KR20050109979A - 항로타바이러스 감염 조성물 및 그의 제법 - Google Patents

Abstract

유청의 정밀여과 보유물, 원심분리 처리물 및/또는 유안침전 처리물이 로타바이러스 감염 저해활성을 갖는 것을 발견하였다.

Description

항로타바이러스 감염 조성물 및 그의 제법{Composition against infection with rotavirus and process for producing the same}

본 발명은 항로타비아러스 감염 조성물과 그의 제법 및 상기 항로타바이러스 감염 조성물의 유효량을 함유시킨 항로타바이러스 감염 식품 조성물에 관한 것이다.

인간 로타바이러스(rotavirus)를 원인으로 하는 영유아 동계 설사증은, 주로 2세 이하의 유아(幼兒)에, 발열, 구토, 설사 및 탈수증상을 일으키는 중증의 설사증 질환이다. 일본에서는 회백색 변의 성상(性狀)으로부터 흰설사라고도 불렸지만, 인간 로타바이러스 감염증인 것이 명확해지고 있다. 미합중국에서는 연간 5세 이하의 어린이 350만명의 설사증이 로타바이러스 감염증으로 진단되고, 5만 5천명이 입원하여, 20명이 사망하고 있다. 전세계에서는, 주로 발전도상국에 있어서 연간 약 60만명의 영유아가 사망하고 있다. 선진국에서의 역학조사로부터, 위생상태의 개선은 로타바이러스의 유병율(有病率)을 감소시킬 수 없는 것으로 알려져, 그 대책의 하나로서 세계적인 로타바이러스 백신 개발이 진행되고 있다.

RRV-TV(rhesus rotavirus tetravalent) 백신은, 선진국, 발전도상국 양쪽에서 로타바이러스에 의한 중증 설사증의 예방에 높은 효과를 나타내, 1998년 8월, 미국 식품의약국은 RRV-TV 백신을 세계에서 처음으로 로타바이러스 백신으로서 인가하였다. 그러나, 장중적증(腸重積症)이 부반응인 것이 미국 질병방역센터로부터 보고되어, RRV-TV 백신의 투여는 중지되었다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조).

한편, 로타바이러스 감염을 저해하는 식품성분 또는 조성물로서, 예를 들면, 초유(初乳) 중의 면역글로불린 및 그의 조성물(예를 들면, 특허문헌 1 참조), 소 κ-카세인(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 젖뮤신(milk mucin)(예를 들면, 비특허문헌 2 참조) 및 버터밀크 유래 폴리펩티드(예를 들면, 비특허문헌 3 참조) 등이 제안되어 있지만 그 평가는 아직으로, 항로타바이러스 감염 효과를 갖는 새로운 항로타바이러스 감염 조성물 및 상기 조성물을 함유시킨 식품 조성물의 등장이 요망되고 있다.

[비특허문헌 1]

이시다 신이치 외, 「로타바이러스 백신」소아과진료 Vol 63, 2000년, p.1045-1049

[비특허문헌 2]

Yolken, R.Y. et al., 「Human Milk Mucin Inhibits Rotavirus Replication and Prevents Experimental Gastroenteritis」J Clin Invest, Vol 90, 1992년, p.1984-1991

[비특허문헌 3]

마쯔모토 미쯔하루 외, 「버터밀크 유래 항 소 로타바이러스 폴리펩티드」일축회보, Vol 73, 2002년, p.49-56

[특허문헌 1]

일본국 특허공개 제(평)3-72432

[특허문헌 2]

일본국 특허공표 제(평)10-505828

발명의 개시

본 발명은 로타바이러스 감염 방어효과를 갖는 신규한 식품 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은 상기 조성물의 유효량을 함유시킨 식품을 제공하는 것을 과제로 한다. 더욱이 본 발명은 상기 조성물의 유효량을 함유시킨 가축사료를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자 등은, 상기 과제를 해결하기 위해 검토한 결과, 유청(whey)의 정밀여과(MF: microfiltration)처리에 의해 얻어지는 보유물(保持物), 원심분리처리(centrifuging)에 의해 얻어지는 분획물(分劃物) 및/또는 유안침전(ammonium sulfate precipitation)(황산암모늄 분획법, 황산암모늄 염석법, 또는 황산암모늄 침전법이라고도 한다)처리에 의해 얻어지는 분획물에 강력한 로타바이러스 감염 저해활성을 발견하였다. 그리고 이 보유물 또는 분획물을 가열처리해도 로타바이러스 감염 저해활성이 손실되지 않는 것을 발견하였다. 즉 본 발명은,

(1) 유청의 정밀여과 보유액, 원심분리 처리액 및/또는 유안침전처리 분획물 또는 그의 건조물로서, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 조성물,

(2) (1)에 있어서, 정밀여과막의 공경(孔徑)이 0.004~1.4 ㎛의 범위에 있는 조성물,

(3) (1)에 있어서, 원심분리처리의 중력이 300~30,000 g의 범위에 있는 조성물,

(4) (1)에 있어서, 유안침전의 포화도(飽和度)가 30~100%의 범위에 있는 조성물,

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 함유하는, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 식품,

(6) (5)에 있어서, 식품이 육아용 조제분유, 고령자용 식품, 보건기능식품 및 병자용 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품,

(7) (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 함유하는, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 가축사료,

(8) (5) 또는 (6)의 식품을 제조하기 위한 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 조성물의 사용,

(9) (7)의 가축사료를 제조하기 위한 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 조성물의 사용,

으로 된다.

