KR102567489B1 - 세포 연계 결합 분자 - Google Patents

세포 연계 결합 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR102567489B1
KR102567489B1 KR1020207032356A KR20207032356A KR102567489B1 KR 102567489 B1 KR102567489 B1 KR 102567489B1 KR 1020207032356 A KR1020207032356 A KR 1020207032356A KR 20207032356 A KR20207032356 A KR 20207032356A KR 102567489 B1 KR102567489 B1 KR 102567489B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
region
delete delete
seq
antigen
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020207032356A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200132996A (ko
Inventor
장세일
박범찬
박영우
Original Assignee
주식회사 와이바이오로직스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 와이바이오로직스 filed Critical 주식회사 와이바이오로직스
Priority claimed from PCT/IB2019/052896 external-priority patent/WO2019197979A1/en
Publication of KR20200132996A publication Critical patent/KR20200132996A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102567489B1 publication Critical patent/KR102567489B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 개시 내용은 암 면역 요법 분야에 광범위하게 관련된다. 예를 들어, 본 개시 내용은 일반적으로 결합 분자가 2개의 서로 다른 항원에 결합하도록 2개의 항원 결합 Fab 영역 및 항원 결합 Fv 영역을 형성하도록 구성된 항체 가변 경쇄 (VL) 영역, 가변 중쇄 (VH) 영역, 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 경쇄 불변 (CL) 영역을 포함하는 결합 분자에 관한 것이다.

Description

세포 연계 결합 분자
상호 참조
본원 출원은 2018년 4월 10일 출원된 미국 가출원 제62/655,762호 및 2018년 8월 17일에 출원된 미국 가출원 제62/719,484호에 기초한 우선권을 주장한다. 본원은 또한 2019년 4월 1일에 출원된 미국 출원 제16/372,172호, 2019년 4월 1일에 출원된 미국 출원 제16/372,190호 및 2019년 4월 1일에 출원된 미국 출원 제16/372,196호에 기초한 우선권을 주장한다. 상기 출원들 각각은 그 전체로서 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 제출된 ASCII 텍스트 형식의 컴퓨터 판독 가능한 양식 (CRF)의 서열목록을 그 전체로서 참조로 포함한다. 14489-004-228_SEQ_LISTING.txt이라는 명칭의 EFS-웹을 통해 제출된 서열목록 텍스트 파일은 2019년 4월 2일에 생성되었으며 크기는 140,862 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 세포 연계 결합 분자, 상기 결합 분자를 제조하는 방법, 상기 결합 분자를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
항체 및/또는 항체-기반 약제는 현재 광범위한 질환 및 장애를 위한 치료 옵션이다. 현재 미국 및/또는 유럽 연합에서 승인된 70종 이상의 항체가 있으며, 다수의 신규 분자가 전임상 연구 및 임상 시험 중에 있다. 그러나, 연구 및 임상 커뮤니티 내에서는 새롭고, 더 우수하며, 더욱 안전한 치료제를 지속적으로 탐색하고 있다.
천연에 존재하는 항체는 단일 특이적이어서 하나의 에피토프 또는 항원과 결합한다. 다중 특이적 항체는 복수의 항체의 특이성을 결합한 것이고, 상이한 항체 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 그러나, 많은 기술적 장애가 다중 특이적 항체의 개발을 저해해 왔다; 따라서, 치료제로서 승인된 다중 특이적 항체는 거의 없다. 그러므로, 보다 나은 다중 특이적 항체 및 기능적이고 안정한 다중 특이적 항체를 효율적으로 생산하기 위한 방법이 여전히 필요하다.
요약
본 발명은 부분적으로는 복수의 결합 도메인을 갖는 세포 연계 결합 분자, 상기 결합 분자의 제조 방법, 및 상기 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 상기 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다.
하나의 양태에서, 세포 연계 결합 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드, (b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 (c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자로서,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고; 또한
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한, 결합 분자가 제공된다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제 3 폴리펩티드는 추가로 제 2 VH 영역의 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제 4 폴리펩티드는 추가로 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제 3 및 제 4 폴리펩티드는 모두 제 2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단 각각에 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 추가로 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 추가로 VL 영역 C-말단에 ABS를 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드는 모두 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단 각각에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 추가로 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 추가로 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단 각각에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역이 유연 펩티드 영역(flexible peptide region)을 통해 Fv 영역에 연결된 결합 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 융합을 통해 Fv 영역에 연결된다.
일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역이다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이의 사슬 간 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열의 2 개의 직렬 카피를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 면역 세포상에 발현된다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 림프구 및 단핵구로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 이펙터 세포(effector cell)이다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프구 세포, 거핵구, 단핵구, 골수-유래 억제 세포 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 종양 관련 항원 (TAA) 또는 종양 특이적 항원 (TSA)이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 CD3 또는 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 암 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 결합 분자의 제조 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 다음을 포함하는 결합 분자의 제조 방법이 제공된다:
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하는 단계로서,
상기 하나 이상의 벡터는
(a) 각각의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산,
을 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성 할 수 있고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성 할 수 있고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한 단계, 및
(ii) 결합 분자를 정제하는 단계.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 각각 제2 VH영역 및/또는 VL영역 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단의 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역이 항체 힌지 영역을 포함하는 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 형성된 사슬간 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 측면에서, 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 결합 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 여기서 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하며, 제1 항원은 제2 항원과 상이하다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에서 CH3 영역을 추가적으로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에서 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에서 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에서 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에서 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에서 각각 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에서 CH1 영역 및 ABS 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 결합 분자의 투여를 포함하는 질병 또는 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 대상체에게 결합 분자의 치료 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
여기서 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하며, 제1 항원은 제2 항원과 상이하다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 세포 연계 결합 분자가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공되는 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드,
를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 세포예정사-리간드 1(PD-L1)에 결합하고, Fv 영역은 분화 클러스터 3(CD3)에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 특징을 갖는 결합 분자가 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; 및
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18 및 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 융합을 통해 Fv 영역에 연결된다.
일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역이다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGSGGGGSG의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 특징을 갖는 결합 분자가 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 95의 아미노산 서열을 포함하고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 96의 아미노산 서열을 포함하고; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 97의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 95의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 98의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 99의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 다음을 포함하는 결합 분자의 제조 방법이 제공된다:
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하는 단계로서, 상기 하나 이상의 벡터는
(a) 각 폴리펩티드가 항체 경쇄를 포함하는, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산
을 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는 단계; 및
(ii) 결합 분자를 정제하는 단계.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음을 특징으로 하는 방법이 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 9, 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 5, 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18, 및 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역이다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGSGGGGSG의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 다음을 특징으로 하는 방법이 제공된다:
제1 및 제2 Fab 영역 각각의 VH 영역은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고;
제1 및 제2 Fab 영역 각각의 VL 영역은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
Fv 영역의 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
Fv 영역의 VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 다음을 포함하는 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다:
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드;
를 포함하되,
여기서 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 각각 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 결합 분자의 투여를 포함하는 질병 또는 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 대상체에게 치료 유효량의 결합 분자를 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 결합 분자는 다음을 포함한다:
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 세포 연계 결합 분자가 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 다음을 포함하는 결합 분자가 제공된다:
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
여기서 제1 Fab 영역과 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 대한 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 결합 분자와 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 27, 서열번호: 28 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 27, 서열번호: 28 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 특징을 갖는 결합 분자가 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하며;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 23의 아미노산 서열을 가지며; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 EGFR에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 45, 서열번호: 46 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 특징을 갖는 결합 분자가 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 37의 아미노산 서열을 가지며; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 다음을 포함하는 결합 분자의 제조 방법이 제공된다:
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하는 단계로서, 상기 하나 이상의 벡터는
(a) 각각의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산
을 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는 단계, 및
(ii) 결합 분자를 정제하는 단계.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역의 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 31, 서열번호: 32 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 27, 서열번호: 28 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 27, 서열번호: 28 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18 및 서열번호:19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 방법이 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 25의 아미노산 서열을 갖고, 제3 폴리펩티드는 서열번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 45, 서열번호: 46 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 13, 서열번호: 14, 및 서열번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 41, 서열번호: 42 및 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 17, 서열번호: 18, 및 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 다음의 방법이 제공된다:
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하며;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열번호: 37의 아미노산 서열을 가지며; 제4 폴리펩티드는 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 치료 유효량의 결합 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 여기서 결합 분자는 다음을 포함한다:
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
여기서 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 약학 조성물과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 결합 분자의 투여를 포함하는 질병 또는 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 대상체에게 결합 분자의 치료 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역의 C-말단에 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 C-말단에 각각 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드는 제2 VH 영역 C-말단에 불변 중쇄 3 (CH3) 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제4 폴리펩티드는 VL 영역 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 및 제4 폴리펩티드 모두는 제2 VH 영역 및 VL 영역 각각의 C-말단에 CH3 영역 및 ABS를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드는 제2 VH 영역 및/또는 VL 영역 각각의 C-말단에 CH1 영역 및 ABS 모두를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 ABS를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 임의의 상기 방법과 관련하여, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 C-말단에 ABS를 추가로 포함한다.
본 개시 내용은 부분적으로 다중 결합 도메인을 갖는 세포 연계 결합 분자를 제공한다. 한 측면에서, 다음의 결합 분자가 본원에 제공된다:
(a) 각각 (i) 항체 가변 중쇄 (VH) 영역 및 항체 CH1 영역을 포함하되, 항체 CH2 영역 및 항체 CH3 영역을 포함하지 않는 제1 부분; 및
(ii) 항체 가변 경쇄 (VL) 영역 및 항체 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 항체 경쇄 (LC)를 포함하는 제2 부분
을 포함하는 2개의 항체 Fab 영역을 포함하고, 상기 2개의 항체 Fab 영역은 각각 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인, 및
(b) VH 영역 및 항체 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항체 Fv 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
상기 제2 항원 도메인은 면역 세포 상에 존재하는 항원에 결합하고;
상기 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 연결되어 있다.
특정 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인의 각 Fab 영역의 제1 부분 및 제2 부분은 동일한 폴리펩티드 상에 존재한다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 Fab 영역은 N-말단에서 C-말단으로 하기 순서로 배향된다: VH-CH1-VL-CL. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 Fab 영역은 N-말단에서 C-말단으로 하기 순서로 배향된다: VL-CL-VH-CH1.
특정 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분 및 제2 부분은 별도의 폴리펩티드 상에 존재한다.
특정 실시예에서, Fv 영역의 VH 영역 및 VL 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 존재한다. 일부 실시예에서, Fv 영역은 N-말단에서 C-말단으로 하기 순서로 배향된다: VH-VL. 다른 실시예에서, Fv 영역은 N-말단에서 C-말단으로 하기 순서로 배향된다: VL-VH.
특정 실시예에서, Fv 영역의 VH 영역 및 VL 영역은 별도의 폴리펩티드 상에 존재한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 유연 펩티드 영역에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다.
특정 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 추가 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 Fv 영역의 VH 영역에 연결된 제1 CH3 영역 및 Fv 영역의 VL 영역에 연결된 제2 CH3 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 결합 분자는 하나 이상의 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, ABS는 Fv 영역의 VH 영역의 C-말단에 연결된다. 다른 실시예에서, ABS는 Fv 영역의 VL 영역의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시예에서, Fv 영역의 VL 및 VH 영역 각각의 C-말단은 ABS에 연결된다. 다른 실시예에서, ABS는 Fab 영역 중 적어도 하나의 CL 영역에 연결된다. 또 다른 실시예에서, 결합 분자는 하나 이상의 알부민 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 2 개의 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다. 다른 실시예에서, 2개의 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 2 개의 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 2 개의 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 다른 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 Fab영역의 제2 부분의 VL 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 동일한 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 상이한 CDR 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각각의 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공되는 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) 제3 VH 영역 및 제2 CH1 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, Fv 영역은 제2 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 다른 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각각의 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 벡터를 숙주 세포로 형질 감염시키는 것을 포함하는 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 하나 이상의 벡터는 다음을 포함한다:
(a) 각각 항체 경쇄인 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산,
(b) 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산; 및
(c) 제3 VH 영역 및 제2 CH1 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산을 포함하며,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성할 수 있다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, Fv 영역은 제2 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 다른 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 실시예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 서열을 가지고; 제3 핵산은 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각각의 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제3 핵산은 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 50의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 48의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제3 핵산은 서열 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 대상체에게서 질병 또는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시예에서, 질병 또는 질환은 암이다. 다른 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시예에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 실시예에서, 질병 또는 질환은 PD-L1 양성 암이다.
또 다른 측면에서, 대상체에 본원에서 제공되는 결합 분자의 치료적 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에게서 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 질병 또는 질환은 암이다. 다른 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시예에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 실시예에서, 질병 또는 질환은 PD-L1 양성 암이다.
본 개시의 측면 또는 실시예가 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대안 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 본 개시는 전체로서 나열된 전체 그룹뿐만 아니라 개별적으로 그룹의 각 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹을 포함하며, 그룹의 구성원 중 하나 이상이 결여된 주 그룹도 포함한다. 또한 본 발명은 청구된 발명에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다.
예시적 실시 태양
1. (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한, 결합 분자.
2. 실시 태양 1의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
3. 실시 태양 2의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 융합을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
4. 실시 태양 2의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 결합 분자.
5. 실시 태양 4의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역인, 결합 분자.
6. 실시 태양 5의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지 영역으로 구성된 군에서 선택되는, 결합 분자.
7. 실시 태양 4의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 결합 분자.
8. 실시 태양 4의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 결합 분자.
9. 실시 태양 8의 결합 분자에 있어서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
10. 실시 태양 9의 결합 분자에 있어서, 링커는 GGGGS (G4S) 아미노산 서열의 2개의 직렬 카피를 포함하는, 결합 분자.
11. 실시 태양 1의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원의 동일한 에피토프에 결합하는, 결합 분자.
12. 실시 태양 1의 결합 분자에 있어서, 제2 항원은 면역 세포에서 발현되는, 결합 분자.
13. 실시 태양 12의 결합 분자에 있어서, 면역 세포는 림프구와 단핵구로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 분자.
14. 실시 태양 12의 결합 분자에 있어서, 면역 세포는 이펙터 세포인, 결합 분자.
15. 실시 태양 12의 결합 분자에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프구 세포, 거핵구, 단핵구, 골수-유래 억제 세포 및 및 자연 살해 (NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합 분자.
16. 실시 태양 1의 결합 분자에 있어서, 제1 항원은 암 항원인, 결합 분자.
17. 실시 태양 16의 결합 분자에 있어서, 암 항원은 종양 관련 항원 (TAA) 또는 종양 특이적 항원 (TSA)인, 결합 분자.
18. 실시 태양 1의 결합 분자에 있어서, 제1 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1로 구성된 군에서 선택되는, 결합 분자.
19. 실시 태양 12의 결합 분자에 있어서, 제2 항원은 CD3 또는 TNF 알파인, 결합 분자.
20. 실시 태양 16의 결합 분자에 있어서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3인, 결합 분자.
21. 실시 태양 20의 결합 분자에 있어서, 암 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1로 구성된 군에서 선택되는, 결합 분자.
22. 결합 분자의 제조 방법으로서,
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하며, 여기서 하나 이상의 벡터는
(a) 각각의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산
을 포함하되,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한,
결합 분자의 제조 방법.
23. 실시 태양 22의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 방법.
24. 실시 태양 23의 방법에 있어서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 형성된 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 방법.
25. 실시 태양 23의 방법에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 방법.
26. 실시 태양 25의 방법에 있어서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
27. 실시 태양 22의 방법에 있어서, 제1 항원은 암 항원이고, 제2 항원은 CD3인 방법.
28. 실시 태양 22의 방법에 있어서, 제1 항원은 CD19, CD20, EGFR, Her2 및 PD-L1로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
29. 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하며,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한, 약학 조성물.
30. 대상체에 대한 결합 분자의 치료적 유효량의 투여를 포함하는, 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원에 결합하고, Fv 영역은 제2 항원에 결합하고, 제1 항원은 제2 항원과 상이한, 방법.
31. (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 세포예정사-리간드 1(PD-L1)에 결합하고, Fv 영역은 분화 클러스터 3 (CD3)에 결합하는, 결합 분자.
32. 실시 태양 31의 결합 분자에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 결합 분자.
33. 실시 태양 32의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
34. 실시 태양 33의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 융합을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
35. 실시 태양 33의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 결합 분자.
36. 실시 태양 35의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역인, 결합 분자.
37. 실시 태양 36의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지 영역으로 구성된 군에서 선택되는, 결합 분자.
38. 실시 태양 35의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 결합 분자.
39. 실시 태양 35의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 결합 분자.
40. 실시 태양 39의 결합 분자에 있어서, 링커는 GGGGS(G4S)의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
41. 실시 태양 40의 결합 분자에 있어서, 링커는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
42. 실시 태양 40의 결합 분자에 있어서, 링커는 GGSGGGGSG의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
43. 실시 태양 32의 결합 분자에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
44. 실시 태양 32의 결합 분자에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
45. 실시 태양 32의 결합 분자에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
46. 실시 태양 32의 결합 분자에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 갖고, 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 갖는, 결합 분자.
47. 결합 분자의 제조 방법으로서,
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하는 단계로서, 상기 하나 이상의 벡터는
(a) 각각의 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산
을 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는 단계, 및
(ii) 결합 분자를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
48.실시 태양 47의 방법에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하는, 방법.
49. 실시 태양 48의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 방법.
50. 실시 태양 49의 방법에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 방법.
51. 실시 태양 50의 방법에 있어서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 방법
52. 실시 태양 50의 방법에 있어서, 항체 힌지 영역은 면역글로불린 G (IgG) 힌지 영역인, 방법.
53. 실시 태양 20의 방법에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 방법.
54. 실시 태양 53의 방법에 있어서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
55. 실시 태양 54의 방법에 있어서, 링커는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
56. 실시 태양 54의 방법에 있어서, 링커는 GGSGGGGSG의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
57. 실시 태양 48의 방법에 있어서,
제1 및 제2 Fab 영역 각각의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고;
제1 및 제2 Fab 영역 각각의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
58. 실시 태양 48의 방법에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
59. 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 있어서, 상기 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는, 약학 조성물.
60. 대상체에 결합 분자의 치료적 유효량을 투여함을 포함하는 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 PD-L1에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는, 방법.
61. (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역과 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는, 결합 분자.
62. 실시 태양 61의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 결합 분자.
63. 실시 태양 62의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
64. 실시 태양 63의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 결합 분자.
65. 실시 태양 64의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역이 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 결합 분자.
66. 실시 태양 64의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 결합 분자.
67. 실시 태양 62의 결합 분자에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서 제3 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
68. 실시 태양 62의 결합 분자에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는, 결합 분자.
69. 실시 태양 61의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 EGFR에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 결합 분자.
70. 실시 태양 69의 결합 분자에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 결합 분자.
71. 실시 태양 70의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 결합 분자.
72. 실시 태양 71의 결합 분자에 있어서, 항체 힌지 영역은 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에 사슬 간 이황화 결합을 포함하는, 결합 분자.
73. 실시 태양 70의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 결합 분자.
74. 실시 태양 69의 결합 분자에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 분자.
75. 실시 태양 69의 결합 분자에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는, 결합 분자.
76. 결합 분자의 제조 방법으로서;
(i) 숙주 세포에서 하나 이상의 벡터로부터 결합 분자를 발현하는 단계로서, 상기 하나 이상의 벡터는
(a) 각각의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산; 및
(c) N-말단에서 C-말단 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제4 핵산
을 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는 단계, 및
(ii) 결합 분자를 정제하는 단계
를 포함하는 방법.
77. 실시 태양 76의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 방법.
78. 실시 태양 77의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 방법.
79. 실시 태양 78의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 결합 분자.
80. 실시 태양 79의 결합 분자에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 결합 분자.
81. 실시 태양 77의 방법에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서 제3 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
82. 실시 태양 77의 방법에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
83. 실시 태양 87의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 CD20에 결합하고,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호 : 13, 서열 번호 : 14, 및 서열 번호 : 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는, 방법.
84. 실시 태양 83의 방법에 있어서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결되는, 방법.
85. 실시 태양 84의 방법에 있어서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는, 방법.
86. 실시 태양 85의 방법에 있어서, 유연 펩티드 영역은 링커를 추가로 포함하는, 방법.
87. 실시 태양 83의 방법에 있어서,
(a) 제1 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄는 각각 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고;
(b) 제3 폴리펩티드에서, 제1 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 제4 폴리펩티드에서, 제3 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
88. 실시 태양 83의 방법에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
89. 결합 분자의 치료학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는, 약학 조성물.
90. 대상체에 결합 분자의 치료적 유효량을 투여함을 포함하는 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
(b) N-말단에서 C-말단의 순서로 제1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) N-말단에서 C-말단의 순서로, 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역, 및 가변 경쇄 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
를 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고; 및
제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 각각 CD20 또는 EGFR에 결합하고, Fv 영역은 CD3에 결합하는, 방법.
도 1a는 본원에 제공된 결합 분자 (ALiCE)를 도시한다. 도 1b는 CH3 영역을 포함하는 본원에 제공된 예시적인 결합 분자를 도시한다. 도 1c는 알부민 결합 부위 (ABS)를 포함하는 본원에 제공된 예시적인 결합 분자를 도시한다. 도 1d는 암 항원을 표적으로 하는 결합 도메인을 갖는 본원에 제공된 예시적인 결합 분자를 도시하고, 또한 본원에 제공된 유연 펩티드 영역에 대한 예시적인 옵션을 도시한다. 도 1e는 암 항원을 표적으로 하는 결합 도메인 및 CD3를 표적으로 하는 결합 도메인을 갖는 본원에 제공된 예시적인 결합 분자를 도시한다.
도 2a는 ACE-00의 어셈블리 패턴을 도시한다. "BiP"는 노출된 ACE-00의 CH1 또는 VH 도메인에 결합하는 결합 면역글로불린 단백질(BiP)을 도시한다. 도 2b는 ACE-00의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 화살표는 환원 조건에서의 "ACE-00 + 경쇄" 샘플에서 ACE-00-VL의 밴드와 "ACE-00-VH + ACE-00-VL + 경쇄" 샘플에서 ACE-00-VH 및 ACE-00-VL의 두 밴드를 나타낸다. 도 2c는 아달리무맙의 야생형 중쇄(HC), CH1-절단 중쇄(CH1) 및 VH-CH1-절단 중쇄(VH-CH1)의 공동 면역 침전(co-IP) 결과를 보여준다. 도 2d는 BiP가 중쇄의 VH 및/또는 CH1 도메인과의 상호 작용에 의해 중쇄의 어셈블리 및 분비를 조절할 수 있음을 도시한다. "ERAD"는 소포체 관련 단백질 분해를 나타낸다. 도 2e는 항체 어셈블리에 대한 항체 VH 도메인의 기여 및 ACE-00 분자의 적절한 어셈블리에 대한 ACE-00-VH 사슬의 기여를 도시한다. "X"는 어셈블리의 부재를 나타내고, "O"는 어셈블리를 나타낸다. 도 2f는 ACE-00의 구조를 도시한다. 도 2g는 Hitrap™ 카파셀렉트 (GE Healthcare, USA)를 사용한 ACE-00 및 ACE-00-VL2 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 도 2h는 ACE-00-VL2와 ACE-00 사이의 분자 크기 차이를 확인하기 위해 수행된 모세관 전기영동의 결과를 보여준다. 도 2i는 ACE-00 및 ACE-00-VL2 분자의 입체 구조(conformation)를 보여주는 모세관 전기영동 결과를 보여준다. 실선 화살표는 ACE-00의 결과를 나타내고; 점선 화살표는 ACE-00-VL2의 결과를 나타낸다. 도 2j는 ACE-00-VH 사슬과 ACE-00-VL 사슬 사이의 이종이량체화를 확인하기 위해 수행된 모세관 등전 포커싱의 결과를 보여준다. 도 2k는 ACE-00의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE 및 모세관 전기 영동의 결과를 보여준다. "R"은 환원을 나타내고; "NR"은 비환원을 나타낸다. 도 2l은 ACE-00의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 3은 ACE-02, ACE-02-VL2, ACE-03, ACE-03-VL2, ACE-00 및 ACE-01의 발현 및 어셈블리를 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE (환원 (좌) 및 비환원 (우) 조건)의 결과를 보여준다. ACE-02는 인간화 12F6 (h12F6, 항-CD3 항체)로 제2 항원을 포함하고, ACE-03은 인간화 OKT3 (hOKT3, 항-CD3 항체)로 제2 항원을 포함한다. 화살표는 각각 비환원 조건에서 조립된 ACE-02, ACE-03 및 ACE-03-VL2의 밴드를 나타낸다.
도 4a는 ACE-04의 구조를 도시한다. "A"는 항-PD-L1을 의미한다. UCHT1은 항-CD3 항체이다. 도 4b는 ACE-05의 구조를 도시한다. "A"는 항-PD-L1을 의미한다. OKT3는 항-CD3 항체이다. 도 4c는 ACE-04, ACE-04-VL2, ACE-05 및 ACE-05-VL2의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과를 보여준다. 화살표는 환원 및 비환원 조건에서 ACE-04 및 ACE-05의 밴드를 나타낸다. 도 4d는 ACE-05의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과(위)를 보여주고, ACE-05 어셈블리의 잠재적인 조절 메커니즘을 도시한다(아래). 도 4e-4f는 ACE-05의 형태와 ACE-05-VH 및 ACE-05-VL 사슬 사이의 이종이량체화 효율을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE 및 모세관 전기 영동의 결과를 보여준다. "M"은 마커를 나타내고; "R"은 환원을 나타내고; "NR"은 비환원을 나타내고; "IN"은 입력을 나타내고; "FT"는 플로우 스루(flow through)를 나타내고; "W"는 세척을 나타내고; "Elu." 용출을 나타낸다. 도 4g는 ACE-05의 순도를 확인하기 위해 수행된 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다. 도 4h는 ACE-05의 겔 여과 분석을 위한 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 도 4i는 ACE-05의 구조 형태를 확인하기 위해 수행된 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 결과를 보여준다.
도 5는 37℃ 및 32℃(위)에서 ACE-09 및 ACE-05의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과를 보여주고, ACE-09 및 ACE-05(아래)의 특징을 요약한다. 위의 그림에서 "ACE-05"로 표시된 레인은 ACE-05의 결과를 보여준다. 나머지 레인은 ACE-09의 결과를 보여주고; "R"은 환원을 나타내고; "N.R"은 "비환원"을 나타내고; "IP"는 입력을 나타내고; "F.T"는 플로우 스루를 나타내고; "W"는 세척을 나타내고; "OP"는 출력을 나타낸다.
