CN110577598B - 抗sFcεRIα单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗sFcεRIα单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗sFcεRIα单克隆抗体及其应用。具体地，本发明提供了产生抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备及其用途。本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体针对sFcεRIα的非IgE结合位点，二者间结合不影响sFcεRIα与IgE的结合。所述的抗体能够高特异性地结合sFcεRIα抗原，其具有很高的亲和力，特异性好、抗体效价高(所述抗体1:50倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到96.7％)。所述的抗体能简便快速、特异地对痕量sFcεRIα进行准确分析检测，为研究该蛋白在各种疾病中的作用奠定了良好基础。

Description

抗sFcεRIα单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和免疫学技术领域，涉及抗sFcεRIα单克隆抗体及其应用。
背景技术
当过敏原初次进入机体，刺激B细胞产生过敏原特异性IgE抗体。FcεRI是IgE的高亲和力受体(IgE high affinity receptor，FcεRI)，它是由α、β和两个γ亚基组成的四聚体，主要表达于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，参与IgE介导的过敏性疾病。其α亚基分为胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区是配体IgE的高亲和力结合部位，二者间结合力大于抗原抗体结合力。IgE与肥大细胞表面FcεRI结合可使细胞处于致敏状态，当相同过敏原再次进入机体，致敏肥大细胞通过抗原交联相邻的FcεRI而激活α链胞内区的活化信号ITAM，活化肥大细胞。肥大细胞在活化的几秒钟内，可迅速脱颗粒释放预先形成的生物活性物质，如组胺、5-羟色胺、粒细胞趋化因子、中性蛋白酶、肝素等，随后合成与分泌大量的促炎类脂质介质如前列腺素E2、白三烯、血小板活化因子、氧代谢产物，最后是细胞因子(如IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13，IL-14，TNF-a等)和趋化因子的合成与分泌。这些生物活性物质具有扩血管活性，可增加血管通透性，促进炎性反应，引起血管扩张、通透性增加导致血压下降、皮肤斑丘疹，支气管平滑肌收缩导致喘息和哮喘，黏膜渗出、水肿导致喷嚏、流涕、腹痛、腹泻等症状。
近年来，研究发现FcεRI以可溶性形式，即sFcεRI(soluble FcεRI)，存在于血液循环中。sFcεRI是一个含完整IgE结合区段的截短的α链，或称为sFcεRIα。FcεRI交联活化后，肥大细胞可通过翻译后修饰机制释放sFcεRIα。目前研究发现多种疾病患者血清中存在sFcεRIα含量升高的现象，例如过敏性疾病、嗜酸细胞性食管炎、部分自身免疫病等等。sFcεRIα可能是肥大细胞或嗜碱性粒细胞活化的新标志。但是目前在开发这类抗sFcεRIα抗体时却往往会遇到抗体亲和力下降、活性不高、稳定性差、或产量低等瓶颈问题。
因此，本领域有必要进一步研究和开发亲和力高、特异性强的抗sFcεRIα单克隆抗体，从而能简便快速、灵敏准确、特异性好地对痕量sFcεRIα进行准确分析检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲和力高、特异性强的抗sFcεRIα单克隆抗体。
本发明的目的在于提供一种能简便快速、灵敏准确、特异性好地对痕量sFcεRIα进行准确分析检测的方法。
本发明的第一方面，提供了一种抗sFcεRIα单克隆抗体，所述抗体能与sFcεRIα的游离态或复合态结合，所述复合态为sFcεRIα与IgE形成复合物。
在另一优选例中，所述的抗体1:50倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到96.7％以上。
在另一优选例中，所述的抗体1:10倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到98.4％以上。
在另一优选例中，所述的抗体1:100倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到88.9％以上。
在另一优选例中，所述的抗体由小鼠杂交瘤细胞株B5A11CCTCC NO:C2017220产生。
在另一优选例中，所述抗sFcεRIα单克隆抗体与保藏号为CCTCC NO:C2017220杂交瘤细胞株产生的参照抗体相比，具有选自下组的一种或多种特性：
(1)所述抗sFcεRIα单克隆抗体的重链可变区的三个CDR区与所述参照抗体的重链可变区的三个CDR区相同；
(2)所述抗sFcεRIα单克隆抗体的轻链可变区的三个CDR区与所述参照抗体的轻链可变区的三个CDR区相同；
