CN115417929A - 一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及蛋白质分离纯化的技术领域，具体公开了一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法。一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，包括以下步骤：离心脱脂：将牛初乳离心脱脂，接着将中间层过滤，得到初乳乳清；硫酸铵盐析：将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，静置，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C；纯化：将沉淀C凝胶柱脱盐，超滤浓缩，柱层析分离，得到牛初乳免疫球蛋白。

Description

一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法

技术领域

本申请涉及蛋白质分离纯化的技术领域，尤其是涉及一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法。

背景技术

牛初乳一般是指奶牛分娩后7天、特别是3天内所分泌的乳汁。相对于牛初乳而言，在其后300多天内所分泌的乳汁称为常乳或牛奶。牛初乳不但含有蛋白质、脂肪、乳糖、脂肪酸、氨基酸和矿物质等常乳中的营养物质，还富含多种生理活性因子，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、生长因子、细胞因子、乳过氧化氢酶和溶菌酶等。其中，免疫球蛋白是最重要的一类免疫因子，牛初乳中的免疫球蛋白主要是IgG、IgM和分泌型IgA，其中分泌型IgA又称为SIgA。

SIgA是60年代初在外分泌液中发现的一种主要免疫抗体，主要存在于乳汁、胃肠道和呼吸道等外分泌液中，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等抵御细菌和病毒等病原菌入侵机体的第一道免疫屏障,是人体粘膜免疫的最重要抗体。人体粘膜表面积约为400m²左右，是机体内环境与外界隔绝的主要屏障，粘膜接触大量种类繁多的病原体，它也是病原微生物人侵机体的门户。机体95％以上的感染发生在粘膜或经粘膜侵入机体，当前对人类生命和健康威胁极大和难以防治的传染病，如AIDS、流感、结核、腹泻等，都是由于黏膜损伤及黏膜免疫功能的紊乱等因素引起的。SIgA是黏膜分泌的最重要的体液免疫分子，它占黏膜免疫球蛋白总量的80％，是最重要的粘膜保护抗体，在呼吸道、肠胃道等的黏膜抗感染中发挥着重要作用。

IgA有血清型和分泌型两种。血清型主要是IgA单体，分泌型SIgA是由两个IgA单体组成，单体间通过J链和分泌片连接而成，它分子质量约为

390kDa，为了与血清IgA单体相区别而被命名为SIgA。分泌片不仅能增加SIgA的稳定性，还能使SlgA具有抵抗分泌液中水解酶的作用，使其不被呼吸道和消化道的蛋白酶、胃酸、消化酶等降解，使SIgA在肠胃道发挥着强有力的抗感染作用。研究发现SIgA可阻断禽流感病毒的附着，而单链IgA和IgG则无该作用。

SIgA分布在黏膜的表面，是黏膜表面重要的抗病毒、抗病原微生物和抗毒素的生物活性成分，是机体抗感染的第一道重要的免疫防御屏障。SlgA具有免疫屏障和免疫清除功能，它能封闭细菌表面与肠上皮细胞结合的特异性位点，阻挡这些病原体和毒素等对粘膜上皮的接触，阻止它们在消化道、呼吸道等粘膜上皮表面的定居和入侵，起到保护呼吸道和消化道作用。同时，SlgA在黏膜表面能特异性地与病毒、毒素及病原菌结合，使其丧失黏附能力，从而阻止其侵入机体。它还能与病毒、细菌和微生物病原菌等抗原形成免疫复合体，这种免疫复合体能被黏膜屏障阻隔或通过痰液、粪便等分泌作用排出体外，保护机体的健康，而lgG和单体lgA不能形成免疫复合体，从而无法起到清除病原菌的作用。SIgA能阻止肠聚集型大肠杆菌黏附于细胞，预防新生儿持续性腹泻的发生。母乳喂养婴幼儿的肠胃炎、腹泻、中耳炎、新生儿败血症、过敏等发病率明显下降，归因于初乳中大量SIgA所起的重要作用。SIgA抗感染的保护作用已被大量的医学临床和研究实验所证实，在预防呼吸道和消化道疾病方面，国内外已有许多的临床应用和研究报道，在新西兰、澳大利亚等国的乳品企业已经将牛初乳SIgA用于婴幼儿食品及保健品中，在我国牛初乳SIgA的产品尚处在研究和开发阶段。

与普通的非分泌型抗体相比，SIgA直接局部用于呼吸道、消化道的免疫，使用方便，使用剂量小，不需进入血液，非常适合在特定条件下的紧急生产和制备。与其它免疫球蛋白不同，SIgA不活化补体，因此不引起炎症和过敏反应,而是直接阻止相应病原粘附于上皮, 达到局部抗感染作用。而且，SIgA具有很高的稳定性，其在黏膜表面的半衰期为IgG的3倍，其在人体外分泌道中的保护作用可以持续4个月以上。因此，研制高效、无毒的SLgA 制剂，能有效的中和病毒，防止病毒和细菌粘附，为预防和治疗由病毒和细菌等病原菌引起的呼吸道和消化道等疾病，开辟一条非抗生素的新途径。