유청은 스위트 유청(sweet whey) 및 산 유청(acid whey)으로 나뉜다. 스위트 유청은 숙성형 치즈의 부산물로, pH 5.9~6.3으로 감미(甘味)가 있다. 한편, 산 유청은 비숙성, 후레쉬형 치즈의 제조에서 얻어지고, 통상 pH 4.4~4.6으로 산미(酸味)가 있다. 또한, 카세인 제조시의 유청도 산 유청이다. 스위트 유청 및 산 유청의 일반적 조성을 표 1에 나타낸다(Milk Science Vol. 51, No. 1, 2002). 본 발명은 스위트 유청 및 산 유청을 포함한다.

본 발명에서 사용하는 유청은 소의 각 비유기(泌乳期)의 젖, 또는 이들의 농축물 또는 건조물(이하 이들을 통틀어 젖으로 기재하는 경우가 있다)을 원료로 하여, 통상적인 방법에 의해 조제한 것이다. 더욱이, 본 발명에 있어서는 인간 및 소 이외의 다른 포유동물의 젖을 사용하는 것도 가능하다. 일반적으로 유청은, 원유를 청정화하여, 72~75℃에서 15초간 가열살균하는 HTST(High Temperature Short Time)살균 및 120~150℃에서 1~3초간 가열살균하는 UHT(Ultra High Temperature)살균 등의 살균처리를 행한 후, 크게 나누면 이하의 두 가지 방법으로 제조할 수 있다. 하나는 스위트 유청의 제조법으로, 살균한 젖, 또는 살균한 젖을 약 30~60℃로 가온하여 수백 G 이상의 중력을 가하여 지방을 크림으로서 탈지한 탈지유에 각종 렌넷(rennet)(동물, 미생물 및 식물 기원)을 첨가하는 방법이다. 즉, 경질(硬質), 반경질(半硬質) 또는 연질(軟質) 치즈 및 렌넷 카세인을 제조할 때에 유청을 용액으로서 배출하는 방법이다. 다른 하나는 산 유청의 제조법으로, 상술한 방법과 동일한 방법으로 얻은 탈지유에 산(초산이나 유산(乳酸) 등의 유기산 또는 염산이나 황산 등의 무기산)을 첨가하는 방법이다. 즉, 탈지유의 pH를 산으로 4.6으로 조정하고, 등전점(等電點) 침전한 카세인을 여과나 원심분리 등으로 제거함으로써 산 유청이 얻어진다. 더욱이 이들 이외에도 탈지유에 유산균을 단독으로, 또는 염화칼슘과 산 양자를 첨가하고, 생성되는 카세인의 침전을 원심분리 등으로 제거한 상청(上淸)도 산 유청으로서 이용할 수 있다.

스위트 유청에는 전체 고형분 중 약 8%의 지질이 포함된다(표 1). 이 지질은, WPC의 풍미를 손상시키는 것이 지적되어 있다. 또한, 유청의 지질은 한외여과막(UF), 역침투막(RO) 등의 막처리 효율과도 관계가 있어, 유청 중에 잔류지질이 많을수록 막분리 중의 유속속도(流束速度)가 저하된다.

본 발명에서는, 유청을 원심분리/청정화하여, pH를 중성 부근(6.8~7.2)으로 조절한 후, MF막 처리한다. 더욱이 보유액에 가수→MF막 처리라고 하는 공정을 복수회(통상 3회) 반복한 후, 보유액을 통상적인 방법에 의해 건조한다.

MF처리는 눈막힘이 발생하기 쉽기 때문에 실용화는 늦었다. 1980년 중반에 ALFA-LAVAL Filtration System사(현 Tetra Pak사)에 의해 우유의 막 제균(除菌) 시스템 「Bactocatch」가 개발되어 실용화되었다.

MF막의 사용방법에는 막면(膜面)에 평행하게 시료를 흘리는 방식(크로스 플로우 여과: tangential flow filtration 또는 cross flow filtration)과 막면에 수직으로 시료를 누르는 방식(전여과: dead end filtration)이 있어 유업(乳業)에서는 유제품의 처리에 크로스 플로우 여과가, 무균 탱크용 공기제균 등에는 전여과가 사용되고 있다.