(3)所述抗sFcεRIα单克隆抗体的重链可变区与所述参照抗体的重链可变区相同；和/或
(4)所述抗sFcεRIα单克隆抗体的轻链可变区与所述参照抗体的轻链可变区相同。
本发明的第二方面，提供了一株杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞用于产生本发明第一方面所述的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞选自下组：
(a)保藏编号为CCTCC NO:C2017220的杂交瘤细胞株；和/或
(b)细胞株(a)的衍生细胞株。
本发明的第三方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：
(1)培养杂交瘤细胞株B5A11CCTCC NO:C2017220或其衍生细胞株，使之分泌单克隆抗体；
(2)分离(1)中获得的单克隆抗体。
本发明的第四方面，提供了一种偶联物，所述偶联物含有：
(a)本发明第一方面所述的单克隆抗体；和(b)与所述抗体偶联的可检测标记和/或固相载体。
在另一优选例中，所述可检测标记包括胶体金标记物、有色标记物和/或荧光标记物。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的单克隆抗体的用途，用于(a)检测sFcεRIα，和/或(b)制备检测sFcεRIα的试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述sFcεRIα包括：游离的sFcεRIα和/或sFcεRIα-IgE复合物。
在另一优选例中，所述检测sFcεRIα包括检测sFcεRIα的有无和/或含量。
在另一优选例中，所述检测sFcεRIα包括检测待测样品中是否含有sFcεRIα。
本发明的第六方面，提供了一种检测游离sFcεRIα的方法，所述方法包括步骤：利用本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第四方面所述的偶联物检测sFcεRIα。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(1)提供第一抗体，所述第一抗体为本发明第一方面所述的抗体；
(2)将所述第一抗体与待测样品混合，得到第一混合物，所述第一混合物中含有“第一抗体-sFcεRIα”二元复合物和/或“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物；
(3)任选地将第一混合物与过量IgE混合，得到第二混合物，所述第二混合物中含有“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物；
(4)将上一步骤中的所述第一混合物或第二混合物中的“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物与带有可检测标记的第二抗体混合，形成“第一抗体-sFcεRIα-IgE-第二抗体”四元复合物；
(5)检测所述四元复合物的有无和/或浓度。
在另一优选例中，所述第一抗体为一种或多种选自下组的形式：
(i)未与任何物质结合或未修饰的形式；
(ii)与可检测标记偶联；
(iii)与固相载体偶联。
在另一优选例中，所述固相载体为微球。
在另一优选例中，所述微球为量子点荧光微球或量子点荧光磁性微球。
在另一优选例中，所述微球直径为5-10μm，优选地为7-8μm。
在另一优选例中，所述量子点微球所带的荧光激发波长为300-500nm，发射波长为600-800nm。
在另一优选例中，所述微球为羧基基团修饰表面的微球。
在另一优选例中，所述微球的数量为1×104-1×105个/反应，优选地为1×104个/反应。
在另一优选例中，所述第一抗体的包被量为0.5-10μg，较佳地1-5μg。
在另一优选例中，所述第二抗体为PE标记的抗人IgE单克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体的可检测标记各自独立地选自下组：荧光基团、发光基团、磁性微粒、纳米材料、或其组合，且第一抗体和第二抗体的可检测标记不同。
在另一优选例中，所述检测为非治疗、非诊断性的。
本发明的第七方面，提供了一种检测sFcεRIα的试剂盒，所述试剂盒含有：
(a)第一容器，所述第一容器中含有第一抗体，所述第一抗体为本发明第一方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组：
(b)第二容器，所述第二容器中含有第二抗体；和/或
(c)第三容器，所述第三容器中含有IgE。
在另一优选例中，所述第二抗体为PE标记的抗人IgE单克隆抗体。
本发明的第八方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第四方面所述的偶联物。
在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。
在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了FcεRI结构图。
图2显示了流式微球技术定量检测sFcεRIα的方法。
图3显示了本发明微球的扫描电镜图。
