ＣＤＲ３の領域とともに有する抗体を作製する。しかし、これらの方法は、安定なフレームワーク領域と正しく折り畳まれたＣＤＲとを含有するライブラリーを提供することができない。
本明細書で提供される方法は、多様性クローニングのために抗体アクセプターフレームワークを設計する。選択されたヒト抗体ドメインのＣＤＲ３内に多様性を導入するための方策が設計され、これは、元のフレームワークの配列の改変を回避した。この方策は、免疫グロブリンコード領域の外側にＩＩｓ型制限部位を導入することに頼る。このクラスの制限酵素は、４〜７塩基対の非対称でとぎれない配列を認識するが、切断部位で見出されるＤＮＡ配列とは独立した２０塩基までの規定された距離にあるＤＮＡを切断する。選択されたフレームワークへの多様化された配列のクローニングのためにこのシステムを利用するために、ＣＤＲ３の代わりに、２つのＩＩｓ型制限部位を含むスタッファーＤＮＡ断片を含有するアクセプターフレームワークを設計した。同様に、ＩＩｓ型を含むフランキング配列を有する多様化されたＤＮＡ配列を作製する。制限酵素により作製される付着末端が適合性であり、リーディングフレームが維持されることを条件として、ＤＮＡ断片をアクセプターフレームワーク内にライゲーションして、コードされたＣＤＲ３を、アクセプター抗体フレームワークの新しい状況において復元できる（図２）。
本明細書で提供される方法は、天然ＣＤＲ多様性を捕捉する。多様性の供給源として天然に多様化されたタンパク質断片を捕捉するために開発された方策は、ＩＩｓ型制限酵素も利用する。例として、免疫グロブリンのＣＤＲ Ｈ３をコードするＤＮＡ配列のフランキング領域に特異的な、すなわち可変領域のＦＲ３およびＦＲ４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、それらの５’末端にＩＩｓ型制限酵素の部位を含有し、一方、それらの３’部分は、標的にされるＤＮＡ配列と一致する。用いられる制限酵素部位は、好ましくは、ＦｏｋＩのようにＤＮＡ認識部位から遠くでＤＮＡを切断する酵素である。このことは、天然ＤＮＡ配列の効率的な増幅を可能にするので、この方法の重要な要素である。なぜなら、これは、プライマーの３’末端とＣＤＲ Ｈ３に接するＤＮＡとの間の良好な一致を維持しながら、ＣＤＲとフレームワーク領域との間の境界におけるＤＮＡ切断によるＣＤＲＨ３コード配列の切り出しを可能にするからである（図３）。ＣＤＲコード配列のこの精密な切り出しは、ＤＮＡをその認識部位で切断するＩＩ型酵素を用いて非常に困難である。なぜなら、対応する制限部位が天然ＤＮＡ配列中に存在せず、増幅中にそのような部位を導入することは、プライマーアニーリングが乏しいために困難であるからである。よって、この方法は、多様化されたタンパク質配列の増幅と、増幅された多様性の起源に関係なく任意のアクセプター抗体フレームワークへのそれらの挿入とを可能にする（図４）。
本明細書に記載される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する。
本明細書に提供される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域が、前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する方法を生成する。
本明細書に提供される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域が、前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップにより、各核酸が免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを生成する。
いくつかの実施形態において、上記の方法におけるステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。
いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップとをさらに含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。
本明細書に提供される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を有するスタッファー核酸配列を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の複数の免疫グロブリンドメインを、標的抗原と接触させるステップと、（ｈ）どの発現された免疫グロブリン可変ドメインコード配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製する方法を作製するか、またはそうでなければ生成する。
本明細書に提供される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域が、前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ１の領域またはＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の複数の免疫グロブリンドメインを、標的抗原と接触させるステップと、（ｇ）どの発現された免疫グロブリン可変ドメインコード配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製するか、またはそうでなければ生成する。
本明細書に提供される方法は、（ａ）各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含む別個の免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を間に有するステップと、（ｂ）相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、（ｃ）前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、（ｄ）前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域が、前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ２の領域またはＣＤＲ２の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の複数の免疫グロブリン可変ドメインを、標的抗原と接触させるステップと、（ｈ）どの発現された免疫グロブリン可変ドメインコード配列が前記標的抗原と結合したかを決定するステップにより、標的特異的抗体、抗体可変領域またはその一部分を作製するか、またはそうでなければ生成する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、（ｉ）標的抗原と結合する免疫グロブリン可変ドメインコード配列を配列決定するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のＩＩｓ型制限酵素認識部位は、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される。
いくつかの実施形態において、ＩＩｓ型制限酵素認識部位は、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、アクセプターフレームワーク核酸配列は、ヒト遺伝子配列に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒト重鎖可変遺伝子配列、またはヒト重鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変遺伝子配列は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される。
いくつかの実施形態において、ヒト配列は、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列、またはヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列に由来する配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列は、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ３配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ１配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ１の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードし、複数の多様化された核酸は、合成配列を含む。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、天然に存在するＣＤＲ２配列、ヒトからの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物からの天然に存在するＩｇ配列、哺乳動物のＴ細胞受容体のループ領域からの天然に存在する配列、およびその他の天然に多様化されたポリペプチドコレクションから選択される配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数の多様化された核酸は、ＣＤＲ２の領域をコードし、複数の多様化された核酸は、特定の免疫原に曝露されたヒトにおいて天然に出現する免疫グロブリン配列、もしくは特定の抗原に曝露されたことが同定された動物に由来する配列を含むか、または該配列に由来する。
いくつかの実施形態において、複数のアクセプターフレームワーク核酸配列は、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ファージミドベクターである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
別段に定義しない限り、本発明に関連して用いる科学的および技術的用語は、当業者により通常理解される意味を有する。さらに、文脈によりそうでないことが必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学ならびにタンパク質およびオリゴもしくはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名は、当該技術において周知で、一般的に用いられるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）について、標準的な技術を用いる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従うか、または当該技術において一般的に達成されるかもしくは本明細書に記載されるようにして行われる。上記の技術および手順は、当該技術において周知であり、かつ本明細書で全体において引用され、議論される種々の全般的でより具体的な参考文献に記載される従来の方法に従って全般的に行われる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品および製薬化学に関連して用いられる命名、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該技術において周知で、一般的に用いられるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、製薬調製、処方および送達ならびに患者の治療のために用いる。
本開示に従って利用する場合、別段に示さない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解される。
本明細書で用いる場合、「抗体」との用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子のことをいう。「特異的に結合する」または「と免疫反応する」または「免疫特異的に結合する」により、抗体が、所望の抗原の１または複数の抗原決定基と反応するが、その他のポリペプチドとは反応しないか、またはより低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体は、それらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖおよびＦａｂ発現ライブラリーを含む。
