JP5097849B2 - ロタウイルス感染阻害活性を有する新規糖タンパク質 - Google Patents
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Description
[1] ウシ乳清中に見出され、SDS-PAGEで測定される分子量が15〜20kDa、等電点pIが6〜9であり、N末端から5残基のアミノ酸配列が(1)Ser-Ser-Arg-Gln-Proであることを特徴とするロタウイルス感染阻害活性を有する糖タンパク質。
[2] ウシ乳清中に見出され、SDS-PAGEで測定される分子量が14〜19kDa、等電点pIが6〜9であり、N末端から7残基のアミノ酸配列が(2)Ile-Leu-Lys-Glu-Lys-His-Leuであることを特徴とするロタウイルス感染阻害活性を有する糖タンパク質。
これら[1]及び[2]の糖タンパク質は、ウシプロテオースペプトン溶液に硫安を加え、55〜90%の飽和度で得られる沈殿物を採取し、それを分画することによって得られるものであることが好ましい。
[3] 前記[1]又は[2]記載の糖タンパク質を含むことを特徴とするロタウイルス感染防御用組成物。
[4] 前記[3]記載のロタウイルス感染防御用組成物を含む食品。
[5] 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメントからなる群より選択される前記[4]記載の食品。
[6] 前記[3]記載のロタウイルス感染防御用組成物を含む医薬組成物。
[7] 前記[3]記載のロタウイルス感染防御用組成物を含む家畜飼料。
[8] ウシプロテオースペプトン溶液に硫安を加え、55〜90%の飽和度で得られる沈殿物を採取し、それを分画することを特徴とする、前記[1]又は[2]記載の糖タンパク質の製造法。
本発明における新規糖タンパク質(以下、本発明物質ということもある)は、ウシプロテオースペプトン溶液に硫安を加え、溶液の飽和度が55〜90%のときに得られる沈殿物に見出すことができる。あるいは、本発明における新規糖タンパク質は、ウシプロテオースペプトン溶液を直接分画することによっても得ることができる。プロテオースペプトンは、95℃で20分間の加熱処理を行った脱脂乳をpH 4.6にしたときに沈殿しない耐熱性の乳清タンパク質画分である(「ミルク総合辞典」朝倉書店 1992年 p.37)。本発明物質は、ウシ乳清を加熱処理して得られる可溶性画分、いわゆるウシプロテオースペプトン画分を硫安沈殿と遠心分離処理を組み合わせた方法で処理して得られる分画物に見出され、ロタウイルスの感染阻害活性が非常に高いことが特徴である。上記の本発明の糖タンパク質は、それぞれ、ラクトフォリン(プロテオースペプトン画分に含まれる耐熱性と可溶性(水溶性)を有する糖タンパク質)を構成するタンパク質成分(ラクトフォリンコンポーネントとも呼ばれる)の一つである。ラクトフォリンは、プロテオースペプトン画分の一分画であるプロテオースペプトン3画分中に見出されたことから、プロテオースペプトン3又はプロテオースペプトンコンポーネント3とも呼ばれる。
等電点電気泳動
1.膨潤化
泳動に用いるStripゲルを膨潤させる。
[IPG Ready Strip]
7cm pH 3-10(BIO-RAD社製)
[膨潤用緩衝液]
2.4gの Urea
0.05gの DTT
0.2gの CHAPS
0.01mlの Bio-Lytes
5μl、50mg/mlの Orange G
これに5mlのMilli-Q(Millipore社)で作成した超純水(以下、MilliQともいう)を加え、冷凍保存した。
プログラム、プリンターは以下のように設定し、この条件下で一次元目の泳動を行う。
[プログラム]
step1:250V、15min、20℃
step2:Start 250-End、4,000V、2hr、20℃
ボルトラインピング設定
電流値リミットは、50μA/Strip
step3:4,000V-20,000VH、5hr、20℃
[プリンター]
Voltage Slopeは、LINEARを選択し、穏やかな電圧上昇のもとで泳動し、泳動が終了した後に、Ready Stripに流れたタンパク質が乱れないように、500V/HOLDを設定する。
1.分離ゲルの作成
[A溶液:30%のアクリルアミド溶液]
29.2gのアクリルアミド(モノマー)
0.8gのN,N’-メチレンビスアクリルアミド
純水で100mlとする。
[B溶液:1.5MのTris-HCl緩衝液(pH 8.8)]
18.17gの Tris
0.4gの Sodium dodecyl sulfate(SDS)
純水で溶解し、HClでpHを8.8に調整した後に、最終容量を100mlとする。
[C溶液:10%の過硫酸アンモニウム溶液]