图4显示了同型对照、D7C1、E5E5、B5A11和E4A11单克隆抗体的流式筛选(与KU812细胞结合的峰图：使用鼠IgG型抗体作为同型对照，以FS、SS设门，峰图显示门内所圈细胞的阳性率)。
图5显示了抗sFcεRIα单克隆抗体B5A11的效价。A-C分别为不同稀释比例下B5A11抗体与KU812细胞结合的峰图，D-F分别为不同稀释比例下B5A11抗体与KU812细胞结合的散点图。
图6显示了流式微球技术检测sFcεRIα的标准曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种抗sFcεRIα单克隆抗体，所述的抗体针对sFcεRIα的非IgE结合位点，二者间结合不影响sFcεRIα与IgE的结合。所述的抗体能够高特异性地结合sFcεRIα抗原，其具有很高的亲和力，灵敏度高、特异性好、抗体效价高(所述抗体1:50倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到96.7％以上)。所述的抗体能简便快速、灵敏准确、特异性好、重复性好地对痕量sFcεRIα进行准确分析检测。基于此完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，本发明的“抗原”或“检测抗原”是指FcεRI或sFcεRIα。
FcεRI
FcεRI是IgE的高亲和力受体(IgE high affinity receptor，FcεRI)，它是由α、β和两个γ亚基组成的四聚体，主要表达于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，参与IgE介导的过敏性疾病(图1)。其α亚基分为胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区是配体IgE的高亲和力结合部位，二者间结合力大于抗原抗体结合力。IgE与肥大细胞表面FcεRI结合可使细胞处于致敏状态，当相同过敏原再次进入机体，致敏肥大细胞通过抗原交联相邻的FcεRI而激活α链胞内区的活化信号ITAM，活化肥大细胞。肥大细胞在活化的几秒钟内，可迅速脱颗粒释放预先形成的生物活性物质，如组胺、5-羟色胺、粒细胞趋化因子、中性蛋白酶、肝素等，随后合成与分泌大量的促炎类脂质介质如前列腺素E2、白三烯、血小板活化因子、氧代谢产物，最后是细胞因子(如IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13，IL-14，TNF-a等)和趋化因子的合成与分泌。这些生物活性物质具有扩血管活性，可增加血管通透性，促进炎性反应，引起血管扩张、通透性增加导致血压下降、皮肤斑丘疹，支气管平滑肌收缩导致喘息和哮喘，黏膜渗出、水肿导致喷嚏、流涕、腹痛、腹泻等症状。
sFcεRIα
sFcεRIα(soluble FcεRIα)，是人类血清中存在的可溶性形式的IgE高亲和力受体FcεRI的α亚基胞外段。sFcεRI是一个含完整IgE结合区段的截短的α链。可溶性FcεRI(sFcεRIα)是截短的α链，不含α链的跨膜区和胞内区，仅保留了可与IgE结合的胞外区，它们以游离或与IgE结合两种形式存在于循环中。在疾病状态时，细胞膜表面的FcεRI受体表达量显著增加，IgE介导的受体交联与细胞活化可进一步增加sFcεRIα的释放量。体外研究显示，经FcεRI交联活化后，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱可通过翻译后修饰机制释放sFcεRIα，sFcεRIα可能是肥大细胞或嗜碱性粒细胞活化的循环标志物。另外，sFcεRIα也可与细胞表面FcεRI竞争结合IgE，降低过敏反应的症状从而达到治疗目的。
抗sFcεRIα单克隆抗体
如本文所用，“抗sFcεRIα单克隆抗体”、“抗sFcεRIα单抗”、“本发明抗体”可互换使用，均是指本发明第一方面所述的抗体，能够高特异性结合sFcεRIα抗原(优选为人sFcεRIα抗原)。本发明抗体由小鼠杂交瘤细胞株B5A11CCTCC NO:C2017220产生。本发明抗sFcεRIα单克隆抗体针对sFcεRIα的非IgE结合位点，二者间结合不影响sFcεRIα与配体IgE的结合。本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等,Nature,256:495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明还包括具有所述的抗sFcεRIα单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗sFcεRIα单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或偶联物及融合表达产物(即偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗sFcεRIα单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗sFcεRIα单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明还提供了编码所述的抗sFcεRIα单克隆抗体或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