Bactocatch는 크로스 플로우 MF(CFMF) 여과방식으로, MF막(프랑스 SCT사제 Membralox)은 알루미나 세라믹스제로 카세인 미셀(casein micelle)을 투과하여 세균을 저지하기 위해 공경은 1.4 ㎛를 채용하고 있다. Bactocatch의 최대 특징은, 투과 유속(流束)을 제어하여, 모듈 전체의 막간차압(膜間差壓)을 0.04 MPa(0.1 MPa≒1 기압)정도의 균일 막간차압(UTP: uniform transmembrane pressure)으로 운전하는 것을 가능하게 한 점이다. 이것에 의해 눈막힘을 방지하는 것이 가능해졌다. 그 결과, 탈지유에서는, 제균율 99.9% 이상을 유지하면서, 온도 50℃에서 500 L/H의 투과 유속이 7시간 안정하게 얻어진다(Olsen, N. et al.: Milchwissenschaft, 44(8): p. 476, 1989). Bactocatch 시스템으로 제균한 우유를 원료로 함으로써 ESL(Extended shelf life) 우유의 제조가 가능해졌다. 또한, 치즈 원료의 포자(胞子) 제거에도 이 Bactocatch 시스템이 이용되고 있다. 본 발명에 있어서도, 유청의 MF처리에, 이 Bactocatch 시스템을 포함하는 크로스 플로우 여과방식 장치의 이용을 생각할 수 있다. 더욱이 유청의 MF처리에 전여과방식의 장치를 사용하는 것도 가능하다. 또한 MF막에는 평막형(平膜型) 및 중공사형(中空絲型) 등의 형상의 차이, 수지막 및 세라믹막 등의 재질의 차이가 있어, 이들을 적절히 사용할 수 있다.

유청 중의 지방은 원심분리로는 완전히 제거할 수 없어, 0.05% 정도 잔류한다. 이 유청으로부터 단백질 함량 80%의 WPC 분말을 제조하면 지방 함량은 5~8%에 달한다(J. L. Maubois: Bulletin of the IDF 320: 37-40, 1997). 이 지질은 WPC의 기능성이나 풍미를 손상시키는 원인이 되는 것이 지적되어 있다(C. V. Mo-rr and E. Y. W. Ha: CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 33: p.431, 1993; J. N. de Wit, G. Klarenbeek and M. Adamse: Neth. Milk Dairy J., 40, p.41, 1986; M. T. Patel and A. Kilara: J. Dairy Sci., 73: p.2731, 1990). 또한, 유청의 지질은 한외여과(UF), 역침투(RO) 등의 막처리 효과와도 관련이 있어, 유청 중에 잔류지질이 많을수록 막분리 중의 유속속도는 저하된다(J. N. de Wit and R. de Boer: Neth. Milk Dairy J., 29, p.198, 1975). 이 지방의 주체는 인지질이다. 이 지방은 유청을 0.1 ㎛의 MF로 처리함으로써 대부분 제거된다(P. Dejimek and B. Hallstroem: 식품막 기술간담회, 제5회 춘기 연구예회 강연요지집, p.36-45, 1993; A. Nielsen: Danish Dairy & Food Ind. Worldwide, 10: 72-73, 1996).

일반적으로 공경이 0.2~0.45 ㎛ 정도의 MF막을 사용함으로써 투과액을 무균으로 할 수 있다. 세균의 크기는 지방구(脂肪球)(지방구의 크기는 직경 0.1~17 ㎛의 범위에 있고, 평균 3.4 ㎛이다)와 거의 동일하다. 일반적으로 MF막의 공경은 0.01 ㎛에서 12 ㎛이다. 본 발명에 사용하는 MF막의 공경은, 실용적으로 0.1~1.4 ㎛의 범위에 있는 것으로 생각되지만, 공경의 최적화는 당업자의 통상의 실험 중에서 확인 가능하다.

또한 보다 간편하게는 원유로부터 생크림을 분리하는 바와 같이, 특히 스위트 유청을 약 30~60℃에서 원심분리처리하여 얻어지는 유청크림을 다시 원심분리처리하여 얻어지는 수상(水相)도 MF 보유액과 동일하게 이용할 수 있다.

더욱이 상기 원심분리처리의 변법으로서, 95℃에서 30분간 가열처리한 탈지유로부터 얻어지는 산 유청, 소위 프로테오스·펩톤(proteose peptone)을 유안침전과 원심분리를 조합한 방법으로 처리하여 얻어지는 분획물도 MF 보유액과 동일하게 이용할 수 있다.

이들 유청의 MF 보유액, 원심분리 처리액 및/또는 유안침전처리 분획물 또는 그의 건조물은, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 항로타바이러스 감염활성을 나타낸다. 또한, 이들을 가열해도 항로타바이러스 감염활성을 보유하고 있다. MF 보유액 또는 그의 건조물은, MF 및 UF의 조합으로 제조되는 유청단백 분리물(WPI)의 부산물로서 얻어진다. 유청의 원심분리 처리액 또는 그의 건조물은, 버터오일의 부산물로서 얻어진다. 이와 같이 하여 제조되는 유청의 MF 보유액 및 원심분리 처리액 또는 그의 건조물 중에는 인지질이 농축되어 있다.

본 발명의 조성물은 가열처리가 불가능하여 식품(특히 육아용 조제분유나 송아지의 사료)에 그 유효량을 혼합함으로써, 인간 영아, 송아지, 망아지 등에 있어서의 로타바이러스가 원인인 설사증을 예방 또는 치료하는데 유효한 것을 기대할 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효량은 최종제품에 대해 0.1~50 중량%의 범위에 있는 것으로 추정되지만, 인간 또는 가축에 의한 시험에서 결정되어야 한다.