0.1gの過硫酸アンモニウム
純水1mlを加える。
[TEMED]
N,N,N',N',-Tetramethylethylenediamine
[泳動用緩衝液]
14.4gのグリシン
3gのTris
1gのSDS
純水で1000mlとする。
IPG Ready Stripを二次元目の泳動に必要なSDS緩衝液系にするため、平衡化を行う。使用する溶液は、以下の通りである。
[平衡化緩衝液1]
3.6g/10mlの Urea
0.2g/10mlの SDS
2.5ml/10ml、1.5Mの Tris-HCl
2ml/10mlの Glycerol
200mg/10mlの DTT
以上、各試薬10mlを合わせて50mlとする。
[平衡化緩衝液2]
3.6g/10mlの Urea
0.2g/10mlの SDS
2.5ml/10ml、1.5Mの Tris-HCl
2ml/10mlの Glycerol
250mg/10mlの Iodoacetamide
以上、各試薬10mlを合わせて50mlとする。
[泳動条件]
200V、30mAの定電圧、定電流で泳動を行う。
CBB染色
電気泳動後のタンパク質染色にはCBB染色を用いる。使用する溶液は、以下の通りである。
[CBB染色]
2.5gの CBB
454mlのメタノール
75mlの 酢酸
これに純水を加えて1000mlとし、3回濾過する。
[脱色液]
250mlのメタノール
375mlの酢酸
純水で5000mlとする。
ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の電気泳動溶出は、Centrilutor micro-electroeluter(Millipore社製)を用いて行うことができる。キャップと底に穴(孔)が空いた0.5mlのサンプルチューブに切り出したポリアクリルアミドゲル細片を入れる。下部のバッファーチェンバーに溶出緩衝液(25mMのTris、192mMのグリシン、0.02%のSDS、20%のメタノール)を注ぎ、上部のバッファーチェンバーラックの穴(孔)に分画分子量が10000Daのセントリコン装置を取り付ける。使用しない穴(孔)はストッパーで閉め、下部のバッファーチェンバーに上部のバッファーチェンバーをのせる。上段のバッファーチェンバーを溶出緩衝液で満たし、セントリコン装置の下部に気泡がないか確認する。気泡がある場合には、シリンジを用いて除去する。それぞれのセントリコン装置のサンプルリザーバーにゲル端片の入ったサンプルチューブを差し込む。溶出機に安全カバーを着け、電極をコンセントに差し込み、200Vで4時間溶出を行う。
タンパク質の定量にはBradford法に従う。Protein assay reagent(BIO-RAD社製)を使用し、ウシ血清アルブミンを標準溶液として測定する。各試料は、PBS(−)[Ca及びMgイオンを除去したDulbecco's Phosphate Buffered Saline]で希釈し、マイクロプレートに10μlずつ注ぐ。5倍に希釈した200μlのBradford試薬を加えてピペッティングし、595nmにおける吸光度を測定する。
ウシ乳由来組成物の加熱処理物を試料として、ヒトロタウイルスMO株の感染阻害活性を以下のように測定することができる。
(1)培養細胞の調製
ウイルスの増殖及び抗ロタウイルス活性の測定に、37℃で7日間培養した単層のアカゲザル腎臓由来株化細胞MA104細胞(J.Clin.Microbiol.Oct. 1982, 727-730)を用いる。継代後の4日間は、10%のウシ胎児血清、10%のトリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地中で培養し、継代して5日目に2%のウシ胎児血清、10%のトリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地に交換する。
(2)ウイルスの調製
ウイルスには、ヒトロタウイルスMO株(血清型3)(J.Clin.Microbiol.Oct.1982,727-730)を用いる。あらかじめ20μg/mlのトリプシンにより、37℃で30分間混合し、M.O.I(Multiplicity Of Infection;細胞1個当たりの接種ウイルス数)=1となるように希釈し、これを0.11%のウシ血清アルブミン、ジエチルアミノエチル、デキストランを加えたHanks液で3回洗浄した単層細胞上に接種する。37℃で60分間吸着させた後に、ウイルスを除去し、前記Hanks液で洗浄した後に、0.5μg/mlのトリプシンを含む2%のウシ胎児血清、5%のトリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地を加え、37℃で回転培養する。大部分の細胞が壁面から剥離したら、その培養液を回収し、遠心分離処理(3000rpm、10分間)を行い、その上清をストックウイルスとして分注し、使用時まで−80℃で保存する。