本发明还提供了可生产本发明抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞系；优选的，本发明提供了高效价的抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
在获得生产本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤，本领域人员可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，优选哺乳动物细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press,Kruse and Patterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例可以知道，本发明也能采用上述这些细胞系。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染宿主细胞。
然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
此外，本发明还提供了一种检测sFcεRIα的试剂盒，它含有所述的抗sFcεRIα单克隆抗体或其活性片段。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够产生抗sFcεRIα单克隆抗体。所述杂交瘤细胞株B5A11已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏日期：2017年10月18日，保藏编号：CCTCC NO:C2017220，分泌抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞株系。
在获得生产本发明的抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种抗sFcεRIα的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出所述抗体，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
流式微球分析技术
流式微球分析技术(Cytometric bead array，CBA)是一种快速定量检测技术，或称液相芯片技术。其原理是将包被某种抗体或抗原的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原抗体复合物，再加入荧光素标记的第二抗体，微球上结合的待测抗原或抗体的数量与其荧光强度呈正相关，由此可对待测液体中的成分进行定性或定量分析。本方法灵敏度高，特异性强，快速简便，重复性佳，能对检测物进行准确分析检测，而且能与不同微球混合从而同时测定单个标本中的多种物质。
量子点
量子点(Quantum dots，QDs)是一种人工合成的半导体纳米晶体，它们具有优异的荧光特性。与传统荧光物质相比，QDs具有很宽的激发光谱，使多种QDs可通过单个波长同时激发；较窄且对称的发射光谱，意味着更高的微球编码能力；强的亮度和产量，还有更高的抗淬灭性和化学稳定性等特点。使QDs成为生物医学诊断、分子成像和化学分析的理想荧光标记或探针。此外，由磁纳米颗粒(Magnetic nanoparticles，MNPs)组成的磁性微球也已经用于稀有细胞和生物分子的捕获、富集和分离，磁性分离方法不需要冗长的洗涤步骤，更加方便、有效。
捕获抗体和检测抗体
在本发明中，捕获抗体为本发明所述抗sFcεRIα单克隆抗体。
在本发明中，检测抗体为IgE抗体，优选地为鼠抗人IgE抗体，更优选地为PE标记的鼠抗人IgE单克隆抗体。
本发明检测sFcεRIα方法
本发明提供一种能简便快速、灵敏准确、特异性好地对痕量sFcεRIα进行准确分析检测的方法。本发明还包括量子点微球的制备，微球与捕获抗体的化学偶联，抗体、抗原、受体、配体的免疫结合条件的优化，及其在流式细胞仪上的分析检测方法。
本发明建立的检测系统选择的捕获抗体是B5A11杂交瘤细胞产生的抗FcεRIα单克隆抗体，它针对sFcεRIα的非IgE结合位点，二者间结合不影响sFcεRIα与配体IgE的结合。再利用人IgE和抗IgE单克隆抗体用于检测。若省略IgE孵育步骤，本发明可以检测血清中预先存在的sFcεRIα-IgE复合物。
微球采用化学偶联法将微球表面的羧基和抗体天然的氨基通过酰胺键连接，捕获抗体为本发明所述抗sFcεRIα单克隆抗体，检测抗原为血清sFcεRIα与该蛋白标准品，IgE为人类骨髓瘤细胞株分泌的天然IgE蛋白，荧光抗体为PE标记的抗人IgE单克隆抗体。
在本发明一个实施方式中，本发明的方法是一种基于流式微球技术定量检测游离sFcεRIα的方法(图2)，含有羧基基团修饰表面的微球先与本发明抗FcεRIα单克隆抗体进行化学偶联，将捕获抗体交联于微球表面，制备成捕获微球，然后偶联有检测抗体的微球与待测样品中的sFcεRIα反应，洗涤后再与过量的IgE结合，再次洗涤后和荧光标记抗体反应，形成“微球-抗体-sFcεRIα-IgE-荧光抗体”的复合物，采用流式细胞仪分析微球上的荧光强度，根据已知标准曲线，计算sFcεRIα含量。