牛初乳和人初乳中免疫球蛋白种类最大的差别在于SLgA的含量，人初乳中以SLgA为主，它占了总Ig的90％以上，SIgA的平均含量约为6-40mg/ml。而牛初乳中LgG占了总 Ig的80-90％，SLgA所占比例约5％左右，通常牛初乳中SIgA的含量约为3.2-6.2mg/ml，是常乳的50-100倍。因而，有学者认为在牛初乳中添加SLgA，提高其中的SLgA含量，可使其母乳化。目前国内外还没有来源于牛初乳的高纯的SIgA的销售信息。可能是由于相对于人类初乳，牛初乳中的SIgA含量非常低，同时牛初乳含有大量的与SIgA理化性质相似的 lgG二聚体，使得到高纯的SIgA的制备非常困难，而且，牛初乳的化学成分远比牛血清复杂的多，使得SIgA的纯化更加困难。所以，目前国内外还只有来源于牛血清高纯度的LgG 和来源于人初乳高纯度的SLgA的商品，而没有来源于牛初乳的高纯的SIgA的销售信息可查。

从牛初乳中制备高纯度SIgA的难点是如何去除大量的与SIgA性质相近的lgG二聚体，提高纯度。至今SIgA的纯化方法主要有离子交换法、分子筛法，其后又出现了亲和色谱法、嗜硫色谱法、超滤法和酶解法等，但由于SIgA结构的复杂性，很难采用一种方法将其纯化，从而制备SIgA都是采用多种纯化方法相结合，虽然可以将SIgA提取出，但是得到产品的纯度为90％左右。

发明内容

为了提高制得免疫球蛋白产品的纯度，本申请提供一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法。

本申请提供的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，采用如下的技术方案：

一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，包括以下步骤：

离心脱脂：将牛初乳离心脱脂，接着将中间层过滤，得到初乳乳清；

硫酸铵盐析：将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，静置，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C；纯化：将沉淀C凝胶柱脱盐，超滤浓缩，柱层析分离，得到牛初乳免疫球蛋白。

通过采用上述技术方案，先将牛初乳离心脱脂，再将中间层过滤，去除底部细胞沉淀物和上部脂肪层，得到初乳乳清；接着对初乳乳清进行三次盐析，得到沉淀C，最后对沉淀C进行纯化，得到纯度较高的免疫球蛋白。

在一个具体的可实施方案中，所述离心脱脂步骤中，将牛初乳离心脱脂，接着将中间层过滤，得到滤液；向滤液中加入凝乳酶，搅拌均匀，在30-40℃下恒温凝乳，接着离心，将上层清夜过滤，得到初乳乳清。

通过采用上述技术方案，向滤液中加入凝乳酶，便于初乳乳清的形成，从而提高了制得免疫球蛋白的纯度。

在一个具体的可实施方案中，所述凝乳酶与所述滤液的重量比为1：(300-350)。

通过采用上述技术方案，本申请中进一步限定了凝乳酶与滤液的配比，从而进一步提高了制得免疫球蛋白的纯度。

在一个具体的可实施方案中，所述硫酸铵盐析步骤中，将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45％-55％，静置，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

通过采用上述技术方案，在第一次加入饱和硫酸铵溶液时，限定了混合液的饱和度，从而进一步提高了制得免疫球蛋白的纯度。

在一个具体的可实施方案中，所述硫酸铵盐析步骤中，将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45％-55％，在0-6℃下静置3-18h，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

在一个具体的可实施方案中，所述初乳乳清与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1：(0.8- 1.2)。

通过采用上述技术方案，本申请中进一步限定了初乳乳清与磷酸盐缓冲液的配比，提高了免疫球蛋白的提取效果。

在一个具体的可实施方案中，所述硫酸铵盐析步骤中，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35％-45％，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

在一个具体的可实施方案中，所述硫酸铵盐析步骤中，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，使得上层清夜B的饱和度为30％-40％，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

通过采用上述技术方案，本申请中进一步限定了后两次加入饱和硫酸铵溶液时，混合液的饱和度，从而进一步提高了制得免疫球蛋白的纯度。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.本申请中先将牛初乳离心脱脂，再将中间层过滤，去除底部细胞沉淀物和上部脂肪层，得到初乳乳清；接着对初乳乳清进行三次盐析，得到沉淀C，最后对沉淀C进行纯化，得到纯度较高的免疫球蛋白；