로타바이러스는 소장 융모(絨毛)의 앞쪽 단부(端部) 약 1/3의 상피세포(上皮細胞)에서 증식한다. 감염 후, 융모는 왜소화되어, 미융모 배열의 흐트러짐이나 결락(缺落) 등의 병변을 일으킨다. 그 결과, 생리기능이 저하되고, 물의 흡수가 저해되어 설사를 일으킨다. 로타바이러스의 감염은 표적세포로의 접착으로부터 시작되어, 침입, 정착이라고 하는 다단계의 과정을 포함하고 있다.

본 발명의 유청의 MF 보유액, 원심분리 처리액 및/또는 유안침전처리 분획물 또는 그의 건조물의 항로타바이러스 감염활성은, 로타바이러스가 표적세포로 접착되는 것을 저해하는 것에 의한 것으로 추정되지만, 향후의 작용 메커니즘 해명을 필요로 한다.

로타바이러스 감염에 있어서의 식품성분의 항로타바이러스 감염효과를 검정·평가하는 방법은 다양하여, 아주 완전한 검정·평가계는 없다. 지금까지 다양한 항로타바이러스 감염효과의 검정·평가법이 보고되어 있다. 예를 들면 본 발명에서 사용한 방법 이외에, 실험동물(마우스)에 로타바이러스 및 식품성분을 투여하고, 설사의 발증 및 소화관 점막으로의 로타바이러스의 결합량을 측정하는 등의 검정·평가계를 들 수 있다(Duffy L. C. Pediatr. Res. 35: 690-695(1994)). 본 발명자는, 이들 계를 적절히 사용하여, 상기 조성물의 항로타바이러스 감염활성을 더욱 상세하게 조사하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 사용하는 젖 유래의 조성물은 오랜 식경험 속에서 안전성은 확립되어 있다. 따라서 인간에 의한 시험에서 본 발명품의 유효성 및 유효량의 확인이 가능하다.

젖 유래의 상기 조성물을 항로타바이러스 감염 조성물로서 사용하는 경우, 그 자신(액상 또는 분말상)으로, 또한, 다른 활성물질과 함께, 또는 다른 약리학적인 활성물질과 함께 사용할 수 있다. 형태는, 예를 들면 정제, 또는 피복정, 캡슐, 용액, 시럽, 유액(乳液) 또는 분산성 분말을 포함한다. 섭취량은, 연령, 신체상태 등에 의존하여 변화되지만 1일당 0.001~10 g/kg 체중, 바람직하게는 0.01~2 g/kg 체중이다.

젖 유래의 상기 조성물은, 로타바이러스 감염에 대한 방어능의 발달이 미숙한 영유아의 육아용 조제분유, 또는 로타바이러스 감염에 대한 방어능이 저하된 고령자를 위한 식품에 그 유효량을 첨가하여 항로타바이러스 감염 식품 조성물로 할 수 있다. 육아용 조제분유란, 0~12개월의 영아를 대상으로 하는 영아용 조제분유, 6~9개월 이후의 영아 및 연소유아(年少幼兒)(3세까지)를 대상으로 하는 팔로우업 밀크(follow-up milk), 출생시의 체중이 2500 g 미만의 신생아(저출생체중아)를 대상으로 하는 저출생체중아용 조제분유, 우유 알레르기나 유당부내증(乳糖不耐症) 등의 병적 상태를 갖는 아이의 치료에 사용되는 각종 치료용 밀크 등을 가리킨다. 더욱이, 상기 조성물을 보건기능식품이나 병자용 식품에 적용할 수 있다. 보건기능식품제도는, 내외의 동향, 종래부터의 특정 보건용 식품제도와의 정합성(整合性)에 입각하여, 통상의 식품 뿐 아니라 정제, 캡슐 등의 형상을 한 식품을 대상으로 하여 마련된 것으로, 특정 보건용 식품(개별허가형)과 영양기능식품(규격기준형)의 2종류의 유형으로 된다. 더욱이, 상기 조성물을 가축용 사료에 그 유효량을 첨가하여 항로타바이러스 감염 조성물로 할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 겔여과(Sephacryl S-500) 칼럼을 사용한 항로타바이러스 감염 조성물의 활성성분의 분획패턴을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 효과를 실시예를 토대로 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 구체예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 유청으로부터의 항로타바이러스 감염 조성물 및 그의 가열처리물의 조제

<재료 및 방법>

착유(搾乳)한 미가열의 원유 100 kg을 72℃에서 15초 살균하여, 통상적인 방법에 따라 모짜렐라치즈(Mozzarella cheese)를 조제하고, 생성된 유청의 pH를 6 N NaOH로 6.8로 하였다. 원심분리하여 크림획분과 미세한 카세인입자를 제거하였다. 크림획분 및 카세인을 제거한 유청을 정밀여과장치(닛폰 폴가부시키가이샤, MEMBRALOX, 공경 0.1 ㎛, 입구압 3.0 kg/㎠, 온도 25℃)로 처리 후, 보유액을 채취하였다. 얻어진 보유액에 탈염수를 첨가하고, 다시 정밀여과장치에 공급하는 조작을 3회 반복하였다. 얻어진 보유액을 스프레이 드라이법에 의해 건조하였다.