도 6a는 ACE-10의 구조를 도시한다. 도 6b-6c는 ACE-10 분자의 발현 및 어셈블리 분석을 보여준다(환원 (좌측) 및 비환원 (우측) 조건). 도 6b에서 화살표는 환원 및 비환원 조건 하에서의 ACE-10 밴드를 나타낸다. "ACE-10 투석"은 투석된 DNA로 형질 감염을 통해 생성된 ACE-10을 나타낸다. 도 6c에서, 항-카파 조건 결과에서의 화살표는 비환원 조건 하의 ACE-10-VL/ACE-10-LC 이량체 및 ACE-10-VH/ACE-10-LC 이량체 복합체를 나타내고; 항-CH1 조건 결과에서의 화살표는 비환원 조건에서 조립된 ACE-10을 나타낸다.
도 7a는 ACE-11의 구조를 도시한다. 도 7b는 ACE-11 및 ACE-11-VL2의 발현 및 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과를 보여준다(쿠마시 블루 염색(좌측) 및 웨스턴블롯(우측)으로 분석). "M"은 마커를 나타낸다. 화살표는 비환원 조건에서 조립된 ACE-11의 밴드를 나타낸다.
도 8은 ACE-12, ACE-05 및 ACE-09의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 화살표는 웨스턴블롯에서 항-카파(좌측) 및 항-CH1(우측) 항체를 사용하여 비환원 조건에서 ACE-05-VH + LC 이량체 및 ACE-05-VL + LC 이량체의 밴드를 나타낸다.
도 9는 TNF 알파에 대한 ACE-00 및 ACE-00-VL2의 친화도를 측정하기 위한 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)의 결과를 보여준다.
도 10a-10c는 ELISA를 사용한 PD-L1(10a) 및 CD3(10b-10c)에 대한 ACE-05의 결합 친화도 분석을 보여준다.
도 11은 ELISA를 이용한 CD3에 대한 ACE-05 및 ACE-09의 결합 친화도 분석을 보여준다.
도 12a-12c는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 PD-L1(12a, 12c) 및 CD3(12b, 12c)에 대한 ACE-05의 결합 동역학 분석을 보여준다. 도 12d는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 PD-L1 및 CD3에 동시에 결합하는 ACE-05의 동역학 분석을 보여준다.
도 13a는 다양한 CD3 항체에 의해 측정된 Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포에서의 CD3 발현 수준(좌측 패널) 및 모 HEK293E 세포 및 HEK293E-PD-L1 세포에서의 PD-L1 발현 수준(우측 패널)을 보여준다. 도 13b-13e는 ACE-05 및 BiTE-05에 대한 T 세포 리디렉팅(redirecting)(활성) 분석의 결과를 보여준다. 도 13f는 상이한 T 세포 단계에서 ACE-05, BiTE-05 또는 YBL-007의 존재하에서의 T 세포 활성화를 나타낸다. 도 13g-13h는 ACE-05에 대한 PD-1/PD-L1 차단 분석의 결과를 보여준다. 도 13i-13j는 ACE-05, BiTE-05, UCHT1 (미국 BioLegend의 항-CD3 항체) 또는 OKT3 (미국 BioLegend의 항-CD3 항체)에 의한 T 세포 활성화를 보여준다. 도 13k는 ACE-05 매개 T 세포 독성을 측정하기 위한 T 세포 세포 독성 분석의 결과를 보여준다. 도 13l은 ACE-05, BiTE-05, YBL-007 또는 UCHT1에 의해 매개된 T 세포 세포 독성의 결과를 보여준다. "IgG"는 음성 대조군으로 사용되는 정상적인 인간 IgG를 나타낸다. 도 13m은 ACE-05 또는 YBL-007의 존재하에서 PBMC 세포와 직접 접촉할 때 종양 세포에 대한 T 세포 세포 독성을 보여준다. 화살표는 표적 HCC827 암 세포를 나타낸다. 도 13n은 공동 배양된 PBMC 및 HCC827 세포에서 ACE-05, BiTE-05 또는 YBL-007의 존재하에서의 IL-2 및 INF-γ 수준을 보여준다. "IgG"는 음성 대조군으로 사용되는 정상적인 인간 IgG를 나타낸다. 도 13o는 ACE-05, BiTE-05, YBL-007 및 UCHT1의 열역학적 안정성의 결과를 보여준다.
도 14a-14b는 ACE-10 매개 T 세포 활성화를 측정하기 위해 수행된 T 세포 리디렉팅 분석의 결과를 보여준다. "hIgG"는 대조군으로 사용되는 정상적인 인간 IgG를 나타낸다.
도 15는 ACE-11 매개 T 세포 독성을 측정하기 위한 T 세포 세포 독성 분석 결과를 보여준다.
도 16a-16b는 스프래그-돌리(SD) 래트에서 ACE-05 약동학 연구 결과를 보여준다.
도 17a는 인간화 마우스 모델에서 HCC827(PD-L1 양성 종양) 이종 이식 연구의 결과를 보여준다. 도 17b는 PBMC 공여자 A 및 공여자 B에서 ACE-05 및 다른 시험 검체의 항 종양 효과를 보여준다. 도 17c는 공여자 A와 공여자 B의 체중 변화를 보여준다. 도 17d는 개별적인 항 종양 효능 반응을 보여준다. 도 17e는 개별 체중 감소(%)(부작용)를 보여준다. 도 17f는 BiTE 및 ACE-05의 항 종양 효능 비교 및 모 PD-L1 항체 및 ACE-05의 비교를 보여준다.
도 18a-18d는 HCC827(PD-L1 양성 종양) 이종이식편이 접종된 인간화 마우스 모델에서 PBMC 공여자 A 및 공여자 B에서 ACE-05 및 다른 시험 검체의 항 종양 효과를 보여주는 용량 제한 연구의 결과를 보여준다. 도 18a는 ACE-05 및 BiTE-05에 대한 항 종양 효능의 용량 반응을 보여준다. 도 18b 및 도 18c는 각각 ACE-05 및 BiTE-05에 대한 각 투여량 군에서 개별 마우스의 항 종양 효능을 보여준다. 도 18d는 ACE-05 및 BiTE-05 치료군의 개별 체중 감소(%)(부작용)를 보여준다.
본 개시 내용은 다중 결합 도메인을 갖는 새로운 세포 연계 결합 분자를 제공한다. 이들 결합 분자는 본원에서 "항체 유사 세포 연계자"(ALiCE)로 지칭된다. 본원에 제공된 ALiCE 분자는 두 개의 항원 결합 도메인을 갖는다. 제1 항원 결합 도메인에는 2개의 Fab 영역을 갖는다. 제2 항원 결합 도메인은 Fv 영역을 갖는다. 전형적인 ALiCE 분자가 도 1a에 도시되어있다. 일반적으로, 이러한 분자에서 제1 항원 결합 도메인은 Fab 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 일반적으로 CH2 및 CH3 도메인이 천연 항체 구조에서 일반적으로 위치할 위치에서 제1 항원 결합 도메인에 (직접 또는 간접적으로) 부착된다. 예를 들어, 설명된 실시예에서, 중쇄의 C 말단은 CH2 도메인이 아닌 VH 도메인을 포함하고 제2 중쇄의 C-말단은 도메인이 아닌 VL 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 결합 분자는 통상적인 항체 및 기존의 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체)에 비해 많은 이점을 제공한다. 이의 다중 항원 결합 도메인 및 전체적인 구성 디자인으로 인해, 본원에 제공된 결합 분자는 다수의 세포를 함께 가져오는 세포 연계자로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 항원 결합 도메인은 제1 세포에서 발현된 항원에 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 세포에서 발현된 항원에 결합할 수 있으며, 이로써 두 세포를 함께 가져올 수 있다.
특정 실시예에서, 연계된 세포 중 하나는 면역 세포, 예를 들어 세포 독성 T이다. 이러한 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 면역 세포를 지시(directing)하고 활성화하는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 특정 실시예에서, ALiCE 분자의 2가 Fab 부분은 통상적인 항체의 기능성을 유지하면서, 제2 Fc-결여 1가 항원 결합 영역(즉, Fv 영역)은 T 세포와 같은 면역 체계의 이펙터 세포를 인식, 연계, 리디렉팅 및/또는 활성화할 수 있다. 예를 들어, 아래의 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, 항-PD-L1 및 항-CD3 도메인으로 구성된 ALiCE 분자인 ACE-05는 PD-L1 의존성(매개) T 세포 활성화 및 PD-1 및 PD-L1 차단 효능 모두에 대한 상승 효과를 나타낸다.
특정 실시예에서, 완전히 기능적인 Fc 영역의 부재 또는 완전한 CH2 및/또는 CH3 영역의 부재는 특정한 바람직하지 않은 Fc-매개 이펙터 세포 독성을 제거하거나 감소시킨다. 특정 실시예에서, Fv 부분의 VH 및 VL 사슬 사이에서 본연의 상호 작용은 인공적인 조작을 통해 바람직하지 않은 면역원성을 부여하지 않으면서 ALiCE 분자의 이종 이량체화를 촉진한다.
본원에 제시된 약동학(PK) 연구는 BiTE(이중 특이적 T 세포 연계자) 또는 DART(이중 친화성 재표적화)와 같은 다른 형식보다 ALiCE 분자의 더 높은 안정성을 나타낸다.(Campagne O. et al. Integrated Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model of a Bispecific CD3xCD123 DART Molecule in Nonhuman Primates: Evaluation of Activity and Impact of Immunogenicity. Clin Cancer Res. 2018 Jun 1;24(11):2631-2641; Moore P. A. et al. Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51; Moore P. A. et al. Development of MGD007, a gpA33 x CD3-Bispecific DART Protein for T-Cell Immunotherapy of Metastatic Colorectal Cancer. Mol Cancer Ther. 2018 Aug;17(8):1761-1772; Yuraszeck T. et al. Translation and Clinical Development of Bispecific T-cell Engaging Antibodies for Cancer Treatment. Clin Pharmacol Ther. 2017 May;101(5):634-645. 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.) 또한, 예시적인 ALiCE 분자의 생체 내 효능 연구는 유의적인 항암 효과를 보여준다. 이러한 결과는 ALiCE가 항체 공학, 예를 들어 암 치료에 유리한 플랫폼 기술임을 입증한다.
I. 정의
본원에 기술되거나 참조된 테크닉 및 절차는 예를 들어 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic(An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols(Albitar ed. 2010); 및 Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and D
Figure 112020119643358-pct00001
bel eds., 2d ed. 2010)에 기술된 널리 사용되는 방법론과 같이, 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 잘 이해되고/되거나 일반적으로 사용되는 것들을 포함한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 설명에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본원을 해석하기 위해, 다음 용어 설명이 적용되며, 적절할 때마다 단수로 사용되는 용어는 복수를 포함하고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 명시된 용어에 대한 설명이 여기에 참조로 포함된 문서와 충돌하는 경우 아래에 명시된 용어에 대한 설명이 우선한다.
용어 "결합 분자"는 표적 또는 항원에 결합하는 부분 (예를 들어, CDR과 같은 하나 이상의 결합 영역) 및 선택적으로 결합 부분이 폴리펩티드, 단편 또는 에피토프에 대한 결합 단백질의 결합을 촉진하는 입체 형태를 채택 할 수 있도록 하는 스캐폴드 또는 프레임워크 부분(예를 들어, 하나 이상의 스캐폴드 또는 프레임워크 영역)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 본 개시 내용의 맥락에서, 결합 분자는 예를 들어 해리 상수(KD)가 ≤10-7 M 일 때 항원에 특이적으로 결합하거나 선택적으로 결합한다고 언급된다. 일부 실시예에서, 결합 분자는 약 10-7 M 내지 약 10-12 M의 KD로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 결합 분자는 KD가 ≤10-8 M 이거나 KD가 ≤10-9 M 일 때 높은 친화도로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 실시예에서, 결합 분자는 OCTET®에 의해 측정될 때 1 Х 10-9 M 내지 10 Х 10-9 M의 KD로 정제된 인간 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 결합 분자는 0.1 Х 10-9 M 내지 10 Х 10-9 M의 KD로 세포 상에서 발현되는 인간 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예에서, 결합 분자는 약 0.1 Х 10-9 M, 약 0.5 Х 10-9 M, 약 1 Х 10-9 M, 약 5 Х 10-9 M, 약 10 Х 10-9 M 또는 이의 임의의 범위 또는 간격의 KD로 세포상에 발현된 인간 항원에 특이적으로 결합한다. 용어 "결합 분자"는 항체 및 항체로부터 유래된 분자를 포함한다.
용어 "항체", "면역글로불린" 또는 "Ig"는 본원에서 상호교환적으로 및 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 아래에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어 단일 클론 항체(작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 온전한 단일 클론 항체를 포함), 다중 에피토프 또는 단일 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 2개 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중 특이적 항체(예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중 특이적 항체), 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포괄한다. 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 친화성 성숙된 항체뿐만 아니라 예컨대, 마우스 및 토끼 등의 다른 종의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성된 면역글로불린 폴리펩티드 부류 내의 B 세포의 폴리펩티드 생성물을 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 각 쌍은 하나의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 하나의 경쇄(약 25 kDa)를 갖고, 각 사슬의 각 아미노 말단 부분은 약 100 내지 130 개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각 사슬의 각 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. Antibody Engineering(Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); 및 Kuby, Immunology(3d ed. 1997) 참조. 특정 실시예에서, 특정 분자 항원은 폴리펩티드 또는 에피토프를 포함하여 본원에 제공된 항체에 의해 결합될 수 있다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 낙타화 항체, 인트라 바디, 항-이디오 타입 (항-Id) 항체 및 상기 중 임의의 것의 기능적 단편 (예를 들어, 항원 결합 단편)을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 상기 단편은 이것이 유래된 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 일부를 지칭한다. 기능성 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 비 제한적인 예로는 단일 사슬 Fv (scFv)(예를 들어, 단일 특이성, 이중 특이성 등을 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디가 포함된다. 특히, 본원에 제공된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예컨대, 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 항원-결합 도메인 또는 분자(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)을 포함한다. 이러한 항체 단편은 예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference(Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Pluckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry(2d ed. 1990)에서 찾을 수 있다. 본원에서 제공되는 항체는 면역글로불린 분자의 임의의 부류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 하위 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 항체는 작용 항체 또는 길항 항체일 수 있다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 구조이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 천연 존재 또는 합성한 화합물 일 수 있다. 일부 실시예에서, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 특정 실시예에서, 항원은 세포와 연관되어 있고, 예컨대, 면역 세포와 같은 세포 상에 또는 세포 내에 존재한다.
용어 "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역" 및 이와 유사한 용어는 항원과 상호 작용하는 아미노산 잔기를 포함하는 결합 분자의 부분을 지칭하고, 결합 제제에 항원(예를 들어, CDR)에 대한 특이성 및 친화성을 부여한다.
용어 "결합" 또는 "결합함"은 예를 들어 복합체를 형성하는 것을 포함하는 분자 간의 상호 작용을 의미한다. 상호 작용은 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호 작용 및/또는 반데르발스 상호 작용을 포함한 비공유 상호 작용일 수 있다. 복합체는 또한 공유 또는 비공유 결합, 상호 작용 또는 힘에 의해 함께 유지되는 둘 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체의 단일 항원 결합 부위와 항원과 같은 표적 분자의 단일 에피토프 사이의 총 비공유 상호 작용의 강도는 해당 에피토프에 대한 항체 또는 기능적 단편의 친화성이다. 1가 항원에 대한 결합 분자(예컨대, 항체)의 결합 속도(kon)와 해리 속도(koff)의 비율(koff/kon)은 해리 상수 KD이며, 이는 친화도와 반비례한다. KD값이 낮을수록 항체의 친화성이 높아진다. KD의 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 따라 다르며, kon과 koff 모두에 의존한다. 본원에 제공된 항체에 대한 해리 상수 KD는 본원에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서의 친화성은 항상 항체와 항원 간 상호 작용의 진정한 강도를 반영하지는 않는다. 다가 항원과 같은 다중 반복 항원 결정기를 포함하는 복합 항원이 다중 결합 부위를 포함하는 항체와 접촉하는 경우, 한 부위에서 항원과 항체의 상호 작용이 제2 부위에서 반응 확률을 증가시킬 것이다. 다가 항체와 항원 사이의 이러한 다중 상호 작용의 강도를 결합력(avidity)이라고 한다.
본원에 기재된 결합 분자와 관련하여, "-에 결합하는", "-에 특이적으로 결합하는"과 같은 용어 및 이와 유사한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 폴리펩티드와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 결합 분자를 지칭한다. 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 관련 항원과 교차 반응할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 다른 항원과 교차 반응하지 않는다. 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 예를 들어 면역 분석법, Octet®, Biacore® 또는 당업자에게 공지된 다른 테크닉에 의해 확인될 수 있다. 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 방사 면역 분석(RIA) 및 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)과 같은 실험 기법을 사용하여 측정된 임의의 교차 반응 항원보다 높은 친화도로 항원에 결합할 때 항원에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 일반적으로 특정 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 2배 이상이며 배경 신호의 10배 이상일 수 있다. 결합 특이성에 대한 논의는 Fundamental Immunology 332-36(Paul ed., 2d ed. 1989)를 참조. 특정 실시예에서, "비 표적" 단백질에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합 정도는 예컨대, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 RIA에 의해 측정되는 특정 표적 항원에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합의 약 10% 미만이다. "특이적 결합"과 같은 용어와 관련하여, "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 비특이적 상호 작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 과량의 비 표지 표적과 같은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 측정될 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비 표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제되면 특이적 결합이 표시된다. 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 결합 분자가 예를 들어 항원을 표적화하는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.1 nM 이하 또는 이와 동등한 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 서로 상이한 종(예컨대, 인간 및 사이노 종)으로부터의 항원 사이에 보존된 항원의 에피토프에 결합한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체와 같은 결합 단백질)와 그의 결합 파트너(예컨대, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍(예컨대, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1: 1 상호 작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 용어 "Bmax"는 실험 결과로부터 추정되는 최대 결합 친화도를 의미한다. Bmax는 당업계에 공지된 곡선 맞춤 방법, 예를 들어 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 7에 제공된 곡선 맞춤 방법을 사용하여 계산할 수 있다. 결합 파트너 Y에 대한 결합 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저 친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 반면, 고 친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 개시 내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 실시예는 다음을 포함한다. 한 실시예에서, "KD" 또는 "KD 값"은 당업계에 공지된 분석 방법, 예컨대, 결합 분석에 의해 측정될 수 있다. KD는 예컨대, 관심 항체의 Fab 버전과 이의 항원을 사용하여 수행된 RIA에서 측정될 수 있다(Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81). 또한 KD 또는 KD값은 예컨대, Octet® QK384 시스템을 사용하는 Octet® 또는 예컨대, Biacore® TM-2000이나 Biacore® TM-3000을 사용하는 Biacore®에 의한 생물층 간섭계 (BLI) 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 예컨대, Octet® QK384, Biacore® TM-2000 또는 Biacore® TM-3000 시스템을 사용하는 상기에 기술된 동일한 생물층 간섭계(BLI) 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 "온-레이트(on-rate)" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"을 측정할 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "환원"은 예를 들어 2-메르캅토 에탄올(2-ME) 또는 디티오트레이톨(DTT)의 첨가에 의해 단백질 내의 사슬 간 또는 사슬 내 이황화물(S-S) 가교가 변성되거나 감소되어 결과적으로 다중 폴리펩티드 사슬을 초래하는 상태를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "비 환원"은 2-메르캅토 에탄올(2-ME) 또는 디티오트레이톨(DTT)과 같은 변성제 또는 환원제가 부재하여 단백질 내의 사슬 간 또는 사슬 내 이황화물(S-S) 가교가 온전하게 유지되는 상태를 지칭한다.
특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 사슬(들)의 나머지 부분은 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종에서 유래하거나 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동적인 "키메라" 서열을 포함할 수 있다. (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55 참조).
특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 천연 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 상응하는 CDR로부터의 잔기(예를 들어, 공여자 항체)로 대체된 인간 면역글로불린(예를 들어, 수용자 항체)을 포함하는 키메라 항체인 비인간(예: 뮤린)항체의 "인간화" 형태의 일부를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 만들어진다. 인간화 항체 중쇄 또는 경쇄는 적어도 하나 이상의 가변 영역을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 CDR에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 CDR이다. 특정 실시예에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 Fc의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 자세한 내용은, Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-29; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89; 미국 특허 제6,800,738호; 미국 특허 제6,719,971호; 미국 특허 제6,639,055호; 미국 특허 제6,407,213호; 및 미국 특허 제6,054,297호를 참조하라.
특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"의 일부를 포함할 수 있으며, 여기서 상기의 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고 인간 가변 영역 및 예컨대, 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 실시예에서, 상기의 용어는 인간 기원의 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 실시예에서, "완전 인간" 항체는 또한 폴리펩티드에 결합하고 인간 생식 계열 면역글로불린 핵산 서열의 자연 발생 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 코딩되는 항체를 포함할 수 있다. 상기의 용어 "완전 인간 항체"는 Kabat 등에서 기술된 바와 같이 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). "인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., 2006, Nature Protocols 1: 755-68)를 포함한 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한 인간 단일 클론 항체의 제조에 이용 가능한 방법은 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95; 및 van Dijk and van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74에 기술되어 있다. 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만 내인성 유전자좌가 무능화된, 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에 항원을 투여하여 제조될 수 있다(예컨대, Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66; Bruggemann and Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58; 및 XENOMOUSETM 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 미국 특허 제6,150,584호 참조). 또한, 예컨대, 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는, Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62를 참조하라.
특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "재조합 인간 항체"의 일부를 포함할 수 있으며, 이는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포로 형질 감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질 전환 및/또는 염색체 형질 전환된 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)에서 분리된 항체 (예컨대, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조), 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). 그러나, 특정 실시예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이(또는 인간 Ig 서열에 대한 동물 형질 전환이 사용되는 경우 생체 내 체세포 돌연변이)의 대상이 되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체 내 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
특정 실시예에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "단일 클론 항체"의 일부를 포함할 수 있으며, 여기서 본원에 사용된 용어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예컨대, 그 집단에 포함된 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 존재 돌연변이를 제외하고는 동일하고, 각 단일클론 항체는 일반적으로 항원의 단일 에피토프를 인식할 것이다. 특정 실시예에서, 본원에 사용된 "단일 클론 항체"는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생성된 항체이다. 용어 "단일 클론"은 항체를 제조하기 위한 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시 내용에 유용한 단일 클론 항체는 Kohler et al., 1975, Nature 256:495에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아 또는 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단일 클론 항체"는 또한 Clackson et al., 1991, Nature 352:624-28 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97에 기술된 테크닉을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현되는 단일 클론 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 알려져있다. 예컨대, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)를 참조하라.
전형적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종 사량체 당단백질이다. IgG의 경우, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 두 개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 또한 각 H 및 L 사슬은 규칙적으로 간격을 둔 사슬 내 이황화 가교를 가지고 있다. 각 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VH), 이어서 α 및 γ 사슬 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VL) 및 이어서 다른 쪽 끝에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 다양한 부류의 항체 구조 및 특성에 대해서는 예컨대, Basic and Clinical Immunology 71(Stites et al. eds., 8th ed. 1994); 및 Immunobiology(Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)를 참조하라.
용어 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 항원에 결합하는 항체 영역을 지칭한다. 통상적인 IgG는 일반적으로 두 개의 Fab 영역을 포함하며, 각각은 Y형 IgG 구조의 두 팔 중 하나에 있다. 각 Fab 영역은 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄에서 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 보다 구체적으로, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역의 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시 내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩티드 상에 있을 수 있고, VL 및 CL 영역은 기존 IgG의 Fab 영역과 유사하게 별도의 폴리펩티드 상에 있을 수 있다. 대안으로, VH, CH1, VL 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩티드 상에 있을 수 있으며, 아래 섹션에서 더 자세히 설명된 대로 상이한 순서로 배향될 수 있다.
용어 "가변 영역", "가변 도메인", "V 영역" 또는 "V 도메인"은 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 중쇄에서 약 120 내지 130개의 아미노산 길이 및 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노산 길이를 가지며, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성 부여에 사용되는, 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 지칭될 수 있다. 용어 "가변"은 가변 영역의 특정 부분이 항체 간 서열에 있어서 광범위하게 상이하다는 사실을 의미한다. V 영역은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 각각 약 9-12개의 아미노산 길이를 갖는 "초가변 영역"이라고 하는 더 큰 가변성(예를 들어, 극도의 가변성)을 갖는 더 짧은 영역에 의해 분리된 약 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 덜 가변적인(상대적으로 불변적인) 스트레치로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR로 구성되고, 이들은 주로 β 시트 구성을 채택하며, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 부분적으로 β 시트 구조를 형성하는 3개의 초가변 영역으로 연결된다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(예컨대, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)를 참조하라). 불변 영역은 항체를 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포 독성(CDC)에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 가변 영역은 서로 다른 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다. 특정 실시예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
용어 "Kabat에 따른 가변 영역 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 상기한 Kabat 등에서의 항체 편집의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 상응하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 잔기 82 뒤에 3개의 삽입된 잔기(예컨대, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링 된 서열로 항체 서열의 상동성 영역을 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(대략 경쇄의 1-107번 잔기 및 중쇄의 1-113번 잔기)를 지칭할 때 사용된다(예컨대, 상기한 Kabat 등을 참조하라). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 지칭할 때 사용된다(그 예는, 상기 Kabat 등에 보고된 EU 인덱스를 참조하라). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. 예컨대, AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon에 의해 다른 넘버링 시스템이 설명되었다.
"온전한" 항체는 CL 및 적어도 중쇄 불변 영역, CH1, CH2 및 CH3뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함한다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 제한없이 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 및 디-디아바디(예컨대, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-48; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudson et al., 2003, Nat. Med. 9:129-34; WO 93/11161; 및 미국 특허 제5,837,242호 및 제6,492,123호 참조); 단일 사슬 항체 분자(예컨대, 미국 특허 제4,946,778호; 제5,260,203호; 제5,482,858호; 및 제5,476,786호 참조); 이중 가변 도메인 항체 (예컨대, 미국 특허 제7,612,181호 참조); 단일 가변 도메인 항체 (sdAbs)(예컨대, Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; 및 Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49 참조); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.