基本抗体構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関係し、これらは、分子内に存在する重鎖の性質により互いに異なる。あるいくつかのクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、および他のものなどのようにサブクラスも有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」の用語は、本明細書で用いる場合、ユニーク軽鎖遺伝子生成物とユニーク重鎖遺伝子生成物とからなる抗体分子の１つの分子種だけを含有する抗体分子の集団のことをいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子で同一である。ＭＡｂは、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる、それに対するユニーク結合親和性を特徴とする抗原結合部位を含有する。
「抗原結合部位」または「結合部分」との用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分のことをいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」とよばれる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様なひと続きは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知の、より保存されたフランキングひと続きの間にある。よって、「ＦＲ」との用語は、免疫グロブリン中の超可変領域の間であってそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列のことをいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合面を形成するように３次元空間において互いに対して配置される。抗原結合面は、結合する抗原の３次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とよばれる。各ドメインのアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｉｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）、ＣｈｏｔｈｉａらＮａｔｕｒｅ ３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従う。
本明細書で用いる場合、「エピトープ」との用語は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖまたはＴ細胞受容体と特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」との用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面の群からなり、通常、特定の３次元構造的特徴および特定の電荷的特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ；例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭおよびより好ましくは≦１ｎＭである場合に、抗原と特異的に結合するという。
本明細書で用いる場合、「免疫学的結合」または「免疫学的結合特性」との用語は、免疫グロブリン分子と、該免疫グロブリンが特異的な抗原との間に生じる型の非共有結合的相互作用のことをいう。免疫学的結合相互作用の強さまたは親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）として表すことができ、ここで、より小さいＫｄは、より大きい親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術において周知の方法を用いて定量できる。あるそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを必要とし、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性および両方向における速度に等しく影響する幾何的パラメータに依存する。よって、「会合速度定数」（Ｋｏｎ）および「解離速度定数」（Ｋｏｆｆ）はともに、濃度と会合および解離の実際の速度とを算出することにより決定できる（Ｎａｔｕｒｅ ３６１巻：１８６〜８７頁（１９９３年）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの相殺を可能にし、解離定数Ｋｄに等しい。（全般的にＤａｖｉｅｓら（１９９０年）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９巻：４３９〜４７３頁を参照されたい）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の類似のアッセイのようなアッセイにより測定して、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭおよびより好ましくは≦１ｎＭである場合に、その標的と特異的に結合するという。
「単離されたポリヌクレオチド」との用語は、本明細書で用いる場合、その起源のおかげで、「単離されたポリヌクレオチド」が、（１）該「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは一部分と会合していないか、（２）それが天然で連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結しているか、または（３）より大きい配列の部分として天然に存在しない、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはそれらのなんらかの組み合わせのポリヌクレオチドを意味する。本発明に従うポリヌクレオチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
「単離されたタンパク質」との用語は、本明細書において、その起源もしくは由来の供給源のおかげで、「単離されたタンパク質」が、（１）天然で見出されるタンパク質と会合していないか、（２）同じ供給源からのその他のタンパク質を含まない、例えば海洋タンパク質を含まないか、（３）異なる種からの細胞により発現されるか、または（４）天然に存在しない、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡもしくは合成起源またはそれらのなんらかの組み合わせのタンパク質を意味する。
「ポリペプチド」との用語は、本明細書で用いる場合、天然タンパク質、断片またはポリペプチド配列の類似体のことをいう包括的な用語である。よって、天然タンパク質断片および類似体は、ポリペプチドの属のうちの種である。本発明によるポリペプチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにカッパ軽鎖免疫グロブリン分子のような重鎖免疫グロブリン分子と軽鎖免疫グロブリン分子とを含む組み合わせにより形成される抗体分子およびその逆、ならびにそれらの断片および類似体を含む。
物体について用いる「天然に存在する」との用語は、本明細書で用いる場合、その物体を天然で見出すことができることをいう。例えば、天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室などで人間により意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「作動可能に連結した」との用語は、本明細書で用いる場合、そのように記載される構成要素の位置が、それらがそれらの意図する様式で機能することを許容する関係にあることをいう。コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、該コード配列の発現が、該制御配列に適合性の条件下で達成されるような方式でライゲーションされている。
「制御配列」との用語は、本明細書で用いる場合、それらがライゲーションされたコード配列の発現およびプロセシングをもたらすために必要なポリヌクレオチド配列のことをいう。このような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なり、原核生物において、このような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含み、真核生物において、一般的に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」との用語は、最小限で、その存在が発現およびプロセシングのために必須である全ての構成要素を含むことを意図し、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。「ポリヌクレオチド」との用語は、本明細書で言及する場合、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの改変形のいずれかの、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー状ホウ素を意味する。この用語は、ＤＮＡの１本鎖形態および２本鎖形態を含む。
本明細書で用いる場合、２０の通常のアミノ酸およびそれらの略称は、通常の使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ． ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ． Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照されたい。２０の通常のアミノ酸の立体異性体（例えばＤアミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸のような非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸およびその他の通常でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切な構成要素であり得る。通常でないアミノ酸の例は、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニンならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書で用いるポリペプチドの表記法において、標準的な使用および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
ポリペプチドについて用いる場合、「実質的に同一」との用語は、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトのギャップ重みを用いてＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムにより最適に整列させたときに、少なくとも８０パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセント配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９９パーセント配列同一性を有することを意味する。
好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の相互交換可能性のことをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
本明細書で論じるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変動は、本発明に包含することを意図するが、但し、アミノ酸配列での変動が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％および最も好ましくは９９％を維持することを条件とする。特に、保存的アミノ酸の置き換えを意図する。保存的置き換えは、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。一般的に、コードされるアミノ酸は、通常、以下のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびトレオニンを含む。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。その他のファミリーのアミノ酸は、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを含む。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、トレオニンのセリンへの単離された置き換えまたはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似の置き換えは、特に置き換えがフレームワーク部位内のアミノ酸を含まないならば、得られる分子の結合または特性に大きな影響を与えないと予期することは妥当である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることにより容易に決定できる。アッセイは、本明細書に詳細に記載される。抗体もしくは免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者が容易に調製できる。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを、公共または専有の配列データベースと比較することにより同定できる。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を用いて、公知の構造および／もしくは機能のその他のタンパク質に出現する配列モチーフまたは推定タンパク質立体構造ドメインを同定する。公知の３次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。ＢｏｗｉｅらＳｃｉｅｎｃｅ ２５３巻：１６４頁（１９９１年）。よって、上記の例は、当業者が、本発明に従う構造的および機能的ドメインを規定するために用い得る配列モチーフおよび構造的立体構造を認識できることを証明する。