가열물의 조제는, 얻어진 분말을 증류수에 10 mg/㎖가 되도록 용해 후, 80℃에서 30분간 가열처리한 후, 통상적인 방법에 의해 동결건조함으로써 행하였다.

[실시예 2] 소 상유(normal cow milk) 유래 조성물의 인지질 함량의 측정

<재료 및 방법>

우유를 사용하여 상술한 실시예 1과 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물의 인지질 함량을 측정하였다. 맨처음에 시료 10 g에 5% NaCl 용액 50 ㎖를 가하여 용해 후, 메탄올 100 ㎖를 첨가하였다. 이어서, 클로로포름 100 ㎖를 가하여 교반 후, 정치(靜置)하고, 클로로포름층을 회수하였다. 동일한 조작을 추가로 2회 반복하였다. 얻어진 클로로포름층을 감압건고한 것을 n-헥산 30 ㎖에 용해하였다. n-헥산 포화 1% 함수(含水) 메탄올 50 ㎖를 가하여 교반 후, 정치하고, 메탄올층을 회수하였다. 동일한 조작을 추가로 2회 반복하였다. 얻어진 메탄올층을 감압건고한 것을 클로로포름:메탄올(2:1)에 용해하여, 인지질 측정용 시료를 얻었다. 얻어진 시료 중의 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 스핑고미엘린(sphingomyelin, SM) 농도를 HPLC법에 의해 측정함으로써, 시료 중의 인지질 함량을 구하였다.

<결과와 고찰>

인지질의 측정결과(중량%)는 PE 0.69%, PC 1.36%, SM 0.85%였다. 우유 중의 인지질의 함량은 0.04~0.05%인 것이 보고되어 있다(젖의 과학, 가미노가와 슈이치편, 아사쿠라서점, 1996). 따라서, 유청의 M막 보유물에는 우유 중의 인지질이 고농도로 농축되어 있는 것이 확인되었다.

[실시예 3] 소 상유 유래의 조성물 및 그의 가열처리물의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

우유를 사용하여 상술한 실시예 1과 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물, 또는 그의 가열처리물의 로타바이러스 감염 저해활성을 측정하였다.

소 상유 유래의 조성물 및 그의 가열처리물을 시료로 하여, 인간 로타바이러스 MO주(株)의 감염 저해활성을 이하와 같이 측정하였다. 10⁶ FCFU(Fluorescent Cell Focus Forming Unit)/㎖의 인간 로타바이러스 MO주 0.4 ㎖와 20 ㎍/㎖의 트립신 0.4 ㎖를 혼합하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 미리 10% 소태아혈청을 포함하는 이글배지에서 각종 농도로 희석 조제된 시료 50 ㎕(시료용액은 0.45 ㎛의 필터로 여과 멸균)를 분주(分注)한 0.5 ㎖ 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에, 조제한 바이러스용액을 각각 50 ㎕씩 가하여 37℃에서 1시간 배양하였다.

또한, 공시험용(空試驗用)으로서는 상기 시료 50 ㎕ 대신에, 10% 소태아혈청을 포함하는 이글배지 50 ㎕를 사용하였다. 이 배양액이 든 각 에펜도르프 튜브에 각각 2×10⁵/㎖의 빨간털원숭이 신장 유래 MA-104 세포를 100 ㎕ 첨가하여 혼합 후, 각 혼합액의 20 ㎕를 각각 대응하는 슬라이드글라스로 옮겨, 37℃에서 45시간 배양하였다. 이것을 아세톤으로 고정하고, 인간 로타바이러스 감염 세포수를, 1차항체로서 비둘기 로타바이러스 PO-13주의 VP6를 특이적으로 인식하는 단일클론항체 및 2차항체로서 형광표지한 염소 항토끼 IgG를 사용한 간접 형광항체법으로 검출하였다.

또한, 감염 저해활성의 평가는, 하기의 식으로부터 구해지는 값(저해율)이 50% 이상일 때, 감염 저해활성 있음으로 판단하고, 감염 저해활성이 있는 가장 낮은 시료농도를 최소 저해활성으로 하였다.

100×[1-(시료 첨가시의 감염 세포수)/(공시험의 감염 세포수)]

<결과와 고찰>

소 상유 유래의 조성물 및 그의 가열처리물의 최소 저해활성은 순서대로 33 및 35 ㎍/㎖(소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도)였다. 이 결과로부터, 상기 조성물이 항로타바이러스 감염활성을 갖는 것, 가열처리 후에도 항로타바이러스활성이 거의 변화되지 않는 것이 판명되었다. 또한, 다른 출발원료 및 방법에 의해 제조한 본 발명의 조성물에 대해서도, 거의 동일한 결과가 얻어졌다. 따라서, 소젖으로부터 정밀여과막에 의한 분리로 얻어지는 상기 조성물에는 항로타바이러스 감염활성이 존재하는 것, 상기 조성물의 항로타바이러스 감염활성은 내열성을 갖는 것이 명확해졌다.

로타바이러스의 감염은 표적세포로의 접착으로부터 시작되어, 칩입, 정착이라고 하는 다단계의 과정을 포함하고 있다. 금번, 상기 조성물을 미리 로타바이러스와 혼합한 후 표적세포와 반응시킨 바, 로타바이러스의 감염이 저해되었기 때문에, 상기 조성물의 항로타바이러스 감염활성은 표적세포로의 로타바이러스의 접착을 저해함으로써 발휘되고 있는 것이 시사되었다.