항체와 관련하여 용어 "중쇄"가 사용되는 경우, 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭하며, 여기서 아미노 말단 부분은 약 120 내지 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지칭되는 5가지 구별되는 유형(예를 들어, 이소형) 중 하나 일 수 있다. 구별되는 중쇄는 그 크기가 다르다: α, δ 및 γ는 약 450 개의 아미노산을 포함하고, μ 및 ε은 약 550 개의 아미노산을 포함한다. 이러한 구별되는 유형의 중쇄가 경쇄와 결합될 때, 각각 IgG의 4개의 하위 부류, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4을 포함하는, 5 개의 잘 알려진 항체 부류(예를 들어, 이소형), IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 생성한다.
항체와 관련하여 용어 "경쇄"가 사용되는 경우, 약 25 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭하며, 여기서 아미노 말단 부분은 약 100 내지 약 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카르복시 말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211-217개이다. 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 또는 람다(λ)라고 지칭하는 두 가지 구별되는 유형이 있다.
본문에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR", "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 상호 교환적으로 사용된다. "CDR"은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비 프레임워크 영역 내 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비 프레임워크 영역 내 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 의미한다. 따라서 CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다.
CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며 잘 알려진 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며 가장 일반적으로 사용된다(예컨대, 상기한 Kabat 등 참조). 대신 Chothia는 구조적 루프의 위치를 나타낸다(예컨대, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-17 참조). Kabat 넘버링 규칙을 사용하여 넘버링 할 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다(이는 Kabat 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 위치시키고; 35A와 35B가 모두 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재하는 경우 루프는 33에서 끝나며; 35A와 35B가 모두 존재하면 루프는 34에서 끝나기 때문이다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충안을 나타내며 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다(예컨대, Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dubel eds., 2d ed. 2010) 참조). "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 개발되고 널리 선택된 또 다른 범용 넘버링 체계는 ImMunoGeneTics (IMGT) Information System®이다(Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77). IMGT는 인간 및 다른 척추 동물의 면역글로불린 (Ig), T 세포 수용체 (TCR) 및 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 전문화된 통합 정보 시스템이다. 여기서, CDR은 경쇄 또는 중쇄 내의 아미노산 서열과 위치 모두의 측면에서 지칭된다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내에서 CDR의 "위치"가 종 간에 보존되고 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용하여 루프라고 하는 구조에 존재하므로, CDR 및 프레임워크 잔기가 쉽게 식별될 수 있다. 이 정보는 한 종의 면역글로불린 CDR 잔기를 일반적으로 인간 항체에서의 수용체 프레임워크로 이식하고 대체하는 데 사용할 수 있다. Honegger and Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70에 의해 추가적인 넘버링 시스템 (AHon)이 개발되었다. 예를 들어 Kabat 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함하는 넘버링 시스템 간의 대응은 당업자에게 잘 알려져있다(예컨대, 상기한 Kabat; Chothia and Lesk; Martin; Lefranc et al. 참조). 이들 초가변 영역 또는 CDR 각각의 잔기는 아래에 언급되어 있다.
표 1: 초가변 영역 또는 CDR의 잔기
주어진 CDR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 따라 다양할 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대, 가변 영역의 용어 "CDR" 및 "상보성 결정 영역" 뿐만 아니라, 항체 또는 이의 영역의 개별 CDR(예컨대, CDR-H1, CDR-H2)은 상기 본원에 기재된 임의의 공지된 체계에 의해 정의된 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, Kabat, Chothia 또는 Contact 방법에 의해 정의된 CDR과 같이, 특정 CDR 또는 CDR들의 식별을 위한 체계가 지정된다. 다른 경우에는 CDR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
초가변 영역은 다음과 같은 "확장 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH에서 26-35 또는 26-35A(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3).
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호 작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카르복시 말단 부분을 의미한다. 상기의 용어는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 영역인 면역글로불린의 나머지 부분에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역과 경쇄의 CL 영역을 포함할 수 있다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 CDR에 인접한 가변 영역 잔기를 지칭한다. FR 잔기는 예컨대, 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체, 디아바디, 선형 항체 및 이중 특이적 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 예컨대, 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 종종 Cys226 위치의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230로부터 이의 카르복시 말단까지 연장되도록 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예컨대, 항체의 생산 또는 정제 중에, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. "기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. "이펙터 기능"의 예시로는 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식균 작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절 등이 포함된다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 영역 또는 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 결합될 것을 요구하며 이는 당업자에게 알려진 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다. "변이 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대, 치환, 추가 또는 결실)으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 다른 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환, 예컨대, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 또는 상기의 영역과 적어도 약 90%의 상동성, 예컨대, 상기의 영역과 적어도 약 95%의 상동성을 가질 수 있다.
폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막 횡단 도메인 및 세포질 도메인이 없는 폴리펩티드의 형태 또는 일부를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 막 횡단 도메인 및/또는 세포질 도메인의 1% 미만을 가질 수 있고, 상기 도메인의 0.5% 미만을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "에피토프"는 당업계의 용어이고 결합 분자(예컨대, 항체)가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체 구조(conformational), 비선형 또는 불연속 에피토프 일 수 있다. 폴리펩티드 항원의 경우, 예를 들어, 에피토프는 폴리펩티드의 인접 아미노산("선형" 에피토프)일 수 있으며, 에피토프는 폴리펩티드의 2개 이상의 비-인접한 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다("입체 구조", "비-선형" 또는 "불연속" 에피토프). 일반적으로 선형 에피토프는 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존하거나 의존하지 않을 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 결합 분자는 천연 3차원 단백질 구조에서 폴딩 (folding) 여부에 관계없이 일 군의 아미노산에 결합한다. 다른 실시예에서, 결합 분자는 에피토프를 인식하고 이에 결합하기 위해, 특정 입체 구조(예컨대, 구부리기, 꼬임, 뒤집기 또는 접힘)를 나타내도록 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기를 필요로 한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수도 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예컨대, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형으로 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 비-천연 아미노산뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 비제한적으로 포함하는, 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 포함된다. 본 개시 내용의 폴리펩티드는 항체 또는 면역글로불린 수퍼 패밀리의 다른 구성원에 기초할 수 있기 때문에, 특정 실시예에서 "폴리펩티드"는 단일 사슬 또는 2개 이상의 연관된 사슬로 존재할 수 있음을 알 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포로 핵산 서열을 도입하기 위해, 예컨대, 본원에 기재된 결합 분자(예컨대, 항체)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 운반 또는 포함하는데 사용되는 물질을 지칭한다. 사용될 수 있는 벡터에는 숙주 세포의 염색체에 안정적으로 통합되도록 작동 가능한 선택 서열 또는 마커를 포함할 수 있는, 예컨대, 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피좀 및 인공 염색체가 포함된다. 추가적으로, 벡터에는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 조절 서열이 포함될 수 있다. 포함될 수 있는 선택 가능한 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성을 제공하거나 영양 요구성 결핍을 보완하거나 배양 배지에 없는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 조절 서열에는 당업계에 잘 알려진 항시성 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등이 포함될 수 있다. 둘 이상의 핵산 분자가 공동 발현되어야 하는 경우(예컨대, 항체 중쇄 및 경쇄 또는 항체 VH 및 VL), 두 핵산 분자는 예를 들어 단일 발현 벡터에 삽입되거나 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 코딩 핵산은 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되거나, 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 항시성 프로모터와 같은 상이한 발현 조절 서열에 연결될 수 있다. 핵산 분자의 숙주 세포로의 도입은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어, 핵산 분석, 예컨대, 노던 블롯 또는 mRNA의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 유전자 산물의 발현에 대한 면역 블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열의 발현 또는 이의 상응하는 유전자 산물을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법이 포함된다. 당업자는 핵산 분자가 원하는 생성물을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해하고, 발현 수준은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 얻기 위해 최적화될 수 있음을 추가로 이해한다.
본원에 사용된 용어 "숙주"는 포유 동물(예컨대, 인간)과 같은 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손으로 형질 감염될 수 있는 특정 대상 세포를 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 숙주 세포 유전체으로의 핵산 분자의 통합 또는 세대를 이어나가는 과정에서 발생할 수 있는 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 핵산 분자로 형질 감염된 모 세포와 동일하지 않을 수 있다.
"분리된 핵산"은 자연적으로 천연 서열을 수반하는, 리보솜 및 중합 효소와 같은 복합체 또는 단백질뿐만 아니라, 다른 게놈 DNA 서열로부터 실질적으로 분리된 핵산, 예컨대, RNA, DNA 또는 혼합된 핵산을 의미한다. "분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 자연적인 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합 테크닉에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 분리되거나 정제된다. 이 용어는 천연에 존재하는 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분리된 형태의 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시 리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합 효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "올리고 뉴클레오티드"는 일반적으로, 그러나 필수적이지는 않는, 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만의 짧은, 일반적으로 단일 가닥의 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고 뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기의 설명은 올리고 뉴클레오티드에 동일하게 완전히 적용 가능하다. 본 개시 내용의 결합 분자를 생산하는 세포에는 항체를 코딩하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵 숙주 세포뿐만 아니라 모 하이브리도마 세포가 포함될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향을 5' 방향이라고 지칭한다. 초기(nascent) RNA 전사체의 5'에서 3' 추가 방향을 전사 방향이라고 지칭하고; RNA 전사체의 5'에서 5' 말단에 있는 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭하고; RNA 전사체의 3'에서 3' 말단에 있는 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역을 "하류 서열"이라고 지칭한다.
본원에 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유 동물에 독성을 가지지 않는, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 인산염, 구연산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함한 항산화제; (예컨대, 약 10개 미만의 아미노산 잔기를 갖는) 저 분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 비 이온성 계면 활성제, 예컨대, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™ 이 포함된다. 용어 "담체"는 또한 희석제, (완전 또는 불완전한) 프로인트 보조제와 같은 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 약학적 담체를 포함하는 이러한 담체는 석유, 동물성, 식물성, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 멸균 액체 일 수 있다. 물은 조성물(예컨대, 약학 조성물)을 정맥 내로 주사할 때 사용되는 예시적 담체이다. 또한 식염수 용액과 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히, 주사 용액을 위한 액체 담체로 사용될 수 있다. 적합한 부형제(예컨대, 제약 부형제)는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구 조성물은 제약 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)에 설명되어 있다. 약학 화합물을 포함하는 조성물은 적합한 양의 담체와 함께, 예를 들어 분리되거나 정제된 형태의 결합 분자(예컨대, 항체)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 동물에게, 보다 구체적으로는 인간에게 사용하기 위해 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 결과를 생성하기에 충분한 결합 분자(예컨대, 항체) 또는 본원에 제공된 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 실시예에서, 대상체는 포유 동물, 예컨대 비 영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)이다. 특정 실시예에서, 대상체는 인간이다. 한 실시예에서, 대상체는 질환 또는 장애로 진단된 인간과 같은 포유 동물이다. 또 다른 실시예에서, 대상체는 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 인간과 같은 포유 동물이다.
"투여하다" 또는 "투여"는 점막, 피내, 정맥 내, 근육 내 전달, 및/또는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법으로 신체 외부에 존재하는 물질을 환자에게 주입하거나, 달리 물리적으로 전달하는 행위를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법의 투여로 인한 질병 또는 질환의 진행, 중증도 및/또는 기간의 감소 또는 개선을 지칭한다.
용어 "약" 및 "대략"은 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 주어진 값이나 범위의 이하를 의미한다.
본 개시 내용 및 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
본원에서 용어 "포함하는"을 사용하여 실시예가 설명되는 경우, "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 측면에서 설명된 유사한 실시예가 또한 제공됨을 이해한다. 또한, "본질적으로 구성되는"이라는 문구로 실시예가 본원에서 설명되는 경우, 또한 "구성된"의 측면에서 설명된 유사한 실시예가 제공됨을 이해한다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A와 B 둘 다; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)을 포함하도록 의도되는 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음 실시예 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. 결합 분자
다중 항원 결합 도메인(예컨대, 2개의 항원 결합 도메인)을 포함하는 결합 분자 (ALiCE)가 본원에서 제공된다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 다중 항원 결합 도메인은 세포를 연계시키거나, 세포를 면역 세포로 가져오거나, 면역 세포를 리디렉팅하는데 유용하다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 2개의 항체 Fab 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 항체 Fv 영역을 포함한다. 2개의 Fab 영역 각각은 2개의 부분을 포함한다: 항체 가변 중쇄 (VH) 영역 및 항체 CH1 영역을 갖는 제1 부분; 및 항체 가변 경쇄 (VL) 영역 및 항체 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 항체 경쇄(LC)를 포함하는 제2 부분. 2개의 Fab 영역 각각은 항원에 결합한다. 제2 항원 결합 도메인의 Fv 영역은 VH 영역 및 항체 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다. 2개의 Fab 영역은 Fv 영역에 연결된다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시 내용은
(a) (i) 항체 가변 중쇄(VH) 영역 및 항체 CH1 영역을 포함하는 제1 부분으로서, 항체 CH2 영역 및 항체 CH3 영역을 포함하지 않는 제1 부분; 및
(ii) 항체 가변 경쇄(VL) 영역 및 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체 경쇄(LC)를 포함하는 제2 부분
을 각각 포함하는, 2개의 항체 Fab 영역을 포함하되, 상기 2개의 항체 Fab 영역은 각각 항원에 결합하는, 제1 항원 결합 도메인, 및
(b) VH 영역 및 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 Fv 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하는 결합 분자로서,
제2 항원 결합 도메인은 면역 세포 상에 존재하는 항원에 결합하고; 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 연결되어 있는, 결합 분자를 제공한다.
Fab 영역(즉, 항원 결합 단편)은 항원에 결합하는 항체 영역이다. 통상적인 IgG는 일반적으로 2개의 Fab 영역을 포함하며, 각각은 Y 형 IgG 구조의 두 팔의 하나에 존재한다. 각 Fab 영역은 전형적으로 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 보다 구체적으로, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역의 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시 내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩티드에 있을 수 있고, VL 및 CL 영역은 기존 IgG의 Fab 영역과 유사하게 별도의 폴리펩티드에 있을 수 있다. 대안적으로, VH, CH1, VL 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩티드 상에 있을 수 있고 아래에 더 상세히 설명된 바와 같이 상이한 순서로 배향될 수 있다.
Fv 영역은 VH 영역과 VL 영역을 포함하는 항원 결합 영역이다. Fv 영역의 VH 및 VL 영역은 본 개시 내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 영역은 동일하거나 별개의 폴리펩티드에 존재할 수 있다. VH 및 VL 영역이 동일한 폴리펩티드에 있는 경우, 아래에 더 상세히 설명한 바와 같이 상이한 순서로 배향될 수 있다.
상기 섹션 I에서 설명한 바와 같이, 용어 "가변 영역"은 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 위치하고, 중쇄에 약 120-130개의 아미노산과 경쇄에 약 100-110개의 아미노산 길이를 갖고, 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 특이성 부여 및 결합에 사용되는, 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 지칭될 수 있다.
용어 "불변 영역"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호 작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카르복시 말단 부분을 지칭한다. 상기의 용어는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 영역인 면역글로불린의 나머지 부분에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 영역은 항원을 파괴하는 데 사용되는 메커니즘을 결정할 수 있다. 항체는 불변 영역 구조와 면역 기능에 따라 IgM, IgG, IgA, IgD 및 IgE의 다섯 가지 주요 부류로 나뉜다. IgG는 γ 중쇄를 특징으로 하는 면역글로불린의 부류이다. 이는 혈장에서 발견되는 가장 풍부한 종류의 면역글로불린이다. 경쇄의 불변 영역은 "CL"이라고 지칭된다. 다중 중쇄 C 도메인 (CH 도메인)은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 예컨대, CH1, CH2, CH3 등과 같이 넘버링 된다. 이들 항체 부류의 임의의 CL 및 CH1 영역이 본 개시 내용에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 CL 및 CH1 영역은 IgG1과 같은 IgG 유형이다. 본원에 제공된 Fab 영역의 대표적인 CL 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
본원에 제공된 Fab 영역의 대표적인 CH1 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
"제1 부분이 항체 CH2 영역 및 항체 CH3 영역을 포함하지 않는다"라는 문구는 본원에서 제1 부분이 완전한 항체 CH2 영역 또는 완전한 CH3 영역을 포함하지 않음을 의미하기 위해 사용된다. 그러나, 이러한 문구는 CH2 영역 및/또는 CH3 영역의 일부가 제1 부분에 포함되는 실시예를 배제하는 것은 아니다. 또한, 특정 실시예에서, 완전한 CH2 및/또는 CH3 활성(예컨대, 이펙터 기능)을 나타내지 않는 CH2 및/또는 CH3 변이 또는 절단이 포함될 수 있다. Fc 수용체 결합 분석 또는 ADCC 활성 분석 또는 Fc 영역 관련 기능을 결정하기 위한 다른 잘 알려진 분석과 같은 분석은 CH2 및/또는 CH3 활성 (또는 Fc 영역 활성)이 완전히 유지되는지 결정하기 위해 본원에서 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분 및 제2 부분은 별개의 폴리펩티드 상에 존재한다. 2개의 Fab 영역 각각은 또한 선택적으로 단일 사슬 Fab 영역일 수 있다. 따라서, 다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인의 두 Fab 영역의 제1 부분 및 제2 부분은 동일한 폴리펩티드 상에 존재할 수 있다. 다른 실시예에서, 2개의 Fab 영역 중 하나의 제1 부분 및 제2 부분은 동일한 폴리펩티드 상에 있다. Fab 영역이 단일 사슬 Fab인 실시예(즉, Fab 영역의 제1 부분 및 제2 부분이 동일한 폴리펩티드 상에 있음)에서, Fab 영역은 N-말단에서 C-말단으로 다음의 순서로 배향될 수 있다: VH-CH1-VL-CL. 대안적으로, 단일 사슬 Fab 영역은 N-말단에서 C-말단으로 다음의 순서로 배향될 수 있다: VL-CL-VH-CH1.
유사하게, 특정 실시예에서, Fv 영역의 VH 영역 및 VL 영역은 별개의 폴리펩티드 상에 있다. 다른 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인의 Fv 영역은 단일 사슬 Fv이다(즉, Fv 영역의 VH 영역 및 VL 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 존재함). 이러한 단일 사슬 Fv 구체예에서, Fv 영역은 N-말단에서 C-말단으로 VH-VL의 순서로 배향될 수 있거나, N-말단에서 C-말단으로 VL-VH의 순서로 배향될 수 있다.
일부 특정 실시예에서, 각 Fab 영역의 두 부분은 별도의 폴리펩티드에 있고 Fv 영역의 VH 및 VL 영역 또한 별도의 폴리펩티드에 있다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 유연 펩티드 영역에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 본원에 제공된 IgG 힌지 영역은 다양한 IgG 서브 타입의 항체 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 아래의 표 2는 본원에 제공된 유연 펩티드 영역에 포함될 수 있는 코어 힌지 서열을 갖는 예시적인 IgG 서브 타입을 나타낸다.
표 2: IgG 서브 타입의 예
따라서, 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다. 일부 특정 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정한 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정한 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 추가적인 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 Fv 항원 결합 도메인 사이에 G4S와 같은 링커를 추가로 포함한다. 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이의 유연 링커는 제2 Fv 도메인의 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 제2 Fv 도메인의 개선된 결합 친화도는 표적 세포(예컨대, 암 세포)에 대한 면역 세포(예를 들어, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)의 리디렉팅 효율을 증가시킬 수 있다. ALiCE의 제2 Fv 도메인의 파라토프가 ALiCE의 제1 Fab 도메인에 의해 구조적으로 마스킹(masking) 되기 때문에, 제2 Fv 도메인은 면역 세포(예컨대, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 제시된 표면 항원과 상호 작용하고 그에 결합할 수 있도록 구부러져야 한다. 따라서 입체 장애를 줄이고 면역 세포(예컨대, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 대한 제2 Fv 도메인의 결합을 최적화하기 위해, G4S와 같은 유연 링커가 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이에 도입될 수 있다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS(G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 n이 정수인 (G4S)n의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 링커는 (G4S)1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)3의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)4의 아미노산 서열을 포함한다. 상이한 유연성을 가진 링커를 설계하고 구성하는 다른 방법은 예컨대, Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2014, 27(10): 325-330 및 DiGiammarino et al., Landes Bioscience, 2011, 3(5): 487-494에 자세히 설명되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 제공된 결합 분자는 임의로 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 도 1b는 이러한 예시적인 결합 분자를 도시한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 Fv 영역의 VH 영역에 연결된 제1 CH3 영역 및 Fv 영역의 VL 영역에 연결된 제2 CH3 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, CH 영역은 Fv 영역의 VH 및 VL 영역의 C-말단에 연결된다. CH3 영역의 존재는 본원에 제공된 결합 분자의 Fc 수용체 결합 능력을 제공한다. 일부 실시예에서, Fv 영역에 연결된 CH3 영역은 KiH(knobs-into-holes) 기술 또는 정전기 조향(electrostatic steering)과 같은 종래의 기술을 사용하여 두 CH3 영역 간의 결합을 촉진하거나 강화하도록 조작된다. 예를 들어, 놉-인투-홀은 원래 인접한 α-나선 사이의 아미노산 측쇄 패킹을 위한 모델로 제안되었으나, 나중에 이종 이량체화를 위한 항체 중쇄 동종 이량체의 조작에 효과적인 설계 전략으로 입증되었다. 요약하자면, 이 접근법의 특정 실시예에서, '놉' 변이는 하나의 IgG CH3 도메인에서 작은 아미노산을 더 큰 아미노산으로 대체함(예를 들어, T에서 Y로 치환)으로써 먼저 수득될 수 있다. 놉은 큰 잔기를 보다 작은 잔기로 대체(예컨대, Y에서 T로 치환)하여 생성된 또 다른 IgG CH3 도메인의 '홀'에 삽입되도록 설계되었다. 놉-인투-홀 기술은 예컨대, WO 96/027011, Ridgway et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621, 및 Merchant et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681에 몇 가지 예와 함께 상세히 설명되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2개의 CH3 영역 사이의 결합을 촉진하거나 강화하기 위해 CH3 영역을 변형하는 다른 잘 알려진 기술도 본 개시 내용에서 고려된다.
인간 혈청 알부민과 같은 알부민은 생물학적 약물의 혈청 반감기를 증가시키는 데 사용되어왔다. Dennis et al., The Journal of Biological Cheminstry, 2002, 277 (38): 35035-35043; Adams et al., MABS, 2016, 8(7): 1336-1346를 참조하라. 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)이 사용되어 왔다. HSA는 혈액에서 가장 풍부한 단백질로 조직에 널리 분포하고 비 급성 기능을 갖는다. 이는 19일의 반감기를 가진다. 따라서, 일부 실시예에서, HSA와 같은 알부민은 본원에서 제공된 결합 분자의 반감기를 증가시키기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 알부민은 여러 가지 방법으로 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 접근법은 HSA와 같은 알부민 도메인을 유전적으로 또는 화학적으로 본원에 제공된 결합 분자에 직접 커플링하는 것이다. 또 다른 예시적인 접근법은 알부민 결합 도메인 (ABD) 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 사용하는 것이다.
따라서, 본원에서 제공되는 결합 분자는 또한 하나 이상의 알부민 결합 도메인 (ABD) 또는 알부민 결합 부위 (ABS)를 임의로 포함할 수 있다. 도 1c는 이러한 예시적인 결합 분자를 도시한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 ABS는 내인성 알부민과의 결합을 매개하여, 본원에 제공된 결합 분자의 치료 효과를 향상시키고/시키거나 반감기가 연장되는 것을 돕는다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 ABS는 또한 알부민에 대한 비공유 결합을 통해 약동학적 개선에 도움을 줄 수 있다. 일부 실시예에서, ABS는 Fv 영역의 VH 영역 C-말단에 연결된다. 다른 구체예에서, ABS는 Fv 영역의 VL 영역 C-말단에 연결된다. 또 다른 구체예에서, Fv 영역의 VL 및 VH 영역 각각의 C-말단은 ABS에 연결된다. 다른 실시예에서, ABS는 Fab 영역 중 적어도 하나의 CL 영역에 연결된다.
특정 실시예에서, 결합 분자는 하나 이상의 HSA와 같은 알부민 도메인을 임의로 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 알부민 도메인은 Fv 영역의 VH 영역 C-말단에 연결된다. 다른 구체예에서, 알부민 도메인은 Fv 영역의 VL 영역 C-말단에 연결된다. 또 다른 구체예에서, Fv 영역의 VL 및 VH 영역 각각의 C-말단은 알부민 도메인에 연결된다. 다른 구체예에서, 알부민 도메인은 Fab 영역 중 적어도 하나의 CL 영역에 연결된다.
본원에 제공된 결합 분자의 Fv 영역 및 2개의 Fab 영역은 각각 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 2개의 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다.
다른 실시예에서, 2개의 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 2개의 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 2개의 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
2개의 Fab 영역이 동일한 항원(제1 항원)에 결합할 때, 제1 항원은 Fv 영역에 의해 결합된 항원(제2 항원)과 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다. 도 1e는 제1 항원 결합 도메인 (2개의 Fab 영역)이 암 항원에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인이 CD3와 같은 항원을 통해 T 세포와 같은 면역 세포에 결합하는 ALiCE 분자의 예시를 제공한다. 이러한 ALiCE 분자는 T 세포와 같은 면역 세포를 암 세포에 연계시킬 수 있으므로, 암 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 (a) 제1 항원에 대한 결합 친화성을 제공하는 (제1 항원 결합 도메인의) 2개의 Fab 영역 및 (b) 제2 항원에 대한 결합 친화성을 제공하는 (제2 항원 결합 도메인의) Fv 영역을 포함하는 이중 특이적 결합 분자이다. 제1 항원 결합 도메인은 하나의 세포에 있는 표면 단백질의 세포외 도메인에 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 도메인은 면역 세포에 있는 표면 단백질의 세포외 도메인에 결합할 수 있어서, 두 세포를 함께 가져올 수 있다.