好ましいアミノ酸置換は、そのような類似体の（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、そして（４）その他の物理化学的もしくは機能的特性を与えるかまたは改変するものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含み得る。例えば、単独または多重のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列内に作製してよい（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分に）。保存的アミノ酸置換は、親の配列の構造的特徴を実質的に変更しない（例えば置き換えるアミノ酸は、親の配列内に存在するヘリックスを破壊するかまたは親の配列を特徴づけるその他の型の２次構造を破壊する傾向にない）。当該技術において認識されるポリペプチドの２次および３次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ． ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ． Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４巻：１０５頁（１９９１年）に記載される。
本明細書で用いる場合、「標識」または「標識された」との用語は、例えば放射性標識アミノ酸の取り込み、または印をつけたアビジン（例えば蛍光マーカーまたは光学的もしくは熱量測定的方法により検出できる酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出できるビオチン化部分のポリペプチドへの付着による検出可能なマーカーの取り込みのことをいう。あるいくつかの状況において、標識またはマーカーは、療法的でもあり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当該技術において公知であり、それらを用いることができる。ポリペプチドのための標識の例は、それらに限定されないが、以下のものを含む：放射性同位体もしくは放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍燐光体）、酵素標識（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、２次レポーターにより認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は、可能性のある立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーアームにより付着される。「薬剤または薬物」との用語は、本明細書で用いる場合、患者に正確に投与された場合に所望の療法的効果を誘導できる化学的な化合物または組成物のことをいう。
本明細書におけるその他の化学的用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例示されるような当該技術における慣用的な使用に従って用いられる。
本明細書で用いる場合、「実質的に純粋」とは、目的の種が、存在する優勢な種であることを意味し（すなわち、モルに基づいて、組成物中のいずれのその他の個別の種よりも豊富である）、好ましくは、実質的に精製された画分は、その目的の種が存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モルに基づいて）を含む組成物である。
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての巨大分子種の約８０パーセントより多く、より好ましくは約８５％、９０％、９５％および９９％より多くを含む。最も好ましくは、目的の種は、組成物が単独の巨大分子種から本質的になる本質的な均質まで精製される（混在する種は、通常の検出方法により組成物中で検出できない）。
患者との用語は、ヒトおよび獣医学的な対象を含む。
抗体は、免疫血清のＩｇＧ画分を主にもたらすプロテインＡまたはプロテインＧを用いる親和性クロマトグラフィーのような周知の技術により精製される。その後、またはその代わりに、探索する免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープをカラムに固定化して、免疫親和性クロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製してよい。免疫グロブリンの精製は、例えばＤ． Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ， Ｉｎｃ．により出版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ、１４巻、８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）により論じられている。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
（実施例１）
免疫グロブリン可変生殖系列遺伝子のクローニング
７つのヒト重鎖可変生殖系列遺伝子（ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３、ＶＨ５−５１）、５つのヒトカッパ軽鎖可変生殖系列遺伝子（ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５、ＶＫ３−２０）および２つのヒトラムダ軽鎖可変生殖系列遺伝子（ＶＬ１−４４、ＶＬ１−５１）を、ライブラリーを構築するために選択した（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．−Ｐ．ら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻、２０９〜２１２頁）。これらの遺伝子は、これらがヒトで発現される抗体レパートリーにしばしば用いられ、これらがコードするフレームワークが個別のドメインとしてまたはＶＨ／ＶＬ対の状況において好ましい安定性および発現プロファイルを示すので、選択した（Ｅｗｅｒｔ Ｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００３年１月１７日；３２５巻（３号）：５３１〜５３頁）。２組の特異的プライマーを用いて、ネステッドＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡからこれらの遺伝子を増幅した。同じファミリーの生殖系列遺伝子の５’配列は同一または非常に類似しているので、このアプローチは必要であった。各遺伝子について、ゲノム探知体とよばれるプライマーの第１対を、生殖系列遺伝子を挟む５’および３’の非翻訳領域に特異的になるように設計した。第２対は、フレームワーク１領域（ＦＲ１）の始めおよびＦＲ２の終わりに特異的になるように設計した。１４の独立したＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）にクローニングし、それらの身元および完全性を、配列決定により確認した。選択された生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を、図５に示す。
用いたプライマーおよびプライマーの組み合わせを、以下に示す。
ゲノム探知体
コード配列に特異的
選択された生殖系列遺伝子を増幅するために用いたプライマーの組み合わせ
（実施例２）
アクセプターフレームワークの作製
選択された生殖系列遺伝子の配列を、ＩＩｓ型制限部位の存在について分析した。ＢｓｍＢＩ部位は、選択された抗体可変生殖系列遺伝子中に存在しなかった。２つのＢｓｍＢＩ部位が、アクセプターフレームワークをクローニングし得るファージミドベクターであるｐＮＤＳ１の主鎖で見出された。アクセプターフレームワークのスタッファーＤＮＡ配列内にユニークＢｓｍＢＩ部位を導入できるように、これらの２つの部位を、部位特異的突然変異誘発により除去した。各生殖系列遺伝子を、多重ネステッドＰＣＲにより増幅して、スタッファーＤＮＡ配列を、それぞれの対応する可変セグメント（ＶＨ、Ｖｋ、Ｖλ）に特異的なＦＲ４をコードする配列が後に続くＦＲ３配列の３’末端に付加した。ＶＨ ＦＲ４のアミノ酸配列は、生殖系列Ｊ遺伝子であるＪＨ１、ＪＨ３、ＪＨ４およびＪＨ５によりコードされるＦＲ４の領域に相当する。ＶＫ ＦＲ４のアミノ酸配列は、生殖系列Ｊ遺伝子であるＪＫ１によりコードされるＦＲ４の領域に相当する。Ｖλ ＦＲ４のアミノ酸配列は、生殖系列Ｊ遺伝子であるＪＬ２およびＪＬ３によりコードされるＦＲ４の領域に相当する。１０６位（アルギニンまたはグリシン）に単独アミノ酸置換を有するＶｋ ＦＲ４配列の２つのバリアントを作製した。生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３に基づくアクセプターフレームワークについて、ＦＲ３の最後の残基である９４位の単独アミノ酸が異なる（リシンからアルギニン）２つのバリアントも構築した。最終増幅ステップ中に、ＳｆｉＩ／ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を、ＶＨの５’および３’末端にそれぞれ導入した。
同様に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位を、ＶＬの５’および３’末端にそれぞれ導入した（図６）。スタッファー断片を、アクセプターフレームワークからのいずれの機能的タンパク質の発現も妨げるように翻訳リーディングフレームをシフトするように設計した（図７）。このプロセスにおいて用いたプライマーを以下に列挙する。
２０の最終的に組み立てたアクセプターフレームワークの配列を、図８に示す。
（実施例３）
インバリアント可変ドメインを含有するファージミドアクセプターベクターの作製
ｓｃＦｖの発現のために用いたファージミドベクターｐＮＤＳ１を、まず改変して、２つのＢｓｍＢＩ部位を除去した。規定されたＣＤＲ３配列を含有するＶＨ３−２３ドメインを、改変されたｐＮＤＳ１に、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてクローニングして、ファージミドベクターｐＮＤＳ＿ＶＨｄｕｍｍｙを得た。このドメインはＦＲ４の領域内にＢｓｍＢＩ部位を含有したが、これは、サイレント部位特異的突然変異誘発により修正した。これと並行して、規定されたＣＤＲ３配列を含有するＶＫ１−３９ドメインを、次いで、改変されたｐＮＤＳ１に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いてクローニングして、ファージミドベクターｐＮＤＳ＿ＶＫｄｕｍｍｙを得た（図９）。８つのＶＨアクセプターフレームワークを、ｐＮＤＳ＿ＶＫｄｕｍｍｙに、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いてクローニングした。１２のＶＬアクセプターフレームワークを、ｐＮＤＳ＿ＶＨｄｕｍｍｙに、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてクローニングした。以下に列挙する、得られた２０のｐＮＤＳファージミドベクターは、この段階で、スタッファーＤＮＡ断片内に存在するＢｓｍＢＩ部位を用いて、多様化されたＣＤＲ３をクローニングするために用いることができた。