所采用的微球为羧基基团修饰其表面的量子点荧光微球或量子点荧光磁性微球，直径为7μm，微球大小均一，量子点均匀分布在微球内，微球的表征如图3所示。微球表面的羧基基团，用于化学偶联，量子点微球所带的荧光激发波长为300-500nm，发射波长为600-800nm。
本发明方法检测物质包括：游离的sFcεRIα，以及预先存在的sFcεRIα-IgE复合物。
在本发明一个优选的实施方式中，一种具体的利用本发明抗体检测sFcεRIα含量的方法，包括步骤：
1.微球与捕获抗体的化学偶联：先取一定数量的微球，根据微球表面带有的羧基，使用EDC和S-NHS与捕获抗体上的氨基进行连接。3×105个微球偶联4μg抗体，制备微球-捕获抗体的偶联物，即捕获微球，反应完洗涤、离心去除偶联试剂，再用含有1％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微球表面未反应位点，用牛鲍计数板计数后，4℃保存待用。
2.取1×104已包被捕获抗体的微球，加入待测样品，混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤。
3.加入过量的天然人IgE蛋白，溶解于5％BSA的磷酸盐缓冲液中(pH＝7.2)，混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤。去除未结合的IgE蛋白。
4.将反应完的“微球-捕获抗体-抗原(受体)-配体”复合物，加入荧光标记的抗配体的抗体，混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤。
5.将反应完的“微球-捕获抗体-抗原(受体)-配体-抗配体抗体”复合物，加入300μL磷酸盐缓冲液重悬，振荡30秒，采用流式细胞仪进行检测。
6.检测“微球-捕获抗体-抗原(受体)-配体-抗配体抗体”复合物的荧光强度，根据已建立的标准曲线，计算获得样品中sFcεRIα的浓度。
7.若省略上述步骤3中的IgE孵育步骤，本发明可以检测血清中预先存在的sFcεRIα-IgE复合物。
通过性能验证发现，本发明方法具有良好的线性，R2>0.99，是定量检测可靠的分析方法。其次，方法具有灵敏的检测下限，达到0.20ng/mL，灵敏度高于市售试剂盒，检测上限达到200ng/mL。方法的精密度满足了免疫测定验证标准，批内及批间重复性实验的平均回收率为绝对浓度的80％-110％，相应的CV<20％，保证结果重现性。
本发明的主要优点
1.流式细胞仪具有高分辨率、高灵敏度、双激光激发、多参数分析等优点。检测的数据收集和分析是通过量子点微球上所携带的荧光信号来完成的，无镉量子点微球大小均一，光学性能好，提高了检测的灵敏度。微球编码数量大，检测时间短，适合高通量分析的优越性，方便提供更多的诊断信息。
2.本发明的抗FcεRIα单克隆抗体B5A11杂交瘤细胞株具有稳定传代的特点，抗体产量高，获得纯化抗体效价高(所述抗体1:50倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到96.7％以上)、特异性好(特异性识别FcεRIα，且不影响其与IgE的结合)、稳定性好(4℃下保存15天后与sFcεRIα的结合率没有明显下降)，经济方便。本发明抗体针对sFcεRIα的非IgE结合位点，二者间结合不影响sFcεRIα与IgE的结合。所述抗体能与sFcεRIα的游离态或复合态结合，可制备成用于检测sFcεRI有无和/或含量的检测板或试剂盒。并且所述抗体能够高特异性地结合sFcεRIα抗原，其亲和力高，灵敏度高、特异性好、稳定性好。综上，本发明抗体能简便快速、灵敏准确、特异性好、重复性好地对(痕量)sFcεRIα进行准确分析检测。
3.本发明采用的是抗原抗体加配体受体的免疫结合，所有条件经过优化，实验中确定了①EDC与S-NHS用量0.5mg；②化学偶联条件为室温振荡30min后4℃摇床过夜；③捕获抗体包被量4μg；④每个反应的微球数量为2×104个；⑤孵育温度25℃或37℃；⑥孵育时间1h；⑦测定缓冲液使用5％BSA，pH＝7.2；⑧封闭液1％BSA，由于微球非特异吸附很小，省略封闭步骤对方法学没有影响。上述条件能够实现最灵敏的检测，具有特异性强、交叉反应少等特点。
4.与酶联免疫吸附试验ELISA相比，本发明方法学灵敏度高、精密度高、线性好、分析速度快、特异性好、重复性佳、快速稳定，能对痕量sFcεRIα进行准确分析检测，为研究该蛋白在各种疾病中的作用奠定了良好基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1抗sFcεRIα单克隆抗体的制备
1.杂交瘤细胞株的建立与筛选
(1)免疫动物：
取FcεRIα原核表达全长蛋白加等量弗式完全佐剂，研磨、充分混合后，皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，两周后加弗式不完全佐剂免疫第二次，后面每两周免疫一次，共免疫6次，每次50μg，最后一次尾静脉加强免疫；共免疫5只小鼠，以右耳打洞标记。
(2)细胞融合：