[실시예 4] 우유를 사용하여 상술한 실시예 1과 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물을, 0.5% 배합한 하기 처방의 영아용 조제분유를 조제하였다.

[실시예 5] 유청으로부터의 항로타바이러스 감염 조성물 및 그의 가열처리물의 조제

착유한 미가열의 원유 100 kg을 72℃에서 15초 살균하여, 통상적인 방법에 따라 고우다치즈(Gouda cheese)를 조제하고, 생성된 유청의 pH를 6 N NaOH로 6.8로 하였다. 동일하게 HTST 살균처리를 한 원유 100 kg으로부터 통상적인 방법에 따라 에멘탈치즈(Emmental cheese)를 조제하고, 생성된 유청의 pH를 6 N NaOH로 6.8로 하였다. 이들 유청을 혼합 후, 원심분리하여 크림획분과 미세한 카세인입자를 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 유청을 고형분이 1.7%가 되도록 물로 희석한 후 정밀여과장치(Exekia제의 세라믹필터, 공경 0.1 ㎛, 입구압 7.5 kg/㎠, 온도 50℃)로 처리 후, 고형분 8%의 보유액을 회수하였다. 얻어진 보유액은 추가로 감압농축한 후, 스프레이 드라이법에 의해 건조하였다.

가열물의 조제는, 얻어진 분말을 증류수에 1, 5 및 10 mg/㎖가 되도록 용해 후, 141℃에서 5초간 가열처리한 후, 통상적인 방법에 의해 동결건조함으로써 행하였다. 또한, 10 mg/㎖가 되도록 용해한 것에 대해서는 별도로 100℃에서 5분간 및 80℃에서 30분간 가열처리한 것을 조제하여, 통상적인 방법에 의해 동결건조하였다.

[실시예 6] 유청으로부터의 항로타바이러스 감염 조성물 및 그의 가열처리물의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 5와 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물, 또는 그의 가열처리물의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 3과 동일한 방법에 의해 측정하였다.

즉, 10⁶ FCFU(Fluorescent Cell Focus Forming Unit)/㎖의 인간 로타바이러스 MO주 0.4 ㎖와 20 ㎍/㎖의 트립신 0.4 ㎖를 혼합하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 미리 10% 소태아혈청을 포함하는 이글배지에서 각종 농도로 희석 조제된 시료 50 ㎕(시료용액은 0.45 ㎛의 필터로 여과 멸균)를 분주한 0.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에, 조제한 바이러스용액을 각각 50 ㎕씩 가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 또한, 공시험용으로서는 상기 시료 50 ㎕ 대신에, 10% 소태아혈청을 포함하는 이글배지 50 ㎕를 사용하였다. 이 배양액이 든 각 에펜도르프 튜브에 각각 2×10⁵/㎖의 빨간털원숭이 신장 유래 MA-104 세포를 100 ㎕ 첨가하여 혼합 후, 각 혼합액의 20 ㎕를 각각 대응하는 슬라이드글라스로 옮겼다. 37℃에서 45시간 배양한 후, 아세톤으로 고정하고, 인간 로타바이러스 감염 세포를 간접 형광항체법(1차항체로서 비둘기 로타바이러스 PO-13주의 VP6를 특이적으로 인식하는 단일클론항체, 2차항체로서 형광표지한 염소 항토끼 IgG 혈청을 사용)으로 검출하였다. 활성은 실시예 3과 동일하게 최소 저해농도로 표시하였다.

<결과와 고찰>

유청으로부터의 항로타바이러스 감염 조성물에 각종 식품의 제조시 살균조건인 가열처리를 가하더라도 표 3에 나타내는 바와 같이 그 활성은 거의 저하되지 않았기 때문에, 본 활성은 최종제품에 있어서도 유지될 가능성이 높은 것으로 생각되었다.

※: 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 표기하였다.

[실시예 7] 유청으로부터 각종 공경의 정밀여과막을 사용하여 조제한 항로타바이러스 감염 조성물

착유한 미가열의 원유 100 kg에 원심분리처리(8000 g, 15분간, 4℃)를 행하고, 크림을 분리하여 탈지유를 얻었다. 이 탈지유를 가온(20~25℃)하고, 0.5 N HCl을 첨가하여 pH 4.6으로 하였다. 이 상태에서 15~30분간 유지한 후, 원심분리처리(3000 g, 15분간, 4℃)를 행하고, 카세인을 분리하여 산 유청을 얻었다. 이 산 유청에 0.5 N NaOH를 첨가하여 pH 6.0으로 한 후, 각종 공경(0.1, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 0.8, 1.0 ㎛)의 정밀여과막(셀룰로오스 혼합 에스테르타입, 어드밴테크도요사제)을 사용하여 산 유청의 정밀여과처리를 실시하였다. 이 때의 처리조건은 입구압 3.0 kg/㎠, 온도 20~25℃였다. 맨처음에 산 유청을 정밀여과막으로 5배 농축하고, 이어서 농축액에 가수(加水)하면서 투석여과를 정밀여과막 투과액의 Brix값이 2% 미만으로 될 때까지 행하였다. 마지막에 얻어진 정밀여과막의 보유액을 통상적인 방법에 의해 동결건조하고, 추가로 γ선 멸균처리를 하여 시험시료로 하였다.