ＶＨアクセプター： ｐＮＤＳ＿ＶＨ１−２＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ１−１８＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ１−６９＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ３−２３Ｒ＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ３−２３Ｋ＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ３−３０＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ５−５１＿ＶＫｄ； ｐＮＤＳ＿ＶＨ３−４８＿ＶＫｄ。
ＶＬアクセプター： ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ１−３３Ｇ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ１−３３Ｒ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ１−３９Ｇ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ１−３９Ｒ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−１１Ｇ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−１１Ｒ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−１５Ｇ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−１５Ｒ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−２０Ｇ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ３−２０Ｒ； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＬ１−４４； ｐＮＤＳ＿ＶＨｄ＿ＶＫ１−５１。
（実施例４）
ヒトレパートリーからの天然ＣＤＲ Ｈ３多様性の捕捉
ヒトｃＤＮＡの複数の供給源を、ＣＤＲ Ｈ３配列の増幅のための鋳型として用いた。これらの供給源は、ヒト胎児脾臓ならびに雄性および雌性の正常成体末梢血精製細胞のプールを含んだ。増幅のためのいくつかの方策を、特定の生殖系列遺伝子によりコードされる再構成されたＶＨ ｃＤＮＡを起源とするＣＤＲ Ｈ３配列、または任意のＶＨ ｃＤＮＡを起源とするＣＤＲ Ｈ３配列を回復するために用いた。
まず、ヒトＶＨファミリーの大多数の５’コード領域に一致するプライマーの混合物を、全てのヒトＪＨ領域と一致するプライマー混合物と組み合わせて用いた。このことにより、大多数の重鎖免疫グロブリン可変遺伝子をＰＣＲ増幅することが可能になった。およそ４００塩基対（ｂｐ）の予期される増幅生成物を、アガロースゲル電気泳動により単離して精製した。このＤＮＡは、ＦＲ３の領域の最後とＦＲ４の始めにそれぞれ１３ｂｐおよび１４ｂｐの一致を有するプライマーを用いる第２ＰＣＲステップにおいて鋳型として貢献した。ほとんどの場合、ＦＲ３の最後の残基は、アルギニンまたはリシンのいずれかである。最後のｂｐの一致が、ポリメラーゼによるプライマー伸長にとって重要であるので、２つの異なる５’プライマーを用いた：５ＶＨＲ＿ＦＯＫ（以下に示す配列番号２０５）および５ＶＨＫ＿ＦＯＫ（以下に示す配列番号２０６）。重要なことには、これらのプライマーは、ＣＤＲ Ｈ３配列の切り出しのためのＦｏｋＩ制限部位も含有した（図４）。第２ＰＣＲステップで用いたプライマーは、それらの５’末端にてビオチン化して、下流の精製ステップを容易にした（実施例５を参照されたい）。この２ステップアプローチにより、塩基対の一致の数が制限されているにもかかわらず、ＣＤＲ Ｈ３配列の効率的な増幅が可能になる。増幅は、変動するアニーリング温度（３０℃と７０℃の間）にて、いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行って、最適条件を確立した。５５〜５８℃のアニーリング温度と、ＧｏＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との組み合わせが、この組のプライマーについて最適であることが見出された。２回目の増幅生成物を、２％アガロースゲルで分離し、異なる長さのＣＤＲ Ｈ３に対応する、ゲルの下部でのスメアが得られた。完全なＤＮＡスメアまたはより大きいＤＮＡ断片に相当する領域のいずれかをゲルから抽出して、長いＣＤＲ Ｈ３を富化した。
代わりに、１回目の増幅ステップを、生殖系列ＶＨ３−２３のＣＤＲ Ｈ２をコードする配列に特異的な５’プライマー５ＶＨ３−２３Ｈ２（以下に示す配列番号２０１）を用いて行った。異なる生殖系列遺伝子は、このＣＤＲ中で多様であるので、選択された生殖系列遺伝子によりコードされるＶＨ ｃＤＮＡは、優先的に増幅できる。その後の精製および増幅ステップは同一であった。この方式で、特定のフレームワーク環境を起源とするＣＤＲを取得し、それを、同じ、類似または異なるフレームワークに再導入することが可能である。
以下は、天然ヒトＣＤＲ Ｈ３レパートリーの増幅のために用いたプライマーのリストである。
（実施例５）
天然ヒトＣＤＲ Ｈ３をアクセプターフレームワーク内にクローニングすることによる１次ライブラリーの作製
増幅したＣＤＲ Ｈ３をＦｏｋＩで消化し、切断した端部および未消化ＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて除去した。これと並行して、ｐＮＤＳ ＶＨアクセプターベクターを、ＢｓｍＢＩを用いて消化した。これらの消化により作製される突出は適合性であるので、天然ＣＤＲ Ｈ３のコレクションは、適当なリーディングフレームを復元してＶＨアクセプターフレームワークにライゲーションすることができた。ライゲーションしたＤＮＡを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ細胞の形質転換のために精製して濃縮し、ＣＤＲ Ｈ３配列が再構築され、ＣＤＲとフレームワーク領域との間の接合部が正しいことを確認するために、ランダムクローンを配列決定により分析した（図１０）。結果は、全てのクローンがＣＤＲ Ｈ３配列を含有し、リーディングフレームが復元され、よって免疫グロブリン可変重鎖をコードすることを示した。さらに、全てのＣＤＲは異なっており、このことは、天然に存在する配列の大きい多様性がこのアプローチにより捕捉されたことを示した。ＣＤＲ Ｈ３の長さも変動性であり、１０〜１５残基の比較的長いＣＤＲが見出され、よって、合成多様性を用いてカバーすることが困難な長いＣＤＲ配列を標本抽出するためのこのアプローチの利点が強調された。
この方法を用いて、プールされたヒト末梢血精製細胞またはヒト胎児脾臓のいずれかに由来する天然ＣＤＲ Ｈ３配列を、ｐＮＤＳ ＶＨアクセプターフレームワークのそれぞれにクローニングし、エレクトロコンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を形質転換し、２ｘＴＹＡＧ Ｂｉｏａｓｓａｙプレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に播種した。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、１０ｍｌの２×ＴＹＡＧ液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを含有する２×ＴＹＡＧを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−８０℃にて貯蔵した。このプロセスにおいて、合計で８．１×１０９の形質転換体を示す１４の１次ライブラリーを作製した。１８０のランダムに採取したクローンを配列決定して、ライブラリーの質および多様性を決定した。全てのクローンは、異なるＶＨ配列をコードし、＞８９％がインフレームであった。これらの１次ライブラリーは、ＣＤＲ Ｈ３のみにおける多様性を含有する。なぜなら、これらは、ダミーＶＬドメインと組み合わせているからである。
（実施例６）
合成ＣＤＲ３をアクセプターフレームワーク内にクローニングすることによる１次ライブラリーの作製
本方法は、天然多様性を取得することを特に対象とするが、これは、合成多様性をアクセプターフレームワークに組み込むために用いることもできる。合成ＣＤＲ３配列を、ＶＨおよびＶＬの両方について設計した。設計は、所与の長さを有するＣＤＲの頻度と、ライブラリー内の形質転換体の妥当な数（約５×１０９形質転換体）のうちの理論的多様性の完全なカバーを可能にする多様性方策（ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴまたはＤＶＴコドン）とを考慮した（図１１）。ＣＤＲの正準構造を維持するための重要な残基は、ＶＫおよびＶλ鎖についてＣＤＲ３の設計中で一定に保った。重鎖について、１０までの多様化された位置を有するＣＤＲ３だけを作製した。なぜなら、より長いＣＤＲによりコードされる多様性をカバーするために必要なクローンの数は、形質転換効率の実際上の限界を超えるからである。
異なる長さの縮重オリゴヌクレオチドを、ＮＮＳ、ＮＶＴ、ＤＶＫまたはＤＶＴランダム化コドンを用いて合成した。各ＣＤＲ Ｈ３について、メチオニンまたはフェニルアラニンのいずれかを１００ｚ位にてコードする２つのオリゴヌクレオチドを合成した（図１１）。各オリゴヌクレオチドを、２つの外部ビオチン化プライマーを用いて伸長して増幅して、設計したＣＤＲをコードする２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。これらの外部プライマーは、ＣＤＲ配列のその後の切り出しとアクセプターフレームワークへの挿入とのためのＢｓｍＢＩ制限部位を含有する（図１２）。組み立てたＤＮＡ断片を、ゲル精製を行わずに加工処理し、ＢｓｍＢＩを用いて消化した。切断した端部および未消化ＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて除去した。消化したＤＮＡ断片を、エタノール沈殿により濃縮し、対応するｐＮＤＳ ＶＨ、ＶＫまたはＶλアクセプターベクターにライゲーションした。ライゲーション生成物を、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の形質転換のために精製して濃縮し、２×ＴＹＡＧ Ｂｉｏａｓｓａｙプレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に播種した。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、１０ｍｌの２×ＴＹＡＧ液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを含有する２×ＴＹＡＧを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−８０℃にて貯蔵した。合計で１．６×１０１０形質転換体を示す合計で２４の１次重鎖ライブラリーを作製した。同様にして、合計で６．９×１０９形質転換体を示す１３の１次軽鎖ライブラリーを作製した。これらの１次ライブラリーは、ＣＤＲ Ｈ３のみにおける多様性を含有する。なぜなら、これらは、ダミーＶＬドメインと組み合わせているからである。合計で３３０のランダムに採取したクローンを配列決定して、ライブラリーの質および多様性を決定した。全てのクローンは、異なる可変ドメイン配列をコードし、＞９０％がインフレームであった。リーディングフレーム内にシフトを含有する配列の頻度が低いことは、挿入の導入がより起こりやすく、機能的クローンの著しい喪失（１５〜４５％）が頻繁に報告されるオーパーラップＰＣＲアプローチを用いる合成抗体断片ライブラリーの構築中に伝統的に得られる結果とは鮮明に対照的である。
これらの１次ライブラリーの多様性は、ＣＤＲ Ｈ３またはＣＤＲ Ｌ３に拘束されていた。なぜなら、これらは、それぞれダミーＶＬまたはＶＨ鎖と組み合わせているからである。
合成ＣＤＲの組み立てのために用いたプライマーを以下に列挙する。
（実施例７）
２次ライブラリーの作製