当小鼠血清抗人FcεRIα抗体的效价在1:50000以上时，筛选出免疫成功的小鼠进行细胞融合。收集该小鼠脾细胞，将1×108个小鼠脾细胞与1×107SP2/0细胞混合，1200rpm离心5min，弃上清，将细胞沉淀轻弹混匀，置于37℃水浴，在1min内边摇边加入0.8mLPEG4000；然后再在1min内匀速滴入1mL RPMI-1640培养液，在2min内再滴入2mL，3min和4min内各滴入1.5mL，最后5min内加入5mL RPMI-1640培养液终止融合；离心去上清，加入HAT培养液置于预先制备有饲养细胞的96孔细胞培养板中初筛培养，100μL/孔，共铺六块板，置于恒温37℃，含5％CO2的培养箱中培养。每2-3天进行细胞换液，7天内用HAT培养液。
(3)杂交瘤细胞株筛选(有限稀释法)：
①采用间接ELISA法检测细胞上清，筛选与FcεRIα重组蛋白发生强阳性反应的克隆，用有限稀释法对阳性孔细胞进行亚克隆化培养；
②自阳性培养孔吸出需要再克隆的细胞并计数，HT培养液稀释使细胞浓度达到50-60个/mL，在96孔培养板中每孔加100μL接种细胞，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，继续接种，如此类推，直至每孔含0.5-1个杂交瘤细胞；
③第20天后改用RPMI-1640培养液培养。
通过间接ELISA筛选阳性的融合细胞培养孔，进行有限稀释法克隆化培养。间接ELISA筛选数据结果见表1，经过两轮筛选获得7孔阳性细胞株，再进行两轮亚克隆筛选，共获得15株单克隆细胞，按顺序1-15号分别为G3G3，E2H2，A5H1，E4A11，D7C1，A8F12，H4E8，E5E5，A8H1，C9H8，D7G11，H4H4，H2G2，A5F5，B5A11。获得15株抗人FcεRⅠα单克隆抗体细胞株，均可结合FcεRⅠα全长蛋白。
表1ELISA筛选出的15株杂交瘤细胞株上清与FcεRIα蛋白结合的吸光度值
细胞株 G3G3 E2H2 A5H1 E4A11 D7C1 A8F12 H4E8 E5E5
OD值 2.315 2.400 2.287 2.198 2.428 2.372 2.380 2.419
细胞株 A8H1 C9H8 D7G11 H4H4 H2G2 A5F5 B5A11 空白
OD值 2.413 2.405 2.160 2.332 2.376 2.446 2.403 0.126
(4)流式筛选鉴定杂交瘤细胞株
在(3)的基础上，继续筛选与天然蛋白结合力强的杂交瘤细胞株。检测杂交瘤细胞上清与表达FcεRIα的KU812细胞和转染人FcεRIα的CHO3D10细胞的结合率。实验发现，与KU812细胞和CHO3D10细胞结合率高的单克隆细胞株为D7C1，E5E5，B5A11和E4A11。4株细胞株的流式筛选的结合率数据见图4，D7C1，E5E5，B5A11和E4A11结合率分别为65.7％、72.3％、86.3％和86.4％。B5A11单克隆细胞株状态佳，细胞呈圆形，大小一致，折光度强，形成多个较大的克隆，而E4A11在后续培养中不能形成较稳定的克隆，细胞状态欠佳。
2.单克隆抗体腹水的制备
(1)小鼠腹腔准备：
取雌性BABL/c小鼠(6w龄)，经腹腔注射无菌石蜡油，每只小鼠0.4mL；石蜡油可以刺激小鼠产生IL-6，IL-6是浆细胞生长因子，从而加速和促进杂交瘤细胞生长以达到增加腹水中抗体产量的目的；预计10-14天后给小鼠注射杂交瘤细胞。
(2)杂交瘤细胞株的接种：
①收集对数生长期的B5A11杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，收集上清；
②加入无菌PBS缓冲液洗涤细胞，1000rpm离心5min，洗两遍；
③重悬细胞计数，调整细胞密度至1×107个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液；
④7～10天后小鼠腹部胀大，每天多次观察小鼠状况。
(3)腹水收集与保存：
①用酒精棉球擦拭小鼠腹部皮肤，用1mL注射器抽取腹水，每只小鼠一次可抽取腹水2-5mL，间隔2～3天后，可再生出腹水，同法收集，直至小鼠死亡；
②收集腹水，4℃离心，3000rpm离心20min，由上至下分层：石蜡油、腹水、细胞；
③小心吸取腹水，4℃离心，10000rpm离心15min；
④吸取中间层腹水进行纯化。
实施例2抗sFcεRIα抗体效价检测
1.间接ELISA检测单克隆抗体B5A11的效价
(1)用包被缓冲液将FcεRIα稀释至5μg/mL(浓度经棋盘法实验得出)，100μL/孔加至ELISA 96孔板，4℃包被过夜；
(2)次日，倾去孔中液体，洗板5遍，每遍洗液在板孔中停留30s，拍干；
(3)加入1％BSA-PBS，200μL/孔进行封闭，37℃封闭2h，洗板、拍干；
(4)孔内加入不同倍比稀释的B5A11单克隆抗体，用市售鼠抗人FcεRI抗体作为阳性对照(1:1000，美国eBioscience公司)，同等浓度BSA作为阴性对照，37℃孵育1h，洗板、拍干；
(5)每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG二抗(1:5000，1％BSA-PBS稀释)，37℃孵育45min，洗板、拍干；
(6)每孔加入100μL底物显色，37℃孵育15min；