(2개의 Fab 영역을 갖는) 제1 항원 결합 도메인은 암 세포에 결합할 수 있다. 또한 이는 비 암세포에도 결합할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1과 같은 암 항원이다. 다른 구체예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 구현예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 특정 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인은 N-말단에 있고 N-말단에서 천연 항체 구조를 유지하는 반면, 제2 항원 결합 도메인은 C-말단에 있고 두 중쇄의 C-말단 CH2 및 CH3 도메인은 각각 단일 VH 및 VL 도메인으로 치환된다. 도 1a는 이러한 ALiCE 분자의 예시이다. 보다 구체적으로, 각 Fab 영역의 제1 부분과 제2 부분은 별도의 폴리펩티드에 있고, 제1 항원 결합 도메인은 제1항원에 결합하고, Fv 영역의 VH 영역과 VL 영역은 별도의 폴리펩티드 상에 존재하며, 제2 항원 결합 도메인은 면역 세포에 존재하는 제2 항원에 결합하고 제1 항원과 제2 항원은 서로 다른 항원이다.
따라서, 한 특정 구체예에서, 본원에 제공된 결합 분자는
(a) (i) 항체 가변 중쇄(VH) 영역 및 항체 CH1 영역을 포함하는 제1 부분으로서, 항체 CH2 영역 및 항체 CH3 영역을 포함하지 않는 제1 부분; 및
(ii) 항체 가변 경쇄(VL) 영역 및 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체 경쇄(LC)를 포함하는 제2 부분을 각각 포함하는, 2개의 항체 Fab영역을 포함하되,
제1 부분과 제2 부분은 별도의 폴리펩티드에 있고; 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하는, 제1 항원 결합 도메인, 및
(b) VH 영역 및 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 Fv 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인으로서, VH 영역 및 VL 영역은 별개의 폴리펩티드 상에 있고; 면역 세포 상에 존재하는 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 및 제2 항원은 서로 다른 항원이다.
일부 실시예에서, 하나의 Fab 영역의 제1 부분 및 Fv 영역의 VH 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 있고, 나머지 Fab 영역의 일부 및 Fv 영역의 VL 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 있다. 따라서, 일부 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는
(a) (i) 항체 가변 중쇄(VH) 영역 및 항체 CH1 영역을 포함하는 제1 부분으로서, 항체 CH2 영역 및 항체 CH3 영역을 포함하지 않는 제1 부분; 및
(ii) 항체 가변 경쇄(VL) 영역 및 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 항체 경쇄(LC)를 포함하는 제2 부분을 각각 포함하는, 제1 항체 Fab영역 및 제2 항체 Fab영역을 포함하는 제1 항원 결합 도메인으로서, 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인,
(b)VH 영역 및 항체 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 Fv 영역을 포함하는 제2 항원 결합 도메인으로서, 면역 세포 상에 존재하는 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인
을 포함하고,
여기서 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 항원이고;
제1 Fab 영역의 제1 부분 및 Fv 영역의 VH 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 있고; 제2 Fab 영역의 제1 부분 및 Fv 영역의 VL 영역은 동일한 폴리펩티드 상에 있다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1과 같은 암 항원이다. 다른 구체예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 구현예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 결합 분자는 4개의 펩티드(2개의 항체 경쇄 및 2개의 중쇄 유사 사슬)를 포함하고, 이들의 전체적인 구조는 IgG의 Fc 영역이 Fv 영역으로 대체된다는 점을 제외하고는 일반적인 IgG와 유사하다. 이 구조는 다양한 속성을 부여하는 변이체를 생성하도록 추가로 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는
(a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드
(b) 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역, 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
(c) 제3 VH 영역 및 제2 CH1, 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
을 포함하고,
제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 CH1 영역 및 제1 VH 영역이 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성하고;
제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제2 CH1 영역 및 제3 VH 영역은 제2 항원 Fab 영역을 형성하고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 2개의 동일한 경쇄 (제1 및 제2 폴리펩티드) 및 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬 (제3 및 제4 폴리펩티드)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체는 IgG 힌지 영역이다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다. 일부 특정 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정한 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 본원에 제공된 유연 펩티드 영역은 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 추가 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 Fv 항원 결합 도메인 사이에 G4S와 같은 링커를 추가로 포함한다. 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이의 유연 링커는 제2 Fv 도메인의 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 제2 Fv 도메인의 개선된 결합 친화도는 암 세포와 같은 표적 세포에 대한 면역 세포 (예를 들어, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)의 리디렉팅 효율을 증가시킬 수 있다. ALiCE의 제2 Fv 도메인의 파라토프가 ALiCE의 제1 Fab 도메인에 의해 구조적으로 마스킹되기 때문에, 제2 Fv 도메인은 면역 세포(예컨대, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 제시된 표면 항원과 상호 작용하고 그에 결합할 수 있도록 구부러져야 한다. 따라서 입체 장애를 줄이고 면역 세포(예컨대, T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 대한 제2 Fv 도메인의 결합을 최적화하기 위해 G4S와 같은 유연 링커가 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이에 도입될 수 있다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS (G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 n이 정수인 (G4S)n의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 링커는 (G4S)1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)3의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다. 다른 구체예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, Fv 영역은 제2 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 다른 구체예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 실시예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 이펙터 세포상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 또는 세포 독성 T 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 헬퍼 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 조절 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포 독성 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD8 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 CD4 + T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 세포외 도메인을 포함한다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 및 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
전술한 바와 같이, 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬을 포함한다. CHO 또는 HEK293과 같은 포유류 세포에서 재조합 단백질을 만들기 위해서는 ER에서 발생하는 항체 어셈블리 및 품질 관리 시스템을 이해하는 것이 매우 중요하다. 항체는 테트라머 H2L2로 조립 및 분비되며, 품질 관리 기구는 BiP 및 PDI에 의해 ER에서 매우 엄격하게 조절된다. 중쇄의 펼쳐진 CH1 도메인은 BiP 의존 방식으로 항체 어셈블리의 조절 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하기 실시예 섹션에서 설명된 바와 같이, 본 개시 내용은 항체 VH 도메인이 또한 항체 어셈블리의 역할을 갖고 있음을 보여주고, (하나는 Fab 영역, 하나는 Fv 영역에 있는) 2개의 VH 영역을 포함하는 본원에 제공된 결합 분자의 중쇄 유사 사슬이 결합 분자의 적절한 어셈블리에 기여한다는 것을 보여준다.
C-말단 Fv는 또한 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬(제3 및 제4 폴리펩티드)의 이종 이량체화에 중요한 역할을 갖는다. VH와 VL 영역 사이의 상호 작용이 VL-VL 상호 작용보다 훨씬 강하기 때문에, VH-VL 상호 작용은 2개의 다른 중쇄 유사 사슬 (제3 및 제4 폴리펩티드) 사이에서 이종 이량체화를 만들기 위해 선택되었다. 이종 이량체화의 효율은 매우 높은 것으로 확인되었으며, 포유류 세포에서 발현 및 정제된 대부분의 결합 분자는 이종 이량체화된 형태였다(99 %에 가까운 이종 이량체화 효율).
또한, 이 구조는 표적 세포와 이펙터 세포 사이의 최적의 시냅스 거리를 제공한다. N-말단 2개의 Fab 영역과 C-말단 Fv 영역의 거리는 40Å로 추정되었다. 또한, 본원에 제공된 결합 분자는 BiTE, DART 및 다른 ScFv 기반 이중 특이적 항체 형식과 같은 다른 공지된 이중 특이적 항체보다 더 큰 접힘 복잡성(folding complexity)(분자 크기)을 가지며, 따라서 개선된 열역학적 안정성을 가질 것으로 예상된다.
또한, 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 2개의 Fab 영역 (N-말단 F(ab')2)이 암 항원과 같은 제1 항원에 결합하고 Fv 영역이 T 세포와 같은 면역 세포에 결합하는 이중 특이적 결합 분자이다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 예를 들어 최대 항-종양 활성을 위해 항체 기능 및 면역 리디렉팅(예컨대, T 세포 리디렉팅)의 상승 효과를 제공하기 위해 Y-형으로 설계 및 구축된다. ALiCE 분자의 구성(주로 Y-형으로 존재)은 두 항원 결합 도메인(두 개의 표적 파라토프) 사이에 최적의 면역학적 시냅스 거리를 부여하고, 세포(예컨대, T 세포)의 다른 세포(예컨대, 종양 세포)로의 기능적 리디렉팅을 최대화하도록 설계된다. 또한, 높은 친화성 및 2가 N-말단 (2개의 Fab 영역)이 제공되며, 동시에 면역 세포 항원에 대한 Fv 영역의 1가 및 낮은 친화성으로 인해 원치 않는 표적 비 의존성 T 세포 활성화는 감소된다.
결합 분자는 결합 분자의 도메인 사이의 거리에 영향을 미칠 수 있는 상이한 구성을 가질 수 있다고 알려져 있다(Zhang X. et al. 3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed by IndividualParticle Electron Tomography. Scientific Reports 5, Article number: 9803 (2015); Klein J. S. et al. Examination of the contributions of size and avidity to the neutralization mechanisms of the anti-HIV antibodies b12 and 4E10. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 5;106(18):7385-90; 두 참고 문헌 모두 전체가 참조로 포함됨). 특정 실시예에서, ALiCE 분자는 상이한 구성을 가질 수 있고, 예를 들어, Y-형상 또는 T-형상으로 존재할 수 있다. 특정 실시예에서, ALiCE 분자의 상이한 구성은 ALiCE 분자에서 N-말단 2개의 Fab 영역과 C-말단 Fv 영역 사이의 상이한 거리에 기여할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자에서 N-말단 2개의 Fab 영역과 C-말단 Fv 영역 사이의 거리는 약 40 Å 내지 약 70 Å의 범위에 있는 것으로 추정될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자에서 N-말단 2개의 Fab 영역과 C-말단 Fv 영역 사이의 거리는 약 42 Å인 것으로 추정될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자에서 N-말단 2개의 Fab 영역과 C-말단 Fv 영역 사이의 거리는 약 60 Å인 것으로 추정될 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 다양한 이중 특이적 결합 분자에서, 제1 항원에 대한 제1 항원 결합 도메인의 결합 친화도는 제2 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합 친화도보다 높다. 예를 들어, 아래의 실시예 3에 나타난 바와 같이, 인간 PD-L1에 대한 ACE-05의 결합 동역학은 모 항-PD-L1 항체(즉, Y-Biologics, Inc.의 YBL-007)와 비견할 만했다(도 12a-12c 참조). 대조적으로, CD3에 대한 ACE-05의 결합 친화도는 모 항-CD3 항체(미국 BioLegend의 UCHT1)보다 훨씬 낮았다(도 12a-12c 참조).
일반적으로 말하면, 항원-항체 상호 작용은 수소 결합, 소수성 상호 작용, 정전기 및 반 데르 발스 힘의 조합에 의해 형성되는 비공유 및 가역적인 상호 작용이다. 항원-항체 복합체의 강도를 설명할 때 일반적으로 친화도(affinity) 및/또는 결합력(avidity)이 언급된다. 위에서 언급했듯이 항체와 항원의 결합은 가역적인 과정이며 결합의 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 보고된다. KD는 항체 해리 속도(koff 또는 kd)(항원에서 얼마나 신속하게 해리되는지)와 항체 결합 속도 (kon 또는 ka)(항원에 얼마나 신속하게 결합하는지)의 비율이다. 일부 실시예에서, KD 값은 특정 항체/항원 상호 작용의 kon 및 koff 비율을 측정한 다음, 이들 값의 비율을 사용하여 KD 값을 계산함으로써 결정된다. KD 값은 개별 항체/항원 상호 작용의 강도를 평가하고 순위를 매기는 데 사용될 수 있다. 항체의 KD가 낮을수록 표적에 대한 항체의 친화도가 높아진다. 결합력은 항체-항원 복합체의 전반적인 강도의 측정값이다. 이는 세 가지 주요 매개 변수에 의존한다: (i) 에피토프에 대한 항체의 친화도, (ii) 항체와 항원 모두의 가수(valency), 및 (iii) 상호 작용하는 부분의 구조적 배열.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 50 pM 이하, 10 pM 이하, 또는 1 pM 이하의 해리 상수(KD)로 하나 이상의 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 20 nM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 결합 분자는 약 10 nM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 결합 분자는 약 1 nM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 결합 분자는 약 0.5 nM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 0.1 nM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 50 pM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 25 pM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 10 pM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 1pM 이하의 KD로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 표적 또는 항원에 대한 본원에 제공된 결합 분자의 해리 상수는 Octet® 칩 상에 고정된 표적 단백질의 적어도 일부를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다. 일부 실시예에서, 표적 또는 항원에 대한 본원에 제공된 결합 분자의 해리 상수는 Octet® 칩상의 항-인간 IgG 항체에 의해 포획된 결합 제제 및 가용성 표적 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 반수 최대 유효 농도(EC50)로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 EC50으로 표적, 항원 또는 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 항원에 대한 결합 분자 KD는 제2 항원에 대한 결합 분자 KD의 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 50배 또는 그 이상이다. 일부 실시예에서, 제1 항원에 대한 결합 분자 KD는 제2 항원에 대한 결합 분자 KD의 약 10, 102, 103 또는 104배이다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자)는 하나 이상의 "모" 항체의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시예에서, 모 항체는 재조합 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 단일 클론 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 다클론 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 인간 항체 또는 완전 인간 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체이다. 특정 실시예에서, 모 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시예에서, 모 항체는 IgG2 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 IgG3 항체이다. 일부 실시예에서, 모 항체는 IgG4 항체이다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자)가 분리된다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자)는 실질적으로 순수하다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자) 또는 이의 일부는 적어도 하나의 단일 클론 항체로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 단일 클론 항체는 당업자에게 공지된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물을 상기 기재된 바와 같이 면역화하여 면역 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도한다. 일부 구체예에서, 림프구는 시험관 내에서 면역화된다. 일부 실시예에서, 면역화 항원은 인간 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 면역화 항원은 마우스 단백질 또는 이의 단편이다.
면역화 후, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 분리하고 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 특화된 배지를 사용하여 선택되며, 이 때 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포는 선택 과정에서 생존하지 못한다. 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시되는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 비제한적으로, 면역 침강, 면역 블롯팅, 및 유세포 분석, FACS, ELISA 및 방사 면역 분석과 같은 시험관 내 결합 분석을 포함하는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론은 제한 희석 테크닉에 의해 서브 클로닝될 수 있다. 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 시험관 내 배양에서 또는 동물에서 복수 종양(ascites tumors)으로서 생체 내에서 증식될 수 있다. 단일 클론 항체는 비제한적으로, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 투석을 포함한 당업계의 표준 방법에 따라 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.
특정 실시예에서, 단일 클론 항체는 당업자에게 공지된 바와 같은 재조합 DNA 테크닉을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서, 단일 클론 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭하는 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 분리되고, 표준 테크닉을 사용하여 이들의 서열이 결정된다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질 감염될 때 단일 클론 항체를 생성하는 적합한 발현 벡터로 클로닝된다.
특정 다른 구체예에서, 재조합 단일 클론 항체 또는 이의 단편은 원하는 종의 가변 도메인 또는 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 파지 라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 테크닉에 의해 이루어질 수 있다.
일부 실시예에서, 단일 클론 항체는 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형되어 대안적인 항체를 생성한다. 일부 실시예에서, 예를 들어 마우스 단일 클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 예컨대, 인간 항체의 불변 영역으로 치환되어 키메라 항체를 생성하거나, 비 면역글로불린 폴리펩티드로 치환되어 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 불변 영역은 절단되거나 제거되어 단일 클론 항체의 원하는 항체 단편이 생성된다. 일부 실시예에서, 가변 영역(들)의 부위 지향적 또는 고밀도 돌연변이가 단일 클론 항체의 특이성 및/또는 친화도를 최적화하기 위해 사용된다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자) 또는 이의 일부는 인간화 항체로부터 유래된다. 인간화 항체를 생성하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시예에서, 인간화는 인간 항체에 상응하는 CDR 서열로 하나 이상의 비-인간 CDR 서열을 치환함으로써 수행된다. 일부 실시예에서, 인간화 항체는 인간 항체에 상응하는 CDR 서열로 설치류와 같은 모 비-인간 항체의 6개 CDR 모두를 치환함으로써 생성된다.
인간화 항체 생성에 사용될 인간 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 선택은 다양한 인자에 기초하여 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일부 실시예에서, 설치류와 같은 비-인간 항체의 가변 영역 서열이 공지된 인간 가변 영역 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝되는 경우, "최적 적합(best-fit)" 방법이 사용된다. 인간화 항체를 위한 인간 가변 영역 골격으로서 비인간 서열과 가장 유사한 인간 서열이 선택된다. 일부 실시예에서, 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 군의 모든 인간 항체의 공통 서열(consensus sequence)로부터 유래된 특정 가변 영역 골격이 선택되는 방법이 사용된다. 일부 실시예에서, 프레임워크는 가장 풍부한 인간 하위 부류의 공통 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 인간 생식 계열 유전자는 가변 영역 프레임워크 서열의 공급원으로 사용된다.
인간화를 위한 다른 방법은 비제한적으로, CDR을 인간 생식 계열 프레임워크로 직접 전달하는 것으로 설명되는 "초 인간화 (superhumanization)"라고 지칭하는 방법, HSC(Human String Content)라고 지칭하는 항체 "인간성(humanness)"의 메트릭을 기반으로 하는 방법, (파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리를 포함한) 인간화 변이체의 대규모 라이브러리 생성에 기반하는 방법 및 프레임워크 영역 셔플링에 기반한 방법을 포함한다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 결합 분자) 또는 이의 일부는 인간 항체로부터 유래된다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 테크닉을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 일부 실시예에서, 인간 항체는 시험관 내에서 면역화된, 불멸화된 인간 B 림프구로부터 생성된다. 일부 실시예에서, 인간 항체는 면역화된 개체에서 분리된 림프구로부터 생성된다. 임의의 경우, 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 세포가 생성 및 분리될 수 있다. 일부 실시예에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술은 면역화되지 않은 공여자의 면역글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용을 위한 테크닉은 당업계에 잘 알려져있다. 항체가 확인되면, 보다 높은 친화도의 인간 항체를 생성하기 위해 비제한적으로 사슬 셔플링 및 부위 지정 돌연변이 유발을 포함한, 당업계에 공지된 친화성 성숙 전략이 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 좌위를 포함하는 트랜스제닉 마우스에서 생산된다. 면역화 시, 이들 마우스는 내인성 면역글로불린 생산이 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자(예건대, 이중 특이적 결합 분자) 또는 본원에 기술된 이의 일부는 적어도 하나 이상의 불변 영역의 변형을 포함하는 항체(예를 들어, 전장 항체 또는 이의 단편)로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 항체는 3개의 중쇄 불변 영역 중 하나 이상(예컨대, CH1) 및/또는 경쇄 불변 영역 (CL)에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 항체의 중쇄 불변 영역은 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 항체의 중쇄 불변 영역은 하나 초과의 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 영역에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 영역은 변형된 항체의 불변 영역으로부터 부분적으로 또는 전체적으로 결실된다. 일부 실시예에서, 전체 CH2 도메인은 항체로부터 제거되었다(ΔCH2 구축물). 일부 실시예에서, 전체 CH3 도메인은 항체로부터 제거되었다(ΔCH3 구축물). 일부 실시예에서, 생략된 불변 영역은 부재 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 유연성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예컨대, 10개의 아미노산 잔기)로 대체된다.
본원에 기재된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 항체) 및/또는 항체(예컨대, 모 항체)의 불변 영역에 대한 변형은 잘 알려진 생화학적 또는 분자 공학 테크닉을 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 실시예에서, 변이체는 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 및/또는 원하는 폴리펩티드 또는 제제의 직접 합성에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련하여 변형된 결합 제제의 구조, 결합 활성 및 다른 원하는 특성을 실질적으로 유지하면서 특정 서열 또는 영역에 의해 제공되는 활성 또는 이펙터 기능을 파괴하는 것이 가능할 수 있다.
본 개시 내용은 본원에 기재된 결합 분자에 실질적으로 상동인 추가 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 비제한적으로, 특이성, 열 안정성, 발현 수준, 이펙터 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해도를 포함한 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직하다. 당업자는 아미노산 변화가 폴리펩티드의 번역 후 과정을 변경할 수 있음을 인식할 것이다.
변이는 모 결합 제제의 서열과 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 다중 특이적 결합 제제를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 예를 들어, 류신을 세린으로 대체하는 것과 같은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과, 예컨대, 보존적 아미노산 대체일 수 있다. 일부 실시예에서, 삽입 또는 결실은 약 1 내지 5개의 아미노산 범위에서 일어난다. 특정 실시예에서, 치환, 결실 또는 삽입은 모 분자에 대해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 생물학적으로 유용하고/하거나 관련된 아미노산 서열의 변이는 서열에 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고 모 단백질과 비교하여 활성에 대해 생성된 변이 단백질을 테스트함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 변이체는 본원에 제공된 결합 분자를 구성하는 하나 이상의 폴리펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에서의 아미노산 잔기의 부가를 포함할 수 있다. 추가 아미노산 잔기의 길이는 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 변이체는 N-말단 메티오닐 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, 변이체는 추가적인 폴리펩티드/단백질, 즉 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시예에서, 변이체는 검출 가능하도록 조작되고 검출 가능한 표지 및/또는 단백질(예컨대, 효소)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 적절한 입체 구조를 유지하는 데 관여하지 않는 시스테인 잔기는 제제의 특성을 조절하기 위하여 예컨대, 산화 안정성을 개선하고/하거나 비정상적인 이황화물 가교를 방지하기 위해 치환되거나 결실된다. 반대로, 일부 실시예에서, 안정성을 개선하기 위해 하나 이상의 시스테인 잔기가 부가되어 이황화 결합(들)을 생성한다.
일부 실시예에서, 본 개시 내용의 결합 분자는 "탈 면역화"된다. 항체와 같은 제제의 탈 면역화는 일반적으로 제제의 결합 친화도 또는 다른 원하는 활성을 현저하게 감소시키지 않으면서 T 세포 에피토프를 제거하기 위해 특정 돌연변이를 도입하는 것으로 구성된다.
본원에 기재된 변이체 결합 분자 또는 폴리펩티드는 비제한적으로, 부위 지향 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 PCR 돌연변이 유발을 포함한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 결합 분자는 화학적으로 변형된다. 일부 실시예에서, 결합 분자는 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 및/또는 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결에 의해 화학적으로 변형된 이중 특이적 항체이다. 임의의 다수의 화학적 변형이 공지된 테크닉에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 다중 특이적 결합 제제를 구성하는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있고, 아래 섹션 III 및 섹션 IV에서 보다 상세하게 설명된다.
본 개시 내용은 또한 본원에 기재된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 항체)중 임의의 하나를 포함하는 컨쥬게이트(conjugates)를 제공한다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 추가적인 분자에 부착된다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 세포 독성 제제 또는 모이어티에 접합된다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 세포 독성 제제에 접합되어 ADC(항체-약물 컨쥬게이트)를 형성한다. 일부 실시예에서, 세포 독성 모이어티는 비제한적으로 메토트렉세이트, 아드리아마이신/독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카르마이신, 다우노루비신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 또는 다른 삽입 제제(intercalating agent)를 포함하는 화학 요법제이다. 일부 실시예에서, 세포 독성 모이어티는 비제한적으로 아우리스타틴, DMI 및 DM4와 같은 메이탄시노이드 및 튜불리신을 포함하는 미세관(microtubule) 억제제다. 일부 실시예에서, 세포 독성 모이어티는 비제한적으로 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비 결합 활성 단편, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, Aleurites fordii 단백질, 디안틴 단백질, Phytolaca americana 단백질(PAPI, PAPII, PAP-S), Momordica charantia 억제제, 커신, 크로틴, Sapaonaria officinalis 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테신을 포함하는, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 칼리케아마이신, 메이탄시노이드, 트리코테신 및 CC1065와 같은 하나 이상의 소분자 독소에 접합된다. 이들 독소 중 어느 하나의 유도체는 유도체가 세포 독성 활성을 유지하는 한 컨쥬게이트에 사용될 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자를 포함하는 컨쥬게이트는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시예에서, 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2- 피리디디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), (디메틸 아디피미데이트 HCl과 같은) 이미도에스테르의 이작용성 유도체, (디숙신이미딜 수베레이트와 같은) 활성 에스테르, (글루타르알데히드와 같은) 알데히드, (비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민과 같은) 비스-아지도 화합물, (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은) 비스-디아조늄 유도체, (톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같은) 디이소시아네이트 및 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은) 비스-활성 불소 화합물과 같은 다양한 이작용성 단백질-커플링제를 사용하여 제조된다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 결합 분자(예컨대, 이중 특이적 항체)는 항체가 진단 및/또는 검출에 사용될 수 있게 하는 검출 가능한 물질 또는 분자에 접합된다. 검출 가능한 물질은 비제한적으로, 겨자무 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 및 아세틸콜린 에스테라제와 같은 효소; 비오틴 및 플라빈과 같은 보결기; 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실클로라이드, 시아닌 (Cy3) 및 피코에리트린과 같은 형광 물질; 루시퍼라제와 같은 생물 발광 물질; 212Bi, 14C, 57Co, 51Cr, 67Cu, 18F, 68Ga, 67Ga, 153Gd, 159Gd, 68Ge, 3H, 166Ho, 131I, 125I, 123I, 121I, 115In, 113In, 112In, 111In, 140La, 177Lu, 54Mn, 99Mo, 32P, 103Pd, 149Pm, 142Pr, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 47Sc, 75Se, 153Sm, 113Sn, 117Sn, 85Sr, 99mTc, 201Ti, 133Xe, 90Y, 69Yb, 175Yb, 65Zn와 같은 방사성 물질; 양전자 방출 금속; 및 자성 금속 이온을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 결합 분자는 표적 항원(들)의 면역 분석 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착된다. 이러한 고체 지지체는 비제한적으로, 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 약학 조성물로 제제화된다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 결합 분자의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 제공되는 약학 조성물은 아래 섹션 V에서 더 자세히 설명되어 있다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 실시예에서, 질병 또는 질환은 암이다. 다른 구체예에서, 암은 PD-L1 양성 암이다. 일부 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 일부 실시예에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 실시예에서, 암은 결장 직장암이다. 일부 실시예에서, 암은 유방암이다. 일부 실시예에서, 암은 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시예에서, 암은 난소암이다.
일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 결합 분자의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 질환 또는 상태는 암이다. 다른 구체예에서, 암은 PD-L1 양성 암이다. 일부 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 일부 실시예에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 일부 실시예에서, 암은 결장 직장암이다. 일부 실시예에서, 암은 유방암이다. 일부 실시예에서, 암은 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시예에서, 암은 난소암이다. 본 결합 분자의 투여 방법은 아래 섹션 VI에 더 자세히 설명되어 있다.