重鎖および軽鎖の両方に多様性を持つｓｃＦｖのライブラリーを作製するために、１次合成軽鎖ライブラリーを、１次合成重鎖ライブラリーまたは１次天然重鎖ライブラリーのいずれかと組み合わせた（図１３）。ファージミドＤＮＡを各１次ライブラリーから調製し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素で切断した。リンカーおよび１次合成ライブラリーからの軽鎖に相当するＤＮＡ断片を、ライゲーションにより、消化した１次天然または合成重鎖ベクターに挿入した。代わりに、リンカー−ＶＬ配列も特異的プライマーを用いて増幅した後に、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩでの消化およびライゲーションを行った。ライゲーション生成物をフェノール／クロロホルム抽出および沈殿により精製した後に、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を形質転換し、２×ＴＹＡＧ Ｂｉｏａｓｓａｙプレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に播種した。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、１０ｍｌの２×ＴＹＡＧ液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを含有する２×ＴＹＡＧを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−８０℃にて貯蔵した。組み換わるライブラリーの数を制限するために、これらを鎖のサブクラスによりプールし（すなわちＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＫ１、ＶＫ３、Ｖλ１）、よって９つのライブラリーの組み合わせを（すなわちＶＨ１×ＶＫ１、ＶＨ１×ＶＫ３、ＶＨ１×Ｖλ１、ＶＨ３×ＶＫ１、ＶＨ３×ＶＫ３、ＶＨ３×Ｖλ１、ＶＨ５×ＶＫ１、ＶＨ５×ＶＫ３、ＶＨ５×Ｖλ１）について行った。２次合成ライブラリーの合計サイズ（ＶＨおよびＶＬの両方に合成多様性を持つ）は、７．３×１０９形質転換体であった。２次天然ライブラリーの合計サイズ（ＶＨに天然多様性、ＶＬに合成多様性を持つ）は、１．５×１０１０形質転換体であった。
（実施例８）
非ヒト種に由来するＣＤＲＨ３レパートリーを表示するヒト抗体ライブラリーの作製
抗体組み合わせ部位内で異なる３次元空間を探索することを可能にする多様性の代替供給源を利用するために、マウスのＣＤＲＨ３を捕捉し、それらをヒト抗体フレームワークのコレクション中に導入することによりライブラリーを創出した。このアプローチのために、合成ＣＤＲ Ｌ３多様性を有するＶＬ遺伝子のコレクションを含有するアクセプターライブラリーを構築し、実施例２に記載されるようにＩＩＳ型制限クローニングのためにすぐに適するスタッファーＤＮＡ配列を含有するアクセプター配列のコレクションと組み合わせた。このライブラリーは、天然（ヒトおよび非ヒト）または合成ＣＤＲ Ｈ３の複数の供給源を用いる２次ライブラリーの迅速な作製のための開始点を表す。この実施例において、天然ＣＤＲ Ｈ３多様性を、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスおよびｈＩＦＮγまたはｈＣＣＬ５（ｈＲＡＮＴＥＳ）で免疫化したマウスから捕捉した。
第１ステップは、ＶＬ含有合成ＣＤＲ Ｌ３多様性のコレクションをアクセプターＶＨフレームワークベクターにクローニングすることによるアクセプターライブラリーの作製であった（図１４）。ＶＬ配列は、実施例６に記載する７つの１次合成ライブラリーから、プライマー５’ｂｉｏｔ−ＶＨｄｕｍｍｙおよび３’ｂｉｏｔ−ｆｄｔｓｅｑを用いるＰＣＲ増幅により導いた。得られたおよそ４００ｂｐのＶＬ含有断片を、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、スピンカラムで精製して、プライマーおよび酵素を除去した。同様にして、ＣＤＲＨ３スタッファーおよびダミー軽鎖を含有するｐＮＤＳ ＶＨアクセプターベクターを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩおよびＳｗａＩ（ＳｗａＩはＶＬダミー内で切断する）で消化し、１０００ｂｐカットオフのＣｈｒｏｍａ Ｓｐｉｎ ＴＥカラムで精製してＶＬダミー断片を除いた。消化したＶＬ断片を、次いで、ＶＨアクセプターベクターにライゲーションした（図１４）。組み換わるライブラリーの数を制限するために、ＶＨアクセプターベクターおよびＶＬ断片を鎖のサブクラスによりプールし（すなわちＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、Ｖκ１、Ｖκ３、Ｖλ１）、よって９つのライブラリーの組み合わせを行った（すなわちＶＨ１×Ｖκ１、ＶＨ１×Ｖκ３、ＶＨ１×Ｖλ１、ＶＨ３×Ｖκ１、ＶＨ３×Ｖκ３、ＶＨ３×Ｖλ１、ＶＨ５×Ｖκ１、ＶＨ５×Ｖκ３、ＶＨ５×Ｖλ１）。ライゲーション生成物でエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を形質転換し、２ｘＴＹＡＧ Ｂｉｏａｓｓａｙプレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に播種した。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、６ｍｌの２×ＴＹＡＧ液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−８０℃にて貯蔵した。ＣＤＲ Ｌ３内の合成多様性を持つこのアクセプターライブラリーの合計サイズは、１．９×１０９形質転換体であった。
次のステップは、ＣＤＲＨ３配列を非ヒト供給源から単離することであった。細胞を、５匹のナイーブまたは免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離し、トータルＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡを、抽出したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得た。このｃＤＮＡを鋳型として用いて、マウスＶＨをＰＣＲにより単離して増幅した。一連のＰＣＲを、ＦＲ１の領域の始めに特異的な１５の異なる５’プライマー（各マウスＶＨサブグループについて１つ）と、３’プライマーのプール（ＪＨ領域をカバーする４つのプライマー）とを用いて行った。これらの１回目のＰＣＲをプールし、２％アガロースゲルで精製した。精製ＤＮＡは、２回目のＰＣＲを行うための鋳型として貢献し、マウスＣＤＲ Ｈ３領域を単離した。
この２回目のＰＣＲの５’および３’プライマーは、マウスＶＨのそれぞれＦＲ３およびＦＲ４の領域を標的にする。これらのプライマーは、ＣＤＲ Ｈ３の正確な切り出しおよびヒトアクセプターベクターへのクローニングを可能にするためのＦｏｋＩ制限部位を付加した。しかし、マウスＶＨ配列のアラインメントにより、マウスＣＤＲ−Ｈ３の５’境界における配列と、ＦｏｋＩの切断部位に位置するものとが、ほぼ常にヒト配列から１塩基異なり、一方、３’末端はこれらの２つの種の間で一致したことが明らかになった。ＦｏｋＩにより切断される配列は、以下の表において箱で囲む。
従って、アクセプターフレームワークの消化により作製される付着末端に適合性の付着末端を作製するために、塩基を２回目の増幅ステップ中に修正しなければならなかった。効率的な増幅が観察され、この変換が容易に生じたことを示唆した。３’末端にて、ＩＩＳ型制限酵素により切断されるマウスおよびヒト配列は、同一であるので、いずれの修正の問題も回避される。
２回目の増幅のためのプライマーをそれらの５’末端にてビオチン化して、下流の精製ステップを容易にした。アクセプターベクターをＢｓｍＢＩで消化し、１０００ｂｐカットオフのＣｈｒｏｍａ Ｓｐｉｎ ＴＥカラムで精製した。消化および精製の後に、９つの異なるライブラリーの組み合わせを、捕捉されたマウスＣＤＲＨ３のライゲーションのために等モルでプールした。
ライゲーションしたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、沈殿により濃縮した後に、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を形質転換し、２ｘＴＹＡＧ Ｂｉｏａｓｓａｙプレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に播種した。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、６ｍｌの２×ＴＹＡＧ液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−８０℃にて貯蔵した。同様のサイズの３つのライブラリーを得た：ＭｎＡ、２．５×１０８形質転換体（拘束された天然ヒトフレームワーク多様性、ＣＤＲ Ｈ３中にナイーブマウス多様性およびＣＤＲ Ｌ３中に合成多様性を持つ）；ＭｉＢ、７．３×１０７形質転換体（拘束された天然ヒトフレームワーク多様性、ＣＤＲ Ｈ３中にｈＩＦＮγに対する免疫マウス多様性およびＣＤＲ Ｌ３中に合成多様性を持つ）およびＭｉＣ、１．８×１０８形質転換体（拘束された天然ヒトフレームワーク多様性、ＣＤＲ Ｈ３中にｈＣＣＬ５に対する免疫マウス多様性およびＣＤＲ Ｌ３中に合成多様性を持つ）。ＣＤＲ Ｈ３配列が再構築され、ＣＤＲとフレームワーク領域との間の接合部が正しいことを確認するために、ランダムクローンを配列決定により分析した。結果は、全てのクローンがＣＤＲ Ｈ３配列を含有し、リーディングフレームが復元され、よって免疫グロブリン可変重鎖をコードすることを示した。全てのＣＤＲは異なり、典型的なマウスＣＤＲ Ｈ３配列に類似しており、このことは、天然に存在するマウスＣＤＲ Ｈ３配列の大きい多様性がこのアプローチにより捕捉されたことを示した。さらに、ＣＤＲＨ３の長さのプロファイルの分析は、ガウス分布が、正常マウスレパートリーにおける長さの予期される分布に対応するナイーブライブラリー内に捕捉されたことを示した。これとは対照的に、２つの免疫ライブラリーにおいて、プロファイルは異なっており、このことは、異なるＣＤＲＨ３レパートリーが捕捉されたことを示唆した（図１５）。
マウスからのＣＤＲＨ３増幅のために用いたプライマー
１回目のＰＣＲ
第２のＰＣＲ
（実施例９）
ライブラリーのファージレスキュー
１次および２次ライブラリーのそれぞれを、以下に簡単にまとめる標準的なファージディスプレイ手順に従って独立してレスキューした。ライブラリーの理論的多様性の少なくとも１０倍をカバーするのに十分な凍結ライブラリー分割量からの細胞の容量を、５００ｍｌの２×ＴＹＡＧに加え、３７℃にて撹拌（２４０ｒｐｍ）しながら０．３〜０．５のＯＤ６００に到達するまで成長させた。培養物に、次いで、ＭＫ１３Ｋ０７ヘルパーファージを重感染させ、３７℃にて１時間（１５０ｒｐｍ）インキュベートした。培地を、次いで、細胞を２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、培地を除去し、ペレットを５００ｍｌの２×ＴＹ−ＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン；５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に再懸濁することにより交換した。培養物を、次いで、３０℃にて１晩（２４０ｒｐｍ）成長させた。培養物を４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して、細胞をペレットにした。上清を回収し、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＰＥＧ８０００（２０％）／２．５Ｍ ＮａＣｌを加えて、混合物を１時間氷上でインキュベートすることによりファージ粒子を沈殿させた。ファージ粒子を、１０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離することにより回収し、１０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。再懸濁した溶液を１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して細菌破片を除去し、沈殿手順を繰り返した。最後の再懸濁の後に、ファージを、Ｅ．ｃｏｌｉの感染および２８０ｎｍでの吸収により滴定した。ファージ表面でのｓｃＦｖのディスプレイレベルも、抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析により評価した。異なるライブラリーからの精製ファージを、１５％（ｗ／ｖ）の最終濃度までグリセロールを加えた後に−８０℃にて凍結貯蔵した。
選択手順中に管理可能な数のライブラリーを用いるために、精製ファージを４つの作業ライブラリーにプールした：ＡＡ１−全ての１次合成ＶＨライブラリーからのファージ；ＡＢ１−全ての１次合成ＶＬライブラリーからのファージ；ＡＣ１−全ての１次天然ＶＨライブラリーからのファージ；ＡＤ１−全ての２次天然ライブラリーからのファージ；ＡＥ１−全ての２次合成ライブラリーからのファージ；ＭｎＡ−ナイーブマウスから捕捉した多様性を有するライブラリー；ＭｉＢ−ｈＩＦＮγで免疫化したマウスから捕捉した多様性を有するライブラリー；ＭｉＣ−ｈＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳで免疫化したマウスから捕捉した多様性を有するライブラリー。
（実施例１０）