(3)ウイルスの感染
ウイルスの接種は同時接種法で行う。すなわち、PBS(−)[Ca及びMgイオンを除去したDulbecco's Phosphate Buffered Saline]で溶解した試料原液を10%ウシ胎児血清、10%トリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地で段階希釈し、50μlの希釈試料(試料溶液は0.45μmのフィルターで濾過滅菌)を0.5mlのエッペンドルフチューブに分注する。次いで105〜106FCFU(Fluorescent Cell Focus Forming Unit)/mlのヒトロタウイルスMO株液の0.4mlを、20μg/mlのトリプシン溶液の0.4mlにより、37℃で30分間の処理を行い、10%のウシ胎児血清、10%のトリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地で20〜100倍に希釈した後に、各エッペンドルフチューブに50μlずつ加え、37℃で1時間培養した。空試験用(試料無添加時)には、前記希釈試料の50μlに代えて、10%ウシ胎児血清、10%トリプトース・ホスフェイト・ブロスを含むイーグルMEN培地を用いる。
1.プロテオースペプトン画分の調製
搾乳した未加熱の10リットルの生乳(原乳)を5℃に冷却し、遠心分離処理(3000rpm、20分)で乳脂肪を除去し、脱脂乳を調製した。pHを4.6に調整した後に、沈殿したカゼインを遠心分離処理(20℃、3000rpm、15分)で除去し、乳清画分(酸ホエイ)を得た。次いで、酸ホエイを95℃で30分間の加熱処理を行い、30℃まで冷却した後に、変性したタンパク質を遠心分離処理(5000G、20℃、30分間)で除去し、プロテオースペプトン画分を得た。
前記プロテオースペプトン画分に100%の飽和硫安溶液を55%の飽和度になるまで加えた。数時間放置した後に、遠心分離処理(7000G、20℃、30分間)を行った。上清を採取し、90%の飽和度になるまで、更に100%の飽和硫安溶液を加えた。スターラーで撹拌しながら、一晩放置した後に、遠心分離処理(7000G、20℃、30分間)を行い、生じた沈殿を脱イオン蒸留水に溶解し、48時間透析を行った。
透析した後に得られた溶液を試料として二次元電気泳動を行った。試験例1記載の条件で一次元目にはpIが5〜8の等電点電気泳動、二次元目には15%のポリアクリルアミド単一ゲルを用いたSDS-PAGEを行った。そして、ポリアクリルアミドゲル上に認められた等電点pIが6〜9で分子量約18kDa付近のタンパク質スポット群を、試験例2に従って電気泳動溶出し、採取した(図1)。
実施例1に従って酸ホエイを調製し、pHを6.0とした。0.15MのNaCl及び0.02%のNaN3を含む10リットルのリン酸緩衝液(pH 6.0)を用い、分画分子量が300万Daの分離膜で限外濾過処理を行った。その保持液を採取し、常法により凍結乾燥することで、500mgの乳清タンパク質濃縮物の粉体を得た。この粉末を溶出緩衝液で濃度を9mg/mlに調整し、Sephacryl S-500(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を充填したカラム(5×60cm、ゲル容積1200ml)に30mlをアプライした。なお、溶出緩衝液には、0.15MのNaCl、1mMのNa2EDTA、0.02%のNaN3を含む0.05MのTris-HCl緩衝液を用い、280nmの吸光度における最初のピークに相当する分画を採取した。その後に実施例1と同様にして、画分を加熱処理した後に硫安沈殿を行い、生じた沈殿を脱イオン蒸留水に溶解し、48時間透析を行った。
搾乳した未加熱の100 kgの生乳(原乳)を63℃で30分間の加熱処理を行い、常法に従ってゴーダチーズを調製し、生成したホエイ(pH 6.0)を分離した。このホエイを加温し、遠心分離処理(3000G、20分間、40℃)を行い、脱脂ホエイを得た。この脱脂ホエイを国際公開第2004/080475号の実施例1に記載された方法に従い、精密濾過処理し、保持液を回収した。更に得られた保持液に脱イオン水を添加し、精密濾過処理を3回繰り返した(ダイアフィルトレーション処理)。最後に得られた保持液はスプレードライ法により乾燥した。次いで乾燥試料の2%の水溶液を調製し、そのpHを1NのHCl及び1NのNaOHでpHを3.0に調整した。55℃に加温してから乾燥試料重量の0.5%に当たるペプシン(Sigma社製)を添加し、3時間の酵素処理を行った。酵素処理液は沸騰水浴中で5分間の加熱処理を行うことで酵素を失活させ、その後に凍結乾燥することで抗ロタウイルス活性の試験試料(ペプシン分解物)を得た。全く同様にして、2%の水溶液をpHで8.0に調整し、ペプシンの代わりにプロナーゼ(Merck社製)を用いることでプロナーゼ分解物を得た。