2.本申请中向滤液中加入凝乳酶，便于初乳乳清的形成，从而提高了制得免疫球蛋白的纯度； 3.本申请中在第一次加入饱和硫酸铵溶液时，限定了混合液的饱和度，从而进一步提高了制得免疫球蛋白的纯度。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例中所有原料均可通过市售获得。其中凝乳酶由泰安市江舟生物科技有限公司提供。

实施例

实施例1

实施例1提供了一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，包括以下步骤：

离心脱脂：将牛初乳加入离心机中，在4℃，4000r/min的条件下，离心30min，去除底部沉淀物和上部脂肪层，得到中间层，将中间层用8层纱布过滤，得到初乳乳清；

硫酸铵盐析：用生理盐水对初乳乳清进行稀释，使得初乳乳清的浓度变为原来的1/2，然后加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45％，在4℃下静置6h，接着在4℃，4000r/min的条件下，离心15min，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，使得沉淀A溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35％，在4℃下静置6h，在4℃，4000r/min的条件下，离心15min，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，使得上层清夜B的饱和度为30％，在4℃， 4000r/min的条件下，离心15min，去除上层清夜C，得到沉淀C；其中饱和硫酸铵溶液的 pH＝7，磷酸盐缓冲液的pH＝7.4，且初乳乳清与磷酸盐缓冲液的体积比为1：0.6。

纯化：将沉淀C用磷酸盐缓冲液充分溶解，在10000r/min下，离心10min，取上层清液加到葡聚糖凝胶柱中脱盐，用PBS缓冲液洗脱，收集流出的含SIgA的蛋白峰；将含 SIgA的蛋白峰用截留分子量为10万kDa的超滤膜包进行超滤浓缩，并加入PBS缓冲液进行补充，且加入的PBS缓冲液为葡聚糖凝胶柱中混合液体积的8倍，超滤浓缩至25ml体积结束，得到超滤浓缩液；向超滤浓缩液中加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35％， 4℃下静置8h，然后在10000r/min下离心10min，将沉淀物用PBS缓冲液充分溶解，接着在 10000r/min下离心10min，将上层清液加到聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱中脱盐，用PBS缓冲液洗脱，每管收集4ml，流速控制0.8ml/min，收集两次流出的蛋白峰，将两次蛋白峰合并，并结合缓冲液透析平衡；得到透析液；将透析液以1ml/min的速度加到琼脂糖凝胶柱中，收集两次穿透峰，将两次穿透峰合并后，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35％， 4℃下静置12h，接着在10000r/min下离心10min后，向沉淀中加入PBS缓冲液，使得沉淀溶解，再加入到超敏葡琼凝胶柱中，以1ml/min的速度进行洗脱，收集第二个洗脱峰，即为牛初乳免疫球蛋白。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于，在离心脱脂步骤中，将牛初乳加入离心机中，在4℃， 4000r/min的条件下，离心30min，去除底部沉淀物和上部脂肪层，得到中间层，将中间层用8层纱布过滤，得到滤液，向滤液中加入凝乳酶，搅拌均匀，在35℃下恒温凝乳，接着在4℃，4000r/min的条件下离心30min，将上层清夜在用纱布过滤，得到初乳乳清；其中凝乳酶与滤液的重量比为1：275；其余步骤与实施例1相一致。

实施例3

实施例3与实施例2的区别在于，在离心脱脂步骤中，凝乳酶与滤液的重量比为1：300；其余步骤与实施例2相一致。

实施例4

实施例4与实施例2的区别在于，在离心脱脂步骤中，凝乳酶与滤液的重量比为1：325；其余步骤与实施例2相一致。

实施例5

实施例5与实施例2的区别在于，在离心脱脂步骤中，凝乳酶与滤液的重量比为1：350；其余步骤与实施例2相一致。

实施例6

实施例6与实施例2的区别在于，在离心脱脂步骤中，凝乳酶与滤液的重量比为1：375；其余步骤与实施例2相一致。

实施例7

实施例7与实施例4的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，用生理盐水对初乳乳清进行稀释，使得初乳乳清的浓度变为原来的1/2，然后加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为50％；其余步骤与实施例4相一致。

实施例8

实施例8与实施例4的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，用生理盐水对初乳乳清进行稀释，使得初乳乳清的浓度变为原来的1/2，然后加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为55％；其余步骤与实施例4相一致。

实施例9

实施例9与实施例7的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，初乳乳清与磷酸盐缓冲液的体积比为1：0.8，其余步骤与实施例7相一致。

实施例10

实施例10与实施例7的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，初乳乳清与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1，其余步骤与实施例7相一致。

实施例11

实施例11与实施例7的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，初乳乳清与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1.2，其余步骤与实施例7相一致。