抗体ライブラリーのハイスループット配列決定
ライブラリーの質および多様性は、ランダムライブラリーメンバーのＤＮＡ配列決定により評価できる。ほとんどの場合、ライブラリーの非常に小さい画分だけを表す（１０，０００，０００ライブラリーメンバーのうちの１未満）数百クローンを配列決定する。本明細書で提供される方法の性能を分析するために、次世代の配列決定技術を用いて、より典型的な数のライブラリーメンバーを分析した。ライブラリーＡＥ１から単離したＤＮＡを、ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザ装置を用いるハイスループット配列決定のための鋳型として用いた。この次世代のＤＮＡ配列決定システムは、数日間で数十億塩基を読み取ることを可能にする。配列決定読み取りは比較的短い（約７０塩基）が、我々のライブラリー設計に完全に適合性である。多様性はＣＤＲ３の領域に限られるので、７０塩基の読み取りは、ＶＨファミリー同定のためにＣＤＲＨ３およびフレームワーク３領域の部分をカバーするために十分である。この技術は、ＡＥ１ライブラリーから数百万のＣＤＲＨ３領域を配列決定するために用いられている。５，０７８，７０５の配列が、合計で３６５，６６６，７６０塩基について得られた。データの分析により、５，００７，０２２の配列（全体の９８．６％）がユニークであったことが示された。合計で４，６８０，８８２の配列を、ＶＨファミリー（ＶＨ１、ＶＨ３およびＶＨ５）に明確に帰着させることができ、ＡＥ１ライブラリーにおけるＶＨファミリーの代表が決定された（４１％ＶＨ１；３０％ＶＨ３；２９％ＶＨ５）。重要な知見は、インフレーム挿入断片の割合が、８８と９１％の間の範囲であったことであった。このデータは、実施例６に記載される２４の１次ＶＨ合成ライブラリーの配列決定の結果よりもはるかに統計学的な様式で確認された。この組み合わせた組の配列決定データは、この方法において用いたＩＩｓ型制限クローニングプロセスが非常に堅固であり、ＡＥ１ライブラリーのＶＨ多様性を作製するために行った２４の独立したライブラリー構築における効率的で生産的な挿入を導くことを証明する。
数百万のライブラリーメンバーの配列決定は、抗体ライブラリーについての前例のない品質管理ステップである。結果は、この方法が、高品質で高い多様性のライブラリーを、再現可能で堅固な様式で作製することを可能にすることを証明する。
（実施例１１）
２次ライブラリーを用いるファージディスプレイ選択
ヒトインターフェロンガンマ（ｈＩＦＮγ）に対する液相選択：
ＡＤ１およびＡＥ１ファージライブラリーの分割量（１０１１〜１０１２Ｐｆｕ）を、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含有するＰＢＳで室温にて１時間、ロータリーミキサー上でブロックした。ブロックしたファージを、次いで、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０）上で室温にて１時間、ロータリーミキサー上で選択解除した。選択解除したファージを、次いで、ｉｎ ｖｉｖｏビオチン化ｈＩＦＮγ（１００ｎＭ）と室温にて２時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉した後に、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で４回、およびＰＢＳで３回洗浄した。ビーズを、次いで、１０ｍｌの指数関数成長しているＴＧ１細胞に直接加え、３７℃にて１時間、緩慢な振とう（１００ｒｐｍ）でインキュベートした。感染させたＴＧ１の分割量を系列希釈して、選択の産出量を滴定した。残りの感染させたＴＧ１を３０００ｒｐｍにて１５分間スピンし、０．５ｍｌの２×ＴＹＡＧ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に再懸濁し、２×ＴＹＡＧ寒天Ｂｉｏａｓｓａｙプレートに広げた。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、１０ｍｌの２×ＴＹＡＧをプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを含有する２×ＴＹＡＧを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。選択回の分割量を−８０℃にて保存した。ファージ産出量を各回の後に滴定し、産出量の累進的な増加は、標的に特異的なクローンの富化が生じていることを示した（図１６）。
ラットモノクローナル抗体５Ｅ３に対するパニングによる選択：
免疫チューブを、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌにて５Ｅ３で４℃にて１晩被覆し、ファージ選択解除のための免疫チューブを、無関係のラット抗体で同じ条件下にて被覆した。洗浄の後に、免疫チューブを、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含有するＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。ＡＤ１およびＡＥ１ファージライブラリーの分割量（１０１１〜１０１２Ｐｆｕ）を、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含有するＰＢＳで室温にて１時間、ロータリーミキサー上でブロックした。ブロックしたファージを、次いで、無関係のラット抗体で被覆した免疫チューブ中で室温にて１時間、ロータリーミキサー上で選択解除した。選択解除したファージを、次いで、５Ｅ３で被覆した免疫チューブに移し、室温にて２時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。チューブをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回およびＰＢＳで３回洗浄した。ファージを、ＴＥＡ １００ｍＭで１０分間溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５で中和した。ファージを、１０ｍｌの指数関数成長しているＴＧ１細胞に加え、３７℃にて１時間、緩慢な振とう（１００ｒｐｍ）でインキュベートした。感染させたＴＧ１の分割量を系列希釈して、選択の産出量を滴定した。残りの感染させたＴＧ１を３０００ｒｐｍにて１５分間スピンし、０．５ｍｌの２×ＴＹＡＧ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含有する２×ＴＹ培地）に再懸濁し、２×ＴＹＡＧ寒天Ｂｉｏａｓｓａｙプレートに広げた。３０℃にて１晩のインキュベーションの後に、１０ｍｌの２×ＴＹＡＧをプレートに加え、細胞を表面からはがし、５０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。５０％グリセロールを含有する２×ＴＹＡＧを細胞懸濁物に加えて、１７％グリセロールの最終濃度を得た。選択回の分割量を−８０℃にて保存した。ラット５Ｅ３と、可変領域をマウスの定常ドメインに融合した５Ｅ３のキメラバージョンとを交互にすることにより選択の回を行った。これらの交互の回を行って、５Ｅ３の可変領域に特異的なクローンを富化し、抗イディオタイプ抗体を作製した。ファージ産出量を各回の後に滴定し、産出量の累進的な増加は、標的に特異的なクローンの富化が生じていることを示した（図１７）。
ファージレスキュー：前の選択の回から得られた１００μｌの細胞懸濁物を２０ｍｌの２×ＴＹＡＧに加え、３７℃にて撹拌（２４０ｒｐｍ）しながら０．３〜０．５のＯＤ６００に到達するまで成長させた。培養物に、次いで、３．３×１０１０のＭＫ１３Ｋ０７ヘルパーファージを重感染させ、３７℃にて１時間（１５０ｒｐｍ）インキュベートした。培地を、次いで、細胞を２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、培地を除去し、ペレットを２０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＫ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン；５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に再懸濁することにより交換した。培養物を、次いで、３０℃にて１晩（２４０ｒｐｍ）成長させた。
ＥＬＩＳＡのためのモノクローナルファージレスキュー：単独クローンを、１５０μｌの２×ＴＹＡＧ培地（２％グルコース）をウェルあたりに含有するマイクロタイタープレートに採取し、３７℃（１００〜１２０ｒｐｍ）にて５〜６時間成長させた。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを各ウェルに加えて、１０の感染多重度（ＭＯＩ）を得て（すなわち、培養中の各細胞について１０ファージ）、３７℃（１００ｒｐｍ）にて１時間インキュベートした。成長の後に、プレートを３，２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞を１５０μｌの２×ＴＹＡＫ培地に再懸濁し、３０℃（１２０ｒｐｍ）にて１晩成長させた。ＥＬＩＳＡについて、ファージを、１５０μｌの５％脱脂粉乳を含有する２倍濃度のＰＢＳを加えた後に室温にて１時間インキュベーションすることによりブロックする。プレートを、次いで、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ファージ含有上清をＥＬＩＳＡのために用いた。
ファージＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ ｈＩＦＮγまたはＰＢｓ中の２μｇ／ｍｌラット５Ｅ３で１晩被覆した。対照プレートを、２μｇ／ｍｌ ＢＳＡまたは無関係のラットモノクローナル抗体で被覆した。プレートを、次いで、３％脱脂乳／ＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後に、予めブロックしたファージ上清を移し、室温にて１時間インキュベーションした。プレートを、次いで、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１：１０，０００に希釈）を含有する５０μｌの３％脱脂乳／ＰＢＳを各ウェルに。室温にて１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。次いで、５０μｌのＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）、および反応を停止するための５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることによってＥＬＩＳＡが明らかにされた。吸収の強度を４５０ｎｍにて読み取った。ｈＩＦＮγに特異的なクローンを同定でき、ヒットの比率は、３回目の選択の後に１０％と３０％の間の範囲であった。５Ｅ３の可変領域に特異的なクローンも同定でき、ヒットの比率は、３回目の選択の後に７と４８％の間の範囲であった。
ファージクローン配列決定：単独クローンを、ウェルあたり５ｍｌの２×ＴＹＡＧ培地（２％グルコース）で成長させ、３７℃（１２０ｒｐｍ）にて１晩成長させた。次の日に、ファージミドＤＮＡを精製し、ｐＮＤＳ１に特異的なプライマー：ｍｙｃｓｅｑ、５’−ＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２５５）を用いるＤＮＡ配列決定のために用いた。
大規模ｓｃＦｖ精製：１ｍｌの２×ＴＹＡＧのスタータ培養物に、新しく画線した２×ＴＹＡＧ寒天プレートからの単独コロニーを接種し、振とう（２４０ｒｐｍ）しながら３７℃にて５時間インキュベートした。この培養物の０．９ｍｌを用いて、同じ培地の４００ｍｌの培養物に接種し、３０℃にて１晩、激しく振とう（３００ｒｐｍ）しながら成長させた。