1.レクチン染色
実施例1で確認された約18kDaのスポットについてレクチン染色を行うため、実施例1に従って二次元電気泳動を行った後に、イモビロンPVDF膜に転写した。転写した後に、CBB染色を行い、次いでレクチン染色をした。
実施例1で採取したスポット群のうち、スポットC、D、E、FのN末端から5残基を気相シークエンス(綱沢進 他、続生化学実験講座 1 タンパク質の化学(上)、東京化学同人、347-373(1987))(Procese 49-HT プロテインシークエンサー)により測定したところ、これらのN末端配列5残基がプロテオースペプトン3(Esben S.S.et.al.,J Dairy Res. 60 535-542(1993))のアミノ酸54位から58位の配列(Ser-Ser-Arg-Gln-Pro)と一致する新規な糖タンパク質であることが確認された。
更にB+C+Dからなるスポット群、スポットE及びスポットFの抗ロタウイルス活性を測定した。以下に手順を示す。
1.レクチン染色
実施例4と同様にして、実施例2で確認された約16kDaのスポットについてRCA-120を用いたレクチン染色を行った。その結果、レクチンと反応性が見られたことから、約16kDaのタンパク質スポット群は、β-ガラクトースを持つことが示された。
次いで、約16kDaのタンパク質スポット群を弱酸性側からA、B、Cとし(図6)、実施例2で採取した、これらのスポット群においてスポットCのN末端から7残基をアミノ酸シークエンス(Procese 49-HT プロテインシークエンサー)により測定した。その結果、N末端配列7残基がプロテオースペプトン3(Esben S.S.et.al.,J Dairy Res. 60 535-542(1993))のアミノ酸69位から75位の配列(Ile-Leu-Lys-Glu-Lys-His-Leu)と一致する新規な糖タンパク質であることが確認された。
実施例2で採取したスポット群のうち、A、B、Cを含むスポット群(A+B+C)の抗ロタウイルス活性を測定した。ロタミルク(EBINA,T.et.al.,J.Med.Virol.38 117-123(1992))をポジティブコントロールとした。また、実施例2における二次元電気泳動の代わりに一次元電気泳動を実施し、CBB染色で約18kDaの位置に認められたタンパク質(heated F1)を比較試料とした。なお、その際に一次元電気泳動のゲルは、試験例1の15%のポリアクリルアミド単一ゲルを用いた。試料の採取では、電気泳動により分離されたタンパク質を試験例2に従って電気泳動溶出することで得た。抗ロタウイルス活性は実施例4と同様にして測定した。
1.抗ロタウイルス活性の測定1
実施例3で得られたペプシン分解物及びプロナーゼ分解物を試料とし、実施例4と同様にして抗ロタウイルス活性を測定した。
一方、プロナーゼ分解物については実施例3の試料に加えて、水溶液の状態で更に100℃で15分間あるいは120℃で5分間の加熱処理を行ったものを調製し、凍結乾燥して試料とした。これら2つの試料の抗ロタウイルス活性を、ロタミルク(EBINA,T.et.al.,J.Med.Virol.38 117-123(1992))を対照として実施例4と同様にして測定した。
前記プロナーゼ分解物及びペプシン分解物を試料とし、実施例1と同様の方法で二次元電気泳動を行った。その結果、プロナーゼ分解物は約18kDaに3つのスポットが認められた(図13)。また、ペプシン分解物は約18kDaに4つのスポットが認められた(図14)。
実施例1や実施例3で確認された約18kDaのスポットに関する情報を得るため、抗ラクトフォリン(プロテオースペプトン3)のモノクローナル抗体染色を行った。抗体染色は、実施例1のプロテオースペプトン画分、その硫安画分及び実施例3で酵素分解物の調製に用いた乳清タンパク質の3つの試料で検討した。