[실시예 8] 유청으로부터 각종 공경의 정밀여과막을 사용하여 조제한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 7과 동일한 방법에 의해 제조한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 6과 동일한 방법에 의해 측정하였다.

<결과와 고찰>

각 시료의 항로타바이러스 활성의 측정결과를 표 4에 나타내었다. 실험시료의 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 나타내었다.

그 결과, MF막의 공경이 0.8 ㎛ 이상이 되면, MF 보유물의 항로타바이러스 활성의 저하가 현저해졌다. 따라서, 항로타바이러스 감염 조성물을 유청으로부터 조제하기 위해서는, 사용하는 정밀여과막의 공경을 0.65 ㎛ 이하로 하는 것이 바람직한 것으로 생각되었다.

※: 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 표기하였다.

[실시예 9] 유청으로부터 원심분리처리로 조제한 항로타바이러스 감염 조성물

착유한 미가열의 원유 100 kg을 63℃에서 30분간 살균하여, 통상적인 방법에 따라 까망베르치즈(Camembert cheese)를 조제하고, 생성된 유청(pH 6.0)을 분리하였다. 이 유청을 가온하고, 원심분리처리(3000 g, 20분간, 40℃)를 행하여 유청크림을 얻었다. 추가로 이 유청크림을 다시 50℃로 가온하고, 원심분리처리(3000 g, 20분간, 50℃)를 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 수상부분(이하, whey cream serum으로 약칭한다)을 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료로 하였다.

[실시예 10] 유청으로부터 원심분리처리로 조제한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 9와 동일한 방법에 의해 제조한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 6과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 또한, 비교를 위해 소 락토페린(bovine lactoferrin)(DMV사)을 대조시료로서 사용하였다.

<결과와 고찰>

각 시료의 항로타바이러스 활성의 측정결과를 표 5에 나타내었다. 실험시료의 최소 저해농도는 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 나타내었다.

whey cream serum은 소 락토페린을 윗도는 강력한 항로타바이러스 활성을 나타내었다.

이상으로부터, 항로타바이러스 감염 조성물은 유청으로부터 원심분리처리만으로 조제 가능한 것이 명확해졌다.

※: 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 표기하였다.

[실시예 11] 95℃에서 30분간 가열처리한 탈지유로부터 얻어지는 유청을 유안침전과 원심분리처리하여 조제한 항로타바이러스 감염 조성물

착유한 미가열의 원유 10 kg에 원심분리처리(8000 g, 15분간, 4℃)를 행하고, 크림을 분리하여 탈지유를 얻었다. 이 탈지유를 가열처리(95℃, 30분간)하고, 0.5 N HCl을 첨가하여 pH 4.6으로 하였다. 이 상태에서 15~30분간 유지한 후, 원심분리처리(5000 g, 30분간, 4℃)를 행하고, 카세인을 분리하여 산 유청을 얻었다. 이 산 유청에 황산암모늄을 가하여 35% 포화의 상태로 하였다. 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 침전물을 제거하였다. 침전 제거한 용액에 다시 황산암모늄을 가하여 55% 포화의 상태로 하였다. 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 다시 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액에 추가로 황산암모늄을 가하여 90% 포화의 상태로 하였다. 마지막에 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 침전물을 회수하였다. 90% 포화로 얻어진 침전물은 증류수에 용해 후, 증류수에 대해 투석하고, 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료로 하였다.

[실시예 12] 95℃에서 30분간 가열처리한 탈지유로부터 얻어지는 유청을 유안침전과 원심분리처리하여 조제한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 11과 동일한 방법에 의해 제조한 항로타바이러스 감염 조성물의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 6과 동일한 방법에 의해 측정하였다.

<결과와 고찰>

90% 포화 침전물은 50 ㎍/㎖(소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도)의 최소 저해농도를 나타내었다.

95℃에서 30분간 가열처리한 탈지유로부터 얻어지는 유청, 소위 프로테오스·펩톤의 유안침전처리 획분이 항로타바이러스 활성을 갖는 것이 명확해졌다.

[실시예 13] 겔여과 칼럼과 유안을 사용한 항로타바이러스 감염 조성물의 활성성분의 분획

원유를 사용하여 상술한 실시예 5와 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물의 활성성분을 추가로 분획하였다.

실시예 5에서 보유액을 스프레이 드라이하여 얻어진 분말을 증류수에 5%가 되도록 용해 후, 95℃에서 30분간의 가열처리를 가하였다. 이 용액의 일부를 하기의 Tris-HCl 완충액에 대해 하룻밤 투석하여, 겔여과 시료로 하였다.