III. 폴리뉴클레오티드
특정 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 위한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 추가적인 코딩 및/또는 비 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA에는 cDNA, 유전체 DNA 및 합성 DNA가 포함되고, 이들은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비 코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다.
특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임에서, 예컨대, 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 선도 서열)에 융합된 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 "성숙한" 형태를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해 절단된 선도 서열을 가질 수 있다.
특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 동일한 리딩 프레임에서 마커 또는 태그 서열에 융합된 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 폴리펩티드의 효율적인 정제를 가능하게하는 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그이다. 일부 실시예에서, 마커는 다른 친화성 태그와 함께 사용된다.
본 개시 내용은 추가로 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이며, 여기서 변이체는 예를 들어 폴리펩티드의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 코딩한다. 특정 실시예에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 결합 분자를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 및 일부 실시예에서, 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예컨대, 95% "동일한" 폴리뉴클레오티드"라는 문구는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일함을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해, 참조 서열에 있는 뉴클레오티드의 최대 5%가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있고, 또는 참조 서열에 있는 총 뉴클레오티드의 최대 5%에 해당하는 수의 뉴클레오티드가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이러한 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 참조 서열의 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접 그룹에서 산재된, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비 코딩 영역, 또는 둘 모두에서 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 생성하지만, 코딩 된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경하지 않는 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 (유전 코드의 축퇴로 인해) 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 침묵 치환을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 예컨대, 특정 숙주에 대한 코돈 발현의 최적화 (즉, 인간 mRNA의 코돈을 대장균과 같은 박테리아 숙주가 선호하는 코돈으로 변경하는 것)를 위한 다양한 이유로 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열의 비-코딩 또는 코딩 영역에 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시예에서, 코딩된 폴리펩티드의 발현 (또는 발현 수준)을 조정하거나 변형하기 위해 폴리뉴클레오티드 변이체가 생성된다. 일부 실시예에서, 코딩된 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위해 폴리뉴클레오티드 변이체가 생성된다. 일부 실시예에서, 코딩된 폴리펩티드의 발현을 감소시키기 위해 폴리뉴클레오티드 변이체가 생성된다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 코딩된 폴리펩티드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 모 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 코딩된 폴리펩티드의 감소된 발현을 갖는다.
특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드가 분리된다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포도 제공된다. 일부 실시예에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
IV. 결합 분자의 제조 방법
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 다양한 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 벡터를 숙주 세포로 형질 감염시키는 것을 포함하는 결합 분자를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 하나 이상의 벡터는
(a) 각각 항체 경쇄인 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산,
(b) 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산; 및
(c) 제3 VH 영역 및 제2 CH1 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산
을 포함하고,
제3 폴리펩티드의 제1 CH1 영역 및 제1 VH 영역 및 제1 폴리펩티드는 제1 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제4 폴리펩티드의 제2 CH1 영역 및 제3 VH 영역 및 제2 폴리펩티드는 제2 항원 결합 Fab 영역을 형성할 수 있고;
제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성할 수 있다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 유연 펩티드 영역을 통해 Fv 영역에 연결된다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG1 서브 타입이다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG2 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG3 서브 타입이다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, IgG 힌지 영역은 IgG4 서브 타입이다. 일부 실시예에서, 유연 펩티드 영역은 항체 힌지 영역과 제2 항원 결합 도메인 사이에 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 GGGGS(G4S)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 링커는 n이 정수인 (G4S)n의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 링커는 (G4S)1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)3의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 보다 구체적인 실시예에서, 링커는 (G4S)4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 상이한 항원에 결합한다. 다른 구체예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합한다.
특정 실시예에서, 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, Fv 영역은 제2 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 결합한다. 일부 실시예에서, 제2 항원 결합 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프 중 적어도 하나와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시예에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 제1 항원에 결합하고 제2 항원 결합 도메인은 제2 항원에 결합한다.
일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이다. 다른 구체예에서, 제1 항원은 암 항원이 아니다.
일부 실시예에서, 제2 항원은 림프구 및 단핵구를 포함하는 면역 세포 상에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 T 세포에서 발현된다. 일부 실시예에서, 제2 항원은 B 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 수지상 세포에서 발현된다. 다른 구체예에서, 제2 항원은 과립구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 선천성 림프구 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 거핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 단핵구에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 골수 유래 억제 세포에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 제2 항원은 NK 세포에서 발현된다.
일부 특정 실시예에서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시예에서, 제1 항원은 암 항원이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 PD-L1이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; 및 Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 22의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 20의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제3 핵산은 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 CD20이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제3 핵산은 서열 번호: 35의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 EGFR이고 제2 항원은 CD3이다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 갖고; 제3 폴리펩티드는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고; 제4 폴리펩티드는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시예에서, 제1 핵산은 서열 번호: 50의 뉴클레오티드 서열을 갖고; 제2 핵산은 서열 번호: 48의 뉴클레오티드 서열을 가지고; 제3 핵산은 서열 번호: 49의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 보다 구체적인 실시예에서, 제1 항원은 Her2이고 제2 항원은 TNF 알파이다. 일부 실시예에서, 각 Fab 영역의 제1 부분의 VH 영역은 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 갖고; 각 Fab 영역의 제2 부분의 VL 영역은 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 갖고; Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 제공된 결합 분자의 재조합 발현은 결합 분자 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 구축을 필요로 할 수 있다. 본원에 제공된 결합 분자, 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 단편 (예컨대, 필수적이지는 않지만 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 포함함)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 결합 분자의 생성을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 테크닉을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, 시험관 내 재조합 DNA 테크닉, 합성 테크닉 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본원에 제공된 결합 분자, 또는 이의 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며(예컨대, 국제공개특허WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 모두의 발현을 위해 이러한 벡터로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 테크닉에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 그 형질 감염된 세포는 본원에 제공된 결합 분자를 생성하기 위해 통상적인 테크닉에 의해 배양된다. 따라서, 본원에서는 또한 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본원에 제공된 결합 분자 또는 이의 단편, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 상이한 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다중 벡터는 아래에 상세히 설명되는 바와 같이 전체 결합 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자를 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,807,715호 참조). 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 생산되고 이후에 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 수 있지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질 전환되거나 형질 감염될 때 본원에 제공된 결합 분자를 동소(in situ) 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 비제한적으로, 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 박테리아(예컨대, E. coli 와 B. subtilis); 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 전환된 효모(예컨대, Saccharomyces Pichia); 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV), 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나, 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대,Ti 플라스미드)로 형질 전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 유전체(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유 동물 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, BHK, 293, NS0, 및 3T3 세포)과 같은 미생물을 포함한다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 대장균과 같은 박테리아 세포 또는 진핵 세포가 재조합 결합 분자의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로 바이러스의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)와 같은 포유 동물 세포는 항체 또는 이의 변이체를 위한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; 및 Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). 일부 실시예에서, 본원에 제공된 항체는 CHO 세포에서 생산된다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 결합 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 항시성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 결합 분자를 위해 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 결합 분자를 다량 생산하고자 하는 경우, 결합 분자의 약학 조성물 생성을 위해서는 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 코딩 서열이 융합 단백질이 생성되도록 lac Z 코딩 영역과 인 프레임(in frame)으로 벡터 내로 개별적으로 연결될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791); pIN 벡터 (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합한 다음 유리 글루타티온 존재하에 용출됨으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서는 외래 유전자 발현을 위한 벡터로 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV)를 사용한다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기퍼르다 세포에서 증식한다. 코딩 서열은 바이러스의 폴리헤드린 유전자와 같은 비 필수 영역으로 개별적으로 클로닝되고 폴리헤드린 프로모터와 같은 AcNPV 프로모터의 제어하에 배치될 수 있다.
포유 동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노 바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 코딩 서열은 후기 프로모터 및 삼자 선도 서열과 같은 아데노 바이러스 전사/번역 제어 복합체에 연결될 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노 바이러스 유전체에 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비 필수 영역(예컨대, El 또는 E3 영역)으로의 삽입은 생존 가능하고 감염된 숙주에서 결합 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성할 것이다(예컨대, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 참조). 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 인 페이스(in phase)이어야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다(예컨대, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예컨대, 글리코실화) 및 가공(예컨대, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 구체적인 메커니즘을 가지고 있다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해 1차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화 및 유전자 산물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유한 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유 동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (내생적으로 어떠한 면역글로불린 사슬도 생성하지 않는 쥐과 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포가 포함되나, 이 세포에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간, 고 수율 생산을 위하여 안정적인 발현이 이용될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 원점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 표지에 의해 제어되는 DNA로 형질 전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 영양 강화 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선택 배지로 변경할 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택 표지는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합할 수 있게 하며, 차례로 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점(foci)을 형성한다. 이 방법은 결합 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 상호 작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있고, 아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있다. 또한, 항 대사 산물 내성은 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 이러한 방법은 예컨대, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)의 챕터 12 및 13; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1에 설명되어 있고, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
결합 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 예컨대, Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) 참조). 결합 분자를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭가능할 때, 숙주 세포 배양에서 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 결합 분자 유전자와 연관되어 있기 때문에 결합 분자의 생성도 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
숙주 세포는 본원에 제공된 다중 발현 벡터로 공동 형질 감염될 수 있다. 벡터는 각각의 코딩 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 표지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다중 폴리펩티드를 코딩하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 코딩 서열은 cDNA 또는 유전체 DNA를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 이후 특정 항원에 대한 친화성에 의한), 사이징 컬럼 크로마토그래피, 및 카파-셀렉트 친화성 크로마토그래피), 원심 분리, 차등 용해도 또는 단백질 정제를 위한 다른 표준 테크닉에 의해 정제될 수 있다. 특정 구체예에서, 카파-셀렉트 (예를 들어, GE Healthcare Life Science에 의해 개발된 카파 셀렉트)는 Fab (카파) 단편 또는 Fab 단편을 함유하는 결합 분자의 정제에 사용된다. 추가로, 본원에 제공된 결합 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 기재되거나 달리 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
V. 약학 조성물
한 측면에서, 본 개시 내용은 적어도 하나의 본 개시 내용의 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 결합 분자의 치료 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
결합 분자를 포함하는 약학 조성물은 원하는 순도를 갖는 결합 분자를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 수용액 형태, 동결 건조 또는 기타 건조 형태로 저장을 위해 제조된다(예컨대, Remington, Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed. 1980) 참조.)
본 개시 내용의 결합 분자는 표적 세포/조직에 전달하기 위한 임의의 적합한 형태, 예를 들어 마이크로캡슐 또는 매크로에멀젼(상기 Remington; Park et al., 2005, Molecules 10:146-61; Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51), 서방형 제제 (Putney and Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57), 또는 리포솜 (Maclean et al., 1997, Int. J. Oncol. 11:325-32; Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45)으로 제형화될 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자는 또한 예컨대, 코아세르베이션 테크닉 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐에, 예컨대, 각각 히드록시 메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐)에 또는 매크로 에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 테크닉은 예컨대, 상기 Remington에 개시되어 있다.
비제한적으로, 리포솜 봉입, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 결합 분자를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도사이토시스(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32 참조), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등을 포함한 다양한 조성물 및 전달 시스템이 공지되어 있고 이는 본원에 기재된 결합 분자와 함께 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 제공될 수 있다. 한 실시예에서, 펌프를 사용하여 제어 또는 지속 방출을 달성할 수 있다(예컨대, 상기 Langer; Selfton, 1987, Cit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507-16; 및 Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74). 또 다른 실시예에서, 중합체 물질은 예방적 또는 치료적 제제(예컨대, 본원에 기재된 결합 분자) 또는 본원에 기재된 조성물의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Medical Applications of Controlled Release(Langer and Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance(Smolen and Ball eds., 1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126; Levy et al., 1985, Science 228:190-92; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-56; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105-12; 미국 특허 제 5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; 국제공개특허 WO 99/15154 및 WO 99/20253 참조). 서방형 제제에 사용되는 중합체의 예에는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴 산), 폴리(에틸렌-co-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴 산), 폴리글리콜라이드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드 (PLA), 폴리(락티드-co-글리콜라이드) (PLGA), 및 폴리오르토에스테르가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 서방형 제제에 사용되는 중합체는 불활성이며, 여과 가능한 불순물이 없고, 저장시 안정하며, 멸균되고, 생분해될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제어 또는 지속 방출 시스템은 특정 표적 조직, 예를 들어 비강 또는 폐에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예컨대, Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984) 참조). 제어 방출 시스템은 예컨대, Langer, 1990, Science 249:1527-33에서 논의된다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 결합 분자를 포함하는 지속형 제형을 생성할 수 있다 (예컨대, 미국특허 제4,526,938호, 국제공개특허 WO 91/05548 및 WO 96/20698, Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89; Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54; 및 Lam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60 참조).
VI. 투여 방법
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자를 포함하는 질환 또는 상태의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용하기 위한 조성물이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 예방에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 관리에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 개선에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 질병 또는 질환은 암이다. 다른 구체예에서, 암은 PD-L1 양성 암이다. 일부 실시예에서, 암은 폐암이다. 일부 실시예에서, 암은 비소세포 폐암 (NSCLC)이다. 일부 실시예에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 실시예에서, 암은 직장암이다. 일부 실시예에서, 암은 유방암이다. 일부 실시예에서, 암은 림프종이다. 일부 실시예에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시예에서, 암은 난소암이다. 특정 실시예에서, 대상체는 이를 필요로 하는 대상체이다. 일부 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 갖는다. 다른 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 가질 위험이 있다. 일부 실시예에서, 투여는 질병 또는 질환의 예방, 관리, 치료 또는 개선을 가져온다.
일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 증상의 예방에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 증상의 관리에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 증상의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 질병 또는 질환의 증상의 개선에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 본원에 제공된 결합 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 질환은 암이다. 특정 실시예에서, 대상체는 이를 필요로 하는 대상체이다. 일부 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 갖는다. 다른 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 가질 위험이 있다. 일부 실시예에서, 투여는 질병 또는 질환의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 개선을 가져온다.
또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는, 대상체에서 질병 또는 질환을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 관리하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체의 질병 또는 질환을 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시예에서, 질환 또는 상태는 암이다. 특정 실시예에서, 대상체는 이를 필요로 하는 대상체이다. 일부 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 갖는다. 다른 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 가질 위험이 있다. 일부 실시예에서, 투여는 질병 또는 질환의 예방, 관리, 치료 또는 개선을 가져온다.
또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는, 대상체에서 질병 또는 질환의 증상을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환의 증상을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환의 증상을 관리하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량을 투여함을 포함하는 대상체에서 질병 또는 질환을 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시예에서, 질병 또는 질환은 암이다. 특정 실시예에서, 대상체는 이를 필요로 하는 대상체이다. 일부 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 갖는다. 다른 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환을 가질 위험이 있다. 일부 실시예에서, 투여는 질병 또는 질환의 증상의 예방, 관리, 치료 또는 개선을 가져온다.
또한, 본원에 제공된 결합 분자의 유효량, 또는 본원에 제공된 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함으로써 질병 또는 질환을 예방, 관리, 치료 및/또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 일 측면에서, 결합 분자는 정제된다(즉, 그 효과를 제한하거나 원치 않는 부작용을 일으키는 물질이 실질적으로 없음). 특정 실시예에서, 결합 분자는 하나 이상의 완전한 인간 단일 클론 항체로부터 유래된다. 치료제가 투여되는 대상체는 비-영장류(예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 등) 또는 영장류(예컨대, 사이노몰구스 원숭이와 같은 원숭이 또는 인간)와 같은 포유류일 수 있다. 일 실시예에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시예에서, 대상체는 질병 또는 질환, 예컨대 암이 있는 인간이다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 비제한적으로, 리포좀 내 봉입, 마이크로 입자, 마이크로캡슐, 결합 분자를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도사이토시스(예컨대, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) 참조), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산 구축물 등을 포함하여, 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에서 제공되는 결합 분자)를 투여하는 데 사용할 수 있다. 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에서 제공된 결합 분자) 또는 약학 조성물의 투여 방법으로는 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외 및 점막(예를 들어, 비강 및 구강 경로)이 포함되지만,이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에서 제공된 결합 분자), 또는 약학 조성물은 비강 내, 근육 내, 정맥 내 또는 피하로 투여된다. 예방제 또는 치료제, 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입(infusion) 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막 피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 비강 내 점막, 직장 점막 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 또한, 폐 투여는 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제로 제제화함으로써 적용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 국제공개특허 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903를 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
특정 구체예에서, 예방제 또는 치료제, 또는 본원에서 제공되는 약학 조성물은 치료가 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어, 비제한적으로, 국부 주입, 국소 투여(예컨대, 비강 내 스프레이), 주사 또는 이식재의 수단으로 달성될 수 있으며, 상기 이식재는 멤브레인, 예컨대, 시알라스틱 멤브레인을 포함하는 다공성, 비 다공성 또는 젤라틴성 재료, 또는 섬유일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 항체를 투여하는 경우, 상기 항체가 흡수되지 않는 물질의 사용에 주의를 기울여야 한다.
또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 예방제 또는 치료제 또는 조성물은 소포(vesicle), 특히 리포좀으로 전달될 수 있다(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 상게서, pp. 317-327 참조; 일반적으로 상게서 참조.)
또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 예방제 또는 치료제 또는 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프를 사용하여 제어 또는 지속 방출을 달성할 수 있다(상기 Langer; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 또 다른 실시예에서, 중합체 물질은 본원에 제공된 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 제공된 항체) 또는 조성물의 제어 또는 지속 방출의 달성에 사용될 수 있다(예컨대, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105 참조); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제 5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제 5,128,326호; 국제공개특허 WO 99/15154; 및 국제공개특허 WO 99/20253 참조. 지속 방출 제제에 사용되는 중합체의 예로는, 비제한적으로 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴 산), 폴리(에틸렌-co-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴 산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락티드-co-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르가 포함된다. 일 실시예에서, 지속 방출 제제에 사용되는 중합체는 불활성이고, 여과 가능한 불순물이 없고, 저장시 안정하며, 멸균되고, 생분해될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제어 또는 지속 방출 시스템은 치료 표적의 근처, 즉 비강 또는 폐에 위치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예컨대, 상기 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138(1984) 참조). 제어 방출 시스템은 Langer의 리뷰에서 논의된다(1990, Science 249:1527-1533). 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본원에 제공된 하나 이상의 결합 분자를 포함하는 지속형 제형을 생성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, 국제공개특허 WO 91/05548, 국제공개특허 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 및 Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760를 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 조성물이 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 제공된 결합 분자)를 코딩하는 핵산인 경우, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구축하고 이를 세포 내에 도달하도록 투여함에 의해, 예를 들어, 레트로 바이러스 벡터(미국 특허 제4,980,286호 참조)의 사용, 또는 직접 주입, 또는 마이크로입자 충격법(예컨대, 유전자 총(gun); Biolistic, Dupont)의 사용, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질 감염제로 코팅, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려진 호메오박스(homeobox)-유사 펩티드와 연결하여 투여함(예를 들어, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 참조) 등에 의해, 생체 내에서 투여되어 이의 코딩된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포 내로 도입될 수 있으며, 상동 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 혼입될 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 조성물은 본원에 제공된 1개, 2개 또는 그 이상의 결합 분자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 조성물은 본원에 제공된 1개, 2개 또는 그 이상의 결합 분자 및 본원에 제공된 결합 분자 이외의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 일 실시예에서, 작용제는 질병 또는 질환의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 유용한 것으로 알려져 있거나 사용되었거나 현재 사용되는 것이다. 예방제 또는 치료제 이외에, 본원에 제공된 조성물은 또한 담체를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 단위 투여 형태의 제조에 사용될 수 있는 약학 조성물 (예를 들어, 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에서 제공된 조성물은 약학 조성물이다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 하나 이상의 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 제공된 결합 분자 또는 다른 예방제 또는 치료제), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약학 조성물은 대상체에 대한 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다.
특정 실시예에서, 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예를 들어, (완전 및 불완전한) 프로인트(Freund) 보조제), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학적 담체는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 유래의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 물은 약학 조성물을 정맥 내로 투여할 때 바람직한 담체이다. 생리식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액상 담체, 특히 주사가능한 용액으로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 목적에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 지속형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구제형은 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences(1990) Mack Publishing Co., Easton, PA에 설명되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 예방적 또는 치료적 유효량의 본원에 제공된 결합 분자, 예컨대 정제된 형태의 것을 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일 실시예에서, 조성물은 인간으로의 정맥 투여를 위해 적용된 약학 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 일반적으로, 정맥 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 리그노카멘과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 그러나 이러한 조성물은 정맥 이외의 경로로 투여될 수 있다.
일반적으로, 본원에 제공된 조성물의 성분은 개별적으로 또는 단위 투여 형태와 혼합되어, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 기밀하게 밀봉된 용기 중의 무수 동결건조된 분말 또는 수분 부재 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균된 제약 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 병으로 조제될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본원에 제공된 결합 분자는 항체의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 기밀하게 밀봉된 용기에 포장될 수 있다. 일 실시예에서, 결합 분자는 기밀하게 밀봉된 용기에 건조 멸균된 동결 건조 분말 또는 수분 부재 농축물로 공급되고, 예를 들어 물 또는 식염수로 대상체에게 투여하기에 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 동결 건조된 결합 분자는 원래 용기에서 2 내지 8 ℃로 보관될 수 있으며, 결합 분자는 재구성 후 12 시간 내, 예컨대, 6시간 내, 5시간 내, 3시간 내 또는 1시간 내에 투여될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 항체의 양 및 농도를 나타내는 기밀하게 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다.
본원에 제공된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 음이온으로 형성된 것 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래된 것과 같은 양이온으로 형성된 것을 포함한다.
질병 또는 질환의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 효과적인 예방제 또는 치료제(예를 들어, 본원에 제공된 결합 분자), 또는 본원에 제공된 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위를 식별하는데 도움이 되도록 시험관 내 분석을 선택적으로 사용할 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질병 또는 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의판단과 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추론할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자의 용량을 환자에게 투여하는 경로는 비강 내, 근육 내, 정맥 내 또는 이들의 조합이지만, 본원에 기재된 다른 경로로의 투여도 허용된다. 각 용량은 동일한 투여 경로에 의해 투여되거나 투여되지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 동시에 또는 순차적으로 본원에 제공된 동일하거나 상이한 결합 분자의 다른 용량으로 다중 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 결합 분자는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여된다. 본원에 제공된 항체는 질병 또는 이의 증상을 예방, 완화 또는 개선하기 위해 대상체에게 예방적 또는 치료적으로 투여될 수 있다.
간결함을 위해 특정 약어가 본원에서 사용된다. 일례는 아미노산 잔기를 나타내는 단일 문자 약어이다. 아미노산과 이에 상응하는 3개의 문자 및 단일 문자 약어는 다음과 같다:
본 발명은 일반적으로 다수의 실시예를 설명하기 위해 긍정 언어를 사용하여 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 특정 주제가 전체 또는 부분적으로 배제되는 실시 태양, 예컨대, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 에세이 또는 분석을 포함한다. 따라서, 본 발명이 포함하지 않는 것의 측면에서 본원에서 일반적으로 표현되지 않았더라도, 본 발명에 명시적으로 포함되지 않은 양태도 그럼에도 불구하고 본원에서 개시된다.
본 발명의 다수의 실시예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 하기 실시예는 청구 범위에 기재된 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 이를 제한하지 않는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 예시적 결합 분자의 구축 및 발현
이 실시예는 (도 1a-1e에 설명된 바와 같은) 본원에 제공된 바와 같은 예시적인 결합 분자, 특히 결합 분자 ACE-00, ACE-02, ACE-03, ACE-04, ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, 및 ACE-12의 구축 및 발현을 설명한다. 각각의 예시적인 결합 분자에서 제1 및 제2 항원을 표적으로 하는 구성 요소는 아래 표에 요약되어 있다.
표 3: 예시적 결합 분자에서 제1 및 제2 항원을 표적으로 하는 구성 요소
아미노산 서열에 사용되는 형식:
굵은 글씨: VH 또는 VL;
굵은 글씨 및 밑줄 : CDR;
이탤릭체: 항체 힌지 영역;
소문자: 유연 링커;
[꺾음 괄호]: CH1;
[꺾음 괄호 및 밑줄]: CL.
1.1. ACE-00의 구축 및 발현
제2 항원 결합 Fv영역이 TNF 알파에 결합하고 제1 항원 결합 도메인 (Fab 영역)이 Her2 항원에 결합하는 ACE-00을 발현하기 위해 HEK-293 일시적 발현 시스템 (Invitrogen, USA)을 사용하였다 (도 2f 참조). ACE-00은 도 1a에 도시된 예시적 결합 분자와 동일한 전체 구조를 갖는다. 간단히 말해서, ACE-00은 두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬 (ACE-00-VH 및ACE-00-VL)을 포함하고 두개의 동일한 경쇄(ACE-00-LC)를 포함한다. ACE-00의 항-Her2 도메인 구축에 사용되는 모 항체는 트라스투주맙이고, ACE-00의 항-TNF 알파 도메인 구축에 사용되는 모 항체는 아달리무맙이다. 이들 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-00-VH 아미노산 서열:
ACE-00-VL 아미노산 서열:
ACE-00-LC 아미노산 서열 (항-CD19 항체 경쇄):
Her2를 표적으로 하는 2가 Fab 영역 및 TNF 알파를 표적으로 하는 1가 Fv 영역에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열은 아래 표에 열거되어 있다:
표 4: ACE-00의 VHs 및 VLs
ACE-00-VH, ACE-00-VL 및 ACE-00-LC를 코딩하는 DNA의 삼중-형질 감염 (tri-transfectction)은 아래에 간략히 설명된대로 수행되었다. 형질 감염 시약으로 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하였다(DNA: PEI =1:4 (w/w) 비율로 사용). 형질 감염 후 6~7일 후 세포 생존율이 약 60%에서 70%로 측정되었을 때, 회분 배양을 중단하고 발현 배지를 수집하고 원심분리(4,800 rpm, 30 분, 4℃)하여 부스러기(debris)를 제거하였다. 이후 0.22μm TOP-필터 (Millipore, USA)를 이용하여 상등액을 여과하였다. 이후, ACE-00분자를 포함한 여과된 상층액은 Hitrap™ 카파셀렉트(GE healthcare, USA)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 정제 과정을 거쳤고, 이어서 용출 완충액 변경을 위해 Slide-A Lyzer 투석 카세트(Thermo, USA)를 이용하여 pH 7.4 PBS로 투석하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE, 모세관 전기 영동 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다. 정제된 ACE-00 분자는 또한 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, 독일) 및 SEC-HPLC (ThermoFisher, USA)를 이용하여 순도를 분석하였다. 순도 분석은 제조자가 제공한 지침을 사용하여 수행되었다.