95℃で30分間の加熱処理を行った脱脂乳に酸添加を行い、カゼイン及び変性タンパク質を沈殿除去して、プロテオースペプトン画分(以下、PP画分ともいう)を調製した。PP画分に、100%飽和硫安溶液を55%の飽和度になるまで加え、遠心分離処理を行い、上清を採取した。更に100%飽和硫安溶液を90%の飽和度になるまで加え、一晩放置した後に、遠心分離処理を行い、生じた沈殿物を採取した。次いで、この沈殿物を脱イオン蒸留水に溶解し、透析を行った。得られた溶液は、プロテオースペプトン画分由来の硫安飽和55%可溶かつ90%不溶の画分であり、以下「PP(0.90)画分」と称した。調製したPP画分とPP(0.90)画分については、試験例4に従うヒトロタウイルス中和活性試験によって、ロタウイルス感染阻害活性を測定した。その活性の評価は、感染阻害率の濃度依存性及び最小阻害濃度(MIC)に基づいて行った。PP画分及びPP(0.90)画分は共に感染阻害活性を示したが、PP画分の最小阻害濃度(MIC)は16μg/ml、PP(0.90)画分の最小阻害濃度(MIC)は19μg/mlであり、活性の強さには大きな違いは認められなかった(図18)。
実施例8に従って調製したプロテオースペプトン画分(PP画分)を、コンカナバリンA(Concanavalin A; ConA)アフィニティーカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーにかけて分画した。以下の組成のバッファーを使用し、流速は0.7ml/分とした。
・結合バッファー: 5mMのCH3COONa, 1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 1mMのMnCl2, 1MのNaCl, 0.02%のNaN3(pH 6.8)
・溶出バッファー: 5mMのCH3COONa, 1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 1mMのMnCl2, 1MのNaCl, 0.5Mのメチル-α-D-グルコピラノシド, 0.02%のNaN3 (pH 6.8)
実施例9に従ってプロテオースペプトン画分(PP画分)から調製したConA結合のBO画分又はConA非結合のUN1画分をプラスミンにより処理した。BO画分又はUN1画分のタンパク質濃度を3mg/mlに調整し、これらにプラスミン溶液(1mg/ml、ヒト血清由来、Sigma社製)を44:1となるように加え、混合液を37℃で5分間保持した。次いで、混合液を沸騰水中で5分間加熱し、プラスミンを失活させた後に、分画分子量が10000Daの透析膜を用いて脱塩処理を行い、分解した後のサンプルをそれぞれBOP画分とUN1P画分とした。
Claims (4)
- ウシ乳清中に見出され、SDS-PAGEで測定される分子量が15〜20kDa、等電点pIが6〜9であり、N末端から5残基のアミノ酸配列がSer-Ser-Arg-Gln-Proであることを特徴とするロタウイルス感染阻害活性を有する糖タンパク質を含む、ロタウイルス感染防御用組成物であって、酸ホエイを加熱処理し、遠心分離により変性タンパク質を除去して得られるウシプロテオースペプトン溶液に、硫安を加え、55〜90%の飽和度で得られる沈殿物を採取し、それを、一次元目にpI 5〜8の等電点電気泳動、二次元目に15%ポリアクリルアミド単一ゲルを用いたSDS-PAGEを実施する二次元電気泳動により分画し、該ポリアクリルアミドゲル上に認められる、等電点pIが6〜9で18kDa付近に現れる弱酸性側から2〜4つ目のスポット群、5つめのスポット、又は6つ目のスポットのタンパク質を採取することによって得られる、ロタウイルス感染防御用組成物。
- 酸ホエイを加熱処理し、遠心分離により変性タンパク質を除去して得られるウシプロテオースペプトン溶液に、硫安を加え、55〜90%の飽和度で得られる沈殿物を採取し、それを、一次元目にpI 5〜8の等電点電気泳動、二次元目に15%ポリアクリルアミド単一ゲルを用いたSDS-PAGEを実施する二次元電気泳動により分画し、該ポリアクリルアミドゲル上に認められる、等電点pIが6〜9で18kDa付近に現れる弱酸性側から2〜4つ目のスポット群のタンパク質を採取することによって得られる、請求項1記載のロタウイルス感染防御用組成物。
- 酸ホエイを加熱処理し、遠心分離により変性タンパク質を除去し、得られるウシプロテオースペプトン溶液に、硫安を加え、55〜90%の飽和度で得られる沈殿物を採取し、それを、一次元目にpI 5〜8の等電点電気泳動、二次元目に15%ポリアクリルアミド単一ゲルを用いたSDS-PAGEを実施する二次元電気泳動により分画し、該ポリアクリルアミドゲル上に認められる、等電点pIが6〜9で18kDa付近に現れる弱酸性側から2〜4つ目のスポット群、5つめのスポット、又は6つ目のスポットのタンパク質を採取することを特徴とする請求項1又は2記載のロタウイルス感染防御用組成物の製造法。
- 前記分画後、前記ポリアクリルアミドゲル上に認められる、等電点pIが6〜9で18kDa付近に現れる弱酸性側から2〜4つ目のスポット群のタンパク質を採取する、請求項3記載の製造法。
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