次の日に、培養物を、４００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧを加えることにより誘導し、インキュベーションをさらに３時間継続した。細胞を、５，０００ｒｐｍにて１０分間、４℃にて遠心分離することにより回収した。ペレットにした細胞を、上記のようなプロテアーゼ阻害剤を補足した１０ｍｌの氷冷却ＴＥＳ緩衝液に再懸濁した。浸透圧ショックを、１５ｍｌの１：５希釈ＴＥＳ緩衝液を加え、氷上で１時間インキュベーションすることにより達成した。細胞を、１０，０００ｒｐｍにて２０分間、４℃にて遠心分離して細胞破片をペレットにした。上清を注意深く新しいチューブに移した。イミダゾールを、１０ｍＭの最終濃度まで上清に加えた。ＰＢＳで平衡化した１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を各チューブに加え、ロータリーミキサー上で４℃（２０ｒｐｍ）にて１時間インキュベートした。チューブを２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレットにした樹脂を、１０ｍｌの冷却（４℃）洗浄緩衝液１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０まで）に再懸濁した。懸濁物を、ｐｏｌｙｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏｒａｄ）に加えた。８ｍｌの冷却洗浄緩衝液２（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０まで）を用いて、カラムを重力流れにより洗浄した。ｓｃＦｖをカラムから、２ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０まで）を用いて溶出した。画分を２８０ｎｍでの吸収により分析し、タンパク質含有画分をプールした後に、ＰＢＳで平衡にしたＰＤ１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で緩衝液交換した。ＰＢＳ中のｓｃＦｖをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、２８０ｎｍでの吸収により定量した。精製したｓｃＦｖを分割し、−２０℃および４℃にて貯蔵した。
（実施例１２）
ハイスループット配列決定を用いる選択の後に得られるＣＤＲ３プロファイルの分析
実施例１０に記載される次世代の配列決定技術を用いて、ＡＥ１およびＡＤ１ライブラリーならびに３回目の選択の後に得られた産出物中の各ＶＨファミリー内のＣＤＲ Ｈ３の長さの分布を分析した。ＡＥ１およびＡＤ１ライブラリーのプロファイルは、明らかに異なる（図１８）。ＡＥ１ライブラリー中のＣＤＲ Ｈ３の長さの分布は、意図するライブラリー設計に相当し、長さは９〜１５の間のアミノ酸の範囲である。これとは対照的に、２２アミノ酸までのより長いＣＤＲ Ｈ３がＡＤ１ライブラリーで見出され、プロファイルは、ヒト天然レパートリーで観察される長さの分布に相当する。これらの結果により、ヒト天然ＣＤＲ Ｈ３レパートリーが、ＡＤ１ライブラリーの構築中に捕捉されたことが確認される。５Ｅ３に対する３回の選択の後に行われた同様の分析により、完全に異なるＣＤＲ Ｈ３の長さのプロファイルが選択されたことが明らかになった。特に、８および２１アミノ酸の長さのＣＤＲ Ｈ３が劇的に富化されたことが、ＡＤ１ライブラリーを用いて行った選択において観察できた。この組のデータは、異なるＣＤＲ Ｈ３プロファイルが、同じ標的に対する選択の後に２つのライブラリーから富化されたことを証明した。さらに、この分析は、本発明を用いて、合成多様性を用いてカバーすることが非常に困難な長いＣＤＲ Ｈ３を、選択したヒトフレームワーク内に捕捉して選択できたことを証明する。
（実施例１３）
同定されたｓｃＦｖの結合アッセイにおける評価
５Ｅ３の可変領域に対して陽性であると同定された、異なる配列を有するクローンの精製されたｓｃＦｖ調製物を、キメラ５Ｅ３に対する結合について、用量応答ＥＬＩＳＡにおいて試験した。これらの調製物は、無関係のマウス抗体（１Ａ６）に対しても試験した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌマウス５Ｅ３で１晩被覆した。対照プレートを、２μｇ／ｍｌ １Ａ６モノクローナル抗体で被覆した。プレートを、次いで、３％脱脂乳／ＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後に、異なる濃度の精製されたｓｃＦｖを加え、室温にて１時間インキュベーションした。プレートを、次いで、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ｍｙｃ抗体を含有する５０μｌの３％脱脂乳／ＰＢＳを各ウェルに。室温にて１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＥＬＩＳＡを、次いで、５０μｌのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光基質を加えることにより明らかにし、シグナルを蛍光分光光度計で読み取った。データは、ほとんどのクローンが、１Ａ６を認識しないので５Ｅ３について高度に特異的であり、これらが５Ｅ３の可変領域を指向することを示す（図１９）。
同様にして、ｈＩＦＮγに対して結合するものとしてファージＥＬＩＳＡにおいて同定された、異なる配列を有するクローンの精製されたｓｃＦｖ調製物を、ｈＩＦＮγに対する結合について、用量応答実験において試験した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ ｈＩＦＮγで１晩被覆し、対照プレートを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ ＢＳＡで被覆した。プレートを、次いで、３％脱脂乳／ＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後に、異なる濃度の精製されたｓｃＦｖを加え、室温にて１時間インキュベーションした。プレートを、次いで、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ｍｙｃ抗体を含有する５０μｌの３％脱脂乳／ＰＢＳを各ウェルに。室温にて１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＥＬＩＳＡを、次いで、５０μｌのＴＭＢ基質、および反応を停止するための５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより明らかにした。シグナルを、４５０ｎｍにて吸光度分光光度計で読み取った。データは、選択されたクローンが、用量依存的な様式でｈＩＦＮγと結合し、ｈＩＦＮγについて高い親和性を有する陽性対照ｓｃＦｖ Ａ６と比較して非常に良好なシグナルが得られたことを示す（図２０）。
（実施例１４）
インターフェロンガンマにより誘導されるレポーター遺伝子発現のＳｃＦｖ阻害
ｈＩＦＮγに特異的な、選択されたｓｃＦｖのパネルを上記のようにして生成して精製し、ｈＩＦＮγの生物活性を遮断する能力について試験した。ＩＦＮγ誘導性ＧＢＰ１プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）を、ヒトメラノーマ株化細胞Ｍｅ６７．８にトランスフェクトした。種々の濃度のｓｃＦｖを２ｎｇ／ｍｌのｈＩＦＮγとインキュベートし、次いで、細胞培養物に加えた。６時間のインキュベーション時間の後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行い、発光の強度を測定した。活性を、ヒトドナーからのＶＨ／ＶＬレパートリー（クローンＧ９）の伝統的な捕捉により構築された別のヒトｓｃＦｖ抗体ライブラリーから単離したｓｃＦｖと比較した。データは、合成または天然のいずれかのヒト多様性ライブラリー（ＡＥ１およびＡＤ１）から単離したｓｃＦｖが、ｈＩＦＮγの生物活性を用量依存的な様式で阻害可能であったことを示す（図２１）。これらのｓｃＦｖの中和効力は、ベンチマークｓｃＦｖクローンＧ９より優れていた。
（実施例１５）
インターフェロンガンマにより誘導されるＭＨＣクラスＩＩ発現のｓｃＦｖ阻害
フローサイトメトリーアッセイを行って、ＩＦＮγにより誘導されるＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を遮断できる完全にヒトのＩｇＧ抗体またはその断片を同定した。Ｍｅ６７．８細胞の播種の後に、５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＦＮγを、種々の濃度の完全にヒトの抗ＩＦＮγモノクローナル抗体の候補の存在下で培養に加えた。４８時間の培養の後に、細胞を、蛍光標識抗ヒトＭＨＣクラスＩＩ抗体（ＨＬＡ−ＤＲ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）を用いて分析した。よって、各候補抗体についてのＩＣ５０（ＩＦＮγにより誘導されるＭＨＣクラスＩＩ発現の５０％が阻害される場合、すなわち５０％阻害濃度）が測定される。
精製された完全にヒトのｓｃＦｖを、上記のようにして生成した。メラノーマ細胞上でのＩＦＮγにより誘導されるＭＨＣクラスＩＩ発現に対する選択されたｓｃＦｖの効果を、上記のようなフローサイトメトリーによる細胞に基づくアッセイを用いて評価した。これらのｓｃＦｖは、メラノーマ細胞上でのＩＦＮγにより誘導されるＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害した（図２２）。
（実施例１６）
ＩｇＧフォーマットへのｓｃＦｖの再フォーマッティング
選択されたｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列を、５’末端にリーダー配列とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とを導入する特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。ＡｐａＩ部位は重鎖の３’末端に導入し、一方、ＡｖｒＩＩおよびＢｓｉＷＩ部位は、それぞれラムダまたはカッパ軽鎖配列の３’末端に導入した。増幅されたＶＨ配列をＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで消化し、ｐＣｏｎ＿ｇａｍｍａ１発現ベクター（ＬＯＮＺＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にクローニングした。増幅されたＶＬラムダ配列をＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、ｐＣｏｎ＿ｌａｍｂｄａ２発現ベクターにクローニングし、増幅されたＶＬカッパ配列をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、ｐＣｏｎ＿ｋａｐｐａ発現ベクター（ＬＯＮＺＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にクローニングした。構築物を配列決定により確認した後に、哺乳動物細胞をトランスフェクトした。
それらの適当な発現ベクター中のＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡ配列を、哺乳動物細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。簡単に述べると、ピーク細胞を、６ウェルプレート中で、胎児ウシ血清を含有する２ｍｌの培養培地中でウェルあたり６×１０５細胞の濃度にて培養した。候補ＶＨおよびＶＬ配列をコードする発現ベクターを、細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬を製造者の使用説明に従って用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの１日後に、培養培地を吸引し、３ｍｌの血清を含まない新鮮な培地を細胞に加え、３７℃にて３日間培養した。３日間の培養期間の後に、上清を、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で、製造者の使用説明に従って精製してＩｇＧについて採集した。簡単に述べると、トランスフェクトされた細胞からの上清を４℃にて１晩、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）とともにインキュベートした。試料を、次いで、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラムに通し、溶出緩衝液を用いてＩｇＧを最終的に精製した。溶出されたＩｇＧ画分を、次いで、ＰＢＳに対して透析し、ＩｇＧ含量を、２８０ｎｍでの吸光度により定量した。純度およびＩｇＧの完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
（実施例１７）
インターフェロンガンマ生物活性のＩｇＧ阻害
機能的アッセイにおいてｈＩＦＮγに対する阻害活性が確認された２つのｓｃＦｖであるＡＥ１−４−Ｒ３−Ｐ２Ｅ４（２Ｅ４）およびＡ２−ＡＤ１−Ｒ４Ｐ１Ａ９（１Ａ９）を、実施例１６に記載されるようにしてＩｇＧに再フォーマットし、実施例１４に記載されるインターフェロンガンマにより誘導されるレポーター遺伝子アッセイにおいて試験した。図２３に示す結果は、ＩｇＧフォーマットにおいて、１Ａ９および２Ｅ４はともにｈＩＦＮγの活性を、それぞれ４２ｎＭおよび１０ｎＭのＩＣ５０で中和できたが、陰性対照ＩｇＧ（ＮＩ−０７０１）はこのアッセイにおいて効果を有さなかったことを示す。よって、合成および天然の多様性ライブラリーの両方から単離されたこれらの２つの候補は、完全ＩｇＧに再フォーマットでき、選択された標的に対する中和活性を特徴とする。