(7)加入终止液，测450nm吸光度。
结果如表2所示，K表示1000倍稀释。吸光度OD值越高说明抗体与抗原结合越多，即抗体效价越高。
表2抗sFcεRIα单克隆抗体B5A11的效价
阴性对照 阳性对照 1:1K 1:3K 1:9K 1:27K 1:81K 1:243K 1:729K
OD值 0.137 2.784 2.832 2.721 2.432 1.943 1.193 0.617 0.298
2.流式检测单克隆抗体B5A11的效价
(1)收集CHO3D10细胞和KU812细胞，用牛鲍计数板计数细胞密度，1000rpm离心3min，去上清，PBS重悬，调整细胞浓度至2×106个/mL；
(2)每个流式细胞术专用管中加入100μL上述细胞悬液，加入PBS洗涤细胞，2500rpm离心8min，弃上清；
(3)第一管Cell only和第二管Isotype加100μL PBS，第三管开始加入不同倍比稀释的单克隆抗体各100μL；
(4)充分振荡后，4℃孵育60min，PBS洗涤细胞，2500rpm离心8min，弃上清；
(5)第一管不加任何抗体，第二管开始加入1μL PE-羊抗鼠IgG抗体；
(6)充分振荡后，4℃孵育60min，PBS洗涤细胞，2500rpm离心8min，弃上清；
(7)用300μL PBS重悬，上流式细胞仪FC500检测。
结果如图5所示，B5A11腹水纯化抗体1:10倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到98.4％，1:50倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到96.7％，1:100倍稀释后与sFcεRIα的结合率达到88.9％。
实施例3应用流式微球技术分析游离sFcεRIα的含量
1.羧基量子点微球(粒径7μm，激发波长488nm，发射波长650-760nm)与捕获抗体(抗FcεRIα单克隆抗体B5A11杂交瘤细胞株)的偶联：首先清洗微球，取6×105个微球置于1.5mL EP管中，用300μL wash buffer(0.05％Tween-20in PBS)洗涤离心，小心吸弃上清，涡旋或超声重悬，洗三遍。加入300μL activation buffer(0.1mol/L NaH2PO4缓冲液，pH＝6.2)洗一遍，小心吸弃上清。80μL activation buffer重悬后加入10μL新鲜activationbuffer配制的EDC(50mg/mL)和S-NHS(50mg/mL)。避光，室温震荡(1400rpm)30分钟。离心，吸弃上清。300μL PBS(pH＝7.4)清洗微球三次。150μL PBS重悬。加入16μL捕获抗体(0.5mg/mL)，用PBS补足至500μL。避光室温孵育30min后4℃摇床过夜。反应结束后，500μL PBS洗三遍，加入500μL封闭液(1％BSA in PBS)，避光，室温震荡30分钟封闭微球表面未偶联位点。离心去上清，500μL wash buffer重悬。用牛鲍计数板计数后，4℃保存待用。微球可稳定保存半个月。
2.标准曲线的绘制：用150μL wash buffer抽滤清洗96孔过滤板三次，分别吸取已偶联的微球置于96孔过滤板中，1×104个微球/孔，150μL wash buffer抽滤清洗三次。分别加入100μL FcεRIα标准品(0.01ng/mL,0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL,2.5ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL)，振荡1min后，37℃避光振荡孵育1小时，抽滤清洗三次。然后加入过量天然人IgE蛋白，振荡混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤三次，去除未结合的IgE蛋白。最后加入100μL PE标记的抗人IgE单克隆抗体，振荡混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤三次后加入200μL PBS重悬，上机检测。记录微球上的PE荧光强度。荧光强度与FcεRIα标准品浓度呈正相关，以标准品浓度为X轴，平均荧光强度MFI为Y轴，绘制流式微球技术检测sFcεRIα的标准曲线。
标准曲线如图6所示，最低检测下限为0.20ng/mL，最高检测限为200ng/mL，sFcεRIα浓度在此范围内线性良好，R2>0.99。
3.待测样品中sFcεRIα含量的检测：用无促凝剂管收集人类全血，3000rpm离心5min分离血清，血清与PBS体积1:4稀释，备用。用150μL wash buffer抽滤清洗96孔过滤板三次，分别吸取已偶联的微球置于96孔过滤板中，1×104个微球/孔，150μL wash buffer抽滤清洗三次。
分别加入100μL待测样品，振荡混匀1min后，37℃避光振荡孵育1小时，抽滤清洗三次。然后加入过量天然人IgE蛋白，振荡混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤三次，去除未结合的IgE蛋白。加入100μL PE标记的抗人IgE单克隆抗体，振荡混合均匀后37℃避光振荡反应1小时，然后真空抽滤洗涤三次后加入200μL PBS重悬，上流式细胞仪检测。记录微球上的PE荧光强度。根据标准曲线计算获得待测样品中sFcεRIα的含量。