实施例12

实施例12与实施例7的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，初乳乳清与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1.4，其余步骤与实施例7相一致。

实施例13

实施例13与实施例10的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，使得沉淀A溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为40％，其余步骤与实施例10相一致。

实施例14

实施例14与实施例10的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，使得沉淀A溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为45％，其余步骤与实施例10相一致。

实施例15

实施例15与实施例13的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，使得上层清夜B的饱和度为35％，其余步骤与实施例13相一致。

实施例16

实施例16与实施例13的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，使得上层清夜B的饱和度为40％，其余步骤与实施例13相一致。

对比例

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于，在硫酸铵盐析步骤中，用生理盐水对初乳乳清进行稀释，使得初乳乳清的浓度变为原来的1/2，然后加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45％，在4℃下静置6h，接着在4℃，4000r/min的条件下，离心15min，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，使得沉淀A溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35％，在4℃下静置6h，在4℃， 4000r/min的条件下，离心15min，去除上层清液B，得到沉淀B，直接对沉淀B进行纯化，其余步骤与实施例1相一致。

性能检测试验纯度：利用高效液相色谱法对各实施例中的牛初乳免疫球蛋白进行检测，测得SIgA的含量。

表1牛初乳免疫球蛋白的性能检测结果

结合实施例1和对比例1，实施例1中牛初乳免疫球蛋白的纯度远高于对比例1，可见在提取SIgA时，对初乳乳清进行三次盐析，提高了制得牛初乳免疫球蛋白的纯度。

结合实施例1和实施例2，实施例2中牛初乳免疫球蛋白的纯度高于实施例1，可见在离心脱脂步骤中，向滤液中加入凝乳酶，便于初乳乳清的形成，从而提高了制得免疫球蛋白的纯度。

结合实施例2-6，实施例3-5中牛初乳免疫球蛋白的纯度较高，可见在离心脱脂步骤中，向滤液中加入凝乳酶，凝乳酶与滤液的最佳配比为1：(300-350)，制得免疫球蛋白的纯度较高。

结合实施例4、实施例7和实施例8，实施例7中牛初乳免疫球蛋白的纯度最高，可见在硫酸铵盐析步骤中，第一次加入饱和硫酸铵溶液，提高混合液的饱和度，制得免疫球蛋白的纯度呈现先上升后下降的趋势。

结合实施例7和实施例9-12，实施例9-11中牛初乳免疫球蛋白的纯度较高，可见在硫酸铵盐析步骤中，加入磷酸盐缓冲液溶解沉淀A，初乳乳清与磷酸盐缓冲液的最佳配比为1：(0.8-1.2)。

结合实施例10、实施例13和实施例14，实施例13中牛初乳免疫球蛋白的纯度最高，可见在硫酸铵盐析步骤中，第二次加入饱和硫酸铵溶液，提高混合液的饱和度，制得免疫球蛋白的纯度呈现先上升后下降的趋势。

结合实施例13、实施例15和实施例16，实施例15中牛初乳免疫球蛋白的纯度最高，可见在硫酸铵盐析步骤中，第三次加入饱和硫酸铵溶液，提高混合液的饱和度，制得免疫球蛋白的纯度呈现先上升后下降的趋势。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

离心脱脂：将牛初乳离心脱脂，接着将中间层过滤，得到初乳乳清；

硫酸铵盐析：将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，静置，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C；

纯化：将沉淀C凝胶柱脱盐，超滤浓缩，柱层析分离，得到牛初乳免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述离心脱脂步骤中，将牛初乳离心脱脂，接着将中间层过滤，得到滤液；向滤液中加入凝乳酶，搅拌均匀，在30-40℃下恒温凝乳，接着离心，将上层清夜过滤，得到初乳乳清。

3.根据权利要求2所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述凝乳酶与所述滤液的重量比为1：（300-350）。

4.根据权利要求1所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述硫酸铵盐析步骤中，将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45%-55%，静置，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

5.根据权利要求4所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述硫酸铵盐析步骤中，将初乳乳清稀释，然后加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，得到混合液，且使得混合液的饱和度为45%-55%，在0-6℃下静置3-18h，离心，去除上层清液A，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

6.根据权利要求5所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述初乳乳清与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1：（0.8-1.2）。

7.根据权利要求6所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述硫酸铵盐析步骤中，向沉淀A中加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，再加入饱和硫酸铵溶液，使得混合液的饱和度为35%-45%，静置，离心，去除沉淀B，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。

8.根据权利要求7所述的一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法，其特征在于：所述硫酸铵盐析步骤中，向上层清液B中加入饱和硫酸铵溶液，使得上层清夜B的饱和度为30%-40%，离心，去除上层清夜C，得到沉淀C。