CN104212860A - 一种体外表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外重组表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法。本发明方法是通过大肠杆菌融合表达人IgE高亲和力受体蛋白，再使用蛋白酶切，亲和层析，凝胶层析和离子交换层析的方法纯化得到纯净的人IgE高亲和力受体蛋白。使用本发明方法使得人IgE高亲和力受体蛋白可以在体外实现大量的可溶性表达，大大降低了IgE高亲和力受体蛋白生产成本和生产难度。

Description

一种体外表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种体外表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法。

背景技术

慢性荨麻疹是皮肤科常见疾病之一，具有病因复杂，症状反复，病程长的特点，大部分患者找不到明确病因，而被认为是“特发性”，大约40%病程可超过10年，虽然不威胁生命，但是其带来的痛苦和烦恼及对工作和社会生活的影响甚至不亚于心脏疾患。深圳市每年发病人数超过1万人。对于相当一部分患者常规的抗过敏治疗（如抗组胺药物）往往不能奏效，这类患者属于自身免疫性慢性荨麻疹，血清中存在抗FcεR Iα（IgE受体）自身抗体或（和）抗IgE自身抗体，发病以自身免疫机制为基础。这些自身抗体可与肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面的IgE受体FcεR的α链结合，并起到持续的炎症刺激作用，导致补体活化、患者肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺。此类患者在规律使用抗过敏治疗3个月后无效改用免疫抑制治疗常常可获得一定疗效，但具有费时的缺点，患者症状缓解慢，痛苦大。

现有的自体血清皮肤试验（autologous serum skin test, ASST）国际上称为Greaves试验，是筛选自身免疫性荨麻疹的临床应用检测方法。通常抽取患者外周血3ml，常温下离心分离血清，注入该被抽血者的前臂真皮内，同时，用等量生理盐水注入对侧真皮内作为对照。30分钟后观察注射处风团大小以进行判断。但是该方法在临床实施起来具有一定的难度，难以获得患者的配合。

利用抗原抗体反应，是一种很好的新方法来检测体内IgE受体蛋白自身抗体数量的方法，但此方法的前提是有高纯度大量的IgE受体蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外重组表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

通过体外重组，借由大肠杆菌表达IgE高亲和力受体蛋白，而后使用亲和层析、凝胶层析和离子交换层析的方法分离纯化IgE高亲和力受体蛋白，进而得到纯IgE高亲和力受体蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将使得人IgE高亲和力受体蛋白可以通过大肠杆菌实现可溶性表达，大大降低了IgE高亲和力受体蛋白生产成本和生产难度。

附图说明

图1 IgE高亲和力受体PCR产物，其中fl为IgE高亲和力受体蛋白cDNA的PCR产物，M为marker；

图2载体酶切图，其中fl为装入IgE高亲和力受体蛋白cDNA的质粒酶切结果，M为marker；

图3为IgE高亲和力受体蛋白最终纯化结果，其中fl为IgE高亲和力受体蛋白，M为marker。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

1. 将已知的IgE高亲和力受体蛋白对应的cDNA序列（SEQ ID NO:1）PCR扩增后（图1），整合进大肠杆菌载体PET32M中（图2），将构建成的载体转化至大肠杆菌BL21。

2. 将菌体置于37℃，200rad/min的摇床中培养至OD₆₀₀在0.6-0.8为止，加入IPTG，使菌液中IPTG的浓度达到0.2mmol/L ，并置于37℃，200rad/min的摇床中培养16h。

3. 离心4000g，20min收取菌体后，悬置于少量含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液中。

4. 超声破碎菌体后，离心18000g，20min，收取上清。

5. 使用亲和层析纯化蛋白，结合液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，5mM咪唑，清洗液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，20mM，洗脱液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，200mM。

6. 使用离子交换纯化蛋白，低盐溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，高盐溶液为50mM Tris-HCl，1M NaCl。

7. 使用EK酶酶切蛋白，酶切溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl。

8. 使用凝胶层析纯化蛋白，溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl。图3中可见纯化后TARC/CCL17蛋白纯度极高，在95%以上。

申请人：深圳北京大学香港科技大学医学中心

发明名称：一种体外表达人IgE高亲和力受体蛋白的方法

 

SEQ ID NO:1

名称：IgE高亲和力受体

序列：

gtccctcagaaacctaaggtctccttgaaccctccatggaatagaatatttaaaggagagaatgtgactcttacatgtaatgggaacaatttctttgaagtcagttccaccaaatggttccacaatggcagcctttcagaagagacaaattcaagtttgaatattgtgaatgccaaatttgaagacagtggagaatacaaatgtcagcaccaacaagttaatgagagtgaacctgtgtacctggaagtcttcagtgactggctgctccttcaggcctctgctgaggtggtgatggagggccagcccctcttcctcaggtgccatggttggaggaactgggatgtgtacaaggtgatctattataaggatggtgaagctctcaagtactggtatgagaaccacaacatctccattacaaatgccacagttgaagacagtggaacctactactgtacgggcaaagtgtggcagctggactatgagtctgagcccctcaacattactgtaataaaagctccgcgtgagaag

Claims (1)

1.一种体外重组表达人IgE高亲和力受体（FcεRIα）蛋白的方法，其特征在于使用大肠杆菌克隆并表达人IgE高亲和力受体蛋白，经超声破碎菌后采用凝胶层析和离子交换层析的方法纯化，并最终得到纯人IgE高亲和力受体蛋白。