Sephacryl S-500 HR을 약 480 ㎖ 취하여, 수회의 디캔테이션(decantation)에 의해 용매를 Milli-Q수(초순수)로 치환하였다. 겔을 균일해지도록 교반하고, 리저버(reservoir)를 장착한 칼럼(2.6×60 ㎝)에 조용히 흘려넣은 후, 공기가 들어가지 않도록 리저버에 Milli-Q수를 채워 뚜껑을 덮었다. 칼럼을 AKTA explorer 10 C(아마샴 파마시아 바이오테크)에 접속하여, Milli-Q수를 흘려 겔을 충분히 침적(沈積)시킨 후, 리저버를 떼어내고 어댑터를 장착하였다. 이 칼럼을 pH 8.0의 0.05 M Tris-HCl 완충액(0.15 M NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 0.02% NaN₃)에 의해 평형화하였다. 상술한 시료를 칼럼에 11 ㎖ 첨가한 후 유속 1.3 ㎖/분으로 용출시켰다. 이 때, 용출액 280 nm에 있어서의 흡광도의 변화를 조사하여, 거의 그대로 지나서 오는 획분 C1을 회수하였다. 이 C1 획분을 증류수에 대해 하룻밤 투석 후, 일부는 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료로 하였다. 나머지는 실시예 11과 동일하게 유안을 사용하여 추가로 분획하였다. 즉, 이 C1 획분용액에 황산암모늄을 가하여 35% 포화의 상태로 하였다. 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 침전물을 제거하였다. 침전 제거한 용액에 다시 황산암모늄을 가하여 55% 포화의 상태로 하였다. 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 다시 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액에 추가로 황산암모늄을 가하여 90% 포화의 상태로 하였다. 마지막에 이 용액을 원심분리처리(7000 g, 30분간, 4℃)하여 침전물을 회수하였다. 90% 포화로 얻어진 침전물은 증류수에 용해 후, 증류수에 대해 투석하고, 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료로 하였다.

[실시예 14] 항로타바이러스 감염 조성물을 겔여과(Sephacryl S-500) 칼럼과 유안으로 분획하여 얻은 성분의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 13과 동일한 방법에 의해 제조한 성분의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 6과 동일한 방법에 의해 측정하였다.

<결과와 고찰>

각 시료의 항로타바이러스 활성의 측정결과를 표 6에 나타내었다. 실험시료의 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 나타내었다.

겔여과 칼럼 후의 유안염석에 의해 활성성분이 농축되는 것이 명확해졌다.

※: 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 표기하였다.

[실시예 15] 원심분리 및 한외여과처리에 의한 항로타바이러스 감염 조성물의 활성성분의 분획

원유를 사용하여 상술한 실시예 5와 동일한 방법에 의해 제조한 젖 유래 조성물의 활성성분을 추가로 분획하였다.

실시예 5에서 보유액을 스프레이 드라이하여 얻어진 분말을 증류수에 10%로 되도록 용해 후, 0.5 N HCl을 첨가하여 pH 4.6으로 하였다. 이 상태에서 15~30분간 유지한 후, 원심분리처리(6000 g, 20분간, 4℃)를 행하여, 침전획분과 상청획분으로 나눴다. 침전획분은 다시 증류수로 분산시킨 후, 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료 A로 하였다. 상청획분은 분획분자량 1만의 한외여과막(닛폰 밀리포아사제)을 사용하여 한외여과처리에 제공하였다. 처리온도는 20~25℃였다. 맨처음에 상청획분을 한외여과막에서 1/4로 농축하고, 이어서 농축액을 4배로 가수 희석한 후, 다시 용량이 1/4이 되도록 투석여과를 행하였다. 마지막에 얻어진 한외여과막의 보유액을 통상적인 방법에 의해 동결건조하여 시험시료 B로 하였다.

[실시에 16] 항로타바이러스 감염 조성물을 원심분리 및 한외여과처리로 분획하여 얻은 성분의 로타바이러스 감염 저해활성의 측정

<재료 및 방법>

원유를 사용하여 상술한 실시예 15와 동일한 방법에 의해 제조한 성분의 로타바이러스 감염 저해활성을 실시예 6과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 또한, 비교를 위해 미분획의 시료를 대조시료로서 사용하였다.

<결과와 고찰>

각 시료의 항로타바이러스 활성의 측정결과를 표 7에 나타내었다. 실험시료의 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 나타내었다.

원심분리 및 한외여과처리에 의해 활성성분이 농축되는 것이 명확해졌다..

※: 최소 저해농도는, 소혈청알부민으로 환산한 경우의 단백질농도로 표기하였다.

본 발명에 의해 새로운 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 그 유효량을 육아용 조제분유에 배합할 수 있다.

Claims (9)

1. 유청의 정밀여과 보유액, 원심분리 처리액 및/또는 유안침전 처리용액 또는 그의 건조물로서, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 정밀여과막의 공경이 0.004~1.4 ㎛의 범위에 있는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 원심분리처리의 중력이 300~30,000 g의 범위에 있는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 유안침전의 포화도가 30~100%의 범위에 있는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 함유하는, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 식품.
6. 제5항에 있어서, 식품이 육아용 조제분유, 고령자용 식품, 보건기능식품 및 병자용 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 함유하는, 로타바이러스 감염 방어작용을 갖는 가축사료.
8. 제5항 또는 제6항의 식품을 제조하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물의 사용.
9. 제7항의 가축사료를 제조하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물의 사용.