（実施例１８）
マウス血清における５Ｅ３の検出のための薬物動態アッセイの開発。
マウスモノクローナル抗体５Ｅ３と特異的に結合する（図１９）２つのｓｃＦｖ候補であるＡＤ１５Ｅ３Ｒ３Ｐ１＿Ａ４およびＡＤ２５Ｅ３Ｒ３Ｐ１＿Ｇ１１を、実施例１６に記載されるようにして完全ヒトＩｇＧに再フォーマットした。対応するＩｇＧであるＤＡ４およびＧ１１の特異性を、マウス５Ｅ３、およびマウス可変領域がラット定常ＩｇＧ領域に融合されたこのモノクローナル抗体のキメラバージョンに対するＥＬＩＳＡにおいて確認した。図２４に示す結果は、ＩｇＧ ＤＡ４およびＧ１１が、これらがマウスおよびキメララット５Ｅ３の両方と結合し、マウスおよびラットのアイソタイプ対照と結合しないので、５Ｅ３の可変領域に特異的であることを証明する。これらの２つのモノクローナル抗体を用いて、薬物動態研究のためにマウス血清中の５Ｅ３を定量するためのアッセイを開発した。マウス血清のいくつかの希釈を、５μｇ／ｍｌのマウス５Ｅ３抗体にスパイクし、血清濃度が希釈系列全体で維持されるように系列希釈した。Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ ＤＡ４またはＩｇＧ Ｇ１１で１晩被覆した。ＰＢＳ；１％ ＢＳＡでブロックした後に、スパイクした血清調製物の希釈系列をウェルに加えた。インキュベーションおよび洗浄の後に、シグナルを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗マウスカッパ軽鎖モノクローナル抗体および蛍光基質（Ａｍｐｌｅｘ ｒｅｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて明らかにした。結果は、両方の抗体を、マウス血清中のマウスモノクローナル５Ｅ３抗体を特異的に検出するために用いることができることを示す（図２５）。血清中のマウス５Ｅ３の検出限界は約２００ｎｇ／ｍｌであり、アッセイは血清濃度により著しく影響されず、このことは、ＩｇＧ ＤＡ４およびＩｇＧ Ｇ１１がマウス５Ｅ３に高度に特異的であり、その他のマウス免疫グロブリンと結合しないことを示した。これらの実験は、高度に特異的な抗イディオタイプ抗体を、天然または合成ライブラリーＡＥ１およびＡＤ１から単離できたことを証明する。
（実施例１９）
ナイーブおよび免疫化マウスから捕捉したＣＤＲＨ３多様性を含有するライブラリーを用いるファージ選択。
実施例８および９に記載されるＭｎＡ、ＭｉＢおよびＭｉＣライブラリーを、実施例１１に記載される手順に従うｈＩＦＮγに対するファージ選択について並行して用いた。選択プロセス中に、ファージの同様の富化が観察された（図２６）。
マイクロタイタープレートフォーマットにおけるｓｃＦｖの発現：単独クローンを、１５０μｌの２×ＴＹＡＧ培地（２％グルコース）をウェルあたりに含有するマイクロタイタープレートに採取し、３７℃（１００〜１２０ｒｐｍ）にて５〜６時間成長させた。プレートを２８０ｒｐｍにて遠心分離し、培地を廃棄し、細胞ペレットを、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する１００μｌの２×ＴＹＡ培地に再懸濁した。プレートを３０℃にて１晩、振とう（１００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。成長の後に、プレートを３，２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上清を、５％脱脂粉乳を含有する２倍濃縮ＰＢＳを含有するプレートにブロッキングのために注意して移した。
ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ ｈＩＦＮγで１晩被覆した。対照プレートを、２μｇ／ｍｌ組換えＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。プレートを、次いで、３％脱脂乳／ＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後に、予めブロックしたｓｃＦｖ上清を移し、室温にて１時間インキュベーションした。プレートを、次いで、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ｃＭｙｃ抗体（１：５，０００に希釈）を含有する５０μｌの３％脱脂乳／ＰＢＳを各ウェルに。室温にて１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＥＬＩＳＡを、次いで、５０μｌのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることにより明らかにした。蛍光強度を、５３０ｎｍでの励起により５９０ｎｍで測定した。対照Ａ６クローンの強度の半分のシグナルを与えるヒットの頻度を、これらの３つのライブラリーについて各回の選択の後に評価した（図２７）。ＭｉＢライブラリーを用いて得られたヒットの比率は、その他の２つのライブラリーと比較して劇的に高く、シグナルの平均レベルは、ＭｉＢライブラリーに由来するクローンについて優れており、これらのことは、より高い親和性のｓｃＦｖが富化されたことを示した（図２８）。この観察結果を確認するために、陽性クローンを配列決定し、より大規模で発現させ、精製して、実施例１３に従う用量応答結合実験において試験した。ＭｉＢライブラリーに由来するｓｃＦｖは全て、ナイーブＭｎＡライブラリーから単離されたものよりも、ｈＩＦＮγについて明らかなより高い親和性を有した（図２９）。これらの結果は、タンパク質で免疫したマウスからのＣＤＲＨ３レパートリーを、ヒト抗体フレームワークの状況に生産的な方式で捕捉でき、より高い頻度で高い親和性のヒト抗体断片を作製できたことを示す。本発明を用いて作製されたライブラリーは、よって、療法的な効力を有する抗体を作製する強力な手段である。
その他の実施形態
本発明を、その詳細な説明に関連して説明したが、上記の記載は、説明することを意図し、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定しない。その他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (42)

  1. 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
  2. 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
  3. 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
  4. （ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
    （ｂ）前記哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、
    （ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、
    （ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
    を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. ステップ（ｂ）が、哺乳動物種からの前記ＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項６に記載の方法。
  8. ステップ（ｂ）が、非ヒト種からの前記ＣＤＲ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項５に記載の方法。
  9. 前記非ヒト種が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項２に記載の方法。
  10. ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される、請求項４に記載の方法。
  11. 前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
  12. ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする、請求項４に記載の方法。
  13. ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする、請求項４に記載の方法。
  14. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
  15. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
  16. 前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
  18. 前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項４に記載の方法。
  20. ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ（ｅ）と、ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ（ｆ）とをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  21. 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項２０に記載の方法。
  23. 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
  24. （ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
    （ｂ）前記免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、
    （ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、
    （ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
    を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップ（ｂ）が、前記免疫した非ヒト哺乳動物からの前記ＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項２６に記載の方法。
  28. ステップ（ｂ）が、前記非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ Ｈ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項２４に記載の方法。
  30. ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される、請求項２４に記載の方法。
  31. 前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
  32. ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする、請求項２４に記載の方法。
  33. ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする、請求項２４に記載の方法。
  34. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
  35. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
  36. 前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
  38. 前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項２４に記載の方法。
  40. ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸の前記ライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ（ｅ）と、ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ（ｆ）とをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  41. 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項４０に記載の方法。
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