대조군으로, ACE-00-VL 및 ACE-00-LC를 코딩하는 DNA의 HEK-293 세포로의 이중-형질 감염(bi-transfection)을 수행하였다. ACE-00(두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬 ACE-00-VH 및 ACE-00-VL 포함) 및 ACE-00-VL2(두 개의 동일한 중쇄 유사 사슬 ACE-00-VL 포함)의 어셈블리 패턴의 차이를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다(도 2a-2b).
항체는 4량체 H2L2로 조립 및 분비되며, 품질 관리 기구는 내강 결합 단백질 (BiP) 및 단백질 이황화 이소머라제(PDI)과 같은 소포체 샤페론에 의해 소포체(ER)에서 매우 엄격하게 조절된다. 중쇄의 펼쳐진 CH1 도메인은 BiP 의존적으로 항체 어셈블리를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BiP은 소포체 관련 단백질 분해(ERAD)의 조절에 의한 항체 어셈블리에 있어서의 품질 관리 메커니즘뿐만 아니라 CH1과 CL의 이종이량체 형성에도 관여할 수 있다(Lee Y. K. et al. BiP and immunoglobulin light chain cooperate to control the folding of heavy chain and ensure the fidelity of immunoglobulin assembly. Mol Biol Cell. 1999 Jul;10(7):2209-19; Feige M. J. et al. An unfolded CH1 domain controls the assembly and secretion of IgG antibodies. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569-79; Feige M. J. et al. How antibodies fold. Trends Biochem Sci. 2010 Apr;35(4):189-98. 이들 각 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다). VH-VL의 특이적 상호작용에 의해 두 개의 상이한 ALiCE 중쇄가 이종 이량체를 형성할 수 있는지를 확인하기 위하여 VH 도메인과 Bip사이의 가능한 상호작용을 조사하였다. CH1 또는 VH-CH1 절단 중쇄인 CH1 또는 VH-CH1을 클로닝하여 HEK293 세포에 전달하였다. 야생형 HC 또는 절단형 HC구축물들을 HEK293 세포로 전달하였다. 항-Fc-HRP (Thermo Fisher) 및 항-Bip-HRP (R&D systems)를 이용하여 Bip에 결합할 수 있는 항체 도메인을 확인하기 위하여 각각의 형질 감염체(transfectant)로부터 얻은 세포 용해물을 프로테인 A 비드로 풀 다운(pull down)하였다.
임의의 특정한 메커니즘이나 이론에 얽매이지 않고 다음과 같은 결과가 얻어졌다. CH1 및 WT-HC 클론 형질 감염된 용해물에서 웨스턴 블롯을 통해 공동-침전된 BiP이 발견되었는데, 이는 VH 및 BiP 상호작용을 나타낸다(도 2c). 더욱이, 분비된 폴리펩티드는 VH-CH1 형질 감염된 발현 배지에서 검출되었는데, 이는 BiP가 중쇄의 VH 및/또는 CH1도메인과 상호작용하여 중쇄의 어셈블리 및 분비를 조절할 수 있음을 나타낸다(도 2c-2e). 잠재적으로, 본 연구에서 항체 VH 도메인은 BiP 의존적 방식으로 항체 어셈블리의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(도 2c-2e). 도 2f에 도시된 바와 같이, 두 개의 VH 영역(Fab 영역에 하나 및 Fv 영역에 하나)을 포함하는 본원에 제공된 결합 분자의 중쇄 유사 사슬, 즉, 본 연구에서 ACE-00-VH는 포유류 발현 시스템에서 본원에 제공된 결합 분자의 적절한 어셈블리에 기여한다. 이 품질 관리 시스템이 없으면, 발현 배지에서 폴리펩티드 사슬의 많은 원하지 않는 조합이 발견될 것이다.
카파셀렉트는 ACE-00 및 ACE-00-VL2 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피에 사용되었다. 도 2g에 도시된 바와 같이, 결합되지 않은 ACE-00는 플로우 스루 레인에서 발견되지 않았다.
이어서 모세관 전기 영동을 수행하여 ACE-00-VL2와 ACE-00간의 분자 크기 차이를 확인하였다. 도 2h에서, 그림(좌측)의 각 피크의 크기는 표(우측)에 표시된다. 피크 7은 ACE-00-VL/ACE-00-LC 이량체 복합체를 나타내고 피크 8은 ACE-00-VH/ACE-00-LC 이량체 복합체를 나타낸다. ACE-00의 분자량은 ACE-00-VL2보다 4 kDa 높다(피크 12).
또한 모세관 전기 영동 결과는 ACE-00 및 ACE-00-VL2 분자의 입체 구조를 보여주었다. 도 2i에 도시 된 바와 같이, 대부분 (거의 99%)의 ACE-00 분자는 이종이량체 형태로 존재했다. 그 다음에 모세관 등전점 포커싱이 수행되고 ACE-00-VH 사슬과 ACE-00-VL 사슬 사이의 이종이량체화가 입증되었다. pI값은 ACE-00 및 ACE-00-VL2의 각각에 대한 cIEF로 측정되었다. 그 결과를 도 2j에 나타낸다. ACE-00-VH 및 ACE-00-VL 사슬 사이의 높은 이종이량체화 효율은 도 2k에 도시된 SDS-PAGE와 모세관 전기영동 결과로 입증되었다. 도 2l에 도시 된 바와 같이, 단백질 응집체의 작은 부분이 ACE-00의 크기배제 크로마토그래피에서 발견되었고, 대부분의 ACE-00는 가용성의 균일한 구조이어서, 높은 이종이량체화 효율이 추가로 입증되었다.
이러한 결과는 ACE-00가 적절하게 발현되고 조립되었음을 나타낸다. 또한 이러한 결과는 두 개의 VH 영역(Fab 영역에 하나 및 Fv 영역에 하나)을 포함하는 본원에서 제공된 결합 분자의 중쇄 유사 사슬이 포유류 발현 시스템에서 본원에 제공된 결합 분자의 적절한 어셈블리에 기여하고, Fv 영역에서 VH-VL 상호작용이 두 개의 중쇄 유사 사슬들의 이종이량체화를 촉진하는 주요 원동력임을 나타낸다. 아래에 설명된 다른 예시적 결합 분자 (예를 들어, ACE-05, ACE-10 및 ACE-11)에 대해 유사한 평가가 수행되었고 이러한 분자들에 대해 동일한 결론이 도출되었다.
1.2. ACE-02의 구축 및 발현
본원에서 제공된 ALiCE 분자 ACE-02를 발현하기 위해 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-02는 항-CD19 및 인간화 항-CD3 12F6 도메인으로 구성된다. ACE-02는 두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬들 (ACE-02-VH 및 ACE-02-VL)과 두 개의 동일한 경쇄 (ACE-02-LC)를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-02-VH 아미노산 서열:
ACE-02-VL 아미노산 서열:
ACE-02-LC 아미노산 서열 (항-CD19 항체 경쇄):
CD19를 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab 영역 및 인간화 12F6의 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv 영역에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 하기 표에 나열하였다:
표 5: ACE-02의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-02-VH, ACE-02-VL 및 ACE-02-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-02-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-02-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-02-LC 뉴클레오티드 서열 (항-CD19 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열):
도 3에서, SDS-PAGE 결과는 ACE-02, ACE-03, ACE-00 및 ACE-01의 발현을 보여준다. 또한 ACE-02와 ACE-02-VL2의 어셈블리 패턴 차이와 ACE-03과 ACE-03-VL2의 어셈블리 패턴 차이를 보여준다. ACE-01는 제1 항원을 표적으로 하는 항-CD19 항체와 제2 항원을 표적으로 하는 뮤린 OKT3의 모 항체를 가진다. 이러한 결과들은 ACE-02가 적절히 발현되고 조립되었음을 제시한다.
1.3. ACE-03의 구축 및 발현
본원에서 제공된 ALiCE 분자 ACE-03을 발현하기 위해 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-03은 항-CD19 및 인간화 항-CD3 OKT3 도메인으로 구성된다. ACE-03는 두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬들(ACE-03-VH 및 ACE-03-VL)과 두 개의 동일한 경쇄(ACE-03-LC)를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-03-VH 아미노산 서열:
ACE-03-VL 아미노산 서열:
ACE-03-LC 아미노산 서열 (항-CD19 항체 경쇄):
CD19를 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab 영역 및 인간화 OKT3의 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv 영역에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 하기 표에 나열하였다:
표 6: ACE-03의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-03-VH, ACE-03-VL 및 ACE-03-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-03-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-03-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-03-LC 뉴클레오티드 서열 (항-CD19 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열):
도 3에서, SDS-PAGE 결과는 ACE-02, ACE-03, ACE-00 및 ACE-01의 발현을 보여준다. 또한 이것은 ACE-02와 ACE-02-VL2의 어셈블리 패턴 차이 및 ACE-03과 ACE-03-VL2의 어셈블리 패턴 차이를 보여준다. 이러한 결과들은 ACE-03이 적절하게 발현되고 조립되었음을 제시한다.
1.4. ACE-04의 구축 및 발현
본원에서 제공된 ALiCE 분자 ACE-04를 발현하기 위해 HEK-293 일시적 발현 시스템 (Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-04는 항-PD-L1 및 키메릭 OKT3 Fab 도메인으로 구성된다 (도 4a 참조). ACE-04는 두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬 ACE-04-VH(VL-CL-VH-CH1) 및 ACE-04-VL(VH-CH1-VL-CL)과 두 개의 동일한 경쇄(ACE-04-LC)를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-04-VH 아미노산 서열:
ACE-04-VL 아미노산 서열:
ACE-04-LC 아미노산 서열(항-PD-L1 항체 경쇄):
PD-L1을 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab 영역 및 키메릭 OKT3 Fab 영역의 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv 영역에 대한 VH과 VL의 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 하기 표에 나열한다:
표 7: ACE-04의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-04-VH, ACE-04-VL 및 ACE-04-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-04-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-04-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-04-LC (항-PD-L1 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열):
도 4c에서, SDS-PAGE결과는 ACE-04 및 ACE-05의 발현, ACE-04와 ACE-04-VL2의 어셈블리 패턴의 차이 및 ACE-05와 ACE-05-VL2의 어셈블리 패턴의 차이를 보여준다. 결과는 ACE-04가 적절히 발현되고 조립되었음을 제시한다.
1.5. ACE-05의 구축 및 발현
본원에서 제공된 또 다른 ALiCE 분자 ACE-05 (항-PD-L1 및 항-CD3 도메인으로 구성된 결합 분자, 도 4b 참조)을 발현하기 위해 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-05는 두 개의 상이한 중쇄 유사 사슬 (ACE-05-VH 및 ACE-05-VL) 과 두 개의 동일한 경쇄(ACE-05-LC)를 포함한다. ACE-05는 유연 펩티드 영역에 G4S 링커(GGGGS의 아미노산 서열, 서열 번호: 112)를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-05-VH 아미노산 서열:
ACE-05-VL 아미노산 서열:
ACE-05-LC 아미노산 서열:
PD-L1을 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab 영역 및 CD3를 표적으로 하는 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv 영역에 대한 VH와 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 아래 표에 나열되어 있다:
표 8: ACE-05의 VHs, VLs 및 CDRs
숙주 세포를 (0.5:0.5:1 w/w 비율로) ACE-05-VH, ACE-05-VL 및 ACE-05-LC의 DNA로 형질 감염 시키기 위해 삼중-형질 감염을 수행하였다. ACE-05-VH, ACE-05-VL 및 ACE-05-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-05-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-05-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-05-LC 뉴클레오티드 서열:
섹션 1.1에서 설명한대로 형질 감염을 수행하였다. 보다 구체적으로 형질 감염 시약으로 폴리에틸렌이민(PEI)를 사용하였다 (DNA:PEI=1:4(w/w)비율로 사용). 형질 감염 6~7일 후 세포 생존율이 약 60에서 70%로 측정되었을 때, 회분 배양을 중단하고 발현 배지를 수집하고 원심 분리(4,800 rpm, 30분, 4℃)하여 부스러기를 제거하였다. 이후 0.22ｕm TOP-필터(Millipore, USA)를 이용하여 상등액을 여과하였다 이후, ACE-05 분자를 포함한 여과된 상등액은 Hitrap™ 카파셀렉트(GE healthcare, USA)를 이용하여 친화성 크로마토그래피 정제 과정을 거친 후, 용출 완충액 변경을 위해 Slide-A Lyzer 투석 카세트(Thermo, USA)를 이용하여 pH 7.4 PBS로 투석하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE, 모세관 전기 영동 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다. 이번 실험에서 HEK-293F 일시적 발현 시스템을 이용한 발현 정도는 약 50mg/mL로 측정되었다. Hitrap™ 카파셀렉트를 이용한 정제 분석은 배지에 발현된 대부분의 분자가 회수되었음을 보여주었다. 정제된 ACE-05 분자도 또한 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, 독일)와 SEC-HPLC (ThermoFisher, USA)를 이용하여 순도를 분석하였다. 순도 분석은 제조자가 제공한 지침을 사용하여 수행되었다.
도 4c에서, SDS-PAGE 결과는 ACE-05와 ACE-04의 발현, ACE-05와 ACE-05-VL2의 어셈블리 패턴의 차이, ACE-04와 ACE-04-VL2의 어셈블리 패턴의 차이를 보여준다. 도 4d는 ACE-05(상단)의 어셈블리 패턴을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE의 결과를 보여주고, ACE-05 어셈블리에 있어 잠재적인 조절 메커니즘을 설명한다.
도 4e 및 4f는 ACE-05의 입체 구조와 ACE-05-VH 및 ACE-05-VL 사슬 사이의 이종이량체화 효율을 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE 및 모세관 전기 영동을 보여준다. 도 4e와 4f의 좌측 패널은 정제된 ACE-05의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 또한 도 4e의 좌측 패널은 카파셀렉트를 이용한 ACE-05 및 ACE-05-VL2 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 도 4e 및 4f의 우측 4개 패널은 거의 동일한 양의 ACE-05-VH와 ACE-05-VL 사슬, ACE-05-LC의 양, 및 ACE-05-VH 및 ACE-05-VL 사슬 간의 높은 이종이량화 효율을 보여준다. 모세관 전기 영동 결과도 또한 ACE-05가 적절히 발현되고 조립되었음을 제시한다. 도 4g는 ACE-05의 순도를 확인하기 위해 수행된 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다. 도시된 바와, 카파셀렉트에 의한 정제된 샘플은 유리 경쇄를 포함한다. 이어서, 제2 겔 여과 크로마토그래피(GFC) 단계를 적용하여 유리 경쇄를 제거하여, 순수하고 적절하게 조립된 ACE-05 분자를 얻었다. 예상대로, SDS-PAGE 이미지의 NR 레인에서 ACE-05-VH 및 ACE-05-LC 이량체와 ACE-05-VL 및 ACE-05-LC 이량체가 관찰되었다. ACE-05-VH와 ACE-05-VL 사이의 소수성 상호작용은 SDS 세척제로 파괴되었다.
도 4h는 ACE-05의 겔 여과 분석을 위한 크기 배제 크로마토그래피 결과이다. ACE-05 입체 구조를 조사하기 위해 카파-셀렉트 친화성 정제 후 겔 여과 분석을 수행하였다. 슈퍼덱스 200A 칼럼 크로마토그래피에서 ACE-05의 약 19%의 응집이 검출되었다. 도 4i는 ACE-05의 구조적 입체 구조를 확인하기 위해 수행된 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 결과이다. 겔 여과에서 분리된 주요 피크를 분석하고, CEX컬럼을 이용하여 2개의 피크로 분리하였다. 더 높은 피크(67.87%)는 조립된 ACE-05이고, 더 낮은 피크(32%)는 힌지 영역에 유리 티올(thiol) 그룹을 가진 ACE-05-VH 사슬이다.
1.6. ACE-09의 구축 및 발현
위 섹션에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 ACE-09(항-PD-L1 및 UCHT1 도메인으로 구성된 결합 분자)의 적절한 발현 및 어셈블리를 입증하기 위하여 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-09는 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬(ACE-09-VH 및ACE-09-VL) 과 두 개의 동일한 경쇄(ACE-09-LC)를 포함한다(도 5 하단). ACE-05와 비교하여, ACE-09는ACE-05가 유연 펩티드 영역에 포함하는 G4S 링커(GGGGS의 아미노산 서열)을 포함하지 않는다(도 5 하단). 이 세 가지 유형의 폴리펩티드 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-09-VH 아미노산 서열(G4S 링커 부재):
ACE-09-VL 아미노산 서열(G4S 링커 부재):
ACE-09-LC 아미노산 서열 (항-PD-L1 항체 경쇄):
PD-L1과 UCHT1를 표적으로 하는 2가 Fab 영역에 대한 VH와 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 아래표에 나열되어 있다:
표 9: ACE-09의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-09-VH, ACE-09-VL 및 ACE-09-LC를 암화화 하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-09-VH 뉴클레오티드 서열(G4S 링커 부재):
ACE-09-VL 뉴클레오티드 서열(G4S 링커 부재):
ACE-09-LC 뉴클레오티드 서열(항-PD-L1 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열):
도 5는 카파셀렉트를 이용한 ACE-09에 대한 친화성 크로마토그래피의 SDS-PAGE 결과와 37℃ 및 32℃에서 ACE-09 및 ACE-05의 SDS-PAGE 결과이다. 결과는 ACE-09가 적절하게 발현되고 조립되었음을 나타낸다. 또한 ACE-09는 Fab과 Fv영역에서 ACE-05와 동일한 VHs 및 VLs을 갖지만(표 8 및 표 9에 표시됨), ACE-09는 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이에 ACE-05의 G4S 링커(GGGGS의 아미노산 서열)을 포함하지 않는다(도 5 하단). G4S 유연 링커는 입체장애를 줄이고 면역 세포 (예: T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 대한 제2 Fv 도메인의 결합을 최적화할 수 있고, 따라서 면역 세포의 표적 세포(예: 암 세포)로의 리디렉팅 효율을 증가시킬 수 있다. 뜻밖에도, ACE-05와 ACE-09는 유사한 수준의 발현을 보였으며, 이는 G4S링커가 발현 및 조립에 영향을 주지 않고 ALiCE 분자의 활성에 유익한 유연성을 제공할 수 있음을 제시한다.
1.7. ACE-10의 구축 및 발현
위 섹션 1.1과 1.2에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 ACE-10(항-CD20 및 항-CD3 도메인으로 구성된 결합 분자; 도 6a 참조)의 적절한 발현 및 어셈블리를 입증하기 위하여 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-10는 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬(ACE-10-VH 및 ACE-10-VL) 과 2개의 동일한 경쇄(ACE-10-LC)를 포함한다. 이 세 지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-10-VH 아미노산 서열:
ACE-10-VL 아미노산 서열:
ACE-10-LC 아미노산 서열:
CD20을 표적으로 하는 2가 Fab 영역 및 CD3을 표적으로 하는 1가 Fv 영역에 대한 VH와 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 아래 표에 나열되어 있다:
표 10: ACE-10의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-10-VH, ACE-10-VL 및 ACE-10-LC을 코딩하는 DNA 서열은 아래와 같다:
ACE-10-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-10-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-10-LC 뉴클레오티드 서열:
도 6b 및 6c는 ACE-10 분자의 발현 분석을 나타낸다. 도시된 바와 같이, ACE-10은 적절히 발현되고 조립되었다. 또한, 결과는 ACE-10의 어셈블리가 VH-BiP의존적 방식으로 조절됨을 나타낸다.
1.8. ACE-11의 구축 및 발현
위 섹션 1.1과 1.2에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 ACE-11(항-EGFR 및 항-CD3 도메인으로 구성된 결합 분자: 도 7a 참조)의 적절한 발현 및 어셈블리를 입증하기 위하여 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-11는 ACE-05 및 ACE-10과 동일한 전체 구조를 가지며, 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬(ACE-11-VH 및ACE-11-VL) 과 두 개의 동일한 경쇄(ACE-11-LC)를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-11-VH 아미노산 서열:
ACE-11-VL 아미노산 서열:
ACE-11-LC 아미노산 서열:
EGFR을 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab영역 및 CD3을 표적으로 하는 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv영역에 대한 VH와 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 아래 표에 나열되어 있다:
표 11: ACE-11의 VHs, VLs 및 CDRs
삭제
ACE-11-VH, ACE-11-VL 및 ACE-11-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-11-VH 뉴클레오티드 서열:
ACE-11-VL 뉴클레오티드 서열:
ACE-11-LC 뉴클레오티드 서열:
도 7b는 ACE-11 와 ACE-11-VL2의 발현 및 어셈블리를 보여준다. 화살표는 조립된 ACE-11의 밴드를 나타낸다. 결과는 ACE-11이 적절하게 발현되고 조립되었음을 제시한다.
1.9. ACE-12의 구축 및 발현
위 섹션에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 ACE-12(항-PD-L1 및 UCHT1 도메인으로 구성된 결합 분자)의 적절한 발현 및 어셈블리를 입증하기 위하여 HEK-293 일시적 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하였다. ACE-12는 2개의 상이한 중쇄 유사 사슬(ACE-12-VH 및ACE-12-VL) 과 두개의 동일한 경쇄(ACE-12-LC)를 포함한다. ACE-05가 유연 펩티드 영역에 GGGGS의 아미노산 서열을 갖는 G4S 링커를 포함하는 반면, ACE-12는 GGGGSGGGGS(서열 번호: 113) 및 GGSGGGGSG(서열 번호: 114)의 아미노산 서열을 갖는 G4S 링커를 포함한다. 이 세 가지 유형의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
ACE-12-VH 아미노산 서열(10개 잔기 GGGGSGGGGS 존재):
ACE-12-VL 아미노산 서열(9개 잔기 GGSGGGGSG 존재):
ACE-12-LC 아미노산 서열(항-PD-L1 항체 경쇄):
PD-L1을 표적으로 하는 제1 항원 결합 도메인 2가 Fab영역 및 UCHT1의 제2 항원 결합 도메인 1가 Fv영역에 대한 VH와 VL 아미노산 서열 및 이의 CDR 서열은 아래 표에 나열되어 있다:
표 12: ACE-12의 VHs, VLs 및 CDRs
ACE-12-VH, ACE-12-VL 및 ACE-12-LC를 코딩하는 DNA 서열은 다음과 같다:
ACE-12-VH 뉴클레오티드 서열(10개 잔기 GGGGSGGGGS 존재):
ACE-12-VL 뉴클레오티드 서열 (9개 잔기 GGSGGGGSG 존재):
ACE-12-LC 뉴클레오티드 서열 (항-PD-L1 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열):
도 8은 ACE-12, ACE-05 및 ACE-09의 어셈블리를 확인하기 위해 수행된 SDS-PAGE 결과이다. 결과는 ACE-12가 적절하게 발현되고 조립되었음을 나타낸다. 또한 ACE-12, ACE-05 및 ACE-09는 Fab 및 Fv 영역에서 동일한 VH 및 VL을 갖고(표 8, 9 및 12에 표시됨), 이들의 구조는 항체 힌지 영역과 제2 Fv 도메인 사이의 G4S 링커의 길이가 다르다(도 8 하단). G4S 유연 링커는 입체 장애를 줄이고 면역 세포 (예: T 세포를 포함하는 이펙터 세포)에 대한 제2 Fv 도메인의 결합을 최적화할 수 있으며, 따라서 면역 세포의 표적 세포(예: 암 세포)로의 리디렉팅 효율을 증가시킬 수 있다. 뜻밖에도, ACE-12, ACE-05 및 ACE-09는 유사한 수준의 발현을 보였다. 상이한 길이의 링커는 발현 및 어셈블리에 영향을 주지 않고 ALiCE 분자의 활성에 유익한 상이한 수준의 유연성을 제공할 수 있다.
요약하면, 상기 실험은 본원에서 제공되는 예시적 결합 분자의 성공적인 구축 및 발현을 설명하고, 이러한 ALiCE 분자가 적절하게 발현되고 조립될 수 있음을 보여준다.
실시예 2: 효소 결합 면역 흡착 분석을 이용한 예시적 결합 분자의 결합 친화도 분석
TNF 알파에 대한 ACE-00 및 ACE-00-VL2의 친화도는 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA))으로 측정하였다. Bmax는 실험 결과에서 추론된 최대 결합 친화력이다(그래프패드 프리즘 소프트웨어 7에서 제공되는 곡선 피팅 방법을 이용하여 계산됨). 도 9에 도시된 바와 같이, TNF 알파에 대한 모 항체 아달리무맙의 KD는 1.125 nM인 것으로 측정되었고; TNF 알파에 대한 1가 결합 도메인만을 갖는 ACE-00의 KD는 30.03 nM으로 측정되었고; ACE-00-VL 동종이량체로 구성된 ACE-00-VL2는 TNF 알파에 대한 친화성이 없는 것으로 측정되었다.
각 항원(예, ACE-05에 대한 PD-L1 및 CD3)에 대한 ACE-05 및 대조군 항체의 친화도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 인간 PD-L1(Y-Biologics, Inc.에 의해 제조된 YBL-007) 및 CD3(Sino Biological)과 같은 항원을 pH 7.4 PBS를 코팅 버퍼로 이용하여 면역 플레이트 (Thermo scientific, USA)에 1에서 10 μg/ml(100에서 1000 ng/웰)의 농도로 4℃에서 밤새도록 고정하였다. 다음 날, 200 μl의 PBST로 플레이트를 1회 세척한 후 상온에서 5% 탈지유로 1~2시간 동안 표면 블록킹 하였다. 이어서 200 μl의 PBST로 각 웰을 2회 세척한 후 ACE-05와 대조군 항체를 1/2에서 1/5의 비율로 희석하고 1~2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그 다음 각 웰을 200 μl의 PBST로 3회 세척하여 결합되지 않은 샘플을 제거하였다. 겨자무 과산화효소(HRP)가 컨쥬게이트된 항-인간 IgG(Fab 특이적) 항체 (Sigma, USA)를 웰에 1:1000 비율로 첨가하고 실온에서 반응시켰다. 200 μl의 PBST로 3번 세척한 후, 100 μl/웰의 부피로 TMB 용액 (GEhealthcare, USA)을 사용하여 HRP 발색 반응을 유도하였다. 종결 용액(2.5 M H2SO4, 100 μl/웰)을 이용하여 반응을 종료시켰다. 분광광도계를 이용하여 A450의 파장에서 흡광도를 측정하여 결합 친화도를 계산하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어 7을 이용하여 ACE-05 및 다른 대조군 항체의 각 표적에 대한 친화성을 분석하였다. 결과는 도 10a, 10b 및 10c에 도시하였다.