利用本发明的抗体和检测方法，可以检测0.20-200ng/mL的sFcεRIα，并具有很好的线性关系，检测灵敏度为0.20ng/mL。可以检测人血清中sFcεRIα的含量，具有很好的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依照本发明申请专利范围所做出的均等变化和条件修饰、调节，皆属于本发明的涵盖范围。
菌种保藏
本发明的产生抗sFcεRIα单克隆抗体的杂交瘤细胞株B5A11，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏日期：2017年10月18日，保藏编号：CCTCC NO:C2017220。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.一种抗sFcεRIα单克隆抗体，其特征在于，所述抗体针对sFcεRIα的非IgE结合位点，所述抗体能与sFcεRIα的游离态或复合态结合，所述复合态为sFcεRIα与IgE形成复合物；
并且，所述的抗体由小鼠杂交瘤细胞株B5A11 CCTCC NO:C2017220产生。
2.一株杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞株用于产生权利要求1所述的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞为：
保藏编号为CCTCC NO:C2017220的杂交瘤细胞株。
3.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)培养杂交瘤细胞株B5A11 CCTCC NO:C2017220，使之分泌单克隆抗体；
(2)分离(1)中获得的单克隆抗体。
4.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物含有：
(a)权利要求1所述的单克隆抗体；和(b)与所述抗体偶联的可检测标记和/或固相载体。
5.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备检测sFcεRIα的试剂、检测板或试剂盒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述sFcεRIα包括：游离的sFcεRIα和/或sFcεRIα-IgE复合物。
7.一种非治疗、非诊断性检测游离sFcεRIα的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求4所述的偶联物检测sFcεRIα。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供第一抗体，所述第一抗体为权利要求1所述的抗体；
(2)将所述第一抗体与待测样品混合，得到第一混合物，所述第一混合物中含有“第一抗体-sFcεRIα”二元复合物和/或“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物；
(3)任选地将第一混合物与过量IgE混合，得到第二混合物，所述第二混合物中含有“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物；
(4)将上一步骤中的所述第一混合物或第二混合物中的“第一抗体-sFcεRIα-IgE”三元复合物与带有可检测标记的第二抗体混合，形成“第一抗体-sFcεRIα-IgE-第二抗体”四元复合物；
(5)检测所述四元复合物的有无和/或浓度。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一抗体为一种或多种选自下组的形式：
(i)未与任何物质结合或未修饰的形式；
(ii)与可检测标记偶联；
(iii)与固相载体偶联。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微球。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述微球为羧基基团修饰表面的微球。
12.一种检测sFcεRIα的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
(a)第一容器，所述第一容器中含有第一抗体，所述第一抗体为权利要求1所述的抗体。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有选自下组：
(b)第二容器，所述第二容器中含有第二抗体；和/或
(c)第三容器，所述第三容器中含有IgE。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为PE标记的抗人IgE单克隆抗体。
15.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求4所述的偶联物。
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