CD3에 대한 ACE-09, ACE-05 및 대조군 항체의 친화도는 위에 서술된 방법과 유사하게 측정되었다. 도 11에 도시된 바와 같이, ACE-09는 ACE-05와 비슷한 수준의 결합 친화도를 보였다.
실시예 3: 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용한 ACE-05의 결합 동력학 분석
인간 PD-L1 및 CD3에 대한 ACE-05의 결합 동력학은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 이용하여 측정하였다. OCTET® QKe 시스템(ForteBio, USA)을 이용한 무표지(label-free) 동역학(단백질-단백질 상호작용) 측정은 인간 PD-L1에 대한 항-인간 IgG 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio, USA) 및 CD3εδ사슬에 대한 아민 반응성(ARG2) 바이오센서를 이용하여 수행하였다. PD-L1과 CD3εδ를 각각의 바이오센서 표면에 고정하고 상이한 농도의 키네틱 완충액으로 희석된 ACE-05와 순차적으로 반응시켰다. 시간에 따른 센서그램(sensorgrams)을 수집하였다. 또한 ACE-05(즉, 항-hPD-L1 항체(YBL-007, 당 업계에 알려진 통상적인 방법을 이용하여 사내에서 생산됨) 및 항-CD3 항체(미국 BioLegend사의 UCHT1)를 제조하는데 사용된 모 항체도 본 실험에서 평가하고 ACE-05와 비교하였다. 도 12a 내지 12c에 도시된 바와 같이, 인간 PD-L1에 대한 ACE-05의 결합 동역학은 모 항-PD-L1 항체(즉, Y-Biologics, Inc.의 YBL-007)에 필적할 만하였으며, KD는 1.09 Х 10-11 미만이었다 (도 12a-12c 참조). 대조적으로 그리고 예상대로, CD3에 대한 ACE-05의 결합 친화도는 모 항-CD3항체(미국 BioLegend사의 UCHT1)보다 훨씬 낮았고 KD는 6.82 Х 10-9으로 측정되었다(도 5c 참조). 도 12a-12c에 도시된 바와 같이, 또한 ACE-05의 결합 동역학을 이중 특이적 T 세포 연계자(BiTE), 즉 BiTE-05와 비교하였다. BiTE는 약 55 킬로달톤의 단일 펩티드 사슬상에, 서로 다른 항체의 두 개의 단일-사슬 가변 단편(scFv), 또는 4종의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질을 생성하는 기존의 이중 특이적 항체 기술이다. BiTE기술에 대한 자세한 설명은 예컨대, Huehls et al., Immunol Cell Biol., 2015, 93(3): 290-296; Baeuerle et al., Drug Discovery Today, 2005, 10: 1237-1244; 및 Kufer et al., Trends in Biotechnology, 2004, 22(5): 238-244에서 찾을 수 있다. ACE-05는 BiTE-05보다 인간 PD-L1에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것으로 입증되었다. 반면, ACE-05는 BiTE-05보다 CD3에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것으로 입증되어, BiTE-05보다 세포독성이 낮을 것으로 예상된다.
도 12d에 도시된 바와 같이, 무표지 동역학 OCTET® 시스템(ForteBio, USA)을 이용하여 hPD-L1 및 hCD3에 대한 ACE-05의 동시 결합을 조사하였다. 리간드로서, 히스티딘 표지된 재조합 리간드 단백질(예, hPD-L1-his, hCD3εδ-his) 및 Fc 표지된 재조합 리간드 단백질(예, hPD-L1-Fc, hCD3εδ-Fc)을 제조하였다. 바이오센서칩 상에 제1 항원을 포획(고정)하기 위해 히스티딘 포획 NTA칩(ForteBio, USA)을 사용하였다. 첫 번째 리간드를 NTA칩에 완전히 포획시킨 후, 키네틱 완충액에 희석한 ACE-05를 분석하였다. 이어서 키네틱 완충액에 희석된 두 번째 리간드 역시 분석하여 두 번째 리간드에 대한 ACE-05의 동시 결합을 평가하였다.
실시예 4: T 세포 리디렉팅(redirecting)(활성) 및 T 세포 세포독성
T 세포를 리디렉팅하고 활성화하는 ACE-05의 활성을 평가하였다. T 세포 리디렉팅(활성) 분석에서는 PD-L1을 안정적으로 발현하는 HEK-293-PD-L1 세포주를 만들어 항원 공여자로 사용하였다. NFAT 루시퍼라제 리포터 시스템을 포함하도록 조작된 CD3양성 Jurkat 세포주를 이펙터 세포로 사용하였다(당업계에 알려진 통상적인 방법을 사용하여 사내에서 제작된 Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포).
그 다음, FACS 분석을 이용하여 상기 언급된 세포주에서 PD-L1 및 CD3 발현 정도를 측정하였다. HEK293E-PD-L1 세포 및 모 HEK293E 세포에서 PD-L1 발현 정도는 도 13a(우측 패널)에 도시하였다. 또한 다양한 CD3 항체로 측정한 Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포에서의 CD 발현 정도도 도 13a에 도시하였다(좌측 패널).
T 세포 리디렉팅(활성) 분석은 다음과 같이 수행하였다: HEK293E 세포 및 HEK293E-PD-L1 세포(7 Х 104 세포/웰)를 폴리-L-라이신(Sigma)이 코팅된 흰색 바닥 플레이트에 시딩하고 24시간 배양하였다. 다음 날, Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포 (1.4 Х 105 세포/웰)를 ACE-05, UCHT1 (미국 BioLegend의 모 항-CD3항체) 및 대조군 분자의 연속적 희석액으로 처리한 후 37℃에서 7시간 배양하였다. Bio-Glo 루시퍼라제 분석(Promega, USA)을 수행하여 Jurkat 활성화 정도를 검출하였다. ACE-05의 경우, PD-1/PD-L1 상호작용 블로킹과 PD-L1 표적화 T 세포 리디렉팅 양자의 상승 효과를 확인하기 위해, PD-1/PD-L1 차단 바이오어세이 키트(Promega, USA)를 이용하여 PD-1/PD-L1 차단 분석을 수행하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 7 소프트웨어를 이용하여 처리하고 분석하였다.
도 13b에 도시된 바와 같이, PD-L1을 발현하는 표적 세포(HEK293E-PD-L1 세포)를 사용한 경우, ACE-05는 이펙터 T 세포(Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포)를 활성화시킬 수 있었던 반면, PD-L1을 발현하지 않는 표적 세포(HEK293E)를 사용하였을 경우, ACE-05에 의해 이펙터 T 세포가 효과적으로 활성화될 수 없었다. 이러한 결과는 ACE-05가 T 세포의 표적 세포 의존적 활성화를 나타낸다는 것을 보여준다. 또한 본 연구에서 ACE-05와 BiTE-05를 비교하였다. 도 13b에 도시된 바와 같이, ACE-05는 PD-L1의 존재 하에 BiTE-05보다 더 효율적인 T 세포 활성화를 나타내었다. 그러나 PD-L1이 없는 경우, BiTE-05 존재 하의 T 세포 활성화가 ACE-05보다 더 높았다. 따라서, BiTE-05는 ACE-05보다 높은 세포 비의존적 T세포 활성화를 보여준다.
도 13c는 PD-L1을 각각 포함하거나 또는 포함하지 않은 ACE-05(좌측 패널)와 BiTE-05(우측 패널)에 대해 별도로 플롯팅된 도 13b과 동일한 데이터이며, 도 13b에서의 관찰과 일치하여, ACE-05 매개된 T세포 활성화의 역학적 범위가 BiTE-05 매개된 T 세포 활성화보다 훨씬 높음을 보여준다(수직 점선 화살표로 표시). 도 13d-13e는 도 13c에 제시된 동일한 데이터를 사용하여, ACE-05 및 BiTE-05의 표적 매개 (PD-L1을 발현하는 HEK) T 세포 활성만을 보여준다.
암에 대한 T세포 반응은 암 면역 사이클에서 다양하다. PD-1 발현이 있거나 없는 HCC827 PD-L1 양성 비소세포 폐암(NSCLC)과 Jurkat 루시퍼라제 리포터 세포를 이용하여 암에 대한 T세포 반응을 측정하였다. 도 13f에서 T 세포의 프라이밍 (primimg) 및 활성화 단계는 Jurkat-PD-1[-]로, T세포 휴지기 및 내성 단계는 Jurkat-PD-1[+]로 표시하였다. 나타낸 바와 같이, 결과는 T세포 발달 단계 모두에서 ACE-05의 항암 효능이 BiTE-05에 비해 훨씬 더 높을 것으로 예상됨을 나타낸다.
PD-1/PD-L1 상호작용 차단 및 PD-L1 표적화된 T 세포 리디렉팅 모두에 대한 상승 효과를 확인하기 위해, PD-1/PD-L1 차단 바이오어세이 키트(Promega, USA)를 이용하여 ACE-05의 생물학적 능력을 측정하였다. PD-1/PD-L1 차단 분석은 제조자가 제공한 지침에 따라 수행되었다. PD-1/PD-L1 차단 분석 결과는 도 13g에 도시하였고, 이는 ACE-05가 PD-1/PD-L1 상호작용뿐만 아니라 T 세포 리디렉팅도 차단할 수 있음을 보여준다. 또한 도 13h는 BiTE-05와 ACE-05를 나란히 비교할 때, ACE-05가 동시적인 PD-L1 차단과 T세포 리디렉팅으로부터의 상승 효과에 의해 가장 높은 T세포 활성화 신호를 보여준다는 것을 추가로 나타낸다. YBL-007는 항-PD-L1 항체이고, UCHT1는 항-CD3 항체이다.
또한 도 13i에 도시된 바와 같이, ACE-05는 항-CD3항체보다 더 적은 표적 비의존적 T세포 활성화를 나타낸다. 이 결과는 모 항-CD3 항체와 비교하여 CD3에 대한 ACE-05의 관찰된 더 낮은 친화도와 일치한다. 따라서, 이러한 결과들은 1가 항-CD3 도메인 단독으로는 T 세포를 활성화시키는데 비효율적이기 때문에 항-CD3항체보다 ACE-05의 세포독성이 더 낮을 것을 나타낸다. 도 13j는 ACE-05와 BiTE-05를 나란히 비교한 동일한 분석의 데이터를 보여주는데, 이는 CD3에 대한 BiTE-05의 친화도가 ACE-05보다 훨씬 높기 때문에 PD-L1 표적이 없는 경우 BiTE-05가 가장 높은 T세포 활성화 신호를 보임을 나타내며, 이는 더 높은 수준의 독성을 의미한다.
LDH(젖산 탈수소효소) 분석을 이용하여 ACE-05 매개 T 세포 세포독성을 측정하였다. 건강한 공여자의 PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, PD-L1이 과발현된 HCC827 비소세포 폐암세포(ATCC)를 표적 세포로 사용하였다. 죽은 종양 세포에서 방출된 LDH를 LDH 분석시스템으로 측정하고, 상이한 비율의 T:E(표적:이펙터)를 ACE-05의 존재 하에서 평가하였다(도 13k). 또한, ACE-05는 건강한 공여자로부터 분리한 PBMC와 공동-배양된 HCC827 세포(PD-L1 양성)에 대해 용량-의존적 종양 사멸 능력을 나타냈다(도 13l). 도 13m은 ACE-05 또는 YBL-007의 존재 하에 PBMC와 직접 접촉할 때 종양 세포에 대한 T 세포 세포독성을 보여준다. 24시간에 걸쳐, 표적 HCC827 세포는 처리 없이 또는 YBL-007 존재 하에서 성장한 반면, 표적 HCC827 암세포는 ACE-05의 존재 하에 사멸되었다.
활성화된 백혈구에 의해 방출된 면역 사이토카인 수준은 오프타겟(off-target) T 세포 활성화와 관련된 부작용을 반영할 수 있다. 따라서, IL-2 또는IFN-γ 어세이 키트(BioLegend, USA)를 이용하여 공동-배양된 건강한 공여자로부터의 PBMC와 HCC827 세포에서 ACE-05 또는 BiTE-05의 존재 하에서 IL-2 및 INF-γ 수준을 모니터링하였다. BiTE-05보다 ACE-05의 존재 하에서 더 낮은 수준의 IL-2가 관찰되었고, 이는 ACE-05가 IL-2 분비의 주요 공급원인 활성 CD3+ T세포를 덜 활성화시킬 것을 제시한다. 따라서 ACE-05는 BiTE-05보다 T 세포의 오프타겟 활성화를 덜 유도할 수 있다. 또한, ACE-05 및 BiTE-05의 존재는 NKT 또는 NK 세포로부터 방출되는 유사한 수준의 INF-γ를 야기했다(도 13n).
ACE-05의 열역학적 안정성은 CFX96TM ORM 시스템을 가진 C1000 열 사이클 장치(BioRad, USA)를 이용하여 평가하였다. 3 μM 결합 분자를 1/25 희석된 CYPRO 오렌지 단백질 염색(Invitrogen, USA) 10 μl와 혼합하고, 이 혼합물 50 μl를 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 샘플은 상온에서 99℃까지 1℃/분으로 가열하여 변성시켰다. CYPRO 염색된 변성된 단백질의 양을 기록하고 용융 온도(TM)를 CFX 관리자 소프트웨어로 계산하였다. 도 13o에 도시된 바와 같이, ACE-05는 BiTE-05보다 열역학적으로 안정성이 더 높았다.
T세포 리디렉팅 분석을 수행하여 CD20 표적화를 통해 ACE-10 매개 T세포 활성화를 측정하였다. CD20 양성 Raji 세포는 항원 공여자 표적 세포로 사용되었고, Karpas-299 세포는 CD20 음성 대조군으로 사용되었다. ACE-10은 BiTE-10보다 더 효과적인 T 세포 활성화를 나타낸다. CD20 양성 Raji 세포에서의 결과와 CD20 음성 Karpas-299 세포에서의 결과를 비교하면, T 세포 활성화는 표적 세포의 CD20 발현에 의존한다는 것을 제시한다(도 14a-14b 참조).
또한 LDH 분석을 이용하여 ACE-11 매개 T 세포 세포독성을 측정하였다. 건강한 공여자의 PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, EGFR-양성 SW48, HT29, 및 HCT116 결장암 세포를 표적 세포로 사용하였다. 죽은 종양 세포에서 방출된 LDH는 LDH 분석 시스템을 이용하여 측정하였다. HT29 및 HCT116 암 세포는 성장 신호의 지속적인 활성화를 유도할 수 있는 Ras 및 Raf 돌연변이를 갖는다. ACE-11은 세 가지 암 세포주 모두에서 세포독성을 보였다. 결과는 도 15에 도시한다.
실시예 5: 스프라그-돌리 (SD) 래트에서의 약동학 분석
SD 래트에서 ACE-05 및 대조군 항체의 약동학 분석을 실시하였다. 이 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다(승인번호: QBSIACUC-A17099).
SD 래트(n=3 수컷 래트/그룹)에 꼬리 정맥을 통해 10 mg/kg 단일 정맥 투여 용량의 ACE-05 또는 대조군 항체(YBL007 또는 아벨루맙)를 투여하였다. 각 동물로부터 총 500μl의 혈청을 다음의 시점에 수집하였다: ACE-05 또는 대조군 항체 투여 후 10 분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 3일, 5일, 및 9일. 샘플을 10,000~13,000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 각 샘플로부터 혈장 70μl를 분리하여 추가 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다. 각 샘플의 농도는 ELISA로 측정하였다. 96-웰 면역-플레이트(Thermo Scientific, USA)를 PD-L1(Y-Biologics, Inc.에서 생산)으로 코팅하였다. 1:1000, 1:4000 또는 1:8000으로 희석된 래트의 혈장 샘플을 웰에 첨가하였다. 결합된 샘플은 HRP가 컨쥬게이트된 항-인간 IgG(Fab 특이적)(Sigma, USA)로 검출하였다. 제조자의 지침에 따라 1:500 비율로 하여 TMB 기질 (Sigma, USA)에 의해 웰을 발색시켰다. 그 다음 A450을 측정하였다. ACE-05 및 대조군 항체의 농도는 알려진 농도의 샘플 단백질을 사용하여 표준 곡선과 비교하여 결정하였다. 흡광도 데이터는 BA Calc 2007 소프트웨어에 의해 분석하였다. 약동학적 연구 결과는 도 16a에 도시하였다. 도시된 대로, ACE-05의 반감기는 10.113시간으로 측정되었다. 그러나, 본 실험에서 모 항체의 반감기가 98 및 73시간으로 측정되었고, 이는 이러한 항체의 일반적인 반감기(7일 또는 10일)보다 훨씬 짧은 것이므로, ACE-05의 실제 반감기는 10시간 보다 훨씬 더 길 가능성이 매우 크다. 도 16b에 도시된 바와 같이, ACE-05는 BiTE-05보다 긴 반감기를 나타내었으며, 이는 ACE-05가 BiTE-05보다 더 높은 혈청 안정성을 가지는 것을 제시한다.
실시예 6: 인간 비소세포 폐암 치료에 있어서ACE-05의 효능 평가
인간 비소세포 폐암 치료에 있어서 ACE-05의 효능을 평가하고 NCG 마우스 (CrownBio, USA)에서 HCC827 세포주를 이용하여 다른 항체와 비교하였다. 연구는 하기 표에 나타낸 바와 같이 설계하였다:
표 13: 연구 설계
참고: N: 동물 수; *2명의 공여자가 사용될 것이다. N=5/그룹
투여부피: 체중을 기초로 하여 투여 부피 조정(5 μL/g)
처리 요법은 제시된 규정 및/또는 고객 요청에 따라 체중 감소 또는 다른 부작용에 따라 변경될 수 있다.
도 17a-17f는 인간화 마우스 모델에서 HCC827 (PD-L1 양성 종양) 이종이식 연구의 결과이다. 6-8 주령 암컷 NCG 마우스를 PBMC 재구성(reconstitution)을 위해 선택하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 4개의 실험군 (10 마우스/그룹) 및 2개의 PBMC 공여자(5 마우스/공여자)로 하였다. 시험 검체를 종양 접종 4일 후 ACE-05, BiTE-05, IgG, 및 YBL-007로 처리하였고(TV 크기= 50 mm3), 각 공여자로부터 분리된 PBMC는 종양 접종 수 일 전에 재구성되었다. ACE-05 및 BiTE-05는 4일, 6일, 8일(총 3회) 주입하였다. IgG 및 YBL-007는 4일, 7일 및 10일(총 3회) 주입하였다. 이 연구의 12일째, ACE-05 처리 후 10마리 중 9마리에서 종양이 완전히 사라졌다. BiTE 처리군의 체중 감소 (BWL)(%)는 ACE-05 처리군보다 훨씬 높았다. BiTE 처리군의 10마리 중 3마리의 마우스는 이 연구 동안 BWL가 20% 이상이 되어 종료하였다. 결과는 ACE-05가 관찰된 폐암의 치료에 효과적임을 보여주며, 또한 ACE-05가 BiTE기술을 이용하여 생산한 이중 특이성 항체인 BiTE-05보다 높은 안전성을 가짐을 나타낸다.
실시예 7: ACE-05 및 BiTE-05 항암 효능에 대한 용량 제한 연구
ACE-05의 유효 용량을 결정하기 위하여 HCC827 인간화 이종이식 모델에서 용량 제한 실험을 실시하였다(도 18a-18d). PBMC 재구성된 인간화를 위해 6-8주령 NCG 암컷 마우스(CrownBio, USA)를 선택하였고, 14개 실험군 (6마우스/그룹)으로 나누었다. 그룹화 및 처리 전에, 모든 동물은 무게를 측정하고 캘리퍼를 이용하여 종양의 부피를 측정하였다. 종양 부피는 임의의 주어진 처리의 효과에 영향을 미칠 수 있으므로 종양 부피를 수치적 매개 변수로 사용하여 선택된 동물을 지정된 그룹으로 무작위화하였다. 그룹화는 StudyDirector™ 소프트웨어(Studylog Systems, USA)를 이용하여 실시하였다. 그룹 배분을 위해 "매칭된 분배(matched distribution)" 무작위화 방법을 선택하였고, 이는 종양 부피의 최소 그룹간 변동을 보여주었다.
2명의 공여자로부터의 인간 PBMC를 종양 세포 접종 3일 전에 정맥 투여로 이식하였다. 각각의 마우스의 우측 옆구리 영역에 0.1 ml의 PBS 중의 HCC827 종양 세포(5 Х 106)를 종양 발달을 위해 피하로 접종하였다. HCC827 접종 4일 후, 0.5 mpk (mg/kg)에서 0.0005 mpk까지의 5개 상이한 농도(0.5, 0.1, 0.05, 0.005, 및 0.0005 mpk)의 ACE-05 및 BiTE-05를 처리하였다. 도 18a의 X-축 위에 4개의 수직 화살표로 표시된 바와 같이, 시험 검체 투여는 3일마다, 즉, 4일, 7일, 10일, 및 13일(Q3d, 총 4회 투여)에 계획하였다.
시험 분자의 처음 투여 후, 2일 또는 3일 마다 종양 치수(도 18a-18c) 및 체중(도 18d)을 스코어링 하였다. 각 군의 종양 부피 및 체중 변화에 대한 평균의 표준 오차(SEM)는 도 18a에서 각각 시간에 대하여 플롯팅하였다. 도 18b-18c는 각각 ACE-05 및 BiTE-05를 처리한 각 투여군에서 각각의 마우스의 항-종양능을 나타낸다. 15일째에 BiTE-05 처리군에서 마우스 4마리가 종료되었지만, ACE-05 처리군에서는 1마리만 종료되었다. 0.5mpk, 0.1mpk, 및 0.05mpk의 ACE-05로 처리한 대부분의 동물에서 BiTE-05를 처리한 그룹(도 18c)과 대조적으로 종양이 완전히 사라졌다 (도 18b).
ACE-05 및 BiTE-05의 항암 활성을 표 14에 요약하였다. 15일째 평균 종양 부피(TV)를 표준 오차와 함께 나타내었다. 종양 성장 억제 퍼센트(TGI%)는 다음 공식을 이용하여 계산한, 시험군과 대조군의 평균 종양 부피간의 차이이다: TGI(%) = (대조군 평균 TV-시험군 평균)/대조군 평균 TV Х 100. T/C(%)는 다음 공식을 이용하여 계산하였다: T/C(%) = 시험군 평균 TV/대조군 평균 TV Х 100. 결과는 관찰된 폐암을 치료하는데 있어 농도 범위에 걸쳐 ACE-05가 BiTE-05보다 더 효과적임을 보여준다.
표 14: ACE-05 및 BiTE-05의 항종양 활성
전술한 내용으로부터, 특정 실시예가 예시의 목적으로 여기에 설명되었지만, 여기에 제공된 것의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해한 것이다. 위에서 언급한 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
<110> Y-BIOLOGICS INC. <120> CELL ENGAGING BINDING MOLECULES <130> SPI20-007 <150> US 16/372,196 <151> 2019-04-01 <150> US 16/372,190 <151> 2019-04-01 <150> US 16/372,172 <151> 2019-04-01 <150> US 62/719,484 <151> 2018-08-17 <150> US 62/655,762 <151> 2018-04-10 <160> 129 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-VH amino acid sequence <400> 1 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 245 250 255 Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His 275 280 285 Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val 290 295 300 Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 305 310 315 320 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu 325 330 335 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser 340 345 350 Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe 355 360 365 Ser <210> 2 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-VL amino acid sequence <400> 2 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser 245 250 255 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala 260 265 270 Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 275 280 285 Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly 290 295 300 Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu 305 310 315 320 Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 325 330 335 Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu 340 345 350 Ile Lys Arg 355 <210> 3 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-LC amino acid sequence <400> 3 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in VH of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 4 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in CDR H1 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 5 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in CDR H2 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 6 Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) CDR H3 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 7 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in VL of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 8 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg 100 105 110 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in CDR L1 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 9 Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in CDR L2 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 10 Gly Asp Ile 1 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (PD-L1) in CDR L3 of ACE-04, ACE-05, ACE-09, and ACE-12 <400> 11 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Gly Val 1 5 10 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VH of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser 115 120 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H1 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 13 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H2 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 14 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H3 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 15 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VL of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L1 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 17 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L2 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 18 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L3 of ACE-05, ACE-09, ACE-10, ACE-11, and ACE-12 <400> 19 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 20 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-VH nucleotide sequence <400> 20 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780 cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840 atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900 tacaaaggtg ttagtaccta caaccagaag ttcaaggaca aggccacact gactgtagac 960 aagtcatcca gcacagccta catggaactc ctcagtctga catctgagga ctctgcagtc 1020 tattactgtg caagatcggg gtactacggt gatagtgact ggtacttcga tgtctggggc 1080 caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110 <210> 21 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-VL nucleotide sequence <400> 21 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780 tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840 aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900 ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960 accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020 cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068 <210> 22 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-05-LC nucleotide sequence <400> 22 cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120 cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657 <210> 23 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-VH amino acid sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 245 250 255 Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His 275 280 285 Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val 290 295 300 Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 305 310 315 320 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu 325 330 335 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser 340 345 350 Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe 355 360 365 Ser <210> 24 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-VL amino acid sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser 245 250 255 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala 260 265 270 Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 275 280 285 Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly 290 295 300 Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu 305 310 315 320 Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 325 330 335 Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu 340 345 350 Ile Lys Arg 355 <210> 25 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-LC amino acid sequence <400> 25 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in VH of ACE-10 <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H1 of ACE-10 <400> 27 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H2 of ACE-10 <400> 28 Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H3 of ACE-10 <400> 29 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in VL of ACE-10 <400> 30 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L1 of ACE-10 <400> 31 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L2 of ACE-10 <400> 32 Ala Thr Ser 1 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L3 of ACE-10 <400> 33 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 34 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-VH nucleotide sequence <400> 34 caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120 cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240 atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300 tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360 gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780 cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840 atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900 tacaaaggtg ttagtaccta caaccagaag ttcaaggaca aggccacact gactgtagac 960 aagtcatcca gcacagccta catggaactc ctcagtctga catctgagga ctctgcagtc 1020 tattactgtg caagatcggg gtactacggt gatagtgact ggtacttcga tgtctggggc 1080 caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110 <210> 35 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-VL nucleotide sequence <400> 35 caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120 cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240 atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300 tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360 gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780 tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840 aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900 ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960 accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020 cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068 <210> 36 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-10-LC nucleotide sequence <400> 36 cagatcgtgc tgagccagag ccctgctatc ctgagcgcca gccctggcga gaaggtgacc 60 atgacctgcc gcgccagcag cagcgtgagc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120 agcagcccca agccctggat ctacgccacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgtgcgc 180 ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagagt ggaggctgag 240 gacgccgcta cctactactg ccagcagtgg accagcaacc cccccacctt cggcggcggc 300 accaagctgg agatcaagag aaccgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642 <210> 37 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-VH amino acid sequence <400> 37 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 245 250 255 Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 260 265 270 Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 275 280 285 Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr 290 295 300 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 320 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 325 330 335 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp 340 345 350 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser 355 360 365 <210> 38 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-VL amino acid sequence <400> 38 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 245 250 255 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 260 265 270 Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 275 280 285 Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 290 295 300 Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 305 310 315 320 Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 325 330 335 Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 340 345 350 Arg <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-LC amino acid sequence <400> 39 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in VH of ACE-11 <400> 40 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H1 of ACE-11 <400> 41 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H2 of ACE-11 <400> 42 Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr 1 5 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR H3 of ACE-11 <400> 43 Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in VL of ACE-11 <400> 44 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L1 of ACE-11 <400> 45 Gln Ser Ile Gly Thr Asn 1 5 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L2 of ACE-11 <400> 46 Tyr Ala Ser 1 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD20) in CDR L3 of ACE-11 <400> 47 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 48 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-VH nucleotide sequence <400> 48 caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60 acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120 ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180 accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240 aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300 tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 ggcggaggtg ggagtgaggt gcagctccag cagtctggac ctgagctggt gaagcctgga 780 ccttcaatga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 840 tgggtgaagc agagtcatgg aaagaacctt gagtggatgg gacttattaa tccttacaaa 900 ggtgttagta cctacaacca gaagttcaag gacaaggcca cactgactgt agacaagtca 960 tccagcacag cctacatgga actcctcagt ctgacatctg aggactctgc agtctattac 1020 tgtgcaagat cggggtacta cggtgatagt gactggtact tcgatgtctg gggccagggg 1080 accacgctga ccgtcttctc ataa 1104 <210> 49 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-VL nucleotide sequence <400> 49 caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60 acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120 ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180 accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240 aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300 tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 ggcggaggtg ggagtgacat ccagatgacc cagaccacct cctccctgtc tgcctccctg 780 ggcgacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagaaatta tttaaactgg 840 tatcaacaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct actacacatc aagattacac 900 tcaggagtcc catcaaagtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc tctcaccatt 960 agcaacctgg agcaagagga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg 1020 tggacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaacggt aa 1062 <210> 50 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-11-LC nucleotide sequence <400> 50 gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60 ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120 aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180 cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240 gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300 ggcaccaaac tggaactgaa aagaaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Her2) in VH of ACE-00 <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Her2) in VL of ACE-00 <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (TNF alpha) in VH of ACE-00 <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (TNF alpha) in VL of ACE-00 <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region sequence of IgG1 <400> 55 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region sequence of IgG2 <400> 56 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 57 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region sequence of IgG3 <400> 57 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 35 40 45 Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region sequence of IgG4 <400> 58 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 59 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A representative CL region of the Fab region <400> 59 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 60 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A representative CH1 region of the Fab region <400> 60 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 61 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in VH of ACE-02, and ACE-03 <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR H1 of ACE-02, and ACE-03 <400> 62 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR H2 of ACE-02, and ACE-03 <400> 63 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR H3 of ACE-02, and ACE-03 <400> 64 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in VL of ACE-02, and ACE-03 <400> 65 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR L1 of ACE-02, and ACE-03 <400> 66 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR L2 of ACE-02, and ACE-03 <400> 67 Asp Ala Ser 1 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (CD19) in CDR L3 of ACE-02, and ACE-03 <400> 68 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 69 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VH of ACE-02 <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H1 of ACE-02 <400> 70 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H2 of ACE-02 <400> 71 Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H3 of ACE-02 <400> 72 Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VL of ACE-02 <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 100 105 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L1 of ACE-02 <400> 74 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 75 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L2 of ACE-02 <400> 75 Ala Thr Ser 1 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L3 of ACE-02 <400> 76 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VH of ACE-03 <400> 77 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H1 of ACE-03, and ACE-04 <400> 78 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H2 of ACE-03, and ACE-04 <400> 79 Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr 1 5 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR H3 of ACE-03, and ACE-04 <400> 80 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VL of ACE-03 <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 100 105 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L1 of ACE-03, and ACE-04 <400> 82 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 83 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L2 of ACE-03, and ACE-04 <400> 83 Asp Thr Ser 1 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L3 of ACE-03 <400> 84 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 85 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VH of ACE-04 <400> 85 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 86 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in VL of ACE-04 <400> 86 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 100 105 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (CD3) in CDR L3 of ACE-04 <400> 87 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe 1 5 <210> 88 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-VH amino acid sequence <400> 88 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val 245 250 255 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 260 265 270 Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 275 280 285 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys 290 295 300 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 305 310 315 320 Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 325 330 335 Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp 340 345 350 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 355 360 <210> 89 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-VL amino acid sequence <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 245 250 255 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser 260 265 270 Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro 275 280 285 Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser 290 295 300 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 305 310 315 320 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser 325 330 335 Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 340 345 350 <210> 90 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-LC, ACE-03-LC (anti-CD19 antibody light chain) <400> 90 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 91 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-03-VH amino acid sequence <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val 245 250 255 Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 260 265 270 Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 275 280 285 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr 290 295 300 Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys 305 310 315 320 Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 325 330 335 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 340 345 350 Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 355 360 <210> 92 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-03-VL amino acid sequence <400> 92 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 245 250 255 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser 260 265 270 Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro 275 280 285 Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser 290 295 300 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser 325 330 335 Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 340 345 350 <210> 93 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-VH amino acid seqeunce <400> 93 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala 245 250 255 Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro 275 280 285 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 290 295 300 Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp 305 310 315 320 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 325 330 335 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys 340 345 350 Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 355 360 365 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 370 375 380 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 405 410 415 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 420 425 430 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 435 440 445 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 450 455 460 Glu Pro Lys Ser Cys 465 <210> 94 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-VL amino acid sequence <400> 94 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 245 250 255 Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 260 265 270 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr 275 280 285 Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 290 295 300 Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 305 310 315 320 Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 325 330 335 Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 340 345 350 Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 355 360 365 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 370 375 380 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 385 390 395 400 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 405 410 415 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 420 425 430 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 435 440 445 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 450 455 460 <210> 95 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-LC, ACE-09-LC, and ACE-12-LC (anti-PD-L1 antibody light chain) <400> 95 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg 100 105 110 Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 96 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-09-VH amino acid sequence (without G4S linker) <400> 96 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 245 250 255 Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 260 265 270 Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu 275 280 285 Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln 290 295 300 Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 305 310 315 320 Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 325 330 335 Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp 340 345 350 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser 355 360 <210> 97 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-09-VL amino acid sequence (without G4S linker) <400> 97 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 245 250 255 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 275 280 285 Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe 290 295 300 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu 305 310 315 320 Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu 325 330 335 Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 340 345 350 <210> 98 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-12-VH amino acid sequence (with 10 residues) <400> 98 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 245 250 255 Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile 260 265 270 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp 275 280 285 Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn 290 295 300 Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala 305 310 315 320 Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu 325 330 335 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly 340 345 350 Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Thr Leu Thr Val Phe Ser 370 <210> 99 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-12-VL amino acid sequence (with 9 residues) <400> 99 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr 245 250 255 Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile 260 265 270 Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 275 280 285 Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg 290 295 300 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 305 310 315 320 Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr 325 330 335 Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly 340 345 350 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 355 <210> 100 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-VH nucleotide sequence <400> 100 caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60 tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120 ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180 aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240 atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300 accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360 acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720 ctcctggggg gaccgcaggt gcagctggtg cagagcggcg gcggcgtggt gcagcccggc 780 cgcagcctgc gcctgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccagcta caccatgcac 840 tgggtgcgcc aggcccccgg caagggcctg gagtggatcg gctacatcaa ccccagcagc 900 ggctacacca agtacaacca gaagttcaag gaccgcttca ccatcagcgc cgacaagagc 960 aagagcaccg ccttcctgca gatggacagc ctgcgccccg aggacaccgg cgtgtacttc 1020 tgcgcccgct ggcaggacta cgacgtgtac ttcgactact ggggccaggg cacccccgtg 1080 accgtgagca gctaa 1095 <210> 101 <211> 1059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-VL nucleotide sequence <400> 101 caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60 tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120 ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180 aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240 atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300 accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360 acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720 ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780 ggcgaccgcg tgaccatgac ctgccgcgcc agcagcagcg tgagctacat gcactggtac 840 cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagccc tggatctacg ccaccagcaa cctggccagc 900 ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacaccct gaccatcagc 960 agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccccc 1020 accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059 <210> 102 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-02-LC, and ACE-03-LC (anti-CD19 antibody light chain nucleotide sequence) <400> 102 gatattcaac tcacgcaatc tccagcaagt ctcgcagtta gtttggggca gcgagctaca 60 ataagttgca aggcgagcca atccgtggat tatgatggag acagctatct taactggtat 120 cagcaaattc caggccagcc acccaagttg ctgatctacg acgcgtcaaa cctggtctca 180 gggatccctc caagatttag cggctcaggt tcaggtacgg attttacgct caatatccat 240 cctgtagaga aggttgatgc agctacatac cactgtcaac agagtaccga ggatccttgg 300 accttcggag gcggtacaaa gctggagatc aagagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657 <210> 103 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-03-VH nucleotide sequence <400> 103 caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60 tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120 ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180 aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240 atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300 accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360 acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720 ctcctggggg gaccggtgca gctggtgcag agcggcggcg gcgtggtgca gcccggccgc 780 agcctgcgcc tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca cccgctacac catgcactgg 840 gtgcgccagg cccccggcaa gggcctggag tggatcggct acatcaaccc cagccgcggc 900 tacaccaact acaaccagaa ggtgaaggac cgcttcacca tcagcaccga caagagcaag 960 agcaccgcct tcctgcagat ggacagcctg cgccccgagg acaccgccgt gtactactgc 1020 gcccgctact acgacgacca ctactgcctg gactactggg gccagggcac ccccgtgacc 1080 gtgagcagct aa 1092 <210> 104 <211> 1059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-03-VL nucleotide sequence <400> 104 caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60 tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120 ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180 aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240 atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300 accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360 acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720 ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780 ggcgaccgcg tgaccatcac ctgcagcgcc agcagcagcg tgagctacat gaactggtac 840 cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagcgc tggatctacg acaccagcaa gctggccagc 900 ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacacctt caccatcagc 960 agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccttc 1020 accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059 <210> 105 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-VH nucleotide seqeunce <400> 105 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tcaggtccag ttgcaacagt ctggagccga gctcgccagg 780 ccaggagcct ccgtcaaaat gtcatgcaag gcctcagggt acacatttac gcgatatacc 840 atgcactggg tgaaacaaag accaggtcag ggacttgaat ggatcggtta cattaacccc 900 tctagaggct atacgaatta caaccagaaa ttcaaagaca aagcaacact tacgactgac 960 aaatccagta gtacggctta catgcagctc tcatctttga cttcagaaga ctctgctgta 1020 tattattgtg cccgctatta cgatgaccat tactgccttg attactgggg ccagggcact 1080 actgttaccg taagtgcggc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 1140 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 1200 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 1260 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 1320 agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 1380 gacaagagag ttgagcccaa atcttgttga 1410 <210> 106 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-VL nucleotide sequence <400> 106 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tcagatcgtc ctcactcaaa gtcctgctat tatgtccgca 780 agccctggtg aaaaggttac catgacttgc tccgcatcta gttctgtctc ttacatgaac 840 tggtaccagc aaaagtctgg aacgtccccg aaaaggtgga tatatgatac gagcaaattg 900 gcaagcggag tacccgcgca ttttaggggt tcaggcagcg gtacgtcata tagcctgact 960 attagcggaa tggaggcgga ggatgctgca acatattatt gccaacaatg gtcatcaaat 1020 ccttttactt tcggctcagg cacaaaactt gaaataaata gaaccgtggc tgcaccatct 1080 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 1140 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 1200 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 1260 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 1320 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1380 taa 1383 <210> 107 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-04-LC, ACE-09-LC, ACE-12-LC (anti-PD-L1 antibody light chain nucleotide sequence) <400> 107 cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120 cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagatctg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657 <210> 108 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-09-VH nucleotide sequence (without G4S linker) <400> 108 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccggagg tgcagctcca gcagtctgga cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg 780 aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag 840 cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg ggacttatta atccttacaa aggtgttagt 900 acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc acactgactg tagacaagtc atccagcaca 960 gcctacatgg aactcctcag tctgacatct gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga 1020 tcggggtact acggtgatag tgactggtac ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg 1080 accgtcttct cataa 1095 <210> 109 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-09-VL nucleotide sequence (without G4S linker) <400> 109 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccggaca tccagatgac ccagaccacc tcctccctgt ctgcctccct gggcgacaga 780 gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagaaatt atttaaactg gtatcaacag 840 aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc 900 ccatcaaagt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 960 gagcaagagg atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtggacgttc 1020 gctggaggca ccaagctgga aatcaaacgg taa 1053 <210> 110 <211> 1125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-12-VH nucleotide sequence (with 10 residues) <400> 110 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gaggtgggag tggaggcgga ggatctgagg tgcagctcca gcagtctgga 780 cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg aagatatcct gcaaggcttc tggttactca 840 ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg 900 ggacttatta atccttacaa aggtgttagt acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc 960 acactgactg tagacaagtc atccagcaca gcctacatgg aactcctcag tctgacatct 1020 gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tcggggtact acggtgatag tgactggtac 1080 ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg accgtcttct cataa 1125 <210> 111 <211> 1080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-12-VL nucleotide sequence (with 9 residues) <400> 111 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300 gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360 tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgggcg gatccggcgg aggcggcagc ggagacatcc agatgaccca gaccacctcc 780 tccctgtctg cctccctggg cgacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt 840 agaaattatt taaactggta tcaacagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac 900 tacacatcaa gattacactc aggagtccca tcaaagttca gtggcagtgg gtctggaaca 960 gattattctc tcaccattag caacctggag caagaggata ttgccactta cttttgccaa 1020 cagggtaata cgcttccgtg gacgttcgct ggaggcacca agctggaaat caaacggtaa 1080 1080 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker in ACE-05-VH and ACE-05-VL <400> 112 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker in ACE-12-VH <400> 113 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker in ACE-12-VL <400> 114 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 115 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-00-VH amino acid sequence <400> 115 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 245 250 255 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp 260 265 270 Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 275 280 285 Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser 290 295 300 Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 305 310 315 320 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 325 330 335 Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp 340 345 350 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360 <210> 116 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-00-VL amino acid sequence <400> 116 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 245 250 255 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn 260 265 270 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 275 280 285 Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 290 295 300 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 305 310 315 320 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro 325 330 335 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 340 345 <210> 117 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE-00-LC amino acid sequence (anti-CD19 antibody light chain) <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR H1 of ACE-00 <400> 118 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR H2 of ACE-00 <400> 119 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr 1 5 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR H3 of ACE-00 <400> 120 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR L1 of ACE-00 <400> 121 Gln Asp Val Asn Thr Ala 1 5 <210> 122 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR L2 of ACE-00 <400> 122 Ser Ala Ser 1 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fab region (Anti-Her2) in CDR L3 of ACE-00 <400> 123 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR H1 of ACE-00 <400> 124 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR H2 of ACE-00 <400> 125 Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile 1 5 <210> 126 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR H3 of ACE-00 <400> 126 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR L1 of ACE-00 <400> 127 Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 1 5 <210> 128 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR L2 of ACE-00 <400> 128 Ala Ala Ser 1 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fv region (Anti-TNF alpha) in CDR L3 of ACE-00 <400> 129 Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr 1 5

Claims (170)

  1. (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드,
    (b) 제1 가변 중쇄 (VH) 영역, 제1 불변 중쇄 1 (CH1) 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
    (c) 제3 VH 영역, 제2 CH1 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드
    를 포함하는 결합 분자로서,
    상기 결합 분자는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하지 않고;
    상기 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 Fab 영역을 형성하고;
    상기 제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 Fab 영역을 형성하고;
    상기 제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 항원 결합 Fv 영역을 형성하고;
    상기 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는 유연 펩티드 영역을 통해 상기 Fv 영역에 연결되며;
    상기 제1 Fab 영역 및 상기 제2 Fab 영역이 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, 상기 Fv 영역이 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 형성하며,
    상기 제1 항원은 암 항원이고;
    상기 제2 항원은 T 세포 상에서 발현되는 항원인, 결합 분자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유연 펩티드 영역이 링커를 추가로 포함하는 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 링커가 GGGGS(G4S)의 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원이 CD3인 결합 분자.
  15. 삭제
  16. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원이 PD-L1이고 상기 제2 항원이 CD3인 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서,
    각 Fab 영역의 VH 영역은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    각 Fab 영역의 VL 영역은 서열 번호: 9, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자.
  18. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원이 CD20이고 상기 제2 항원이 CD3인 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서,
    각 Fab 영역의 VH 영역은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    각 Fab 영역의 VL 영역은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 및 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자.
  20. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원이 EGFR이고 상기 제2 항원이 CD3인 결합 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    각 Fab 영역의 VH 영역은 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    각 Fab 영역의 VL 영역은 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VH 영역은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 및 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하고;
    Fv 영역의 VL 영역은 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 3개의 CDR을 포함하는 결합 분자.
  22. 하나 이상의 벡터를 숙주 세포로 형질 감염시키는 것을 포함하는 제1항에 따른 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 벡터는
    (a) 각각 항체 경쇄를 포함하는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산,
    (b) 제1 VH 영역, 제1 CH1 영역 및 제2 VH 영역을 포함하는 제3 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산; 및
    (c) 제3 VH 영역, 제2 CH1 영역 및 VL 영역을 포함하는 제4 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산
    을 포함하고,
    상기 결합 분자는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하지 않고;
    상기 제1 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드의 제1 VH 영역 및 제1 CH1 영역은 제1 Fab 영역을 형성하고;
    상기 제2 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 제3 VH 영역 및 제2 CH1 영역은 제2 Fab 영역을 형성하고;
    상기 제3 폴리펩티드의 제2 VH 영역 및 제4 폴리펩티드의 VL 영역은 Fv 영역을 형성하고;
    상기 제1 Fab 영역 및 제2 Fab 영역은 항체 힌지 영역을 포함하는 유연 펩티드 영역을 통해 상기 Fv 영역에 연결되며;
    상기 제1 Fab 영역 및 상기 제2 Fab 영역이 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 형성하고, 상기 Fv 영역이 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 형성하며,
    상기 제1 항원은 암 항원이고;
    상기 제2 항원은 T 세포 상에서 발현되는 항원인, 방법.
  23. 제1항에 따른 결합 분자의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 데 사용하기 위한 약학 조성물.
  24. 삭제
  25. 제23항에 있어서,
    상기 암은 폐암 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)인 약학 조성물.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 암은 PD-L1 양성 암인 약학 조성물.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 삭제
  114. 삭제
  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 삭제
  118. 삭제
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
  122. 삭제
  123. 삭제
  124. 삭제
  125. 삭제
  126. 삭제
  127. 삭제
  128. 삭제
  129. 삭제
  130. 삭제
  131. 삭제
  132. 삭제
  133. 삭제
  134. 삭제
  135. 삭제
  136. 삭제
  137. 삭제
  138. 삭제
  139. 삭제
  140. 삭제
  141. 삭제
  142. 삭제
  143. 삭제
  144. 삭제
  145. 삭제
  146. 삭제
  147. 삭제
  148. 삭제
  149. 삭제
  150. 삭제
  151. 삭제
  152. 삭제
  153. 삭제
  154. 삭제
  155. 삭제
  156. 삭제
  157. 삭제
  158. 삭제
  159. 삭제
  160. 삭제
  161. 삭제
  162. 삭제
  163. 삭제
  164. 삭제
  165. 삭제
  166. 삭제
  167. 삭제
  168. 삭제
  169. 삭제
  170. 삭제
KR1020207032356A 2018-04-10 2019-04-09 세포 연계 결합 분자 KR102567489B1 (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862655762P 2018-04-10 2018-04-10
US62/655,762 2018-04-10
US201862719484P 2018-08-17 2018-08-17
US62/719,484 2018-08-17
US16/372,172 2019-04-01
US16/372,190 US10640576B2 (en) 2018-04-10 2019-04-01 Cell engaging binding molecules
US16/372,190 2019-04-01
US16/372,196 2019-04-01
US16/372,196 US10654944B2 (en) 2018-04-10 2019-04-01 Cell engaging binding molecules
US16/372,172 US10633458B2 (en) 2018-04-10 2019-04-01 Cell engaging binding molecules
PCT/IB2019/052896 WO2019197979A1 (en) 2018-04-10 2019-04-09 Cell engaging binding molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200132996A KR20200132996A (ko) 2020-11-25
KR102567489B1 true KR102567489B1 (ko) 2023-08-17

Family

ID=68098107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207032356A KR102567489B1 (ko) 2018-04-10 2019-04-09 세포 연계 결합 분자

Country Status (8)

Country Link
US (4) US10654944B2 (ko)
EP (1) EP3774922A4 (ko)
JP (1) JP7076571B2 (ko)
KR (1) KR102567489B1 (ko)
CN (1) CN112074540B (ko)
AU (1) AU2019251422A1 (ko)
CA (1) CA3096791C (ko)
RU (1) RU2770620C1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10654944B2 (en) 2018-04-10 2020-05-19 Y-Biologics Inc. Cell engaging binding molecules
KR102503349B1 (ko) 2019-05-14 2023-02-23 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016023909A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung Des Öffentlichen Rechts Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted t cell activation
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69232706T2 (de) 1991-05-01 2002-11-28 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
DE69630514D1 (de) 1995-01-05 2003-12-04 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
EP0954282B1 (en) 1997-01-16 2005-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
ES2198922T3 (es) 1998-06-24 2004-02-01 Advanced Inhalation Research, Inc. Particulas porosas grandes emitadas por un inhalador.
CN100376599C (zh) * 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
CA2594356C (en) 2005-01-05 2018-07-17 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2009000006A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Display of binding agents
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CA2765478A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Stabilized immunoglobulin constant domains
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
EP2407487A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Multispecific modular antibody
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
CA2807269A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
BR112013027021A2 (pt) 2011-04-19 2016-11-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc anticorpos anti-igf-1r e anti-erbb3 monoespecíficos e biespecíficos
EP2546268A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Internalising immunoglobulin
CN105189557A (zh) 2013-03-15 2015-12-23 默克专利有限公司 四价双特异性抗体
US10087248B2 (en) 2013-05-22 2018-10-02 Metabolic Engineering Laboratories Co., Ltd. Anti-TNF-α/CXCL10 double-targeting antibody and use thereof
AP2016009586A0 (en) * 2014-05-29 2016-11-30 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
DK3356401T3 (da) * 2015-09-30 2020-09-07 Igm Biosciences Inc Bindingsmolekyler med modificeret j-kæde
SG11201808911SA (en) * 2016-04-13 2018-11-29 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
US11248048B2 (en) 2016-08-05 2022-02-15 Y-Biologics Inc. Antibody to programmed cell death 1 (PD-1) and use thereof
WO2018026249A1 (ko) * 2016-08-05 2018-02-08 주식회사 와이바이오로직스 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2018026248A1 (ko) 2016-08-05 2018-02-08 주식회사 와이바이오로직스 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
GB201700345D0 (en) 2017-01-09 2017-02-22 F-Star Beta Ltd Conditional agonists of immune responses
CA3057567A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Biomunex Pharmaceuticals Stable multispecific antibodies
JP2020515532A (ja) 2017-03-29 2020-05-28 グリコトープ ゲーエムベーハー Ｍｕｃ１およびｃｄ３に結合する多重特異的抗体構築物
US10654944B2 (en) 2018-04-10 2020-05-19 Y-Biologics Inc. Cell engaging binding molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016023909A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung Des Öffentlichen Rechts Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted t cell activation
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MABS. 2017. Vol.9, No.2, pp.182-212.*
Pharmacology and Therapeutics. 2018. Vol.182, pp.161-175.*

Also Published As

Publication number Publication date
CN112074540B (zh) 2024-04-16
CN112074540A (zh) 2020-12-11
CA3096791C (en) 2024-02-13
KR20200132996A (ko) 2020-11-25
EP3774922A1 (en) 2021-02-17
RU2770620C1 (ru) 2022-04-19
EP3774922A4 (en) 2022-01-05
CA3096791A1 (en) 2019-10-17
JP2021517904A (ja) 2021-07-29
US20190309094A1 (en) 2019-10-10
US20200181288A1 (en) 2020-06-11
AU2019251422A1 (en) 2020-10-08
US20190309093A1 (en) 2019-10-10
US10654944B2 (en) 2020-05-19
US10836833B2 (en) 2020-11-17
US20190338029A1 (en) 2019-11-07
US10640576B2 (en) 2020-05-05
US10633458B2 (en) 2020-04-28
JP7076571B2 (ja) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014268298A1 (en) Anti-B7-H5 antibodies and their uses
US9321841B2 (en) Humanised anti-CD52 antibodies
JP2012500815A (ja) 抗ｃｄ５抗体
US20240124590A1 (en) Pd1 binding agents
TWI815306B (zh) PD-1/TGF-beta四價雙特異性抗體、其製備方法和用途
JP2024507180A (ja) Ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ、及びｃｄ３を標的とする三重特異的抗体
JP2016179978A (ja) Ｃｄ２０に対するモノクローナル抗体
KR102567489B1 (ko) 세포 연계 결합 분자
CA3207791A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
AU2020257053B2 (en) Cell engaging binding molecules
WO2019197979A1 (en) Cell engaging binding molecules
KR20220167331A (ko) 항-flt3 항체 및 조성물
KR20210043475A (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
JP2023536630A (ja) Ｐｄ－ｌ１結合性作用剤およびその使用
JP2022547650A (ja) ヒトプログラム細胞死受容体ｐｄ－１に対する抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant