CN112074540B

CN112074540B - 细胞接合的结合分子

Info

Publication number: CN112074540B
Application number: CN201980030028.0A
Authority: CN
Inventors: 张世逸; 朴范灿; 朴荣祐
Original assignee: Y Biologics Inc
Current assignee: Y Biologics Inc
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: US10836833B2; EP3774922A1; CA3096791C; KR20200132996A; US10640576B2; AU2019251422A1; US10654944B2; US10633458B2; US20190309093A1; CN112074540A; US20190338029A1; CA3096791A1; JP7076571B2; US20190309094A1; EP3774922A4; US20200181288A1; JP2021517904A; KR102567489B1; RU2770620C1

Abstract

本公开广泛地涉及癌症免疫治疗领域。例如，本公开一般涉及结合分子，所述结合分子包括抗体可变轻链(VL)区、可变重链(VH)区、恒定重链1(CH1)区和轻链恒定(CL)区，其配置形成两个抗原结合Fab区和一个抗原结合Fv区，使所述结合分子结合两种不同的抗原。

Description

细胞接合的结合分子

交叉引用

本申请要求2018年4月10日提交的美国临时申请号62/655,762和2018年8月17日提交的美国临时申请号62/719,484的优先权。本申请进一步要求2019年4月1日提交的美国申请号16/372,172、2019年4月1日提交的美国申请号16/372,190和2019年4月1日提交的美国申请号16/372,196的优先权。上述每个申请的全部内容均通过引用并入本文。

序列表

本申请通过引用整体并入通过EFS-Web提交的ASCII文本格式的序列表的计算机可读形式(CRF)。通过EFS-Web提交的序列表文本文件名为14489-004-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2019年4月2日，大小为140,862字节。

技术领域

本公开一般涉及细胞接合的结合分子、制备所述结合分子的方法、包含所述结合分子的组合物及其用途。

背景技术

现在抗体和/或基于抗体的试剂是治疗多种疾病和病症的选择。目前，美国和/或欧盟至少批准了70种抗体，并且在临床前研究和临床试验中有大量新分子。然而，在研究和临床领域中持续寻求新的、更好和更安全的治疗剂。

天然产生的抗体是单特异性的，并且结合一个表位或抗原。多特异性抗体结合了多种抗体的特异性，并具有结合不同抗原或表位的能力。但是，许多技术障碍阻碍了多特异性抗体的发展；正因如此，很少有多特异性抗体被批准用作治疗剂。因此，仍然需要更好的多特异性抗体和高效生产功能的和稳定的多特异性抗体的方法。

发明概述

本公开分别提供了具有多个结合结构域的细胞接合的结合分子、制备所述结合分子的方法以及包含所述结合分子的药物组合物。本文还提供了包括施用所述结合分子的治疗方法。

一方面，本文提供了细胞接合的结合分子。在一些实施方案中，提供了一种结合分子，其包括：

(a)第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自包含抗体轻链，

(b)第三多肽，所述第三多肽以从N端至C端的顺序包含第一可变重链(VH)区和第一恒定重链1(CH1)区、以及第二VH区；和

(c)第四多肽，所述第四多肽以从N端至C端的顺序包含第三VH区和第二CH1区以及可变轻链(VL)区，

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的第一VH区和第一CH1区形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；

其中，所述第三多肽的第二VH区和所述第四多肽的VL区形成抗原结合Fv区；和

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合第一抗原，所述Fv区结合第二抗原，并且所述第一抗原与所述第二抗原不同。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽还包含在所述第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽都进一步包含分别在所述第二VH区C端和所述VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽进一步包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽进一步包含在所述VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽都还分别包含在所述第二VH区和所述VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽在第二VH区的C端还包含恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽在VL区的C端进一步包含CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽在第二VH区和VL区的C端都还分别包含CH3区ABS的。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽和/或四个多肽在第二VH区和/或VL区的C端还分别包含CH1区和ABS的。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽还包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含一个ABS。

在一些实施方案中，本文提供了结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过融合连接至所述Fv区。

在一些实施方案中，所述柔性肽区包含抗体铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区是免疫球蛋白G(IgG)铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区选自由IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4组成的组的铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。在一些实施方案中，所述柔性肽区还包括接头。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)的两个串联拷贝。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合所述第一抗原的相同表位。在一些实施方案中，所述第二抗原在免疫细胞上表达。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自由淋巴细胞和单核细胞组成的组。在一些实施方案中，所述免疫细胞是效应细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自由T细胞、B细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴样细胞、巨核细胞、单核细胞、骨髓来源的抑制细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的组。

在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症抗原。在一些实施方案中，所述癌症抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一些实施方案中，所述第一抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2、和PD-L1组成的组。

在一些实施方案中，所述第二抗原是CD3或TNFα。在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症抗原，所述第二抗原是CD3。在一些实施方案中，所述癌症抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2和PD-L1组成的组。

另一方面，本文提供了制备结合分子的方法。在一些实施方案中，提供了一种制备结合分子的方法，包括：

(i)在宿主细胞中表达一种或多种载体的结合分子，其中，所述一种或多种载体包括

(a)第一核酸，所述第一核酸编码所述第一多肽，和第二核酸，所述第二核酸编码所述第二多肽，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自是抗体轻链，

(b)第三核酸，所述第三核酸编码所述第三多肽，所述第三多肽按从N端到C端的顺序包含第一VH区，和第一CH1区以及第二VH区；和

(c)第四核酸，所述第四核酸编码所述第四多肽，所述第四多肽按从N端至C端的顺序包含第三VH区、第二CH1区和VL区，

其中，所述第一多肽和所述第三多肽的所述第一VH区和所述第一CH1区能够形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽和所述第四多肽的所述第三VH区和所述第二CH1区能够形成第二抗原结合Fab区；和

其中，所述第三多肽的所述第二VH区和所述第四多肽的所述VL区形成抗原结合Fv区；和

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合第一抗原，所述Fv区结合第二抗原，并且第一抗原与第二抗原不同，和

(ii)纯化结合分子。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽在第二VH区C端还包含恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽在VL区的C端进一步包含CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽在第二VH区和VL区的C端进一步分别包含CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽在第二VH区的C端进一步包含白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽在VL区的C端还包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均在第二VH区和VL区的C端还分别包含ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽在第二VH区的C端进一步包含恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽在VL区的C端进一步包含CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均在第二VH区和VL区的C端还分别包含CH3区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽和/或第四多肽在第二VH区和/或VL区的C端还分别包含CH1区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽进一步包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。

在一些实施方案中，本文提供了其中第一Fab区和第二Fab区通过包含抗体铰链区的柔性肽区与Fv区连接的方法。在一些实施方案中，所述抗体铰链区包含在第三多肽和第四多肽之间形成的链间二硫键。在一些实施方案中，所述柔性肽区还包含接头。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症抗原，所述第二抗原是CD3。在一些实施方案中，所述第一抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2、和PD-L1组成的组。

再一方面，本文提供了包含结合分子的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物，其中，所述结合分子包括：

(b)第三多肽，所述第三多肽以从N端到C端的顺序包含第一VH区和第一CH1区以及第二VH区；和

(c)第四多肽，所述第四多肽以从N端到C端的顺序包含第三VH区和第二CH1区以及VL区，

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的所述第一VH区和所述第一CH1区形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的所述第三VH区和所述第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合第一抗原，所述Fv区结合第二抗原，并且第一抗原与第二抗原不同。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽还包含在所述第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽还包含在所述VL区C端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均进一步包含分别在所述第二VH区和所述VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽在所述第二VH区C端进一步包含白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽还包含在所述VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽进一步包含恒定重链3(CH3)区和在第二VH区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽进一步包含CH3区和VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽和/或四个多肽还包含分别在第二VH区和/或VL区C端的CH1区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第一和/或第二多肽进一步包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第一和/或第二多肽还包含在抗体轻链C端的ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。

又一方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括施用结合分子。在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽还包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包含在VL区的C末端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，第三和第四多肽均进一步包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽进一步包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽还包含在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均还分别包含在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽进一步包含恒定重链3(CH3)区和在第二VH区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包含CH3区和在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均还包含CH3区和分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽和/或四个多肽均还包含CH1区和分别在第二VH区和/或VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽还包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽还包含在抗体轻链C端的ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。

(b)第三多肽，所述第三多肽以从N端至C端的顺序包含第一可变重链(VH)区和第一恒定重链1(CH1)区，以及第二VH区；和

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合程序性死亡配体1(PD-L1)，并且所述Fv区结合分化簇3(CD3)。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽还包含在第二VH区的C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽都进一步包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽还包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽两者还包含分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽和/或第四多肽还包含分别在第二VH区和/或VL区C端的CH1区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽进一步包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽进一步包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽还包含在抗体轻链C端的ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。

在一些实施方案中，提供了结合分子，其中：

(a)所述第一和第二多肽的所述抗体轻链各自包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的互补决定区(CDR)；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:5、SEQID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR，并且所述第二VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:5、SEQID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；并且所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过融合连接至所述Fv区。

在一些实施方案中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区是免疫球蛋白G(IgG)铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区选自由IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4组成的组的铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

在一些实施方案中，所述柔性肽区还包括接头。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGSGGGGSG。

在一些实施方案中，提供了结合分子，其中：

(a)所述第一多肽和所述第二多肽的所述抗体轻链各自包括氨基酸序列如SEQ IDNO.:8所示的VL区；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示，并且所述第二VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示，并且所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:95所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:96所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:97所示。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:95所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:98所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:99所示。

(a)第一核酸，所述第一核酸编码所述第一多肽；和第二核酸，所述第二核酸编码所述第二多肽，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自包含抗体轻链，

(b)第三核酸，所述第三核酸编码所述第三多肽，所述第三多肽按从N端到C端的顺序包含第一可变重链(VH)区，和第一恒定重链1(CH1)区，以及第二VH区；和

(c)第四核酸，所述第四核酸编码所述第四多肽，所述第四多肽按从N端至C端的顺序包含第三VH区、第二CH1区和可变轻链(VL)区，

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的所述第三VH区和所述第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；和

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合PD-L1，并且所述Fv区结合CD3，和(ii)纯化所述结合分子。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽还包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽都进一步包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽还包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽两者还包含分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽进一步包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽和/或四个多肽还包含分别在第二VH区和/或VL区C端的CH1区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽进一步包含ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽还包含在抗体轻链C端的ABS。在具体的实施方案中，对于任何前述方法，所述第一和/或第二多肽在抗体轻链的C端还包含ABS。

在一些实施方案中，提供了一种方法，其中：

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。在一些实施方案中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区是免疫球蛋白G(IgG)铰链区。在一些实施方案中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

在一些实施方案中，提供了一种方法，

其中，所述第一和第二Fab区的每个所述VH区包含如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列；

其中，所述第一和第二Fab区的每个所述VL区包含如SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列；

其中，所述Fv区的所述VH区包含如SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列；和

其中，所述Fv区的所述VL区包含如SEQ ID NO.:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列；和所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示；且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

(b)第三多肽，所述第三多肽以从N端到C端的顺序包含第一可变重链(VH)区和第一恒定重链(CH1)区以及第二VH区；和

(c)第四多肽，所述第四多肽以从N端到C端的顺序包含第三VH区和第二CH1区以及可变轻链(VL)区，

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合PD-L1，并且所述Fv区结合CD3。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽还包含在第二VH区的C端的恒定重链3(CH3)区。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽都进一步包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽还包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽两者还包含分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽进一步包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽进一步包含在VL区C端的CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在另一方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，包括施用结合分子。在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区各自结合CD20或表皮生长因子受体(EGFR)，并且所述Fv区结合CD3。

在一些实施方案中，对于任何前述结合分子，所述第三多肽和/或四个多肽还包含分别在第二VH区和/或VL区C端的CH1区和ABS。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20，并且

(a)所述第一和第二多肽的所述抗体轻链各自包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的互补决定区(CDR)；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:27、SEQID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示的CDR，并且所述第二VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:27、SEQID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示的CDR；并且所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。在一些实施方案中，所述柔性肽区包含抗体铰链区。在一些实施方案中所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。在一些实施方案中，所述柔性肽区还包括接头。

在一些实施方案中，提供了结合分子，其中：

(a)所述第一多肽和所述第二多肽的所述抗体轻链各自包括氨基酸序列如SEQ IDNO.:30所示的VL区；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:26所示，并且所述第二VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:26所示，并且所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:23所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:24所示。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合EGFR，并且

(a)所述第一和第二多肽的所述抗体轻链各自包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:45、SEQ ID NO.:46和SEQ ID NO.:47所示的CDR；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:41、SEQID NO.:42和SEQ ID NO.:43所示的CDR，并且所述第二VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:41、SEQID NO.:42和SEQ ID NO.:43所示的CDR；并且所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，提供了结合分子，其中：

(a)所述第一多肽和所述第二多肽的所述抗体轻链各自包括含如SEQ ID NO.:44所示的氨基酸序列的VL区；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区包含如SEQ ID NO.:40所示的氨基酸序列，并且所述第二VH区包含如SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区包含如SEQ ID NO.:40所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO.:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:39所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:38所示。

(a)第一核酸，所述第一核酸编码所述第一多肽；和第二核酸，所述第二核酸编码所述第二多肽，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自为抗体轻链，

(b)第三核酸，所述第三核酸编码所述第三多肽，所述第三多肽按从N端到C端的顺序包含第一VH区，和第一CH1区，以及第二VH区；和

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20或EGFR，并且所述Fv区结合CD3，和

(ii)纯化所述结合分子。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽进一步包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽还包含在VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽进一步包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第四多肽进一步包在VL区C端的含CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。在一些实施方案中，所述柔性肽区包含抗体铰链区。在一些实施方案中，所述柔性肽区还包括接头。

在一些实施方案中，提供了一种方法，其中：

(a)所述第一多肽和所述第二多肽的所述抗体轻链各自包括含如SEQ ID NO.:30所示的氨基酸序列的VL区；

(b)在所述第三多肽中，所述第一VH区包含如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列，并且所述第二VH区包含如SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列；和

(c)在所述第四多肽中，所述第三VH区包含如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO.:16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供了一种方法，其中：

(a)所述第一多肽和所述第二多肽的所述抗体轻链各自包括含如SEQ ID NO.:44所示氨基酸序列的VL区；

另一方面，本文提供了包含结合分子的药物组合物。在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含治疗有效量的结合分子和药学上可接受的载体，其中所述结合分子包括：

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20或EGFR，并且所述Fv区结合CD3。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽进一步包含在所述第二VH区C端的白蛋白结合结构域或位点(ABS)。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽还包含在所述VL区C端的ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均还分别包含在第二VH区和VL区C端的ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽进一步包含在第二VH区C端的恒定重链3(CH3)区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第四多肽进一步包含VL区C端的CH3区和ABS。在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三和第四多肽均还包含分别在第二VH区和VL区C端的CH3区和ABS。

在一些实施方案中，对于任何前述药物组合物，所述第三多肽和/或四个多肽还分别包在第二VH区和/或VL区C端的含CH1区和ABS。

另一方面，本文提供了治疗疾病或病症的方法，其包括施用结合分子。在一些实施方案中，提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

在一些实施方案中，对于任何前述方法，所述第三多肽和/或四个多肽还分别包含在第二VH区和/或VL区C端的CH1区和ABS。

本公开部分提供了具有多个结合结构域的细胞接合的结合分子。一方面，本文提供的结合分子包括：

(a)第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含两个抗体Fab区，每个区包括：

(i)第一部分，所述第一部分包含抗体可变重链(VH)区和抗体CH1区，其中所述第一部分不包含抗体CH2区和抗体CH3区；和

(ii)第二部分，所述第二部分包含抗体轻链(LC)，所述抗体轻链(LC)包含抗体可变轻链(VL)区和抗体轻链恒定区(CL)，

其中，所述两个抗体Fab区各自结合抗原，和

(b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含抗体Fv区，所述抗体Fv区包含VH区和VL区，

其中，所述第二抗原结合结构域与存在于免疫细胞上的抗原结合；和

其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域相连。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域的每个所述Fab区的第一部分和第二部分在同一多肽上。在一些实施方案中，至少一个所述Fab区按以下顺序从N端至C端取向：VH-CH1-VL-CL。在其他实施方案中，至少一个所述Fab区按以下顺序从N端至C端取向：VL-CL-VH-CH1。

在某些实施方案中，每个所述Fab区的第一部分和第二部分存在于分开的多肽上。在一些实施方案中，所述Fv区按以下顺序从N端至C端取向：VH-VL。在其他实施方案中，所述Fv区按以下顺序从N端到C端取向：VL-VH。

在某些实施方案中，所述Fv区的VH区和VL区在分开的多肽上。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过柔性肽区连接。在一些实施方案中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。在一些具体的实施方案中，所述抗体铰链区是IgG铰链区。在一些更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG1亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG2亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG3亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG4亚型的铰链区。

在某些实施方案中，所述柔性肽区包含额外的氨基酸。例如，在一些实施方案中，所述柔性肽区还包括所述抗体铰链区和所述第二抗原结合结构域之间的接头。在一些实施方案中，所述接头包括氨基酸序列GGGGS(G4S)。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域还包括连接至所述Fv区域的所述VH区的第一CH3区和连接至所述Fv区域的所述VL区的第二CH3区。

在一些实施方案中，所述结合分子还包含一个或多个白蛋白结合域或位点(ABS)。在一些实施方案中，所述ABS连接至所述Fv区的VH区的C端。在其他实施方案中，所述ABS连接至所述Fv区的所述VL区的C端。在其他实施方案中，所述Fv区的每个所述VL和所述VH区的C端连接至ABS。在其他实施方案中，所述ABS连接至至少一个所述Fab区的CL区。在其他实施方案中，所述结合分子还包含一个或多个白蛋白结构域。

在一些实施方案中，所述两个Fab区结合不同的抗原。在其他实施方案中，所述两个Fab区结合相同抗原。在一些实施方案中，所述两个Fab区结合相同抗原的相同表位。在其他实施方案中，所述两个Fab区结合相同抗原的不同表位。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合与所述第一抗原结合结构域结合的至少一个表位相同的表位。

在其他实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的抗原，并且其中，所述第一抗原结合结构域结合第一抗原，并且所述第二抗原结合结构域结合第二抗原。

在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症抗原。在其他实施方案中，所述第一抗原不是癌症抗原。

在一些实施方案中，所述第二抗原在包括淋巴细胞和单核细胞的免疫细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在B细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在树突细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在粒细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在先天淋巴样细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在巨核细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在单核细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在骨髓来源的抑制细胞上表达。在其他实施方案中，所述第二抗原在NK细胞上表达。

在一些实施方案中，所述第二抗原在效应细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在T辅助细胞、调节性T细胞或细胞毒性T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在T辅助细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在调节性T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在细胞毒性T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在CD8+T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原在CD4+T细胞上表达。在一些实施方案中，所述第二抗原包含胞外结构域。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含相同的CDR氨基酸序列。在其他实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含不同的CDR氨基酸序列。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含相同的CDR氨基酸序列。在其他实施方案中，每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含不同的CDR氨基酸序列。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含相同的CDR氨基酸序列，并且每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含相同的CDR氨基酸序列。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含相同的CDR氨基酸序列，并且每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含不同的CDR氨基酸序列。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含不同的CDR氨基酸序列，并且每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含相同的CDR氨基酸序列。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含不同的CDR氨基酸序列，并且每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含不同的CDR氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述第二抗原是CD3。在一些实施方案中，所述第一抗原是癌症抗原，并且所述第二抗原是CD3。

在一些更具体的实施方案中，所述第一抗原是PD-L1，所述第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ IDNO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区的氨基酸序列如SEQID NO.:4所示；每个Fab区所述第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示；所述Fv区的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；所述Fv区的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是CD20，所述第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQID NO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区的氨基酸序列如SEQID NO.:26所示；每个Fab区所述第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:30所示；所述Fv区的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；所述Fv区的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是EGFR，所述第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:41、SEQ ID NO.:42和SEQ ID NO.:43所示的CDR；每个Fab区所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:45、SEQ ID NO.:46和SEQ ID NO.:47所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ IDNO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区的氨基酸序列如SEQID NO.:40所示；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:44所示；所述Fv区的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；所述Fv区的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是Her2，所述第二抗原是TNFα。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:51所示；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:52所示；所述Fv区的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:53所示；所述Fv区的所述VL区的氨基酸序列如SEQ IDNO.:54所示。

另一方面，本文提供了一种结合分子，其包括：

(b)第三多肽，所述第三多肽包含第一VH区和第一CH1区以及第二VH区；和

(c)第四多肽，所述第四多肽包含第三VH区和第二CH1，以及VL区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；和

其中，所述第三多肽的第二VH区和所述第四多肽的VL区形成抗原结合Fv区。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至Fv区。在一些实施方案中，所述柔性肽区包含抗体铰链区。在一些具体的实施方案中，所述抗体铰链区是IgG铰链区。在一些更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG1亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG2亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG3亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG4亚型的铰链区。在一些实施方案中，所述柔性肽区还包含在所述抗体铰链区和所述第二抗原结合结构域之间的接头。在一些实施方案中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合不同的抗原。在其他实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合相同的抗原。在一些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合相同抗原的相同表位。在其他实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合相同抗原的不同表位。

在某些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区形成第一抗原结合结构域，并且所述Fv区域形成第二抗原结合结构域。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合相同的抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合与所述第一抗原结合结构域结合的至少一个表位相同的表位。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ IDNO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:16、SEQ IDNO.:17和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每述Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQID NO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列；和所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:23所示；所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:24所示。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:41、SEQ ID NO.:42、SEQ ID NO.:43所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:45、SEQ ID NO.:46和SEQ ID NO.:47所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQID NO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:39所示的氨基酸序列；所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示；所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:38所示。

另一方面，本文提供了制备本文提供的所述结合分子的方法。在一些实施方案中，提供了一种制备结合分子的方法，包括将一种或多种载体转染到宿主细胞中，其中所述一种或多种载体包括：

(a)第一核酸，所述第一核酸编码第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自为抗体轻链；

(b)第二核酸，所述第二核酸编码第三多肽，所述第三多肽包含第一VH区和第一CH1区以及第二VH区；和

(c)第三核酸，所述第三核酸编码第四多肽，所述第四多肽包含第三VH区和第二CH1和VL区；

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的第一VH区和第一CH1区能够形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区能够形成第二抗原结合Fab区；和

其中，所述第三多肽的第二VH区和所述第四多肽的VL区可形成抗原结合Fv区。

在某些实施方案中，所述第一Fab区和所述第二Fab区形成第一抗原结合结构域，并且所述Fv区形成第二抗原结合结构域。

在一些更具体的实施方案中，所述第一抗原是PD-L1，并且所述第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列；所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示；所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在一些实施方案中，所述第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:22所示；所述第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:20；所述第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:21所示。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示的CDR；每个Fab区的所述第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的CDR；所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQID NO.:15所示的CDR；所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，所述第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:36所示，所述第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:34所示，所述第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:35所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是EGFR，并且所述第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，所述第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:50所示，所述第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:48所示，所述第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:49所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是Her2，所述第二抗原是TNFα。在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:51所示；每个Fab区所述第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:52所示；所述Fv区的所述VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:53所示；所述Fv区的所述VL区的氨基酸序列如SEQ IDNO.:54所示。

另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文提供的结合分子和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在其他实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在其他实施方案中，所述疾病或病症是PD-L1阳性癌症。

另一方面，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的所述结合分子。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在其他实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在其他实施方案中，所述疾病或病症是PD-L1阳性癌症。

在根据马库什组或替代方案的其他组来描述本公开的方面或实施例的情况下，本公开不仅涵盖整体上列出的整个组，而且还包括每一个组和主组的所有可能的亚组，以及缺少一个或多个组成员的所述主组中的每个成员。本公开还设想在要求保护的公开中明确排除任何一个或多个组成员。

说明性的实施方案

1.一种结合分子，其包括：

2.如实施方案1所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

3.如实施方案2所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过融合连接至所述Fv区。

4.如实施方案2所述的结合分子，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

5.如实施方案4所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区为免疫球蛋白G(IgG)铰链区。

6.如实施方案5所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区选自由IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4组成的组的铰链区。

7.如实施方案4所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

8.如实施方案4所述的结合分子，其中，所述柔性肽区还包括接头。

9.如实施方案8所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

10.如实施方案9所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)的两个串联拷贝。

11.如实施方案1所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合所述第一抗原的相同表位。

12.如实施方案1所述的结合分子，其中，所述第二抗原在免疫细胞上表达。

13.如实施方案12所述的结合分子，其中，所述免疫细胞选自由淋巴细胞和单核细胞组成的组。

14.如实施方案12所述的结合分子，其中，所述免疫细胞为效应细胞。

15.如实施方案12所述的结合分子，其中，所述免疫细胞选自由T细胞、B细胞、树突细胞、粒细胞、先天淋巴细胞、巨核细胞、单核细胞、骨髓来源的抑制细胞、和自然杀伤(NK)细胞组成的组。

16.如实施方案1所述的结合分子，其中，所述第一抗原为癌症抗原。

17.如实施方案16所述的结合分子，其中，所述癌症抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。

18.如实施方案1所述的结合分子，其中，所述第一抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2、和PD-L1组成的组。

19.如实施方案12所述的结合分子，其中，所述第二抗原为CD3或TNFα。

20.如实施方案16所述的结合分子，其中，所述第一抗原为癌症抗原，并且所述第二抗原为CD3。

21.如实施方案20所述的结合分子，其中，所述癌症抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2、和PD-L1组成的组。

22.一种制备结合分子的方法，包括：

(a)第一核酸，所述第一核酸编码所述第一多肽，和第二核酸，所述第二核酸编码所述第二多肽，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自为抗体轻链，

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的所述第一VH区和所述第一CH1区可形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的所述第三VH区和所述第二CH1区可形成第二抗原结合Fab区；和

23.如实施方案22所述的方法，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过包含抗体铰链区的柔性肽区连接至所述Fv区。

24.如实施方案23所述的方法，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

25.如实施方案23所述的方法，其中，所述柔性肽区还包括接头。

26.如实施方案25所述的方法，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

27.如实施方案22所述的方法，其中，所述第一抗原为癌症抗原，并且所述第二抗原为CD3。

28.如实施方案22所述的方法，其中，所述第一抗原选自CD19、CD20、EGFR、Her2、和PD-L1组成的组。

29.一种包含结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物，其中，所述结合分子包括：

30.一种治疗受试者疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

31.一种结合分子，其包含：

32.如实施方案31所述的结合分子，其中：

33.如实施方案32所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

34.如实施方案33所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过融合连接至所述Fv区。

35.如实施方案33所述的结合分子，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

36.如实施方案35所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区为免疫球蛋白G(IgG)铰链区。

37.如实施方案36所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区选自由IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4组成的组的铰链区。

38.如实施方案35所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

39.如实施方案35所述的结合分子，其中，所述柔性肽区还包括接头。

40.如实施方案39所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

41.如实施方案40所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS。

42.如实施方案40所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGSGGGGSG。

43.如实施方案32所述的结合分子，其中：

44.如实施方案32所述的结合分子，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

45.如实施方案32所述的结合分子，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:95所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:96所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:97所示。

46.如实施方案32所述的结合分子，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:95所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:98所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:99所示。

47.一种制备结合分子的方法，包括：

48.如实施方案47所述的方法，其中：

49.如实施方案48所述的方法，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

50.如实施方案49所述的方法，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

51.如实施方案50所述的方法，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

52.如实施方案50所述的方法，其中，所述抗体铰链区为免疫球蛋白G(IgG)铰链区。

53.如实施方案20所述的方法，其中，所述柔性肽区还包括接头。

54.如实施方案53所述的方法，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

55.如实施方案54所述的方法，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS。

56.如实施方案54所述的方法，其中，所述接头包含氨基酸序列GGSGGGGSG。

57.如实施方案48所述的方法，

58.如实施方案48所述的方法，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列；和所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示；所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

59.一种包含结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物，其中，所述结合分子包括：

60.一种治疗受试者疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

61.一种结合分子，包括：

62.如实施方案61所述的结合分子，其中：所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20，和

63.如实施方案62所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

64.如实施方案63所述的结合分子，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

65.如实施方案64所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

66.如实施方案64所述的结合分子，其中，所述柔性肽区还包括接头。

67.如实施方案62所述的结合分子，其中：

68.如实施方案62所述的结合分子，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:23所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:24所示。

69.如实施方案61所述的结合分子，其中：所述第一Fab区和所述第二Fab区结合EGFR，和

70.如实施方案69所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

71.如实施方案70所述的结合分子，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

72.如实施方案71所述的结合分子，其中，所述抗体铰链区包括在所述第三多肽和所述第四多肽之间的链间二硫键。

73.如实施方案70所述的结合分子，其中，所述柔性肽区还包括接头。

74.如实施方案69所述的结合分子，其中：

75.如实施方案69所述的结合分子，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:39所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:38所示。

76.一种制备结合分子的方法，包括：

(ii)纯化所述结合分子。

77.如实施方案76所述的方法，其中：所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20，和

78.如实施方案77所述的方法，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

79.如实施方案78所述的方法，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

80.如实施方案79所述的方法，其中，所述柔性肽区还包括接头。

81.如实施方案77所述的方法，其中：

82.如实施方案77所述的方法，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:23所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:24所示。

83.如实施方案87所述的方法，其中：所述第一Fab区和所述第二Fab区结合CD20，和

84.如实施方案83所述的方法，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区。

85.如实施方案84所述的方法，其中，所述柔性肽区包括抗体铰链区。

86.如实施方案85所述的方法，其中，所述柔性肽区还包括接头。

87.如实施方案83所述的方法，其中：

88.如实施方案83所述的方法，其中，所述第一多肽和所述第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:39所示的氨基酸序列，所述第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示，并且所述第四多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:38所示。

89.一种包含结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物，其中，所述结合分子包括：

90.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的结合分子，其中，所述结合分子包括：

附图说明

图1A示出了本文提供的结合分子(ALiCE)。图1B示出了本文提供的包含CH3区的示例性结合分子。图1C示出了本文提供的包含白蛋白结合位点(ABS)的示例性结合分子。图1D示出了本文提供的具有靶向癌抗原的结合结构域的示例性结合分子，并且还示出了本文提供的柔性肽区的示例性选择。图1E示出了本文提供的示例性结合分子，其具有靶向癌症抗原的结合结构域和靶向CD3的结合结构域。

图2A示出了ACE-00的装配模式。“BiP”表示结合的免疫球蛋白(BiP)，其结合ACE-00暴露的CH1或VH结构域。图2B示出了鉴定ACE-00的装配模式的SDS-PAGE结果。箭头指示在还原条件下“ACE-00+轻链”样本中的ACE-00-VL条带，以及“ACE-00-VH+ACE-00+轻链”样本中的ACE-00-VH和ACE-00-VL条带。图2C显示了阿达木单抗的野生型重链(HC)、CH1截短的重链(ΔCH1)和VH-CH1截短的重链(ΔVH-CH1)的免疫共沉淀(co-IP)结果。图2D说明BiP可以通过与重链的VH和/或CH1结构域相互作用来调节重链的装配和分泌。“ERAD”指内质网相关蛋白降解。图2E示出了抗体VH结构域对抗体装配的作用以及ACE-00-VH链对ACE-00分子的正确装配的作用。“X”表示未装配；“O”表示装配。图2F示出了ACE-00的结构。图2G显示了使用Hitrap^TMKappaSelect(GE Healthcare,USA)对ACE-00和ACE-00-VL2蛋白进行亲和层析的结果。图2H显示了鉴定ACE-00-VL2和ACE-00之间的分子大小差异的毛细管电泳的结果。图2I显示了ACE-00和ACE-00-VL2分子的构象的毛细管电泳的结果。实线箭头表示ACE-00的结果；虚线箭头表示ACE-00-VL2的结果。图2J示出了证实ACE-00-VH链与ACE-00-VL链之间的异二聚作用的毛细管等电聚焦的结果。图2K显示了鉴定ACE-00的装配模式的SDS-PAGE和毛细管电泳的结果。“R”表示还原；“NR”表示非还原。图2L显示了ACE-00的尺寸排阻色谱的结果。

图3显示了鉴定ACE-02、ACE-02-VL2、ACE-03、ACE-03-VL2、ACE-00和ACE-01的表达和装配的SDS-PAGE(在还原(左)和非还原(右)条件下)的结果。ACE-02包含第二抗原，作为人源化12F6(h12F6，抗CD3抗体)，并且ACE-03包含第二抗原，作为人源化OKT3(hOKT3，抗CD3抗体)。箭头分别指示在非还原条件下装配的ACE-02、ACE-03和ACE-03-VL2的条带。

图4A示出了ACE-04的结构。“A”是指抗PD-L1。UCHT1是抗CD3抗体。图4B示出了ACE-05的结构。“A”是指抗PD-L1。OKT3是抗CD3抗体。图4C示出了鉴定ACE-04、ACE-04-VL2、ACE-05和ACE-05-VL2的装配模式的SDS-PAGE结果。箭头指示在还原和非还原条件下ACE-04和ACE-05的条带。图4D示出了鉴定ACE-05的装配模式的SDS-PAGE结果(顶部)，并且示出了ACE-05装配的潜在调节机制(底部)。图4E-4F显示了鉴定ACE-05的构象以及ACE-05-VH和ACE-05-VL链之间的异二聚效率的SDS-PAGE和毛细管电泳的结果。“M”表示蛋白质分子量标记；“R”表示还原；“NR”表示非还原；“IN”表示输入；“FT”表示流穿；“W”表示洗涤；“Elu.”表示洗脱。图4G显示了鉴定ACE-05纯度的尺寸排阻色谱法。图4H示出了用于ACE-05的凝胶过滤分析的尺寸排阻色谱法的结果。图4I显示了鉴定ACE-05的结构构象的阳离子交换色谱法(CEX)的结果。

图5示出了鉴定ACE-09和ACE-05在37℃和32℃下的装配模式的SDS-PAGE的结果(顶部)，并总结了ACE-09和ACE-05的特点(底)。在顶部的图中，标有“ACE-05”的泳道显示了ACE-05的结果；其余泳道显示ACE-09的结果；“R”表示还原；“N.R”表示“非还原”；“IP”表示输入；“F.T”表示流穿；“W”表示洗涤；“OP”表示输出。

图6A示出了ACE-10的结构。图6B-6C显示了所述ACE-10分子的表达和装配分析(在还原(左)和非还原(右)条件下)。在图6B中，箭头指示ACE-10在还原和非还原条件下的条带。“ACE-10透析”表示通过透析的DNA转染产生的ACE-10。在图6C中，抗κ条件的结果中的箭头指示在非还原条件下的ACE-10-VL/ACE-10-LC二聚体和ACE-10-VH/ACE-10-LC二聚体复合物；抗CH1条件的结果中的箭头表示在非还原条件下装配的ACE-10。

图7A示出了ACE-11的结构。图7B显示了鉴定ACE-11和ACE-11-VL2的表达和装配模式的SDS-PAGE的结果(通过考马斯蓝染色(左)和Western blot(右)进行分析)。“M”表示蛋白质分子量标记。箭头指示在非还原条件下装配的ACE-11的条带。

图8示出了鉴定ACE-12、ACE-05和ACE-09的装配模式的SDS-PAGE的结果。箭头指示Western blot中使用抗κ(左)和抗CH1(右)抗体在非还原条件下的ACE-05-VH+LC二聚体和ACE-05-VL+LC二聚体的条带。

图9示出了用于测定ACE-00和ACE-00-VL2对TNFα的亲和力的酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果。

图10A-10C显示了ACE-05与PD-L1(10A)和CD3(10B-10C)的结合亲和力的ELISA分析。

图11显示了ACE-05和ACE-09对CD3的结合亲和力的ELISA分析。

图12A-12C示出了ACE-05与PD-L1(12A，12C)和CD3(12B，12C)的结合动力学的表面等离子体共振(SPR)分析。图12D显示了使用表面等离子体共振(SPR)对ACE-05同时结合PD-L1和CD3的动力学分析。

图13A显示了HEK293E-PD-L1细胞和亲本HEK293E细胞中的PD-L1表达水平(右图)，和通过各种CD3抗体测定的Jurkat荧光素酶报告细胞中的CD3表达水平(左图)。图13B-13E显示了ACE-05和BiTE-05的T细胞重定向(活性)测定的结果。图13F显示在不同T细胞阶段中，ACE-05、BiTE-05或YBL-007存在的情况下的T细胞活化。图13G-13H示出了ACE-05的PD-1/PD-L1阻断试验的结果。图13I-13J显示了ACE-05、BiTE-05、UCHT1(抗CD3抗体，来自BioLegend,USA)或OKT3(抗CD3抗体，来自BioLegend,USA)的T细胞活化。图13K显示了用于测定ACE-05介导的T细胞细胞毒性的T细胞细胞毒性测定的结果。图13L显示了ACE-05、BiTE-05、YBL-007或UCHT1介导的T细胞细胞毒性的结果。“IgG”表示用作阴性对照的正常人IgG。图13M显示了ACE-05或YBL-007存在的情况下直接接触PBMC细胞时，肿瘤细胞的T细胞细胞毒性。箭头指示靶HCC827癌细胞。图13N示出了在ACE-05、BiTE-05或YBL-007存在的情况下，共培养的PBMC和HCC827细胞中的IL-2和INF-γ水平。“IgG”表示用作阴性对照的正常人IgG。图13O显示了ACE-05、BiTE-05、YBL-007和UCHT1的热力学稳定性结果。

图14A-14B示出了测定ACE-10介导的T细胞活化的T细胞重定向测定的结果。“hIgG”表示用作对照的正常人IgG。

图15显示了测定ACE-11介导的T细胞细胞毒性的T细胞细胞毒性测定的结果。

图16A-16B显示了ACE-05在Sprague-Dawley(SD)大鼠中的药代动力学研究的结果。

图17A显示了在人源化小鼠模型中HCC827(PD-L1阳性肿瘤)异种移植研究的结果。图17B显示了ACE-05和其他供试品在PBMC供体A和供体B中的抗肿瘤作用。图17C示出了供体A和供体B的体重变化。图17D显示了个体抗肿瘤效应应答。图17E示出了个体体重下降(％)(副作用)。图17F显示了BiTE和ACE-05的抗肿瘤作用的比较以及亲本PD-L1抗体和ACE-05的比较。

图18A-18D显示了剂量限制研究的结果，显示在接种了HCC827(PD-L1阳性肿瘤)异种移植物的人源化小鼠模型中，ACE-05和其他供试品在PBMC供体A和供体B中的抗肿瘤作用。图18A显示了ACE-05和BiTE-05的抗肿瘤作用的剂量应答。图18B和图18C分别显示了ACE-05和BiTE-05在各剂量组小鼠个体中的抗肿瘤作用。图18D显示了ACE-05和BiTE-05治疗组的个体体重下降(％)(副作用)。

发明详述

本公开提供了具有多个结合结构域的新的细胞接合的结合分子。在本文中这些结合分子称为“抗体样细胞接合子”(Antibody like cell engager，ALiCE)。本文提供的ALiCE分子具有两个抗原结合结构域。第一抗原结合结构域具有两个Fab区。第二抗原结合结构域具有Fv区。图1A中描绘了典型的ALiCE分子。通常，在这种分子中，所述第一抗原结合结构域包含Fab区，并且所述第二抗原结合结构域通常在天然抗体结构中CH2和CH3结构域通常定位的位置(直接或间接)连接至所述第一抗原结合结构域。例如，在所描绘的实施方案中，重链的C端包含VH结构域而不是CH2结构域，并且第二重链的C端包含VL结构域而不是结构域。

本文公开的结合分子提供了相比于常规抗体和现有的多特异性抗体(例如双特异性抗体)的许多优点。由于其多个抗原结合结构域和整体结构设计，本文提供的结合分子可用作细胞接合子以将多个细胞结合在一起。例如，所述第一抗原结合结构域可以结合在第一细胞上表达的抗原，所述第二抗原结合结构域可以结合在第二细胞上表达的抗原，从而将两个细胞结合在一起。

在某些实施方案中，接合的细胞之一是免疫细胞，例如细胞毒性T细胞。在这些实施方案中，本文提供的所述结合分子对于定向和激活免疫细胞十分有用。例如，在某些实施方案中，ALiCE分子的二价Fab部分保留了常规抗体的功能的同时，无Fc的单价第二抗原结合区(即Fv区)可以识别、接合，重定向和/或激活免疫系统的效应细胞，例如T细胞。例如，如以下实施例部分所述，ACE-05(一种由抗PD-L1和抗CD3结构域组成的ALiCE分子)对PD-L1依赖的(介导的)T细胞活化和PD-L与PD-L1阻断效应均显示出协同效应。

在某些实施方案中，不存在完全功能性的Fc区，或不存在完整的CH2和/或CH3区消除或减少了某些不希望的Fc介导的效应因子细胞毒性。在某些实施方案中，Fv部分中VH链和VL链之间的天然相互作用促进ALiCE分子的异二聚化，而不赋予不希望的通过人工工程产生的免疫原性。

本文提出的药代动力学(PK)研究表明ALiCE分子比其他形式(例如BiTE(双特异性T细胞接合子)或DART(双亲和性重定位))具有更高的稳定性(Campagne O.etal.Integrated Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model of a Bispecific CD3×CD123 DART Molecule in Nonhumn Primates:Evaluation of Activity and Impact ofImmunogenicity.Clin Cancer Res.2018Jun 1；24(11):2631-2641；Moore P.A.etal.Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimalredirected T-cell kinlling of B-cell lymphoma.Blood.2011Apr 28；117(17):4542-51；Moore P.A.et al.MGD007,a gpA33×CD3-Bispecific DART Protein for T-CellImmunotherapy of Metastatic Colorectal Cancer.Mol Cancer Ther.2018Aug；17(8):1761-1772；Yuraszeck T.et al.Translation and Clinical Development ofBispecific T0cell Engaging Antibodies for Cancer Treatment.Clin PharmacolTher.2017May；101(5):634-645，这些内容均以整体引用方式并入本文)。此外，对于一个示例性ALiCE分子的体内效应研究显示显著的抗癌作用。这些结果表明，ALiCE是抗体工程例如癌症治疗中的有利平台技术。

I.定义

本文描述或引用的技术和流程包括通常为本领域技术人员熟知和/或广泛应用的常规方法，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3ded.2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Benchto Clinic(An ed.2009)；Monoclonal Antibodies:Methods andProtocols(Albitar ed.2010)；和Antibody Engineering Vols1and 2(Kontermann and Dübel eds.,2d ed.2010)中描述的广泛采用的方法。

除非本文另外定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。为了解释本说明书，将使用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。在阐述的术语的任何描述与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下述术语的描述为准。

术语“结合分子”是指一种蛋白质，其包含与靶标或抗原结合的部分(例如，一个或多个结合区，例如CDR)以及可选地，使结合部分采用促进结合蛋白结合多肽、片段或表位的构象的骨架或框架部分(例如，一个或多个骨架或框架区)。在本公开的文本中，例如当解离常数(K_D)≤10^-7M时，认为结合分子与抗原特异性结合或选择性结合。在一些实施方案中，所述结合分子可以K_D为约10^-7M至约10^-12M特异性结合抗原。在某些实施方案中，当K_D≤10^-8M或K_D≤10^-9M时，所述结合分子可以高亲和力特异性结合抗原。在一个实施方案中，所述结合分子可以特异性结合纯化的人抗原，此时K_D通过测定为1×10^-9M至10×10^-9M。在又一实施方案中，所述结合分子特异性结合在细胞上表达的人抗原，此时K_D为0.1×10^-9M至10×10^-9M。在某些实施方案中，所述结合分子特异性结合细胞上表达的人抗原，此时K_D为约0.1×10^-9M、约0.5×10^-9M、约1×10^-9M、约5×10^-9M、约10×10^-9M或其任何范围或间隔。术语“结合分子”包括抗体和抗体来源的分子。

术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文可互换使用，并且在最广义上使用，并且具体地涵盖例如如下所述的单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂，中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物学活性)，由至少两种完整抗体形成、单链抗体及其片段。所述抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，也可以是其他物种的抗体，例如小鼠抗体和兔抗体等。术语“抗体”旨在包括B细胞的属于免疫球蛋白类多肽的多肽产物，所述多肽产物能够结合具体的分子抗原并由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130个或更多个氨基酸组成的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见，例如，Antibody Engineering(Borrebaeck ed.,2d ed.1995)；和Kuby,Immunology(3d ed.1997)。在具体的实施方案中，所述具体的分子抗原可以与本文提供的抗体结合，包括多肽或表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼源抗体、体内抗体，抗独特型(抗Id)抗体和上述任何一种抗体的功能片段(例如抗原结合片段)，所述功能片段是指抗体重链或轻链多肽上保留部分或全部所述功能片段来源的抗体的结合活性的部分。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)₂片段、F(ab')₂片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。具体地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如，包含与抗原结合的抗原结合位点(例如抗体的一个或多个CDR)的抗原结合结构域或分子。这样的抗体片段可以在，例如Harlow and Lane,Antibodies: ALaboratory Mannual(1989)；Mol. Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers ed.,1995)；Huston et al.,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun and Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；和Day,Advanced Immunochemistry(2d ed.1990)中找到。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。

“抗原”是抗体可以选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，所述靶抗原是多肽。在某些实施方案中，所述抗原与细胞相关，例如存在于细胞例如免疫细胞上或细胞中。

术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似术语是指结合分子的一部分，其包括与抗原相互作用的氨基酸残基，并且在结合剂上赋予对抗原(例如CDR)的特异性和亲和力。

术语“结合”或“结合”是指分子之间的相互作用，包括，例如形成复合物。相互作用可以是，例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价或非共价键、相互作用或作用力结合的结合在一起的两个或多个分子。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子(例如抗原)的单个表位之间的总的非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(k_off)与结合速率(k_on)之比(k_off/k_on)是解离常数K_D，其与亲和力成反比。K_D值越低，抗体的亲和力越高。K_D的值因抗体和抗原的复合物不同而异，并且取决于k_on和k_off。可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其他方法来测定本文提供的抗体的解离常数K_D。在一个结合位点的亲和力并不总是反映出抗体和抗原之间相互作用的真实强度。当复杂抗原(包含多个重复抗原决定簇，比如多价抗原)与包含多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点的相互作用将增加第二个位点反应的可能性。多价抗体和抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。

关于本文所述的结合分子，术语“结合至”、“特异性结合”和类似术语在本文中也可互换使用，是指特异性结合抗原的抗原结合结构域的结合分子，例如多肽。结合抗原或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域可以与相关抗原交叉反应。在某些实施方案中，结合抗原或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域不与其他抗原交叉反应。结合抗原或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域可以，例如通过免疫分析、或其他本领域技术人员已知的技术来鉴定。当结合抗原或特异性结合抗原的结合分子或抗原结合结构域结合与其他交叉反应的抗原相比具有更高的亲和力的抗原时，其可以通过使用诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)的实验技术测定。通常，特异性或选择性反应是至少两次背景信号或噪声，并且可能是背景的10倍以上。参见例如Fundamental Immunology 332-36(Paul ed.,2d ed.1989)中有关结合特异性的讨论。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域结合“非靶标”蛋白的结合程度比结合分子或抗原结合结构域结合其特定靶标抗原的结合程度至少小约10％，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或RIA测定。关于诸如术语“特异性结合”、“特异性结合”或“特异性的”是指可测定的与非特异性相互作用不同的结合。特异性结合可以通过例如测定与对照分子的结合相比分子的结合，所述对照分子通常是具有相似结构的但不具有结合活性的分子。例如，特异性结合可以通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记靶标)竞争来测定。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表明是特异性结合。结合抗原的结合分子或抗原结合结构域包括能够以足够的亲和力结合抗原的分子，使得结合分子可用作例如靶向抗原的诊断剂。在某些实施方案中，结合抗原的结合分子或抗原结合结构域的解离常数(K_D)小于或等于10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域与抗原的表位结合，所述抗原的表位在来自不同物种的抗原之间(例如，在人和食蟹猴物种之间)是保守的。

“结合亲和力”通常是指分子(比如结合蛋白，例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的总非共价相互作用的强度。除非另有说明，否则如本文所使用的“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1的相互作用。术语“Bmax”是指从实验结果推断出的最大结合亲和力。Bmax可以使用本领域已知的曲线拟合方法来计算，例如，GraphPad Prism软件7中提供的曲线拟合方法。结合分子X对其结合伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过包括本文所述的本领域已知的常规方法来测定。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并趋向易于解离，而高亲和力抗体通常会更快地结合抗原并倾向于保持更久的结合。测定结合亲和力的多种方法是本领域已知的，任何一种方法均可用于本公开的目的。具体的说明性实施例包括以下内容。在一个实施方案中，“K_D”或“K_D值”可以通过本领域已知的测定方法例如通过结合测定法来测定。可以通过RIA中测定K_D，例如，使用目的抗体的Fab及其抗原(Chen et al.,J.Mol Biol293:865-81)。K_D或K_D值也可以通过使用生物层干涉仪或的表面等离振子共振(SPR)分析测定，使用例如/>QK384系统，或通过/>使用例如/>TM-2000或TM-3000。“结合速率”或“结合速率”或“结合速率”或“k_on”还可以通过与上述相同的生物层干涉仪(BLI)或表面等离振子共振(SPR)技术测定，使用例如/>QK384、TM-2000或/>TM-3000系统。

本文使用的术语“还原”是指蛋白质内的链间或链内二硫键(S-S)桥变性或还原的情况，例如，通过添加2-巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DTT)，产生多条多肽链。本文使用的术语“非还原性”是指诸如2-巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DTT)的变性剂或还原剂不存在的情况下，蛋白质内的链间或链内二硫键(S-S)桥保持完整的情况。

在某些实施方案中，所述结合分子或抗原结合结构域可包括“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类及其片段的相应序列相同或同源，只要它们具有所需的生物学活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison etal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-55)。

在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可包含非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式的部分，其为包含人免疫球蛋白(例如受体抗体)的嵌合抗体，所述嵌合抗体中天然CDR残基被具有所需特异性、亲和力、和能力的非人物种(例如供体抗体)中相应CDR的残基取代，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类。在一些情况下，所述人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可包含所述受体抗体或所述供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体的重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR都对应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或基本上所有的FR是相应人免疫球蛋白序列。在某些实施方案中，所述人源化抗体包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关更多细节，参见Jones et al.,1986,Nature 321:522-25；Riechmannet al.,1988,Nature 332:323-29；Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-96；Carteret al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；美国专利号：6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；和6,054,297。

在某些实施方案中，所述结合分子或抗原结合结构域可包含在本文可互换使用的“全人源抗体”或“人抗体”的部分，其指包含人可变区的抗体，以及例如人恒定区。在具体的实施方案中，所述术语是指包含人源可变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中，“全人源”抗体还可涵盖结合多肽的抗体，以及由核苷酸序列编码的抗体，所述核苷酸序列是人种系免疫球蛋白核苷酸序列的天然体细胞变体。术语“全人源抗体”包括具有可变区和恒定区的抗体，其对应于如Kabat et al.(见Kabat et al.(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)所述的人种系免疫球蛋白核苷酸序列。“人抗体”是指具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人产生的抗体和/或已使用任何制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的所述定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以通过使用本领域已知的各种技术制备，包括噬菌体展示文库(Hoogenboomand Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581)和酵母展示文库(Chao et al,2006，Nature Protocols 1:755-68)。也可制备人单克隆抗体，如使用Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner etal.,1991,J.Immunol.147(1):86-95；和van Dijk and van de Winkel,2001,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74中描述的方法。人抗体可通过将抗原施用于已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已被沉默的转基因动物来制备，例如小鼠(参见例如，Jakobovits,1995,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；BrüggemannandTaussing,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；以及关于XENOMOUSE^TM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见，例如关于通过人B细胞杂交瘤技术产生人抗体的Liet al.,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-62中。

在某些实施方案中，所述结合分子或抗原结合结构域可包含“重组人抗体”的部分，其中所述短语包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从转人免疫球蛋白基因和/或染色体的动物(例如小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.etal.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(参见Kabat,E.A.et al.(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。但是在某些实施方案中，将所述重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为，当衍生自并与人种系VH和VL序列相关时，在体内人抗体种系库中可能不天然存在。

在某些实施方案中，所述结合分子或抗原结合结构域可包含“单克隆抗体”的一部分，其中本文所用的术语是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，例如，包含除了可能少量存在的可能自然发生的突变外相同的种群的单个抗体，并且每种单克隆抗体通常会识别抗原上的单个表位。在具体的实施方案中，本文所使用的“单克隆抗体”是指由单个杂交瘤细胞或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于制备抗体的任何特定方法。例如，本公开使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler et al.,1975,Nature 256:495描述的杂交瘤方法来制备，或者可以在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。所述“单克隆抗体”也可以通过例如Clackson et al.,1991,Nature352:624-28和Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.222:581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域公知的。参见，例如Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,5th ed.2002)。

典型的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。就IgG而言，所述4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链相连，而两条H链则根据H链的同种型通过一个或多个二硫键彼此相连。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫键桥。每条H链在N端均具有一个可变结构域(VH)，其后是每条α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N端均具有可变结构域(VL)，所述可变结构域的另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链(CH1)的第一恒定结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链的可变结构域之间形成面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同种类抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology 71(Stites et al.eds.,8th ed.1994)；和Immunobiology(Janeway et al.eds.,5^th ed.2001)。

术语“Fab”或“Fab区”是指抗体与抗原结合的区。常规的IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区位于Y形IgG结构的两个臂之一上。每个Fab区通常由每条重链和轻链中的一个可变区和一个恒定区组成。更具体地，Fab区中的重链的可变区和恒定区是VH和CH1区，并且Fab区中的轻链的可变区和恒定区是VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以按照本公开以各种方式排列以赋予抗原结合能力。例如，与常规IgG的Fab区类似，VH和CH1区可以在一条多肽上，而VL和CL区可以在分开的多肽上。可选地，VH、CH1、VL和CL区都可以在相同的多肽上并且如以下部分详述的以不同的顺序取向。

术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体轻链或重链的一部分，通常位于重链或轻链的氨基端，在重链中的长度约120至130个氨基酸，在轻链中的长度约100至110个氨基酸，并用于每种特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以称为“VH”。轻链的可变区可以称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些片段的序列在抗体之间差异很大的事实。所述V区介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性在可变区的110个氨基酸跨度中分布不均匀。反而，所述V区由可变性较小(例如，相对不变)的片段组成，约15-30个氨基酸，称为框架区(FR)，其间被可变性较大(例如，极端可变性)的较短区域，约9-12个氨基酸，称为“高变区”隔开。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，主要采用β折叠构象，并通过三个高变区连接，所述三个高变区环状连接并在某些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，参与抗体的抗原结合位点的形成(参见例如，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed.1991))。所述恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应因子功能，例如抗体参与抗体依赖细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。所述可变区的序列在不同抗体之间差异很大。在具体的实施方案中，所述可变区是人可变区。

术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位点编号”及其变体，是指用于Kabat et al.,supra抗体汇总的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括在残基52之后插入单个氨基酸(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后插入三个残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体的序列的同源性区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。当指可变结构域中的残基(轻链中的约残基1-107和重链的残基1-113)(Kabat et al.,supra)时，通常使用Kabat编号系统。当指免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat et al.,supra报道的EU索引)。“如Kabat中的EU指数”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。描述了其他编号系统，例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon。

“完整的”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少有重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。所述恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整的抗体具有一种或多种效应因子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如所述完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；双抗体和二聚双抗体(参见例如Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:6444-48；Lu et al.,2005,J.Biol.Chem.280:19665-72；Hudson et al.,2003,Nat.Med.9:129-34；WO 93/11161；和美国专利号5,837,242和6,492,123)；单链抗体分子(参见例如，美国专利号4,946,778；5,260,203；5,482,858；和5,476,786)；双可变结构域抗体(参见例如，美国专利号7,612,181)；单可变结构域抗体(sdAbs)(参见例如Woolven et al.,1999,Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov et al.,2004,Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

当用于抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中，氨基端部分包括约120-130或更多个氨基酸的可变区，并且羧基端部分包括恒定区。所述恒定区可以是基于重链恒定区的氨基酸序列的五种不同类型(例如，同种型)之一，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同的重链大小不同：α、δ和γ包含约450个氨基酸，而μ和ε包含约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生五种公知类别(例如同种型)的抗体，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

当用于抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中，氨基端部分包括约100至约110或更多个氨基酸的可变区，并且羧基端部分包括恒定区。轻链的长度大约是211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，有两种不同的类型，称为κ或λ。

如本文使用的术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。

CDR区是本领域技术人员众所周知的，并且已经由公知的编号系统定义。例如，Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且最常用(参见例如，Kabat et al.,supra)。相反，Chothia是指结构环的定位(参见例如，Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。当使用Kabat编号编码时，Chothia CDR-H1环的终点在H32和H34之间的差异取决于环的长度(这是因为所述Kabat编号方案将插入位点设置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则该环在32处结束；如果仅存在35A，则该环在33处结束；如果同时存在35A和35B，则该环在34处结束)。AbM高变区体现了Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如，Antibody Engineering Vol.2(Kontermannand Dübel eds.,2d ed.2010))。“接触”高变区是基于对可用复杂晶体结构的分析。已开发并广泛采用的另一种通用编号系统是ImMunoGeneTics(IMGT)Information (Lafranc et al.,2003,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。IMGT是一个集成的信息系统，专门研究人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(Ig)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，CDR是指氨基酸序列和CDR在轻链或重链中的定位。由于CDR在免疫球蛋白可变域结构内的“定位”在物种之间是保守的，并存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征排列可变结构域序列的编号系统，易于识别CDR和框架残基。所述信息可用于将一种物种的免疫球蛋白的CDR残基嫁接和替换为通常来自人抗体的受体框架。Honegger andPlückthun,2001,J.Mol.Biol.309:657-70另外开发了一种编号系统(AHon)。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统在内的编号系统之间的对应关系是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Kabat et al.,supra；Chothia and Lesk,supra；Martin,supra；Lafrancet al.,supra)。这些高变区或CDR的残基如下所示。

表1：高可变区或CDR的残基

给定CDR的边界可以根据用于鉴定的方案而变化。因此，除非另有说明，否则给定抗体的术语“CDR”和“互补决定区”或其区域，例如可变区，以及其各个CDR(例如“CDR-H1，CDR-H2”)抗体或其区域应理解为涵盖由上文所述的任何已知方案定义的互补决定区。在某些情况下，指定用于鉴定一个或多个具体的CDR的方案，例如由Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR的具体氨基酸序列。

高变区可以包括如下的“扩展高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)、和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)、以及93-102，94-102或95-102(H3)。

术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应因子功能，例如与Fc的受体相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，相对于免疫球蛋白的其他部分，即包含抗原结合位点的可变区，具有更保守的氨基酸序列。所述恒定区可以包含重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。

术语“框架”或“FR”是指在CDR两侧的可变区残基。FR残基存在于例如嵌抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基以外的那些可变结构域残基。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区、和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从位点Cys226的氨基酸残基，或从Pro230延伸至其羧基端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以除去，例如在抗体的生产或纯化过程中，或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可以包括所有去除了K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体以及带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。“功能性Fc区”的Fc区天然序列具有“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括结合C1q；CDC；结合Fc受体；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体下调(例如B细胞受体)等。这样的效应子功能通常需要将所述Fc区与结合区或结合域(例如抗体可变区或结构域)结合，并且可以使用各种本领域技术人员已知的测定方法进行评价。“Fc区变体”的氨基酸序列由于至少一种氨基酸修饰(例如取代、添加或缺失)而与Fc区的天然序列不同。在某些实施方案中，与Fc区天然序列或亲本多肽的Fc区相比，所述Fc区变体具有至少一个氨基酸取代，例如，在Fc区天然序列或亲本多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸取代，或约1至约5个氨基酸取代。本文的Fc区变体可与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或具有至少约90％的同源性，例如，具有至少约95％的同源性。

多肽“胞外结构域”或“ECD”是指基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的多肽的形式或部分。例如，ECD可具有小于1％的此类跨膜和/或胞质结构域，并且可具有小于0.5％的此类跨膜结构域。

如本文使用的“表位”是本领域的术语，并且是指结合分子(例如抗体)可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或具有构象的、非线性的、或不连续的表位。对于多肽抗原，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“具有构象的”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员应当理解，通常，线性表位可能依赖或可能不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，结合分子结合一组氨基酸，而不论该组氨基酸是否以天然的三维蛋白质结构折叠。在其他实施方案中，结合分子需要氨基酸残基组成表位以表现出特定构象(例如弯曲、扭曲、转向或折叠)，以便识别并结合表位。

术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。该定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括但不限于非天然氨基酸，以及本领域已知的其他修饰。应当理解，因为本公开的多肽可以是基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员的多肽，所以在某些实施方案中，“多肽”可以是单链或两个或更多个相关的链。

术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列的物质，包括例如编码本文所述的结合分子(例如抗体)的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括，例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，它们可以包括可稳定整合入宿主细胞染色体的选择序列或标记。另外，所述载体可以包括一种或多种可选择的标记基因和合适的表达控制序列。可包括的可选择的标记基因，例如，提供抗生素抗性或毒素抗性、补充营养缺陷型、或提供培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或多个核酸分子要共表达时(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，两个核酸分子都可以插入，例如，插入到单个表达载体或分开的表达载体。对于单载体表达，可以将编码核酸可选地连接至一个共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域公知的方法证实已将核酸分子导入宿主细胞。此类方法包括例如核酸分析，例如mRNA的Northern blot或聚合酶链式反应(PCR)扩增，用于基因产物表达的免疫印迹、或其他合适的分析方法以检测导入的核酸序列或其对应的表达基因产物。本领域技术人员应理解，所需核酸分子以足以产生所需产物的量表达，并且应进一步理解，可以使用本领域公知的方法来优化表达水平以获得足够的表达。

本文使用的术语“宿主”是指动物，例如哺乳动物(例如人)。

本文使用的术语“宿主细胞”是指特定的受试者细胞，所述细胞可用核酸分子和所述细胞的子代或潜在子代转染。由于继代或整合所述核酸序列宿主细胞基因组中可能发生的突变或环境影响，这种细胞的子代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。

“分离的核酸”是核酸，例如RNA、DNA或混合核酸；所述核酸实质上是分离自其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物，如核糖体和聚合酶，并自带天然序列。“分离的”核酸分子是分离自存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子。此外，当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以完全脱离其他细胞材料或培养基，或者当化学合成时可以完全脱离化学前体或其他化学物质。在一个具体的实施方案中，分离或纯化编码本文所述抗体的一种或多种核酸分子。该术语包括已经从其天然存在的环境中除去的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括分子的分离形式。

本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指包括DNA和RNA的任何长度的核苷酸的聚合物。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。本文使用的“寡核苷酸”是指短的、通常为单链的合成多核苷酸，其长度通常但非必须小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是互相排斥的。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。产生本公开的结合分子的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞、以及已经导入了编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左手端为5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录本从5'到3'的添加方向称为转录方向；具有与RNA转录本相同的序列的DNA链上RNA转录物的5'至5'端的序列区域称为“上游序列”；具有与RNA转录本相同的序列的DNA链上3'到3'末端的序列区域称为“下游序列”。

本文所用的“载体”包括以所采用的剂量和浓度对暴露于其上的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的示例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。术语“载体”还可以指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂或媒介物。这样的载体，包括药物载体，可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当组合物(例如药物组合物)静脉内施用时，水是示例性载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的赋形剂(例如药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。口服组合物(包括制剂)可以包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于Remington and Gennaro,Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.1990)。组合物，包括药物化合物，可包含例如分离或纯化形式的结合分子(例如抗体)以及合适量的载体。

本文使用的术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准，或在United States Pharmacopeia、European Pharmacopeia、或其他公认的药典中列出，用于动物，尤其是人类。

本文使用的术语“有效量”是指足以提供所需结果的本文提供的结合分子(例如抗体)或药物组合物的量。

术语“受试者”和“患者”可以互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人)。在具体的实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是被诊断出患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一实施方案中，受试者是处于患病或病症风险中的哺乳动物，例如人。

“施用”或“给药”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者体内，例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或任何其他方法本文所述或本领域已知的物理递送方式。

本文使用的术语“治疗”、“治疗”和“治疗”是指由于施用一种或多种疗法而导致的疾病或病症的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。

术语“约”和“大约”是指给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更少。

本公开和权利要求书中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。

应该理解的是，无论在本文描述的实施方案中何处使用术语“包括”，则提供类似实施方案，使用“由……构成”和/或“基本上由……构成”描述。还应当理解的是，无论在何处在本文中用短语“基本上由……组成”描述实施方案时，还提供类似实施方案，使用“由……组成”描述。

如本文中的短语“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括：A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，用在诸如“A、B和/或C”之类的短语中的术语“和/或”旨在涵盖以下每个实施方案：A、B和C；以及A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

II.结合分子

本文提供了包含多个抗原结合结构域(例如，两个抗原结合结构域)的结合分子(ALiCE)。在一些实施方案中，本文提供的结合分子的多个抗原结合结构域可用于接合细胞，将细胞带入免疫细胞或重定向免疫细胞。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子包含两个抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域包含两个抗体Fab区，第二抗原结合结构域包含抗体Fv区。所述两个Fab区的每一个包含两个部分：第一部分具有抗体可变重链(VH)区和抗体CH1区；第二部分具有第二部分，该第二部分包括抗体轻链(LC)，所述抗体轻链包含抗体可变轻链(VL)区和抗体轻链恒定区(CL)。两个Fab区的每一个都结合抗原。所述第二抗原结合结构域中的Fv区包含VH区和抗体可变轻链(VL)区。两个Fab区连接至Fv区。

因此，一方面，本公开提供了一种结合分子，其包含：

其中，所述两个抗体Fab区各自结合抗原，和

Fab区(即抗原结合片段)是与抗原结合的抗体区域。常规的IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区位于Y形IgG结构的两个臂之一上。每个Fab区通常由重链和轻链中的一个可变区和一个恒定区组成。更具体地，Fab区中的重链的可变区和恒定区是VH和CH1区，而Fab区中的轻链的可变区和恒定区是VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以按照本公开以各种方式排列以赋予抗原结合能力。例如，类似于常规IgG的Fab区，VH和CH1区可以在一条多肽上，而VL和CL区可以在分开的多肽上。可选地，VH、CH1、VL和CL区都可以在同一多肽上并且以不同的顺序取向，如下文更详细的描述。

Fv区是包含VH区和VL区的抗原结合区。Fv区中的VH和VL区可以按照本公开以各种方式排列以赋予抗原结合能力。例如，VH和VL区可以在相同或分开的多肽上。如果VH和VL区在同一多肽上，则可以以不同的顺序取向，如下文更详细的描述。

如以上在I中所解释的，术语“可变区”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基端，并且长度为重链中大约120至130个氨基酸，轻链中约100至110个氨基酸，用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以称为“VH”。轻链的可变区可以称为“VL”。

术语“恒定区”是指轻链和重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，相对于免疫球蛋白的其他部分，即包含抗原结合位点的可变区，其具有更保守的氨基酸序列。所述恒定区可以确定破坏抗原的机制。根据抗体的恒定区结构和免疫功能，其抗体可分为五个主要类别，即IgM、IgG、Iga、IgD和IgE。IgG是一类以γ重链为特征的免疫球蛋白。它是血浆中发现的最丰富的免疫球蛋白类别。轻链的恒定区称为“CL”。多个重链C结构域(CH结构域)从氨基端到羧基端编号，例如CH1、CH2、CH3等。这些抗体类别的任何CL和CH1区可用于本公开中。在一个具体的实施方案中，本文提供的CL和CH1区是IgG类型(例如IgG1)。本文提供的Fab区的代表性CL区具有如下所示的氨基酸序列：

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.:59).

本文提供的Fab区的代表性CH1区具有如下所示的氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO.:60)

本文中使用“第一部分不包含抗体CH2区和抗体CH3区”的用语是指第一部分不包含完整的抗体CH2区或完整CH3区。但是，该用语不排除在第一部分中包括CH2区和/或CH3区的一部分的实施方案。另外，在某些实施方案中，可以包括不具有完全的CH2和/或CH3活性(例如效应子功能)的CH2和/或CH3变体或截短。用于测定Fc区相关功能的诸如Fc受体结合测定或ADCC活性测定或其他公周知的测定可在本文中用于测定CH2和/或CH3活性(或Fc区活性)是否完全保留。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分和第二部分存在于分开的多肽上。每个Fab区可选地是单链Fab区。因此，在其他实施方案中，第一抗原结合结构域的两个Fab区的第一部分和第二部分在同一多肽上。在其他实施方案中，两个Fab区之一的第一部分和第二部分在同一多肽上。在Fab区是单链Fab(即，Fab区的第一部分和第二部分在同一多肽上)的实施方案中，Fab区可以按以下顺序从N端到C端取向：VH-CH1-VL-CL。可选地，单链Fab区可以按照以下顺序从N端到C端取向：VL-CL-VH-CH1。

类似地，在某些实施方案中，Fv区的VH区和VL区在分开的多肽上。在其他实施方案中，第二抗原结合结构域的Fv区是单链Fv(即，Fv区的VH区和VL区在同一多肽上)。在单链Fv的实施方案中，Fv区可以按照以下顺序从N端到C端取向：VH-VL，或者可以按照以下顺序从N端到C端取向：VL-VH。

在一些具体的实施方案中，每个Fab区的两个部分在分开的多肽上，并且Fv区的VH和VL区也在分开的多肽上。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过柔性肽区连接。在一些实施方案中，柔性肽区包含抗体铰链区。在一些具体的实施方案中，抗体铰链区是IgG铰链区。本文提供的IgG铰链区可以选自各种IgG亚型的抗体铰链区。下表2列出了具有核心铰链序列的示例性IgG亚型，其可包含在本文提供的柔性肽区中。

表2：示例性IgG亚型

IgG亚型	核心铰链序列	SEQ ID NO:
			IgG1	EPKSCDKTHTCPPCP	55
IgG2	ERKCCVECPPCP	56
			IgG3	ELKTPLDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)₃	57
IgG4	ESKYGPPCPSCP	58

因此，在一些更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG1亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG2亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG3亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG4亚型的铰链区。在一些具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在其他具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，柔性肽区包含额外的氨基酸。例如，在一些实施方案中，柔性肽区还包含在抗体铰链区和第二Fv抗原结合结构域之间的接头(例如G4S)。抗体铰链区和第二Fv结构域之间的柔性接头可能会影响第二Fv结构域的结合亲和力。第二Fv结构域的结合亲和力的改善可提高免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)对靶细胞(例如，癌细胞)的重定向效率。第二Fv结构域需要弯曲才能与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)上呈现的表面抗原相互作用并结合，因为ALiCE的第二Fv结构域的互补位被ALiCE的第一Fab结构域结构性掩盖。因此，为了减少空间位阻并优化第二Fv结构域与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)的结合，可以在抗体铰链区和第二Fv结构域之间引入柔性接头如G4S。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是整数。在一些具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₁。在一些更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₂。在其他更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₃。在其他更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₄。设计和构建具有不同灵活性的接头的其他方法在例如Klein et al.,Protein Engineering,Design&Selection,2014,27(10):325-330和DiGiammarino et al.,Landes Bioscience,2011,3(5):487-494中有更详细的描述，每一个均通过引用整体并入本文。

本文提供的结合分子可任选地包含CH3结构域。图1B示出了这样的示例性结合分子。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域还包含连接至Fv区的VH区的第一CH3区和连接至Fv区的VL区的第二CH3区。在一些实施方案中，CH区连接至Fv区的VH和VL区的C端。CH3区的存在为本文提供的结合分子提供了Fc受体结合能力。在一些实施方案中，使用现有技术，例如knobs-into-holes(KiH)技术或静电操作，将CH3区连接至Fv区，以促进或加强两个CH3区之间的关联。例如，knobs-into-holes最初作为相邻α-螺旋之间氨基酸侧链堆积的模型，后来发现是作为工程化抗体重链同型二聚体以异源二聚化的有效的设计策略。简而言之，在该方法的某些实施方案中，可以首先通过在一个IgG CH3结构域中用一个较大的氨基酸替换小的氨基酸(例如，T取代Y)获得“knob”变体。所述knob设计用于插入另一个IgGCH3结构域中通过较小的残基替换较大的残基(例如，Y取代T)产生的“hole”中。knobs-into-holes技术在例如WO 96/027011、Ridgway et al.,Protein Eng 9(1996)617-621，和Merchant et al.,Nat Biotechnol 16(1998)677-681中用几个示例进行详细描述，每一个均通过引用整体并入本文。在本公开中还考虑了用于修饰CH3区以促进或加强两个CH3区之间的关联的其他公知技术。

白蛋白(例如人血清白蛋白)已被用于增加生物药的血清半衰期。参见Dennis etal.,The Journal of Biological Cheminstry,2002,277(38):35035-35043；Adams etal.,MABS,2016,8(7):1336-1346。例如，使用人血清白蛋白(HSA)。HSA是血液中最丰富的蛋白质，广泛分布于组织中，具有非急性功能。HAS的半衰期为19天。因此，在一些实施方案中，白蛋白(例如HSA)可用于本文中以增加本文提供的结合分子的半衰期。铝可以以几种方式使用。一种示例性方法是通过遗传或化学方法将白蛋白结构域(例如HSA)直接偶联至本文提供的结合分子。另一示例性方法是使用白蛋白结合域或位点(ABD或ABS)。

因此，本文提供的结合分子还可任选地包含一个或多个白蛋白结合结构域或白蛋白结合位点(ABD或ABS)。图1C示出了这样的示例性结合分子。在一些实施方案中，本文提供的结合分子的ABS介导与内源性白蛋白的结合，从而帮助延长本文提供的结合分子的半衰期和/或增强其治疗效果。在一些实施方案中，本文提供的结合分子的ABS还可以通过与白蛋白的非共价结合来帮助改善药代动力学。在一些实施方案中，ABS连接至Fv区的VH区的C端。在其他实施方案中，ABS连接至Fv区的VL区的C端。在其他实施方案中，Fv区的每个VL和VH区的C端连接ABS。在其他实施方式中，ABS连接至至少一个Fab区的CL区。

在某些实施方案中，结合分子可以进一步任选地包含一个或多个白蛋白结构域(例如HSA)。在一些实施方案中，白蛋白结构域连接至Fv区的VH区的C端。在其他实施方案中，白蛋白结构域连接至Fv区的VL区的C端。在其他实施方案中，Fv区的每个VL和VH区的C端连接至白蛋白结构域。在其他实施方案中，白蛋白结构域连接至至少一个Fab区的CL区。

本文提供的结合分子的两个Fab区和Fv区可各自结合抗原。在一些实施方案中，两个Fab区结合不同的抗原。

在其他实施方案中，两个Fab区结合相同的抗原。在一些实施方案中，两个Fab区结合相同抗原的相同表位。在其他实施方案中，两个Fab区结合相同抗原的不同表位。

当两个Fab区结合相同的抗原——第一抗原时，第一抗原可以与Fv区结合的抗原(第二抗原)相同或不同。因此，在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合相同的抗原。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合与第一抗原结合结构域结合的至少一个表位相同的表位。

在其他实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合不同的抗原，并且其中，第一抗原结合结构域结合第一抗原，第二抗原结合结构域结合第二抗原。图1E提供一种ALiCE分子的图示，其中第一抗原结合结构域(两个Fab区)结合至癌症抗原，并且第二抗原结合结构域通过抗原(例如CD3)结合至免疫细胞例如T细胞。这样的ALiCE分子可以使免疫细胞(例如T细胞)与癌细胞接合，因此可以用作癌症治疗的治疗剂。

因此，在一些实施方案中，本文提供的结合分子是双特异性结合分子，其包含(a)提供与第一抗原的结合亲和力的两个Fab区(在第一抗原结合域中)和(b)提供与第二抗原的结合亲和力的Fv区(在第二抗原结合结构域中)。第一抗原结合结构域可以结合细胞上的表面蛋白的胞外结构域，并且第二抗原结合域可以结合免疫细胞上的表面蛋白的胞外结构域，从而将两个细胞结合在一起。

第一抗原结合结构域(具有两个Fab区)可以结合癌细胞。第一抗原结合结构域也可以结合非癌细胞。因此，在一些实施方案中，第一抗原是癌症抗原(例如PD-L1)。在其他实施方案中，第一抗原不是癌症抗原。

在一些实施方案中，第二抗原在包括淋巴细胞和单核细胞的免疫细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在B细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在树突细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在粒细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在先天淋巴样细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在巨核细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在单核细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在骨髓来源的抑制细胞上表达。在其他实施方案中，第二抗原在NK细胞上表达。

在一些实施方案中，第二抗原在效应细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在T辅助细胞、调节性T细胞或细胞毒性T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在T辅助细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在调节性T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在细胞毒性T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在CD8+T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原在CD4+T细胞上表达。在一些实施方案中，第二抗原包含胞外结构域。

在一些具体的实施方案中，第二抗原是CD3。在一些实施方案中，第一抗原是癌症抗原，第二抗原是CD3。

在一些更具体的实施方案中，第一抗原是PD-L1，第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；每个Fab区的第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示；每个Fab区第二部分的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示；Fv区的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；Fv区的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，第一抗原是CD20，第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29所示的CDR；每个Fab区的第二部分的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:26所示；每个Fab区第二部分的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:30所示；Fv区的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；Fv区的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，第一抗原是EGFR，第二抗原是CD3。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:41、SEQ ID NO.:42和SEQ ID NO.:43所示的CDR；每个Fab区第二部分的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:45、SEQ ID NO.:46和SEQ ID NO.:47所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:40所示；每个Fab区的第二部分的所述VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:44所示；Fv区的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；Fv区的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在其他更具体的实施方案中，所述第一抗原是Her2，所述第二抗原是TNFα。在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:51所示；每个Fab区的第二部分的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:52所示；Fv区的VH区的氨基酸序列如SEQID NO.:53所示；Fv区的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:54所示。

在一些具体的实施方案中，第一抗原结合结构域在N端，并在N端保持天然抗体结构；而第二抗原结合结构域在C端，并且两条重链C端的CH2和CH3结构域各自分别被单个VH和VL结构域取代。图1A是该示例性ALiCE分子的图示。更具体地，每个Fab区的第一部分和第二部分在分开的多肽上，第一抗原结合结构域与第一抗原结合，Fv区的VH区和VL区在分开的多肽上，第二抗原结合抗原结构域结合存在于免疫细胞上的第二抗原，并且第一抗原与第二抗原是不同的抗原。

因此，在一个具体的实施方案中，本文提供的结合分子包含：

其中，第一部分和第二部分在分开的多肽上；和

其中，第一抗原结合结构域结合第一抗原。

(b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含抗体Fv区，所述抗体Fv区包含VH区和抗体可变轻链(VL)区，其中VH区和VL区位于分开的多肽上；其中第二抗原结合结构域与免疫细胞上存在的第二抗原结合，

其中第一抗原和第二抗原是不同的抗原。

在一些实施方案中，一个Fab区的第一部分和Fv区的VH区在同一多肽上，而另一Fab区的一部分和Fv区的VL区在同一多肽上。因此，在一些具体的实施方案中，本文提供的结合分子包含：

(a)第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含第一抗体Fab区和第二抗体Fab区，每个区包括：

其中第一抗原结合结构域结合第一抗原。

(b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含抗体Fv区，所述抗体Fv区包含VH区和VL区，其中第二抗原结合域与免疫细胞上存在的第二抗原结合，

其中，第一抗原和第二抗原是不同的抗原；和

其中，第一Fab区的第一部分和Fv区的VH区在同一多肽上；第二Fab区的第一部分和Fv区的VL区在同一多肽上。

在一些实施方案中，第一抗原是癌症抗原(例如PD-L1)。在其他实施方案中，第一抗原不是癌症抗原。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；每个Fab区的第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

另一方面，本文提供的结合分子包括四条肽(两条抗体轻链和两条重链样链)，并且四条肽的总体结构类似于传统的IgG，不同之处在于IgG的Fc区被Fv取代。可以进一步修改此结构以产生赋予的各种性质的变化。更具体地，在一些实施方案中，本文提供的结合分子包含：

其中，第一多肽与第三多肽的第一VH区和第一CH1区形成第一抗原结合Fab区；

其中，第二多肽与第四多肽的第三VH区和第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；和

其中，第三多肽的第二VH区和第四多肽的VL区形成抗原结合Fv区。

在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽具有相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，本文提供的结合分子包含两条相同的轻链(第一和第二多肽)和两条不同的重链样链(第三和第四多肽)。

在一些实施方案中，第一Fab区和第二Fab区通过柔性肽区连接至Fv区。在一些实施方案中，柔性肽区包含抗体铰链区。在一些具体的实施方案中，抗体是IgG铰链区。在一些更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG1亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG2亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG3亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，所述IgG铰链区是IgG4亚型的铰链区。在一些具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在其他具体的实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供的柔性肽区包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，柔性肽区包含额外的氨基酸。例如，在一些实施方案中，柔性肽区还包含在抗体铰链区和第二Fv抗原结合结构域之间的接头(例如G4S)。抗体铰链区和第二Fv结构域之间的柔性接头可能会影响第二Fv结构域的结合亲和力。第二Fv结构域的结合亲和力的改善可提高免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)对靶细胞(例如，癌细胞)的重定向效率。第二Fv结构域需要弯曲才能与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)上呈现的表面抗原相互作用并结合，因为ALiCE的第二Fv结构域的互补位被ALiCE的第一Fab结构域结构性掩盖。因此，为了减少空间位阻并优化第二Fv结构域与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)的结合，可以在抗体铰链区和第二Fv结构域之间引入柔性接头如G4S。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是整数。在一些具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₁。在一些更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₂。在其他更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₃。

在一些实施方案中，第一Fab区和第二Fab区结合不同的抗原。在其他实施方案中，第一Fab区和第二Fab区结合相同的抗原。在一些实施方案中，第一Fab区和第二Fab区结合相同抗原的相同表位。在其他实施方案中，第一Fab区和第二Fab区结合相同抗原的不同表位。

在某些实施方案中，第一Fab区和第二Fab区形成第一抗原结合结构域，并且Fv区形成第二抗原结合结构域。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域与相同抗原结合。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域结合与第一抗原结合结构域结合的至少一个表位相同的表位。

在其他实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合至不同的抗原，并且其中，第一抗原结合结构域结合第一抗原，并且第二抗原结合结构域结合第二抗原。

在一些实施方案中，第一抗原是癌症抗原。在其他实施方案中，第一抗原不是癌症抗原。

在一些实施方案中，每个Fab区的所述第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的CDR；每个Fab区的第二部分的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14、SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列，第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，并且第四多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示。

在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列，第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:23所示，并且第四多肽的氨基酸序列如SEQID NO.:24所示。

在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自具有如SEQ ID NO.:39所示的氨基酸序列，第三多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示，并且第四多肽的氨基酸序列如SEQID NO.:38所示。

如上所述，在某些实施方案中，本文提供的结合分子包含两条相同的轻链和两条不同的重链样链。为了在CHO或HEK293等哺乳动物细胞中制备重组蛋白，了解ER中发生的抗体装配和质量控制系统非常重要。抗体以H₂L₂四聚体的形式装配和分泌，并且BiP和PDI在ER中对质量控制机制的调控非常严格。已知重链未折叠的CH1结构域以依赖BiP方式调控抗体装配。如下文示例性部分中所述，本公开显示抗体VH结构域也参与了抗体装配，并显示本文提供的结合分子的包含两个VH区(一个在Fab区，一个在Fv区)的重链样链有助于结合分子的正确装配。

C末端Fv还在两条不同的重链样链(第三和第四多肽)的异二聚化中具有重要作用。由于VH和VL区之间的相互作用比VL-VL相互作用强得多，所以选择VH-VL相互作用在两条不同的重链样链(第三和第四条多肽)之间进行异二聚化。发现异二聚化的效率非常高，并且在哺乳动物细胞中表达和纯化的大多数结合分子都是异二聚化形式(接近99％异二聚化效率)。

此外，该结构提供了靶细胞和效应细胞之间的最佳突触距离。N端两个Fab区和C端Fv区的距离估计为此外，本文提供的结合分子比其他已知的双特异性抗体(例如BiTE、DART和其他基于ScFv的双特异性抗体形式)具有更多的折叠复杂性(分子大小)，因此预期具有改善的热力学稳定性。

此外，在某些实施方案中，本文提供的结合分子是双特异性结合分子，其中两个Fab区(N端F(ab')₂)结合至第一抗原(例如癌症抗原)，并且Fv区与免疫细胞(例如T细胞)结合。在某些实施方案中，本文提供的结合分子以Y形设计和构建，以提供抗体功能和免疫重定向(例如T细胞重定向)的协同作用，例如最大抗肿瘤活性。ALiCE分子的构型(主要呈Y形)旨在赋予两个抗原结合结构域(两个靶互补位)之间最佳的免疫突触距离，并最大化细胞(例如T细胞)向其他细胞(例如，肿瘤细胞)的功能重定向。另外，提供了高亲和力和二价N端(两个Fab区)，并且同时，由于单价的Fv区对免疫细胞抗原的低亲和力，减少了不希望的不依赖靶的T细胞活化。

已经报道结合分子可以具有不同的构型，这可以影响结合分子中结构域之间的距离(Zhang X.et al.3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed byIndividual Particle Electron Tomography.Scientific Reports 5,Article number:9803(2015)；Klein J.S.et al.Examination of the contributions of size andavidity to the neutralization mechanisms of the anti-HIV antibodies b12 and4E10.Proc Natl Acad Sci U S A.2009May 5；106(18):7385-90；两个参考文献均通过引用整体并入)。在某些实施方案中，ALiCE分子可以具有不同的构型，例如ALiCE分子可以以Y形或T形存在。在某些实施方案中，ALiCE分子的不同构型可导致ALiCE分子中N端的两个Fab区和C端的Fv区之间的不同距离。在某些实施方案中，本文提供的结合分子中的N端两个Fab区和C端Fv区之间的距离可估计为在约至约/>的范围内。在某些实施方案中，本文提供的结合分子中的N端两个Fab区和C端Fv区之间的距离可以估计为约/>在一些其他实施方案中，本文提供的结合分子中的N端两个Fab区和C端Fv区之间的距离可以估计为约

因此，在本文提供的各种双特异性结合分子中，第一抗原结合结构域与第一抗原的结合亲和力高于第二抗原结合结构域与第二抗原的结合亲和力。例如，如以下实施例3中所示，ACE-05与人PD-L1的结合动力学与亲本抗PD-L1抗体(即YBL-007，来自Y-Biologics，Inc.)相当(参见图12A-12C)。相反地，ACE-05与CD3的结合亲和力远低于亲本抗CD3抗体(UCHT1，来自BioLegend,USA)(参见图12A-12C)。

一般而言，抗原-抗体相互作用是非共价的并且是可逆的，通过氢键、疏水相互作用、静电力和范德华力的组合形成的。当描述抗原-抗体复合物的强度时，通常提及亲和力和/或亲合力。如上所述，抗体与其抗原的结合是可逆的过程，并且结合的亲和力通常报道为平衡解离常数(K_D)。K_D是抗体解离速率(k_off或k_d)(从抗原解离的速度)与抗体结合率(k_on或k_a)(与抗原结合的速度)的比率。在一些实施方案中，通过测定具体抗体/抗原相互作用的k_on和k_off速率，然后使用这些值的比率来计算K_D值，以测定K_D值。K_D值可用于对单个抗体/抗原相互作用的强度的评价和排序。抗体的K_D越低，抗体对其靶标的亲和力就越高。亲合力给出了抗体-抗原复合物的总体强度的量度。亲合力取决于三个主要参数：(i)抗体对表位的亲和力；(ii)抗体和抗原的价数；以及(iii)相互作用部分的结构排列。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、约0.1nM或更小、50pM或更小、10pM或更小、或者1pM或更小的解离常数(K_D)结合一种或多种靶标、抗原、或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约20nM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，结合分子以约10nM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，结合分子以约1nM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，结合分子以约0.5nM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约0.1nM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约50pM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约25pM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约10pM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子以约1pM或更小的K_D结合靶标、抗原或表位。在一些实施方案中，本文提供的结合分子与靶标或抗原的解离常数是使用融合蛋白测定的解离常数，所述融合蛋白包含固定在芯片上的靶蛋白的至少一部分。在一些实施方案中，本文提供的结合分子与靶标或抗原的解离常数是使用由抗人IgG抗体在/>芯片上捕获的结合剂和可溶性靶蛋白测定的解离常数。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、或者约0.1nM或更小的50％最大有效浓度(EC₅₀)结合靶标、抗原或表位。在某些实施方案中，本文提供的结合分子以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、或者约0.1nM或更小的EC50结合靶标、抗原或表位。

在某些实施方案中，结合分子结合第一抗原的K_D为约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、50倍或更多倍于结合分子结合第二抗原的K_D。在一些实施方案中，结合分子结合第一抗原的K_D为约10、10²、10³或10⁴倍于结合分子结合第二抗原的K_D。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)包含一种或多种“亲本”抗体的至少一部分。在一些实施方案中，亲本抗体是重组抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是人抗体或完全人抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方案中，亲本抗体是IgG1抗体。在某些实施方案中，亲本抗体是IgG2抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是IgG3抗体。在一些实施方案中，亲本抗体是IgG4抗体。

在一些实施方案中，分离本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)。在一些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)是基本上纯的。

在一些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)或其一部分源自至少一种单克隆抗体。在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体。例如，使用杂交瘤方法，对小鼠、大鼠、兔子、仓鼠或其他合适的宿主动物如上所述进行免疫，以诱导产生特异性结合免疫抗原的抗体。在一些实施方案中，体外免疫淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫抗原是人蛋白质或其片段。在一些实施方案中，免疫抗原是小鼠蛋白或其片段。

免疫后，分离淋巴细胞并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合。使用本领域已知的专门培养基筛选杂交瘤细胞，未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞不能在筛选过程中存活。可以通过各种方法来鉴定产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤，所述方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合测定(例如流式细胞术、FACS、ELISA和放射免疫测定)。一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，就可以通过有限稀释技术将克隆进行亚克隆。杂交瘤可以使用标准方法在体外培养基中繁殖或在动物体内腹水肿瘤繁殖。可以根据本领域中的标准方法从培养基或腹水中纯化单克隆抗体，所述标准方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析。

在某些实施方案中，单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的重组DNA技术来制备。例如，在某些实施例中，从成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离编码单克隆抗体的多核苷酸，例如通过使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物进行RT-PCR，并使用标准技术测定其序列。然后将分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，所述载体在转染到宿主细胞(如大肠杆菌、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中后会产生单克隆抗体。

在某些其他实施方案中，重组单克隆抗体或其片段可以从表达所需种类的可变结构域或CDR的噬菌体展示文库中分离。噬菌体文库的筛选可以通过本领域已知的多种技术来完成。

在一些实施方案中，单克隆抗体通过例如重组DNA技术来修饰以产生可选抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域，可以代替例如人抗体的恒定区以产生嵌合抗体或非免疫球蛋白多肽来产生融合抗体。在一些实施方案中，恒定区被截短或去除以产生单克隆抗体的所需抗体片段。在一些实施方案中，使用可变区的定点或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性和/或亲和力。

在一些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)或其一部分衍生自人源化抗体。产生人源化抗体的各种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，通过使用一种或多种非人CDR序列替换人抗体的相应CDR序列来进行人源化。在一些实施方案中，通过用亲本非人抗体(例如啮齿动物)的所有六个CDR替换人抗体的相应CDR序列来产生人源化抗体。

可基于多种因素和多种方法来选择用于产生人源化抗体的人重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，使用“best-fit”方法，其中针对已知的人类可变区序列的整个文库筛选非人类(例如啮齿动物)抗体的可变区的序列。选择与非人序列最相似的人序列作为人源化抗体的人可变区骨架。在一些实施方案中，使用一种方法，其中选择衍生自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定可变区骨架。在一些实施方案中，框架衍生自最丰富的人类亚类的共有序列。在一些实施方案中，人种系基因被用作可变区框架序列的来源。

其他人源化的方法包括但不限于：称为“超人源化”的方法，该方法被描述为将CDR直接转移至人种系框架；称为Human String Content(HSC)的方法，其基于抗体的“人源性”标准；基于生成大型人源化变体文库(包括噬菌体、核糖体和酵母展示文库)生成的方法；以及基于框架区重组的方法。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)或其部分源自人抗体。可以使用本领域已知的各种技术直接制备人抗体。在一些实施方案中，人抗体是从体外免疫的永生化人B淋巴细胞产生的。在一些实施方案中，人抗体从分离自免疫个体的淋巴细胞产生。在任何情况下，产生针对靶抗原的抗体的细胞可以产生和分离。在一些实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体。可选地，可以使用噬菌体展示技术从未免疫供体的免疫球蛋白可变区基因库中体外产生人抗体和抗体片段。抗体噬菌体文库的产生和使用技术是本领域公知的。一旦鉴定出抗体，就可以采用本领域已知的亲和力成熟策略，包括但不限于链重组和定点诱变，以产生更高亲和力的人抗体。

在一些实施方案中，在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中产生人抗体。免疫后，这些小鼠能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的人类抗体库。

在一些实施方案中，本文提供的结合分子(例如双特异性结合分子)或其部分衍生自在至少一个或多个恒定区中包含修饰的抗体(例如全长抗体或其片段)。在一些实施方案中，抗体包含对三个重链恒定区(例如CH1)中的一个或多个和/或对轻链恒定区(CL)的修饰。在一些实施方案中，修饰的抗体的重链恒定区包含至少一个人恒定区。在一些实施方案中，修饰的抗体的重链恒定区包含一个以上的人恒定区。在一些实施方案中，对恒定区的修饰包括在一个或多个区中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或替代。在一些实施方案中，一个或多个区从修饰的抗体的恒定区中部分或全部去除。在一些实施方案中，已经从抗体(ΔCH2构建体)中去除了整个CH2结构域。在一些实施方案中，已经从抗体(ΔCH3构建体)去除了整个CH3结构域。在一些实施方案中，删除的恒定区被短的氨基酸间隔子(例如10个氨基酸残基)代替，其提供通常由于缺失的恒定区而得到的部分分子柔性。

对本文提供的抗体(例如亲本抗体)和/或本文提供的结合分子(例如双特异性抗体)的恒定区的修饰可以使用公知的生物化学或分子工程技术进行。在一些实施方案中，可以通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA和/或所需的多肽或试剂的直接合成中来制备变体。在这方面，有可能破坏由特定序列或区域提供的活性或效应子功能，同时基本上保持修饰的结合剂的结构，结合活性和其他所需特性。

本公开还包括与本文所述的结合分子基本同源的其他变体和等同物。在一些实施方案中，期望改善结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。本领域技术人员将理解，氨基酸变化可以改变多肽的翻译后过程。

与亲代结合剂的序列相比，变化可以是编码多特异性结合剂的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，其导致氨基酸序列的变化。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸置换一个氨基酸的结果，比如用丝氨酸置换亮氨酸，例如保守氨基酸置换。在一些实施方案中，插入或缺失在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，与亲本分子相比，取代、缺失或插入包括少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个相对于亲本分子的氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、或者少于2个氨基酸取代。具有生物学上可用和/或相关的氨基酸序列的变化可以通过系统地在序列中插入、缺失或取代，并检测所得变体蛋白与亲本蛋白的活性来测定。

在一些实施方案中，变体可以包括在构成本文提供的结合分子的一种或多种多肽的氨基和/或羧基端添加氨基酸残基。额外的氨基酸残基的长度可以在一个残基到一百个或更多个残基的范围内。在一些实施方案中，变体包含N端甲硫酰基残基。在一些实施方案中，变体包含额外的多肽/蛋白，即融合蛋白。在某些实施方案中，变体被工程化为可检测的并且可以包含可检测的标记和/或蛋白质(例如酶)。

在一些实施方案中，不参与维持本文提供的结合分子的适当构象的半胱氨酸残基被取代或缺失以调节试剂的特性，例如，为提高氧化稳定性和/或防止异常的二硫键交联。相反，在一些实施方案中，添加一个或多个半胱氨酸残基以产生二硫键来改善稳定性。

在一些实施方案中，本公开的结合分子是“去免疫的”。诸如抗体的试剂的去免疫通常包括引入特异性突变以去除T细胞表位而不显著降低试剂的结合亲和力或其他期望的活性。

本文所述的变体结合分子或多肽可以使用本领域已知的方法产生，包括但不限于定点诱变、丙氨酸筛选诱变和PCR诱变。

在一些实施方案中，本文所述的结合分子被化学修饰。在一些实施方案中，结合分子是双特异性抗体，其已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化，通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割和/或与细胞配体或其他蛋白质的连接而被化学修饰。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何一种。

组成本文所述的多特异性结合剂的多肽可以通过本领域已知的任何合适的方法产生，并且在下文的第III部分和第IV部分中有更详细的描述。

本公开还提供了包含本文所述的任何一种结合分子(例如双特异性抗体)的偶联物。在一些实施方案中，本文提供的结合分子连接另外的分子。在一些实施方案中，本文提供的结合分子与细胞毒剂或细胞毒性部分偶联。在一些实施方案中，本文提供的结合分子与细胞毒剂偶联以形成ADC(抗体-药物偶联物)。在一些实施方案中，细胞毒性部分是化学治疗剂，包括但不限于甲氨蝶呤、阿霉素/阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、多卡霉素、柔红霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其他嵌入剂。在一些实施方案中，细胞毒性部分是微管抑制剂，包括但不限于耳他汀、美登木素生物碱(例如DMI和DM4)和微管溶素。在一些实施方案中，细胞毒性部分是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、阿布林A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌素、Aleurites fordii蛋白、石竹黄素蛋白、美洲疫霉蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆丁、鼠尾草、白树毒素、mitolgellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族毒素。在一些实施方案中，本文提供的结合分子与一种或多种小分子毒素，例如加利车霉素、美登木素生物碱、天花粉蛋白和CC1065偶联。这些毒素中任何一种的衍生物都可以在偶联物中使用，只要该衍生物保留了细胞毒活性即可。

可以使用本领域已知的任何合适的方法来制备包含本文提供的结合分子的偶联物。在一些实施方案中，使用多种双功能蛋白偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备偶联物。

在一些实施方案中，本文所述的结合分子(例如双特异性抗体)与允许将抗体用于诊断和/或检测的可检测物质或分子偶联。可检测物质可包括但不限于酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、和乙酰胆碱酯酶；修复基团，例如生物素和黄素；荧光物质，例如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯、花青(Cy3)和藻红蛋白；生物发光材料，例如荧光素酶；放射性物质，例如²¹²Bi、¹⁴C、⁵⁷Co、⁵¹Cr、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁸Ga、⁶⁷Ga、¹⁵³Gd、¹⁵⁹Gd、⁶⁸Ge、³H、¹⁶⁶Ho、¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I、¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In、¹⁴⁰La、¹⁷⁷Lu、⁵⁴Mn、⁹⁹Mo、³²P、¹⁰³Pd、¹⁴⁹Pm、¹⁴²Pr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、³⁵S、⁴⁷Sc、⁷⁵Se、¹⁵³Sm、¹¹³Sn、¹¹⁷Sn、⁸⁵Sr、^99mTc、²⁰¹Ti、¹³³Xe、⁹⁰Y、⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、⁶⁵Zn；正电子发射金属；和磁性金属离子。

在一些实施方案中，本文所述的本文提供的结合分子连接至固相支持物，其对于免疫测定或靶抗原的纯化十分有用。这样的固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

在一些实施方案中，本文提供的结合分子被配制成药物组合物。因此，在另一方面，本文提供了包含治疗有效量的本文提供的结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。本文提供的药物组合物在下面的第V部分中有更详细的描述。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。在其他实施方案中，所述癌症是PD-L1阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。

在一些实施方案中，本文提供的结合分子用于治疗疾病或病症。因此，在另一方面，本文提供了一种治疗对象的疾病或病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文提供的结合分子。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。在其他实施方案中，所述癌症是PD-L1阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。下文第VI部分中更详细地描述了施用本发明结合分子的方法。

III.多核苷酸

在某些实施方案中，本公开内容涵盖编码本文所述的结合分子的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包含该多肽的编码序列的多核苷酸以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。

在某些实施方案中，多核苷酸包含在相同阅读框中与多核苷酸融合的多肽的编码序列，该编码序列有助于例如宿主细胞表达和分泌多肽(例如具有控制多肽运输的分泌序列功能的前导序列)。多肽可以具有被宿主细胞切割的前导序列，以形成多肽的“成熟”形式。

在某些实施方案中，多核苷酸包含在相同阅读框中与标记或标签序列融合的多肽的编码序列。例如，在一些实施方案中，标记物序列是由载体提供的6组氨酸标签，其在细菌宿主中可以有效纯化与标记物融合的多肽。在一些实施方案中，标记物与其他亲和标记物结合使用。

本公开还涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中所述变体编码例如多肽的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施方案中，本公开提供了包含具有与编码包含本文所述结合分子的多肽的多核苷酸至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同，并且在一些实施方案中，至少约96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列的多肽。

本文使用的短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸”是指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，该多核苷酸序列可包含参考核苷酸序列的每100个核苷酸最多五个点突变除外。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除参考序列中至多5％的核苷酸或用另一种核苷酸取代，或至多占总核苷酸的5％的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，或者散布在参考序列的核苷酸之间或在参考序列内的一个或多个连续基团中。

多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中发生变化。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含产生沉默的取代、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含沉默取代，其不改变多肽的氨基酸序列(由于遗传密码的简并性)。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主例如大肠杆菌优选的密码子)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码或编码区中包含至少一个沉默突变。

在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以调控或改变编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以增加编码的多肽的表达。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以减少编码的多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的编码多肽表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有降低的编码多肽表达。

在某些实施方案中，分离了多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸是基本上是纯的。

还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含具有多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种包含多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个多核苷酸分子。

IV.制备结合分子的方法

另一方面，本文提供了制备本文提供的各种结合分子的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种制备结合分子的方法，包括将一种或多种载体转染到宿主细胞中，其中所述一种或多种载体包括：

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的第一VH区和第一CH1区可形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区可形成第二抗原结合Fab区；和

在一些实施方案中，第一Fab区和第二Fab区通过柔性肽区连接至Fv区。在一些实施方案中，柔性肽区包含抗体铰链区。在一些具体的实施方案中，抗体铰链区是IgG铰链区。在一些更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG1亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG2亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG3亚型的铰链区。在其他更具体的实施方案中，IgG铰链区是IgG4亚型的铰链区。在一些实施方案中，柔性肽区还包含在抗体铰链区和第二抗原结合结构域之间的接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是整数。在一些具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₁。在一些更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₂。在其他更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₃。在另一个更具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)₄。

在其他实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域结合至不同的抗原，并且其中第一抗原结合结构域与第一抗原结合并且第二抗原结合结构域与第二抗原结合。

在一些实施方案中，第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:22所示；第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:20；第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:21所示。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:27、SEQ ID NO.:28和SEQ ID NO.:29所示的CDR；每个Fab区的第二部分的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:31、SEQ ID NO.:32和SEQ ID NO.:33所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:36所示；第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:34；第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:35所示。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ IDNO.:41、SEQ ID NO.:42和SEQ ID NO.:43所示的CDR；每个Fab区的第二部分的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:45、SEQ ID NO.:46和SEQ ID NO.:47所示的CDR；Fv区的VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15所示的CDR；Fv区的VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO.:17、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:19所示的CDR。

在一些实施方案中，每个Fab区的第一部分的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:40所示；每个Fab区第二部分的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:44所示；Fv区的VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示；Fv区的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:16所示。

在一些实施方案中，第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:50所示；第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:48；第三核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.:49所示。

本文提供的结合分子的重组表达可能需要构建包含编码结合分子或其片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得了本文提供的编码结合分子，抗体重链或轻链或其片段(例如但不一定包含重链和/或轻链可变域)的多核苷酸，则可以使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生结合分子。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制的载体，其包含可操作地连接至启动子的编码本文提供的结合分子的核苷酸序列或其片段，或重链或轻链CDR。这样的载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，PCT国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；以及美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可以克隆到这样的载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链。

通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文提供的结合分子。因此，本文还提供了宿主细胞，该宿主细胞包含与异源启动子可操作的连接的编码本文提供的结合分子的多核苷酸或其片段、或其重链或轻链或其片段。在某些实施方案中，如下文详述，可以在宿主细胞中共表达包含编码本文提供的结合分子的不同部分的多核苷酸的多个载体，以表达整个结合分子。

多种宿主表达载体系统可用于表达本文提供的结合分子(参见，例如美国专利号5,807,715)。这样的宿主表达系统代表可以产生目的编码序列并随后纯化的载体，但是也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文提供的结合分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)。用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母)；被含有编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV、烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)，其含有源自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如晚期腺病毒；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。细菌细胞，例如大肠杆菌、或真核细胞，特别是用于表达整个重组抗体分子的细胞，可以用于表达重组结合分子。例如，哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))连接载体(例如来自人类巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)是抗体或其变体的有效表达系统(Foecking et al.,1986,Gene 45:101；和Cockettet al.,1990,Bio/Technology 8:2)。在一些实施方案中，本文提供的抗体在CHO细胞中产生。在一个具体的实施方案中，编码本文提供的结合分子的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。

在细菌系统中，根据表达的结合分子的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量这样的结合分子时，为了产生结合分子的药物组合物，可能期望能够指导融合蛋白产物高水平表达的、并且已完成纯化的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al,1983,EMBO 12:1791)，其中可以将编码序列单独连接到具有lac Z编码框的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985,NucleicAcids Res.13:3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于表达外源多肽，作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，因此可以从GST部分释放克隆的靶基因产物。

在昆虫系统中，将加州苜蓿根实线虫核多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将编码序列分别克隆到病毒的非必需区域(例如多面体基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多面体启动子)的控制之下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将感兴趣的编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)将产生重组病毒，该重组病毒在被感染的宿主中是有活力的并且能够表达结合分子(例如参见Logan&Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:355-359)。为了有效翻译插入的编码序列，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种来源。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达的效率(参见例如，Bittner et al.,1987,Methods in Enzymol.153:51-544)。

此外，可以选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于适当加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不产生任何内源免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。

为了长期、高产量地生产重组蛋白，可以利用稳定的表达。例如，可以设计稳定表达结合分子的细胞系。可以不使用包含病毒复制起点的表达载体，而用合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外源DNA后，可以使工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换至选择性培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并使细胞将质粒稳定整合到其染色体中并生长以形成源(foci)，然后可以将其克隆并扩增成细胞系。该方法可以有利地用于工程化表达结合分子的细胞系。这样的工程细胞系在筛选和评价与结合分子直接或间接相互作用的组合物时可能十分有用。

可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,1980,Cell22:8-17)基因，可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.,1980,Natl.Acad.Sci.USA77:357；O’Hare et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo，赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu and Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science 260:926-932；和Morgan and Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIB TECH 11(5):l55-2 15)；和hygro，赋予抗潮霉素的抗性和潮性(Santerre et al.,1984,Gene 30:147)。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规地用于选择所需的重组克隆，并且这种方法例如在Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A LaboratoryManual,Stockton Press,NY(1990)；在Chapters 12和13,Dracopoli et al.(eds.),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapinet al.,1981,J.Mol.Biol.150:1中描述，其全部内容通过引用合并于此。

可以通过载体扩增来提高结合分子的表达水平(参见综述，Bebbington andHentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3(Academic Press,NewYork,1987))。当表达结合分子的载体系统中的标记是可扩增的，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与结合分子基因相关，所以结合分子的产生也将增加(Crouse et al.,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。

宿主细胞可以与本文提供的多种表达载体共转染。载体可以包含相同的选择标记，其使得各个编码多肽能够相等表达。或者，可以使用编码并且能够表达多种多肽的单个载体。编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。

一旦通过重组表达产生了本文提供的结合分子，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和力，特别是通过蛋白质A柱层析后具体抗原的亲和力、尺寸色谱柱、和Kappa-Select亲和层析)、离心、差异溶解度或其他任何纯化蛋白质的标准技术。在一个具体的实施方案中，κ选择(例如，由GEHealthcare Life Science开发的KappaSelect)用于纯化Fab(κ)片段或含有Fab片段的结合分子。此外，本文提供的结合分子可与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。

V.药物组合物

在一方面，本公开进一步提供了包含本公开的至少一个结合分子的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文提供的结合分子和药学上可接受的载体。

通过将具有所需纯度的结合分子与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备以水溶液或冻干或其他干燥形式存在的包含结合分子的药物组合物度进行储存(参见例如，Remington,Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed.1980))。

本公开内容的结合分子可以以任何合适的形式配制成用于递送至靶细胞/组织的形式，例如作为微胶囊或大乳液(Remington,supra；Park et al.,2005,Molecules 10:146-61；Malik et al.,2007,Curr.Drug.Deliv.4:141-51)、作为缓释制剂(Putney andBurke,1998,Nature Biotechnol.16:153-57)，或在脂质体中(Maclean et al.,1997,Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。

本文提供的结合分子也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中递送。此类技术例如在上文的Remington,supra公开。

各种组合物和递送系统是已知的并且可以与本文所述的结合分子一起使用，包括但不限于封装在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达结合分子的重组细胞中、受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-32)、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。在另一个实施方案中，可以提供组合物作为控释或缓释系统。在一个实施方案中，可使用泵来实现受控或持续释放(参见例如，Langer,supra；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507-16；和Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现预防剂或治疗剂(例如如本文所述的结合分子)或本文提供的组合物的受控的或持续的释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer and Wiseeds.,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen and Ball eds.,1984)；Ranger and Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy et al.,1985,Science 228:190-92；During etal.,1989,Ann.Neurol.25:351-56；Howard et al.,1989,J.Neurosurg.71:105-12；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质，在储存时稳定，无菌且可生物降解的。

在又一个实施方案中，可将控释或缓释系统置于特定靶组织例如鼻腔通道或肺部附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release Vol.2,115-38(1984))。控释系统例如Langer,1990,Science 249:1527-33讨论的。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含一种或多种如本文所述的结合分子的持续释放制剂(参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698，Ning et al.,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song etal.,1995,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek et al.,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；和Lam et al.,1997,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60)。

VI.施用方法

在一个具体的实施方案中，本文提供了包含本文提供的结合分子的用于预防、控制、治疗和/或改善疾病或病症的组合物。在一个实施方案中，本文提供了用于预防疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供用于治疗疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供用于治疗疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了用于改善疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。在其他实施方案中，所述癌症是PD-L1阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述受试者是有此需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者处于患疾病或病状的风险中。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的预防、控制、治疗或改善。

在一个实施方案中，本文提供了用于预防、控制、治疗和/或改善疾病或病症的症状的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了用于预防疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供用于治疗疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了用于治疗疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了用于改善疾病或病症的组合物，其中该组合物包含本文提供的结合分子。在一个实施方案中，该疾病是癌症。在某些实施方案中，所述受试者是有此需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者处于患疾病或病状的风险中。在一些实施方案中，所述给药导致疾病或病症的症状的预防、控制、治疗或改善。

在另一个实施方案中，本文提供了预防、控制、治疗和/或改善受试者的疾病或病状的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的疾病或病状的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病状的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种减轻受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，所述受试者是有此需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者处于患疾病或病状的风险中。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的预防、控制、治疗或改善。

在另一个实施方案中，本文提供了预防、控制、治疗和/或减轻受试者的疾病或病症的症状的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种预防对象的疾病或病状的症状的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供一种在受试者中治疗疾病或病症方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一个实施方案中，本文提供了一种改善受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文提供的结合分子。在一实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，所述受试者是有此需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者处于患疾病或病症的风险中。在一些实施方案中，所述给药导致疾病或病症预防、控制、治疗或改善。

本文还提供了通过向受试者施用有效量的本文提供的结合分子或包含本文提供的结合分子的药物组合物来预防、控制、治疗和/或改善疾病或病症的方法。一方面，结合分子是基本上纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生不良副作用的物质)。在某些实施方案中，结合分子衍生自一种或多种完全人单克隆抗体。接受治疗的受试者可以是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴子，例如食蟹猴或人)。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是患有疾病或病症例如癌症的人。

各种递送系统是已知的，并且可以用于施用预防剂或治疗剂(例如本文提供的结合分子)，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达结合分子的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如，Wu and Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))，作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。施用预防剂或治疗剂(例如本文提供的结合分子)或药物组合物包括但不限于肠胃外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服途径)。在一个具体的实施方案中，通过鼻内、肌内、静脉内或皮下施用预防或治疗剂(例如，本文提供的结合分子)或药物组合物。预防剂或治疗剂或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或大剂量注射，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、鼻内粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起给药。施用可以是系统的或局部的。另外，还可以例如通过使用吸入器或雾化器以及与雾化剂一起配制来进行肺部给药。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其全部内容通过引用整体并入本文。

在一个具体的实施方案中，可能需要向需要治疗的区域局部施用本文提供的预防剂或治疗剂或药物组合物。这可以通过例如但不限于局部输注、通过局部给药(例如通过鼻内喷雾)、通过注射或通过植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜(例如sialastic膜)或纤维。在一些实施方案中，当施用本文提供的抗体时，必须注意使用抗体不吸收的材料。

在另一个实施方案中，本文提供的预防或治疗剂或组合物可以在囊泡，特别是脂质体中递送(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat et al.,in Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；基本同上)。

在另一个实施方案中，本文提供的预防剂或治疗剂或组合物可以控释或缓释系统递送。在一个实施方案中，可以使用泵来实现控制释放或持续释放(参见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald et al.,1980,Surgery 88:507；Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现预防剂或治疗剂(例如本文提供的抗体)或本文提供的组合物的控制或持续释放(参见例如Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRCPres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger andPeppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；同时参见Levy et al.,1985,Science 228:190；During et al.,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard et al.,1989,J.Neurosurg.7 1:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；PCT公开号WO99/20253。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质，在储存时稳定，无菌且可生物降解的。在又一个实施方案中，可将控释或缓释系统放置在治疗靶标附近，即鼻腔通道或肺部，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如，Goodson,in Medical Applications of ControlledRelease,supra,vol.2,pp.115-138(1984))，在Langer(1990,Science 249:1527-1533)的综述中讨论了控释系统。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含一种或多种本文提供的结合分子的持续释放制剂。参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开号WO 91/05548，PCT公开号WO96/20698，Ning et al.,1996,“Intratumoral Radioimmunotherapyof a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189，Song et al.,1995,“Antibody Mediated LungTargeting of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397，Cleek et al.,1997,“Biodegradable PolymericCarriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854，和Lam et al.,1997,“Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一个通过引用整体并入本文。

在一个具体的实施方案中，当本文提供的组合物是编码预防剂或治疗剂的核酸(例如本文提供的结合分子)时，可以在体内给予该核酸以促进其编码的预防剂或治疗剂的表达，通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并将其施用以使其进入细胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射、或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入细胞核的同源盒状肽结合使用(参见例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)等。可选地，可将核酸引入细胞内并掺入宿主细胞DNA中以通过同源重组表达。

在一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含一个、两个或更多个本文提供的结合分子。在另一个实施方案中，本文提供的组合物包含一个、两个或多个本文提供的结合分子以及除本文提供的结合分子以外的预防剂或治疗剂。在一个实施方案中，已知该试剂可用于或已经或目前用于预防、控制、治疗和/或改善疾病或病症。除预防剂或治疗剂外，本文提供的组合物还可包含载体。

本文提供的组合物包括可用于制备单位剂型的药物组合物(例如，适合向受试者或患者给药的组合物)的制造中使用的原料药组合物。在一个实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物。此类组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗剂(例如，本文提供的结合分子或其他预防或治疗剂)和药学上可接受的载体。可以将药物组合物配制成适合于向受试者的给药途径。

在一个具体的实施方案中，术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当组合物(例如药物组合物)静脉内施用时，水是示例性载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的赋形剂(例如药物赋形剂)包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。口服组合物(包括制剂)可以包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于Remington and Gennaro,Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.1990)。这样的组合物将包含预防或治疗有效量的本文提供的结合分子，例如纯化形式，以及合适量的载体，以提供用于向患者适当施用的形式。该制剂应适合于给药方式。

在一个实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，例如木质素，以减轻注射部位的疼痛。但是，此类组合物可以通过静脉内以外的途径施用。

通常，本文提供的组合物的成分分别或以单位剂型混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在密闭容器中，例如安瓿或小药囊中，以指示活性剂含量。当组合物要通过输注给药时，可以用装有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用之前将成分混合。

本文提供的结合分子可以包装在指示抗体量的气密容器中，例如安瓿或小药囊中。在一个实施方案中，结合分子以干燥的无菌冻干粉或无水浓缩物的形式提供在密封的容器中，并且可以例如用水或盐水重构至合适的浓度以施用于受试者。冻干的结合分子可以在其原始容器中储存在2至8℃之间，并且结合分子可以在重构后的12小时内，例如6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一个替代实施方案中，本文提供的结合分子以液体形式提供在密闭容器中，指示抗体的量和浓度。

本文提供的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

预防或治疗剂(例如本文提供的结合分子)或本文提供的组合物的量，其可有效预防、控制、治疗和/或改善疾病或病症的量可通过以下方法确定：标准临床技术。另外，可任选地采用体外测定法以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中要使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病或状况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。

有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线中推断出来。

在某些实施方案中，本文中提供给患者的剂量的结合分子的给药途径是鼻内、肌内、静脉内或其组合，但是本文所述的其他途径也是可接受的。每个剂量可以或可以不通过相同的给药途径来给药。在一些实施方案中，本文提供的结合分子可以同时或随后经由多种施用途径与其他剂量的本文提供的相同或不同结合分子一起施用。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子是预防性或治疗性地施用于受试者的。本文提供的抗体可以预防性或治疗性地施用于受试者，以预防、减轻或改善疾病或症状。

为了简洁起见，在此使用某些缩写。一个例子是代表氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应的三个字母和单个字母的缩写如下：

在此通常使用肯定性语言来公开本发明以描述众多实施例。本发明还具体包括其中全部或部分排除特定主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使就本发明不包括的内容而言，虽然本发明在本文中通常未表示，但是仍在本文中公开了未明确包括在本发明中的方面。

已经描述了本发明的多个实施例。然而，将理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制权利要求中描述的发明范围。

实施例

实施例1：构建并表达示例性结合分子

本实施例说明了构建并表达本文提供的示例性结合分子(图1A-1E所示)，具体地，是结合分子ACE-00、ACE-02、ACE-03、ACE-04、ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11和ACE-12。下表中总结了每个示例性结合分子中靶向第一和第二抗原的组分。

表3：示例性结合分子中靶向第一和第二抗原的组分

氨基酸序列中使用的格式：

加粗：VH或VL；

加粗并加下划线：CDR；

斜体：抗体铰链区；

小写：可变接头；

[方括号]：CH1；

[方括号和下划线]：CL。

1.1.构建并表达ACE-00

使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)表达ACE-00，其第二抗原结合Fv区结合TNFα，并且其第一抗原结合结构域(Fab区)结合抗原Her2(参见图2F)。ACE-00具有与如图1A所示的示例性结合分子相同的整体结构。简而言之，ACE-00包含两条不同的重链样链(ACE-00-VH和ACE-00-VL)和两条相同的轻链(ACE-00-LC)。用于构建ACE-00的抗Her2结构域的亲本抗体是曲妥珠单抗，用于构建ACE-00的抗TNFα结构域的亲本抗体是阿达木单抗。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-00-VH的氨基酸序列：

ACE-00-VL的氨基酸序列：

ACE-00-LC的氨基酸序列(抗CD19抗体轻链)：

下表列出了靶向Her2的二价Fab区和靶向TNFα的单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列：

表4：ACE-00的VH和VL

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如以下简要描述的，对编码ACE-00-VH、ACE-00-VL和ACE-00-LC的DNA进行三次转染。聚乙烯亚胺(PEI)用作转染试剂(以DNA:PEI＝1:4(w/w)的比例使用)。转染后六到七天，当细胞存活率约为60％至70％时，终止分批培养，收集表达培养物并离心(4,800rpm，30min，4℃)以除去碎片。然后使用0.22μmTOP过滤器(Millipore,USA)过滤上清液。随后，将过滤后的包含ACE-00分子的上清液用Hitrap^TMKappaSelect(GE Healthcare,USA)进行亲和色谱纯化，然后使用Slide-A Lyzer透析盒(Thermo,USA)用pH 7.4PBS透析以进行洗脱缓冲液置换。通过SDS-PAGE、毛细管电泳和尺寸排阻色谱(SEC)分析纯化的蛋白质。还使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Germany)和SEC-HPLC(ThermoFisher,USA)分析纯化的ACE-00分子的纯度。使用制造商提供的方案进行纯度分析。

作为对照，将编码ACE-00-VL和ACE-00-LC的DNA二次转染到HEK-293细胞中。进行SDS-PAGE以鉴定ACE-00(包含两条不同的重链样链ACE-00-VH和ACE-00-VL)和ACE-00-VL2(包含两条相同的重链样链ACE-00-VL)的装配模式的差异(图2A-2B)。

装配抗体并以四聚体H₂L₂的形式分泌，并且内质网(ER)中的质量控制机制受到诸如分子结合蛋白(BiP)和蛋白质二硫键异构酶(PDI)的ER伴侣的严格控制。已知未折叠的重链CH1结构域具有以依赖BiP方式调节抗体装配的作用。通过调节内质网相关蛋白降解(ERAD)，BiP可能在CH1和CL的异二聚体形成以及抗体组装的质量控制机制中起作用(LeeY.K.et al.BiP and immunoglobulin light chain cooperate to control the foldingof heavy chain and ensure the fidelity of immunoglobulin assembly.Mol BiolCell.1999Jul；10(7):2209-19；Feige M.J.et al.An unfolded CH1 domain controlsthe assembly and secretion of IgG antibodies.Mol Cell.2009Jun 12；34(5):569-79；Feige M.J.et al.How antibodies fold.Trends Biochem Sci.2010Apr；35(4):189-98。这些内容均通过引用全部并入本文)。研究了VH结构域和BiP之间可能的相互作用，以检查两条不同的ALiCE重链是否可以通过VH-VL的特异性相互作用形成异二聚体。克隆了CH1或VH-CH1截短的重链ΔCH1或ΔVH-CH1，并将其递送到HEK293细胞中。将野生型HC或截短的HC构建体递送至HEK293细胞。使用蛋白A珠拉下从每种转染物获得的细胞裂解液，以鉴定可以使用抗Fc-HRP(Thermo Fisher)和抗BiP-HRP(R&D System)与BiP结合的抗体结构域。

不希望受到任何特定机制或理论的束缚，获得了以下结果。通过Western blot在ΔCH1和WT-HC克隆转染的裂解物中发现了共沉淀的BiP，表明VH和BiP相互作用(图2C)。此外，在ΔVH-CH1转染的表达培养物中检测到分泌的多肽，表明BiP可以通过与重链的VH和/或CH1结构域相互作用来调节重链的装配和分泌(图2C-2E)。在该研究中还发现抗体VH结构域潜在地以依赖BiP的方式参与抗体装配(参见图2C-2E)。如图2F所示，本文提供的结合分子的重链样链，其包含两个VH区(一个在Fab区中，一个在Fv区中)，即本研究中的ACE-00-VH，有助于本文提供的结合分子在哺乳动物表达系统中的正确装配。没有这种质量控制系统，将在表达培养物中发现许多不需要的多肽链的不同组合。

KappaSelect用于ACE-00和ACE-00-VL2蛋白的亲和层析。如图2G所示，在流穿(F.T)泳道中未检测到未结合的ACE。

然后进行毛细管电泳以鉴定ACE-00-VL2和ACE-00之间的分子大小差异。在图2H中，图中每个峰的大小(左)在表(右)中示出。峰7表示ACE-00-VL/ACE-00-LC二聚体复合物，峰8表示ACE-00-VH/ACE-00-LC二聚体复合物。ACE-00的分子量比ACE-00-VL2(峰12)高出4kDa。

毛细管电泳结果还显示了ACE-00和ACE-00-VL2分子的构象。如图2I所示，大多数(几乎99％)ACE-00分子以异二聚体形式存在。然后进行毛细管等电聚焦，并证实了ACE-00-VH链和ACE-00-VL链之间的异二聚化。通过cIEF测定每一ACE-00和ACE-00-VL2的pI值。结果如图2J所示。在如图2K所示的SDS-PAGE和毛细管电泳结果证实ACE-00-VH和ACE-00-VL链之间的高效异二聚化。如图2L所示，在ACE-00尺寸排阻色谱中发现一小部分蛋白质聚合体，而大多数ACE-00呈可溶性均匀结构，这进一步证实了异二聚化的高效。

这些结果表明ACE-00被正确表达和装配。这些结果还表明，本文提供的结合分子包含两个VH区(一个在Fab区，一个在Fv区)的重链样链有助于在哺乳动物表达系统中正确提供本文提供的结合分子，并且Fv区中VH-VL相互作用是促进两条重链样链异二聚化的主要驱动力。对下文所述的其他示例性结合分子(例如ACE-05、ACE-10和ACE-11)进行了类似的检测，并得出了与这些分子相同的结论。

1.2.构建并表达ACE-02

使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)表达本文中提供的ALiCE分子ACE-02。ACE-02由抗CD19和人源化抗CD3 12F6结构域组成。ACE-02包含两条不同的重链样链(ACE-02-VH和ACE-02-VL)和两条相同的轻链(ACE-02-LC)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-02-VH的氨基酸序列：

ACE-02-VL的氨基酸序列：

ACE-02-LC的氨基酸序列(抗CD19抗体轻链)：

下表列出了靶向CD19的第一抗原结合结构域的二价Fab区和人源化12F6的第二抗原结合结构域的单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表5：ACE-02的VH、VL和CDR

编码ACE-02-VH、ACE-02-VL和ACE-02-LC的DNA序列如下所示：

ACE-02-VH的核苷酸序列：

CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTACACCAAGTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGCTTCACCATCAGCGCCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGCTGGCAGGACTACGACGTGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(SEQ ID NO:100)

ACE-02-VL的核苷酸序列：

CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTTCTGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(SEQ ID NO:101)

ACE-02-LC的核苷酸序列(抗CD19抗体轻链核苷酸序列)：

GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(SEQ ID NO:102)

如图3所示，SDS-PAGE结果显示了ACE-02、ACE-03、ACE-00和ACE-01的表达。它还显示了ACE-02和ACE-02-VL2的装配模式的差异以及ACE-03和ACE-03-VL2的装配模式的差异。ACE-01具有靶向第一抗原的抗CD19单克隆抗体的亲本抗体，和靶向第二抗原的鼠OKT3亲本抗体。这些结果表明ACE-02正确表达和装配。

1.3.构建并表达ACE-03

使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)表达本文中提供的ALiCE分子ACE-03。ACE-03由抗CD19和人源化抗CD3 OKT3结构域组成。ACE-03包含两条不同的重链样链(ACE-03-VH和ACE-03-VL)和两条相同的轻链(ACE-03-LC)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-03-VH的氨基酸序列：

ACE-03-VL的氨基酸序列：

ACE-03-LC的氨基酸序列(抗CD19抗体轻链)：

下表列出了靶向CD19的第一抗原结合结构域的二价Fab区和人源化OKT3的第二抗原结合结构域单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表6：ACE-03的VH、VL和CDR

编码ACE-03-VH、ACE-03-VL和ACE-03-LC的DNA序列如下所示：

ACE-03-VH的核苷酸序列：

CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACCGCTTCACCATCAGCACCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA(SEQ ID NO:103)

ACE-03-VL的核苷酸序列：

CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA(SEQ ID NO:104)

ACE-03-LC的核苷酸序列(抗CD19抗体轻链核苷酸序列)：

GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(SEQ ID NO:102)如图3所示，SDS-PAGE结果显示了ACE-02、ACE-03、ACE-00和ACE-01的表达。它还显示了ACE-02和ACE-02-VL2的装配模式的差异以及ACE-03和ACE-03-VL2的装配模式的差异。这些结果表明ACE-03正确表达和装配。

1.4.构建并表达ACE-04

使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)表达本文中提供的ALiCE分子ACE-04。ACE-04由抗PD-L1和嵌合OKT3 Fab结构域组成(参见图4A)。ACE-04包含两条不同的重链样链ACE-04-VH(VL-CL-VH-CH1)和ACE-04-VL(VH-CH1-VL-CL)，以及两条相同的轻链(ACE-04-LC)。所示三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-04-VH的氨基酸序列：

ACE-04-VL的氨基酸序列：

ACE-04-LC的氨基酸序列(抗PD-L1抗体轻链)：

下表列出了靶向PD-L1的第一抗原结合结构域的二价Fab区域和嵌合OKT3 Fab区域的第二抗原结合结构域的单价Fv区的VH和VL氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表7：ACE-04的VH、VL和CDR

/>

编码ACE-04-VH、ACE-04-VL和ACE-04-LC的DNA序列如下所示：

ACE-04-VH的核苷酸序列：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGAGCCGAGCTCGCCAGGCCAGGAGCCTCCGTCAAAATGTCATGCAAGGCCTCAGGGTACACATTTACGCGATATACCATGCACTGGGTGAAACAAAGACCAGGTCAGGGACTTGAATGGATCGGTTACATTAACCCCTCTAGAGGCTATACGAATTACAACCAGAAATTCAAAGACAAAGCAACACTTACGACTGACAAATCCAGTAGTACGGCTTACATGCAGCTCTCATCTTTGACTTCAGAAGACTCTGCTGTATATTATTGTGCCCGCTATTACGATGACCATTACTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGCACTACTGTTACCGTAAGTGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTTGA(SEQ ID NO:105)

ACE-04-VL的核苷酸序列：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGATCGTCCTCACTCAAAGTCCTGCTATTATGTCCGCAAGCCCTGGTGAAAAGGTTACCATGACTTGCTCCGCATCTAGTTCTGTCTCTTACATGAACTGGTACCAGCAAAAGTCTGGAACGTCCCCGAAAAGGTGGATATATGATACGAGCAAATTGGCAAGCGGAGTACCCGCGCATTTTAGGGGTTCAGGCAGCGGTACGTCATATAGCCTGACTATTAGCGGAATGGAGGCGGAGGATGCTGCAACATATTATTGCCAACAATGGTCATCAAATCCTTTTACTTTCGGCTCAGGCACAAAACTTGAAATAAATAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGcTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(SEQ ID NO:106)

ACE-04-LC(抗PD-L1抗体轻链核苷酸序列)：

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:107)如图4C所示，SDS-PAGE结果显示了ACE-04和ACE-05的表达，ACE-04和ACE-04-VL2的装配模式的差异以及ACE-05和ACE-05-VL2的装配模式的差异。结果表明ACE-04正确表达和装配。

1.5.构建并表达ACE-05

使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)表达本文中提供的另一种ALiCE分子ACE-05(由抗PD-L1和抗CD3结构域组成的结合分子；参见图4B)。ACE-05包含两条不同的重链样链(ACE-05-VH和ACE-05-VL)和两条相同的轻链(ACE-05-LC)。ACE-05在柔性肽区中包含G4S接头(氨基酸序列GGGGS，SEQ ID NO:112)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-05-VH的氨基酸序列：

ACE-05-VL的氨基酸序列：

ACE-05-LC的氨基酸序列：

下表列出了靶向PD-L1的第一抗原结合结构域的二价Fab区和靶向CD3的第二抗原结合结构域单价Fv区的VH和VL氨基酸序列及其CDR序列：

表8：ACE-05的VH、VL和CDR

/>

用ACE-05-VH、ACE-05-VL和ACE-05-LC的DNA(以0.5:0.5:1w/w的比例)进行三次转染以转染宿主细胞。编码ACE-05-VH、ACE-05-VL和ACE-05-LC的DNA序列如下所示：

ACE-05-VH的核苷酸序列：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(SEQ ID NO:20)

ACE-05-VL的核苷酸序列：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(SEQ ID NO:21)

ACE-05-LC的核苷酸序列：

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGAaccGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(SEQ ID NO:22)

如上文1.1节所述进行转染。更具体地，使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂(以DNA:PEI＝1:4(w/w)的比例使用)。转染后六到七天，当细胞存活率约为60％至70％时，终止分批培养，收集表达培养物并离心(4,800rpm，30min，4℃)以除去碎片。然后使用0.22μmTOP过滤器(Millipore,USA)过滤上清液。随后，将过滤后的包含ACE-05分子的上清液用Hitrap^TMKappaSelect(GE Healthcare,USA)进行亲和色谱纯化，然后使用Slide-A Lyzer透析盒(Thermo,USA)用pH 7.4PBS透析以进行洗脱缓冲液置换。通过SDS-PAGE、毛细管电泳和尺寸排阻色谱(SEC)分析纯化的蛋白质。本实验用HEK-293F瞬时表达系统测定其表达水平在50mg/L左右。用Hitrap^TMitrap测定其表达水平进行的纯化测定显示，在培养基中表达的大部分分子被回收。还使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Germany)和SEC-HPLC(ThermoFisher,USA)分析纯化的ACE-05分子的纯度。使用制造商提供的方案进行纯度分析。

在图4C中，SDS-PAGE结果显示了ACE-05和ACE-04的表达，ACE-05和ACE-05-VL2的装配模式的差异以及ACE-04和ACE-04-VL2的装配模式的差异。图4D示出了采用SDS-PAGE鉴定ACE-05(顶部)的装配模式的结果，并且示出了ACE-05装配中的潜在调节机制。

图4E-4F显示了鉴定ACE-05的构象以及ACE-05-VH和ACE-05-VL链之间的异二聚化效率的SDS-PAGE和毛细管电泳。图4E-4F的左图显示纯化的ACE-05的SDS-PAGE结果。图4E的左图还显示了使用KappaSelect对ACE-05和ACE-05-VL2蛋白进行亲和层析的结果。图4E-4F中四幅右图显示了几乎相同数量的ACE-05-VH和ACE-05-VL链，ACE-05-LC数量以及ACE-05-VH和ACE-05-VL链之间的高效的异二聚化。毛细管电泳结果也表明ACE-05正确表达和装配。图4G显示了进行尺寸排阻色谱法以鉴定ACE-05的纯度。如图所示，KappaSelect纯化的样品含有游离轻链。然后应用第二个凝胶过滤色谱(GFC)步骤以除去游离轻链，从而生成纯的且正确装配的ACE-05分子。如预期的那样，在SDS-PAGE图像的NR道中观察到ACE-05-VH和ACE-05-LC二聚体以及ACE-05-VL和ACE-05-LC二聚体。SDS清洁剂破坏了ACE-05-VH和ACE-05-VL之间的疏水相互作用。

图4H示出了用于ACE-05的凝胶过滤分析的尺寸排阻色谱法的结果。进行κ-选择亲和纯化后，进行凝胶过滤分析以检测ACE-05构象。通过Superdex 200A柱色谱检测到ACE-05的聚集率约为19％。图4I显示通过阳离子交换色谱法(CEX)鉴定ACE-05的结构构象的结果。分析从凝胶过滤分离的主峰，并通过CEX色谱柱分离为2个峰。较高的峰(67.87％)是装配好的ACE-05，而较低的峰(32％)是在铰链区具有游离硫醇基团的ACE-05-VH链。

1.6.构建并表达ACE-09

也使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，美国)，采用类似上节描述的方法证实ACE-09(由抗PD-L1和UCHT1结构域组成的结合分子)的正确表达和组装。ACE-09包含两条不同的重链样链(ACE-09-VH和ACE-09-VL)和两条相同的轻链(ACE-09-LC)(图5底部)。与ACE-05相比，ACE-09不包含ACE-05在柔性肽区域中包含的G4S接头(氨基酸序列GGGGS)(图5底部)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-09-VH的氨基酸序列(不含G4S接头)：

ACE-09-VL的氨基酸序列(不含G4S接头)：

ACE-09-LC的氨基酸序列(抗PD-L1抗体轻链)：

下表列出了靶向PD-L1和UCHT1的二价Fab区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表9：ACE-09的VH、VL和CDR

/>

编码ACE-09-VH、ACE-09-VL和ACE-09-LC的DNA序列如下所示：

ACE-09-VH的核苷酸序列(不含G4S接头)：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(SEQ ID NO:108)

ACE-09-VL的核苷酸序列(不含G4S接头)：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(SEQID NO:109)

ACE-09-LC的核苷酸序列(抗PD-L1抗体轻链核苷酸序列)：

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:107)

图5显示了在37℃和32℃下使用KappaSelect的ACE-09的亲和色谱的SDS-PAGE结果以及ACE-09和ACE-05的SDS-PAGE结果。结果表明ACE-09正确表达和装配。此外，ACE-09在Fab和Fv区的VH和VL与ACE-05(如表8和9所示)相同，但是ACE-09在ACE-09中不包含在抗体铰链区和第二个Fv结构域之间的G4S接头(氨基酸序列GGGGS)(图5底部)。G4S柔性接头可减少空间位阻并优化第二个Fv结构域与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)的结合，从而使得免疫细胞向靶细胞(例如癌细胞)的重定向效率提高。出乎意料的是，ACE-05和ACE-09表现出相似的表达水平，这表明G4S接头可能提供灵活性，从而有益于ALiCE分子的活性而又不影响其表达和装配。

1.7.构建并表达ACE-10

也使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)，采用类似于上文第1.1节和第1.2节中所述的方法，证实ACE-10(由抗CD20和抗CD3结构域组成的结合分子；参见图6A)的正确表达和组装。ACE-10包含两条不同的重链样链(ACE-10-VH和ACE-10-VL)和两条相同的轻链(ACE-10-LC)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-10-VH的氨基酸序列：

ACE-10-VL的氨基酸序列：

ACE-10-LC的氨基酸序列：

下表列出了靶向CD20的二价Fab区和靶向CD3的单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表10：ACE-10的VH、VL和CDR

编码ACE-10-VH、ACE-10-VL和ACE-10-LC的DNA序列如下所示：

ACE-10-VH的核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(SEQ ID NO:34)

ACE-10-VL的核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(SEQ ID NO:35)

ACE-10-LC的核苷酸序列：

CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCtGCtATCCTGAGCGCCAGCCCtGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO:36)

图6B-6C显示了ACE-10分子的表达分析。如图所示，ACE-10正确表达和装配。另外，结果表明以依赖VH-BiP方式调控ACE-10的装配。

1.8.构建并表达ACE-11

也使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)，采用类似于上文第1.1节和第1.2节中所述的方法，证实ACE-11(由抗EGFR和抗CD3结构域组成的结合分子；参见图7A)的正确表达和组装。ACE-11的整体结构与ACE-05和ACE-10相同，并包含两条不同的重链样链(ACE-11-VH和ACE-11-VL)和两条相同的轻链(ACE-11-LC)。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下所示：

ACE-11-VH的氨基酸序列：

ACE-11-VL的氨基酸序列：

ACE-11-LC的氨基酸序列：

下表列出了靶向EGFR的第一抗原结合结构域的二价Fab区和靶向CD3的第二抗原结合结构域的单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表11：ACE-11的VH、VL和CDR

编码ACE-11-VH、ACE-11-VL和ACE-11-LC的DNA序列如下所示：

ACE-11-VH的核苷酸序列：

CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(SEQ ID NO:48)

ACE-11-VL的核苷酸序列：

CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(SEQ ID NO:49)

ACE-11-LC的核苷酸序列：

GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA(SEQ ID NO:50).

图7B示出了ACE-11和ACE-11-VL2的表达和装配。箭头指示已装配的ACE-11的条带。结果表明ACE-11正确表达和装配。

1.9.构建并表达ACE-12

也使用HEK-293瞬时表达系统(Invitrogen，USA)，采用类似于上文所述的方法，证实ACE-12(由抗PD-L1和UCHT1结构域组成的结合分子)的正确表达和组装。ACE-12包含两条不同的重链样链(ACE-12-VH和ACE-12-VL)和两条相同的轻链(ACE-12-LC)。ACE-12包含具有氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:113)和GGSGGGGSG(SEQ ID NO:114)的G4S接头，而ACE-05包含在柔性肽区具有氨基酸序列GGGGS的G4S接头。所述三种类型的多肽的氨基酸序列如下：

ACE-12-VH的氨基酸序列(含有10个残基GGGGSGGGGS)：

ACE-12-VL的氨基酸序列(含有9个残基GGSGGGGSG)：

ACE-12-LC的氨基酸序列(抗PD-L1抗体轻链)：

下表列出了靶向PD-L1的第一抗原结合结构域的二价Fab区和UCHT1的第二抗原结合结构域的单价Fv区的VH和VL的氨基酸序列以及其中的CDR序列：

表12：ACE-12的VH、VL和CDR

编码CE-12-VH、ACE-12-VL和ACE-12-LC的DNA序列如下所示：

ACE-12-VH的核苷酸序列(含有10个残基GGGGSGGGGS)：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA(SEQ IDNO:110)

ACE-12-VL的核苷酸序列(含有9个残基GGSGGGGSG)：

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA(SEQ ID NO:111)

ACE-12-LC的核苷酸序列(抗PD-L1抗体轻链核苷酸序列)：

图8示出了鉴定ACE-12、ACE-05和ACE-09的装配的SDS-PAGE结果。结果表明ACE-12正确表达和装配。此外，ACE-12、ACE-05和ACE-09在Fab和Fv区具有相同的VH和VL(如表8、9和12所示)，并且其结构在抗体铰链区和第二个Fv结构域的G4S接头的长度内不同(图8底部)。G4S柔性接头可减少空间位阻并优化第二个Fv结构域与免疫细胞(例如，包括T细胞的效应细胞)的结合，从而提高免疫细胞向靶细胞(例如癌细胞)的重定向效率。出乎意料的是，ACE-12、ACE-05和ACE-09表现出相似的表达水平。不同长度的接头可提供不同程度的灵活性，从而有益于ALiCE分子的活性，而不会影响其表达和装配。

总之，以上实验说明了本文提供的示例性结合分子的成功构建和表达，并表明这些ALiCE分子可以被适当地表达和装配。

实施例2：使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析示例性结合分子的结合亲和力

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定ACE-00和ACE-00-VL2对TNFα的亲和力。Bmax是从实验结果推断出的最大结合亲和力(使用GraphPad Prism软件7中提供的曲线拟合方法计算)。如图9所示，测定亲本抗体阿达木单抗对TNFα的K_D为1.125nM；测定仅具有针对TNFα的单价结合结构域的ACE-00的K_D为30.03nM。确定由ACE-00-VL同型二聚体组成的ACE-00-VL2对TNFα没有亲和力。

使用ELISA测定ACE-05和对照抗体对每种抗原(例如，ACE-05的PD-L1和CD3)的亲和力。更具体地，诸如人PD-L1(Y-Biologics,Inc.制造的YBL-007)和CD3(SinoBiological)的抗原以1至10μg/ml(100至1000ng/孔)的浓度固定在免疫板上(Thermoscientific,USA)，在4℃下使用pH 7.4PBS作为包被缓冲液过夜。第二天，将板用200μlPBST洗涤一次，然后在室温下用5％脱脂奶进行表面封闭1-2小时。随后，在每个孔中用200μl PBST洗涤两次后，将ACE-05和对照抗体以1/2到1/5的比例稀释，并在室温下反应1-2小时。然后将每个孔用200μl PBST洗涤3次，以除去未结合的样品。将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗人IgG(Fab特异性)抗体(Sigma,USA)以1:1000的比例添加至孔中，在室温下反应。用200μl PBST洗涤3次后，使用TMB溶液(Gehealthcare,USA)以100μl/孔的体积诱导HRP显色。通过使用终止液(2.5M H₂SO₄，100μl/孔)终止反应。使用分光光度计测量在A450波长处的吸光度，以计算结合亲和力。GraphPad Prism软件7用于分析ACE-05和其他对照抗体与其各自靶标的亲和力。结果如图10A、10B和10C所示。

使用上述类似方法测定ACE-09、ACE-05和对照抗体对CD3的亲和力。如图11所示，ACE-09显示出与ACE-05相似的结合亲和力水平。

实施例3：使用表面等离子体共振(SPR)分析ACE-05的结合动力学

使用表面等离子体共振(SPR)分析来测定ACE-05与人PD-L1和CD3的结合动力学。使用系统(ForteBio,USA)通过使用针对人PD-L1的抗人IgG捕获(AHC)生物传感器(ForteBio,USA)和针对CD3εδ链的胺反应性(ARG2)生物传感器进行无标记动力学(蛋白质-蛋白质相互作用)的测定。将PD-L1和CD3εδ固定在其各自的生物传感器表面上，然后与已经用不同浓度的动力学缓冲液稀释的ACE-05反应。随时收集传感图。用于制备ACE-05的亲本抗体(即抗hPD-L1抗体(YBL-007，使用本领域已知的常规方法在内部生产)和抗CD3抗体(UCHT1，得自BioLegend，USA))在本实验中测试并与ACE-05进行了比较。如图12A-12C所示，ACE-05与人PD-L1的结合动力学与亲本抗PD-L1抗体(即，Y-Biologics,Inc.的YBL-007)相当，并且K_D小于1.09×10^-11(参见图12A-12C)。相比之下，正如预期的那样，ACE-05与CD3的结合亲和力比亲代抗CD3抗体(BioLegend的UCHT1,USA)低得多，测定K_D为6.82×10^-9(见图5C)。如图12A-12C所示，还将ACE-05的结合动力学与双特异性T细胞衔接子(BiTE)，即BiTE-05进行了比较。BiTE是一种现有的双特异性抗体技术，可在约55道尔顿的单条肽链上产生由两个不同抗体的单链可变片段(scFv)或来自四个不同基因的氨基酸序列组成的融合蛋白。BiTE技术的更详细描述可以在例如Huehls et al.,Immunol Cell Biol.,2015,93(3):290-296；Baeuerle et al.,Drug Discovery Today,2005,10:1237-1244；和Kufer etal.,Trends in Biotechnology,2004,22(5):238-244中找到。事实证明，ACE-05对人PD-L1的亲和力高于BiTE-05。另一方面，证实ACE-05对CD3的亲和力低于BiTE-05，因此预期其细胞毒性比BiTE-05小。

在图12D中，使用无标记动力学系统(ForteBio,USA)检测ACE-05与hPD-L1和hCD3的同时结合。作为配体，制备了组氨酸标记的重组配体蛋白(例如，hPD-L1-his、hCD3εδ-his)和Fc标记的重组配体蛋白(例如，hPD-L1-Fc、hCD3εδ-Fc)。为了在生物传感器芯片上捕获(固定)第一抗原，使用了组氨酸捕获NTA芯片(ForteBio,USA)。在NTA芯片上完全捕获第一个配体后，分析用动力学缓冲液稀释的ACE-05。随后，分析也在动力学缓冲液中稀释的第二配体，以评价ACE-05与第二配体的同时结合。

实施例4：T细胞重定向(活性)和T细胞细胞毒性

检测了ACE-05对重定向和激活T细胞的活性。在T细胞重定向(活性)测定中，产生稳定表达PD-L1的HEK293E-PD-L1细胞系用作抗原供体。被工程化以包含NFAT荧光素酶报告系统的CD3阳性Jurkat细胞系用作效应细胞(Jurkat荧光素酶报告细胞，使用本领域已知的常规方法在内部产生)。

然后将FACS分析用于测定上述细胞系中的PD-L1和CD3表达水平。HEK293E-PD-L1细胞和亲本HEK293E细胞中的PD-L1表达水平如图13A(右图)所示。通过各种CD3抗体测定的Jurkat荧光素酶报道细胞中的CD3表达水平如图13A(左图)所示。

T细胞重定向(活性)测定如下进行：将HEK293E细胞和HEK293E-PD-L1细胞(7×10⁴细胞/孔)接种在包被有聚-L-赖氨酸(Sigma)的白色底板上并孵育24小时。第二天，用系列稀释的ACE-05、UCHT1(BioLegend,USA的亲本抗CD3抗体)和对照分子稀释Jurkat荧光素酶报告细胞(1.4×10⁵细胞/孔)，然后在37℃下孵育7小时。进行Bio-Glo荧光素酶测定(Promega,USA)以检测Jurkat活化的程度。对于ACE-05，为测定PD-1/PD-L1相互作用阻断和PD-L1靶向T细胞重定向的协同作用，使用PD-1/PD-L1阻断生物测定试剂盒(Promega,USA)进行了PD-1/PD-L1阻断试验。使用GraphPad Prism 7软件处理和分析数据。

如图13B所示，当使用表达PD-L1的靶细胞(HEK293E-PD-L1细胞)时，ACE-05能够激活效应T细胞(Jurkat荧光素酶报告细胞)。而当使用不表达PD-L1(HEK293E)的靶细胞时，效应T细胞不能被ACE-05有效激活。这些结果表明ACE-05证实了依赖靶细胞的T细胞活化。在这项研究中，还将ACE-05与BiTE-05进行了比较。如图13B所示，在存在PD-L1的情况下，ACE-05表现出比BiTE-05更有效的T细胞活化。然而，在不存在PD-L1的情况下，在BiTE-05存在下的T细胞活化高于ACE-05。因此，BiTE-05显示出比ACE-05高的不依赖细胞的T细胞活化。

图13C与图13B中分别绘制有或没有PD-L1的ACE-05(左图)和BiTE-05(右图)的数据相同，表明ACE-05介导的T细胞活化的动态范围比BiTE-05介导的T细胞活化高得多(由垂直虚线箭头指示)，这与图13B的观察一致。图13D-13E使用图13C中呈现的相同数据，仅显示ACE-05和BiTE-05的靶标介导的(表达PD-L1的HEK)T细胞活化。

针对癌症的T细胞应答在癌症免疫周期中变化。使用具有或不具有PD-1表达的HCC827 PD-L1阳性非小细胞肺癌(NSCLC)和Jurkat荧光素酶报告基因细胞来测定针对癌症的T细胞反应。在图13F中，T细胞的启动阶段和激活阶段表示为Jurkat-PD-1[-]，而T细胞的静息和耐受阶段表示为Jurkat-PD-1[+]。如图所示，结果表明，在T细胞的两个发育阶段中，ACE-05的抗癌作用均有望远高于BiTE-05。

为了鉴定来自阻断PD-1/PD-L1相互作用和PD-L1靶向的T细胞重定向的协同作用，使用PD-1/PD-L1阻断生物测定试剂盒(Promega,USA)来测定ACE-05的生物学能力。通过遵循制造商提供的方案进行PD-1/PD-L1阻断测定。PD-1/PD-L1阻断测定的结果如图13G所示，表明ACE-05可以阻断PD-1/PD-L1相互作用以及T细胞重定向。图13H进一步表明，当与BiTE-05并列比较时，ACE-05显示出最高的T细胞活化信号，这是由于同时的PD-L1阻滞和T细胞改向的协同作用。YBL-007是抗PD-L1抗体，UCHT1是抗CD3抗体。

另外，如图13I所示，ACE-05显示出比抗CD3抗体少的不依赖靶标的T细胞活化。与亲本抗CD3抗体相比，该结果与观察到的ACE-05对CD3的较低亲和力一致。因此，这些结果表明，ACE-05将比抗CD3抗体表现出更少的细胞毒性，因为单独的单价抗CD3结构域不足以激活T细胞。图13J显示了来自并列比较ACE-05和BiTE-05的相同测定的数据，表明在没有PD-L1靶标的情况下BiTE-05显示出最高的T细胞活化信号，因为BiTE-05对CD3的亲和力高得多。与ACE-05相比，意味着更高的细胞毒性。

使用LDH(乳酸脱氢酶)测定法测定ACE-05介导的T细胞的细胞毒性。将来自健康供体的PBMC用作效应细胞，并将具有过表达的PD-L1的HCC827非小细胞肺癌细胞(ATCC)用作靶细胞。通过LDH测定系统测量从死亡肿瘤细胞释放的LDH，并在ACE-05存在的情况下测试不同比例的T:E(靶标:效应子)(图13K)。此外，ACE-05显示出针对与从健康供体分离的PBMC共孵育的HCC827细胞(PD-L1阳性)的剂量依赖性肿瘤杀伤能力(图13L)。图13M显示了在ACE-05或YBL-007存在的情况下与PBMC直接接触时，T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在24小时内，在有ACE-05的情况下杀死了目标HCC827癌细胞，而在没有处理或YBL-007存在的情况下，靶标HCC827细胞却在生长。

由活化的白细胞释放的免疫细胞因子的水平可以反映与脱靶T细胞活化有关的不良事件。因此，使用IL-2或IFN-γ测定试剂盒(BioLegend,USA)，在来自健康供体和HCC827细胞的共培养的PBMC中，监测ACE-05或BiTE-05存在时的IL-2和INF-γ水平。在ACE-05存在的情况下观察到的IL-2水平低于BiTE-5，这表明ACE-05不太可能产生活性CD3+T细胞，而CD3+T细胞是IL-2分泌的主要来源。因此，与BiTE-05相比，ACE-05可以诱导更少的脱靶活化T细胞。另外，ACE-05和BiTE-05的存在导致NKT或NK细胞释放相似水平的INF-γ(图13N)。

使用具有CFX 96TM ORM系统(BioRad,USA)的C1000热循环仪评估ACE-05的热力学稳定性。将3μM结合分子与10μl 1/25稀释的CYPRO橙色蛋白染色剂(Invitrogen,USA)混合，然后将50μl的混合物在25℃温育30分钟。通过从室温以1℃/min的速度加热样品至99℃使样品变性。记录CYPRO染色的变性蛋白的量，并通过CFX Manager软件计算解链温度(TM)。如图13O所示，ACE-05比BiTE-05具有更高的热力学稳定性。

进行T细胞重定向测定以确定经由靶向CD20的ACE-10介导的T细胞活化。CD20阳性Raji细胞用作抗原供体靶细胞，而Karpas-299细胞用作CD20阴性对照。显示ACE-10比BiTE-10更有效的活化T细胞。CD20阳性Raji细胞中的结果与CD20阴性Karpas-299细胞中的结果的比较表明，T细胞的活化取决于靶细胞中CD20的表达(见图14A-14B)。

还使用LDH测定法测定ACE-11介导的T细胞的细胞毒性。来自健康供体的PBMC用作效应细胞，而EGFR阳性的SW48、HT29和HCT116结肠癌细胞被用作靶细胞。通过LDH测定系统测定从死亡的肿瘤细胞释放的LDH。HT29和HCT116癌细胞具有Ras和Raf突变，可导致生长信号持续激活。ACE-11在所有三种癌细胞系中均显示出细胞毒性。结果如图15所示。

实施例5：在Sprague-Dawley(SD)大鼠中的药代动力学研究

在SD大鼠中进行了ACE-05和对照抗体的药代动力学研究。该研究得到机构动物护理和使用委员会的批准(批准号：QBSIACUC-A17099)。

SD大鼠通过尾静脉接受单次静脉内剂量的10mg/kg ACE-05或对照抗体(YBL007或奥维单抗)(n＝3只雄性大鼠/组)。在施用ACE-05或对照抗体后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、3天、5天和9天的流动时间点，从每只动物收集总共500μl血清。将样品以10,000-13,000rpm离心2分钟，并从每个样品中分离出70μl血浆，并在-80℃下保存直至进一步分析。通过ELISA确定每个样品的浓度。用PD-L1(由Y-Biologics，Inc.生产)包被96孔免疫板(Thermo Scientific,USA)。将以1:1000、1:4000或1:8000稀释的大鼠血浆样品添加到孔中。用结合了HRP的抗人IgG(Fab特异性)(Sigma,USA)检测结合的样品。这些孔是由TMB基板(Sigma,USA)根据制造商的规程按1:500的比例开发的。然后测量A450。通过使用已知浓度的样品蛋白与标准曲线比较，确定ACE-05和对照抗体的浓度。通过BA Calc2007软件分析观察数据。药代动力学研究结果如图16A所示。如图所示，测得的ACE-05的半衰期为10.113小时。但是，ACE-05的实际半衰期很可能比10小时长得多，因为在此实验中测定了亲本抗体的半衰期分别为98和73小时，比这类抗体的典型半衰期(7或10天)要短得多。如图16B所示，ACE-05的半衰期比BiTE-05更长，表明ACE-05的血浆稳定性高于BiTE。

实施例6：ACE-05在治疗人非小细胞肺癌中的有效性评价

在NCG小鼠(CrownBio,USA)中评估了ACE-05在治疗人非小细胞肺癌中的作用并将其与使用HCC827细胞系的其他抗体进行比较。该研究的设计如下表所示：

表13：研究设计

标注：N：动物编号；*将使用2个供体，n＝5/组

给药量：基于体重调整给药量(5μL/g)

处理方法可改动每体重减小或其他副作用根据预设的规则和/或客户要求。

图17A-17F显示了在人源化小鼠模型中的HCC827(PD-L1阳性肿瘤)异种移植研究的结果。选择6-8周龄的雌性NCG小鼠进行PBMC重构(reconstitution)。如表13所示，有4个研究组(10只小鼠/组)和2个PBMC供体(5只小鼠/供体)。肿瘤接种后4天(TV大小＝50mm³)用ACE-05、BiTE-05、IgG和YBL-007处理测试物品，并在肿瘤接种前几天重构从每个供体分离的PBMC。在第4天、第6天、第8天注射ACE-05和BiTE-05(共3次)。在第4天、第7天和第10天注射IgG和YBL-007(共3次)。在这项研究的第12天，ACE-05治疗后10只小鼠中有9只的肿瘤完全消失。BiTE治疗组的体重下降(BWL)(％)远高于ACE-05治疗组。由于这项研究中超过20％的BWL，BiTE治疗组的10只小鼠中有3只被终止。结果表明，ACE-05可有效治疗观察到的肺癌，并且还表明ACE-05的安全性高于使用BiTE技术生成的双特异性抗体BiTE-05。

实施例7：ACE-05和BiTE-05的抗癌作用的剂量限制研究

为了找到ACE-05的有效剂量，在HCC827人源化异种移植模型中进行了剂量限制研究(图18A-18D)。选择6-8周龄的NCG雌性小鼠(CrownBio,USA)用于PBMC重构人源化，并分成14个研究组(6只小鼠/组)。在分组和治疗之前，将所有动物称重并使用卡尺测量肿瘤体积。由于肿瘤体积会影响任何给定治疗的有效性，因此将肿瘤体积用作数值参数，将选定的动物随机分为指定的组。通过使用StudyDirector^TM软件(Studylog Systems,USA)进行分组。选择“匹配分布”随机化方法进行组分配，显示出肿瘤体积的最小组间差异。

接种肿瘤细胞前3天，通过静脉内植入来自2个供体的人PBMC。每只小鼠在右侧腹皮下接种在0.1ml PBS中的HCC827肿瘤细胞(5×10⁶)，以进行肿瘤进展。在HCC827接种后第4天，处理了从0.5mpk(mg/kg)到0.0005mpk(0.5、0.1、0.05、0.005和0.0005mpk)的五种不同浓度的ACE-05和BiTE-05。每3天施用一次待测物质，例如第4天、第7天、第10天和第13天(Q3d，共4剂)，如图18A3中x轴上方的4个垂直箭头所示。

在最初施用测试分子后每2或3天对肿瘤尺寸(图18A-18C)和体重(图18D)进行评分。图18A中将肿瘤体积的平均值(SEM)的标准误差和每组的体重变化相对于时间分别作图。图18B-18C显示了在分别用ACE-05和BiTE-05治疗的每个剂量组中单个小鼠的抗肿瘤作用。BiTE-05治疗组在第15天终止了四只小鼠，而ACE-05治疗组仅终止了1只小鼠。与用BiTE-05治疗的组(图18C)相比，在用0.5mpk、0.1mpk和0.05mpk的ACE-05治疗的大多数动物中，肿瘤完全消失(图18B)。

表14总结了ACE-05和BiTe-05的抗肿瘤活性。显示了第15天的平均肿瘤体积(TV)和平均值的标准误差。肿瘤生长抑制百分比(TGI％)是测试组和对照组的平均肿瘤体积之间的差异，其计算公式如下：TGI(％)＝(对照组的平均TV-治疗的平均TV)/对照×100。使用以下公式计算T/C(％)：T/C(％)＝处理后的平均TV/对照的平均TV×100。结果表明，ACE-05比BiTE-05在一定浓度范围内更有效治疗观察到的肺癌。

表14：ACE-05和BiTE-05的抗肿瘤活性

根据前述内容，将理解的是，尽管在此出于说明的目的描述了特定实施例，但是可以在不脱离本文所提供内容的精神和范围的情况下进行各种修改。上述所有参考文献均通过引用全文并入本文。

SEQUENCE LISTING

<110> Y生物股份有限公司

<120> 细胞接合的结合分子

<130> P20115461WP

<150> US 16/372,196

<151> 2019-04-01

<150> US 16/372,190

<151> 2019-04-01

<150> US 16/372,172

<151> 2019-04-01

<150> US 62/719,484

<151> 2018-08-17

<150> US 62/655,762

<151> 2018-04-10

<160> 129

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-VH氨基酸序列

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Ser

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-VL氨基酸序列

<400> 2

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

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Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

245 250 255

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260 265 270

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290 295 300

Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

325 330 335

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

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Ile Lys Arg

355

<210> 3

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-LC氨基酸序列

<400> 3

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

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<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和ACE-12的VH的Fab区 (PD-L1)

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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和 ACE-12的CDR H1的Fab区 (PD-L1)

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和 ACE-12的CDR H2的Fab区 (PD-L1)

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<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和 ACE-12的CDR H3的Fab区 (PD-L1)

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<213> Artificial Sequence

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<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和 ACE-12的VL的Fab区 (PD-L1)

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Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<213> Artificial Sequence

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<223> ACE-04、ACE-05、ACE-09、和 ACE-12的CDR L3的Fab区 (PD-L1)

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Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

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35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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<212> PRT

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<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR H1 的Fv 区 (CD3)

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<211> 10

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR H2 的Fv 区 (CD3)

<400> 14

Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR H3 的Fv 区 (CD3)

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的VL 的Fv 区 (CD3)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR L1 的Fv 区 (CD3)

<400> 17

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR L2 的Fv 区 (CD3)

<400> 18

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05、ACE-09、ACE-10、ACE-11、和ACE-12的 CDR L3 的Fv 区 (CD3)

<400> 19

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 20

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-VH核苷酸序列

<400> 20

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

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tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780

cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840

atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900

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caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110

<210> 21

<211> 1068

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-VL核苷酸序列

<400> 21

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

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atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780

tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840

aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900

ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960

accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020

cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068

<210> 22

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-LC核苷酸序列

<400> 22

cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120

cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657

<210> 23

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-VH氨基酸序列

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

245 250 255

Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His

275 280 285

Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val

290 295 300

Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu

325 330 335

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser

340 345 350

Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe

355 360 365

Ser

<210> 24

<211> 355

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-VL氨基酸序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

260 265 270

Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

275 280 285

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

290 295 300

Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

325 330 335

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

340 345 350

Ile Lys Arg

355

<210> 25

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-LC氨基酸序列

<400> 25

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的VH的Fab区 (CD20)

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR H1的Fab区 (CD20)

<400> 27

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR H2的Fab区 (CD20)

<400> 28

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR H3的Fab区 (CD20)

<400> 29

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的VL的Fab区 (CD20)

<400> 30

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR L1的Fab区 (CD20)

<400> 31

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR L2的Fab区 (CD20)

<400> 32

Ala Thr Ser

1

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10的CDR L3的Fab区 (CD20)

<400> 33

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 34

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-VH核苷酸序列

<400> 34

caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120

cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300

tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360

gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780

cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840

atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900

tacaaaggtg ttagtaccta caaccagaag ttcaaggaca aggccacact gactgtagac 960

aagtcatcca gcacagccta catggaactc ctcagtctga catctgagga ctctgcagtc 1020

tattactgtg caagatcggg gtactacggt gatagtgact ggtacttcga tgtctggggc 1080

caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110

<210> 35

<211> 1068

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-VL核苷酸序列

<400> 35

caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120

cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300

tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360

gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780

tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840

aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900

ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960

accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020

cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068

<210> 36

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-10-LC核苷酸序列

<400> 36

cagatcgtgc tgagccagag ccctgctatc ctgagcgcca gccctggcga gaaggtgacc 60

atgacctgcc gcgccagcag cagcgtgagc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120

agcagcccca agccctggat ctacgccacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgtgcgc 180

ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagagt ggaggctgag 240

gacgccgcta cctactactg ccagcagtgg accagcaacc cccccacctt cggcggcggc 300

accaagctgg agatcaagag aaccgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642

<210> 37

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-VH 氨基酸序列

<400> 37

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

245 250 255

Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

260 265 270

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

275 280 285

Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr

290 295 300

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

305 310 315 320

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

325 330 335

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp

340 345 350

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

355 360 365

<210> 38

<211> 353

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-VL氨基酸序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

260 265 270

Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

275 280 285

Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

290 295 300

Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

305 310 315 320

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

325 330 335

Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

340 345 350

Arg

<210> 39

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-LC氨基酸序列

<400> 39

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 40

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的VH的Fab区 (CD20)

<400> 40

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR H1的Fab区 (CD20)

<400> 41

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR H2的Fab区 (CD20)

<400> 42

Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR H3的Fab区 (CD20)

<400> 43

Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的VL的Fab区 (CD20)

<400> 44

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 45

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR L1的Fab区 (CD20)

<400> 45

Gln Ser Ile Gly Thr Asn

1 5

<210> 46

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR L2的Fab区 (CD20)

<400> 46

Tyr Ala Ser

1

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11的CDR L3的Fab区 (CD20)

<400> 47

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 48

<211> 1104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-VH核苷酸序列

<400> 48

caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60

acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120

ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180

accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240

aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300

tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

ggcggaggtg ggagtgaggt gcagctccag cagtctggac ctgagctggt gaagcctgga 780

ccttcaatga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 840

tgggtgaagc agagtcatgg aaagaacctt gagtggatgg gacttattaa tccttacaaa 900

ggtgttagta cctacaacca gaagttcaag gacaaggcca cactgactgt agacaagtca 960

tccagcacag cctacatgga actcctcagt ctgacatctg aggactctgc agtctattac 1020

tgtgcaagat cggggtacta cggtgatagt gactggtact tcgatgtctg gggccagggg 1080

accacgctga ccgtcttctc ataa 1104

<210> 49

<211> 1062

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-VL核苷酸序列

<400> 49

caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60

acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120

ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180

accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240

aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300

tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

ggcggaggtg ggagtgacat ccagatgacc cagaccacct cctccctgtc tgcctccctg 780

ggcgacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagaaatta tttaaactgg 840

tatcaacaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct actacacatc aagattacac 900

tcaggagtcc catcaaagtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc tctcaccatt 960

agcaacctgg agcaagagga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg 1020

tggacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaacggt aa 1062

<210> 50

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-11-LC核苷酸序列

<400> 50

gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60

ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120

aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180

cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240

gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300

ggcaccaaac tggaactgaa aagaaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645

<210> 51

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的VH的Fab区 (Her2)

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的VL的Fab区 (Her2)

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的VH的Fv区 (TNFα)

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的VL的Fv区 (TNFα)

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG1的核心铰链区序列

<400> 55

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 56

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG2的核心铰链区序列

<400> 56

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 57

<211> 61

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG3的核心铰链区序列

<400> 57

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

20 25 30

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 58

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG4的核心铰链区序列

<400> 58

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 59

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Fab区的代表性CL区

<400> 59

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 60

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Fab区的代表性CH1区

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 61

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的VH的Fab区 (CD19)

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR H1的Fab区 (CD19)

<400> 62

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR H2的Fab区 (CD19)

<400> 63

Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR H3的Fab区 (CD19)

<400> 64

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的VL的Fab区 (CD19)

<400> 65

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR L1的Fab区 (CD19)

<400> 66

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR L2的Fab区 (CD19)

<400> 67

Asp Ala Ser

1

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02、和ACE-03的CDR L3的Fab区 (CD19)

<400> 68

Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 69

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的VH的Fv区 (CD3)

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR H1的Fv区 (CD3)

<400> 70

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR H2的Fv区 (CD3)

<400> 71

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 72

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR H3的Fv区 (CD3)

<400> 72

Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的VL的Fv区 (CD3)

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

100 105

<210> 74

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR L1的Fv区 (CD3)

<400> 74

Ser Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 75

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR L2的Fv区 (CD3)

<400> 75

Ala Thr Ser

1

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02的CDR L3的Fv区 (CD3)

<400> 76

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 77

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03的VH的Fv区 (CD3)

<400> 77

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR H1的Fv区 (CD3)

<400> 78

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR H2的Fv区 (CD3)

<400> 79

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr

1 5

<210> 80

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR H3的Fv区 (CD3)

<400> 80

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 81

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03的VL的Fv区 (CD3)

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

100 105

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR L1的Fv区 (CD3)

<400> 82

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 83

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR L2的Fv区 (CD3)

<400> 83

Asp Thr Ser

1

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的CDR L3的Fv区 (CD3)

<400> 84

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 85

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03、和ACE-04的VH的Fv区 (CD3)

<400> 85

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 86

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04的VL的Fv区 (CD3)

<400> 86

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg

100 105

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<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04的CDR L3的Fv区 (CD3)

<400> 87

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

1 5

<210> 88

<211> 364

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-VH氨基酸序列

<400> 88

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val

245 250 255

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

260 265 270

Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

275 280 285

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys

290 295 300

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

325 330 335

Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp

340 345 350

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 89

<211> 352

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-VL氨基酸序列

<400> 89

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro

275 280 285

Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

290 295 300

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

325 330 335

Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

340 345 350

<210> 90

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-LC、ACE-03-LC (抗CD19抗体轻链)

<400> 90

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 91

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03-VH氨基酸序列

<400> 91

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val

245 250 255

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

260 265 270

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

275 280 285

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

290 295 300

Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys

305 310 315 320

Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

325 330 335

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

340 345 350

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 92

<211> 352

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03-VL氨基酸序列

<400> 92

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro

275 280 285

Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

290 295 300

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

325 330 335

Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

340 345 350

<210> 93

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-VH氨基酸序列

<400> 93

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala

245 250 255

Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro

275 280 285

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr

290 295 300

Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

325 330 335

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys

340 345 350

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

355 360 365

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

370 375 380

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

405 410 415

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

420 425 430

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

435 440 445

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

450 455 460

Glu Pro Lys Ser Cys

465

<210> 94

<211> 460

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-VL氨基酸序列

<400> 94

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

245 250 255

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala

260 265 270

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

275 280 285

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

290 295 300

Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

305 310 315 320

Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

325 330 335

Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

340 345 350

Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

355 360 365

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

370 375 380

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

385 390 395 400

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

405 410 415

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

420 425 430

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

435 440 445

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

450 455 460

<210> 95

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-LC、ACE-09-LC、和ACE-12-LC (抗PD-L1抗体轻链)

<400> 95

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

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Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 96

<211> 364

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-09-VH氨基酸序列 (无G4S接头)

<400> 96

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

245 250 255

Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

260 265 270

Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu

275 280 285

Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln

290 295 300

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

305 310 315 320

Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

325 330 335

Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp

340 345 350

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

355 360

<210> 97

<211> 350

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-09-VL氨基酸序列 (无G4S接头)

<400> 97

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

245 250 255

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg

260 265 270

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

275 280 285

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe

290 295 300

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

305 310 315 320

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

325 330 335

Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

340 345 350

<210> 98

<211> 374

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VH氨基酸序列 (10个残基)

<400> 98

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

245 250 255

Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile

260 265 270

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp

275 280 285

Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn

290 295 300

Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala

305 310 315 320

Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu

325 330 335

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly

340 345 350

Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

355 360 365

Thr Leu Thr Val Phe Ser

370

<210> 99

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VL氨基酸序列 (9个残基)

<400> 99

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr

245 250 255

Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile

260 265 270

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

275 280 285

Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg

290 295 300

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

305 310 315 320

Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

325 330 335

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly

340 345 350

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

355

<210> 100

<211> 1095

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-VH核苷酸序列

<400> 100

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccgcaggt gcagctggtg cagagcggcg gcggcgtggt gcagcccggc 780

cgcagcctgc gcctgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccagcta caccatgcac 840

tgggtgcgcc aggcccccgg caagggcctg gagtggatcg gctacatcaa ccccagcagc 900

ggctacacca agtacaacca gaagttcaag gaccgcttca ccatcagcgc cgacaagagc 960

aagagcaccg ccttcctgca gatggacagc ctgcgccccg aggacaccgg cgtgtacttc 1020

tgcgcccgct ggcaggacta cgacgtgtac ttcgactact ggggccaggg cacccccgtg 1080

accgtgagca gctaa 1095

<210> 101

<211> 1059

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-VL核苷酸序列

<400> 101

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780

ggcgaccgcg tgaccatgac ctgccgcgcc agcagcagcg tgagctacat gcactggtac 840

cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagccc tggatctacg ccaccagcaa cctggccagc 900

ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacaccct gaccatcagc 960

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccccc 1020

accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059

<210> 102

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-02-LC、和ACE-03-LC (抗CD19抗体轻链核苷酸序列)

<400> 102

gatattcaac tcacgcaatc tccagcaagt ctcgcagtta gtttggggca gcgagctaca 60

ataagttgca aggcgagcca atccgtggat tatgatggag acagctatct taactggtat 120

cagcaaattc caggccagcc acccaagttg ctgatctacg acgcgtcaaa cctggtctca 180

gggatccctc caagatttag cggctcaggt tcaggtacgg attttacgct caatatccat 240

cctgtagaga aggttgatgc agctacatac cactgtcaac agagtaccga ggatccttgg 300

accttcggag gcggtacaaa gctggagatc aagagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657

<210> 103

<211> 1092

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03-VH核苷酸序列

<400> 103

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggtgca gctggtgcag agcggcggcg gcgtggtgca gcccggccgc 780

agcctgcgcc tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca cccgctacac catgcactgg 840

gtgcgccagg cccccggcaa gggcctggag tggatcggct acatcaaccc cagccgcggc 900

tacaccaact acaaccagaa ggtgaaggac cgcttcacca tcagcaccga caagagcaag 960

agcaccgcct tcctgcagat ggacagcctg cgccccgagg acaccgccgt gtactactgc 1020

gcccgctact acgacgacca ctactgcctg gactactggg gccagggcac ccccgtgacc 1080

gtgagcagct aa 1092

<210> 104

<211> 1059

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-03-VL 核苷酸序列

<400> 104

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780

ggcgaccgcg tgaccatcac ctgcagcgcc agcagcagcg tgagctacat gaactggtac 840

cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagcgc tggatctacg acaccagcaa gctggccagc 900

ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacacctt caccatcagc 960

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccttc 1020

accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059

<210> 105

<211> 1410

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-VH核苷酸序列

<400> 105

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tcaggtccag ttgcaacagt ctggagccga gctcgccagg 780

ccaggagcct ccgtcaaaat gtcatgcaag gcctcagggt acacatttac gcgatatacc 840

atgcactggg tgaaacaaag accaggtcag ggacttgaat ggatcggtta cattaacccc 900

tctagaggct atacgaatta caaccagaaa ttcaaagaca aagcaacact tacgactgac 960

aaatccagta gtacggctta catgcagctc tcatctttga cttcagaaga ctctgctgta 1020

tattattgtg cccgctatta cgatgaccat tactgccttg attactgggg ccagggcact 1080

actgttaccg taagtgcggc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 1140

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 1200

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 1260

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 1320

agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 1380

gacaagagag ttgagcccaa atcttgttga 1410

<210> 106

<211> 1383

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-VL核苷酸序列

<400> 106

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tcagatcgtc ctcactcaaa gtcctgctat tatgtccgca 780

agccctggtg aaaaggttac catgacttgc tccgcatcta gttctgtctc ttacatgaac 840

tggtaccagc aaaagtctgg aacgtccccg aaaaggtgga tatatgatac gagcaaattg 900

gcaagcggag tacccgcgca ttttaggggt tcaggcagcg gtacgtcata tagcctgact 960

attagcggaa tggaggcgga ggatgctgca acatattatt gccaacaatg gtcatcaaat 1020

ccttttactt tcggctcagg cacaaaactt gaaataaata gaaccgtggc tgcaccatct 1080

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 1140

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 1200

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 1260

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 1320

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1380

taa 1383

<210> 107

<211> 657

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-04-LC、ACE-09-LC、ACE-12-LC (抗PD-L1抗体轻链核苷酸序列)

<400> 107

cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120

cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagatctg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657

<210> 108

<211> 1095

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-09-VH 核苷酸序列(无G4S接头)

<400> 108

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccggagg tgcagctcca gcagtctgga cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg 780

aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag 840

cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg ggacttatta atccttacaa aggtgttagt 900

acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc acactgactg tagacaagtc atccagcaca 960

gcctacatgg aactcctcag tctgacatct gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga 1020

tcggggtact acggtgatag tgactggtac ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg 1080

accgtcttct cataa 1095

<210> 109

<211> 1053

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-09-VL核苷酸序列(无G4S接头)

<400> 109

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccggaca tccagatgac ccagaccacc tcctccctgt ctgcctccct gggcgacaga 780

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagaaatt atttaaactg gtatcaacag 840

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc 900

ccatcaaagt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 960

gagcaagagg atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtggacgttc 1020

gctggaggca ccaagctgga aatcaaacgg taa 1053

<210> 110

<211> 1125

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VH核苷酸序列 (10个残基)

<400> 110

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tggaggcgga ggatctgagg tgcagctcca gcagtctgga 780

cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg aagatatcct gcaaggcttc tggttactca 840

ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg 900

ggacttatta atccttacaa aggtgttagt acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc 960

acactgactg tagacaagtc atccagcaca gcctacatgg aactcctcag tctgacatct 1020

gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tcggggtact acggtgatag tgactggtac 1080

ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg accgtcttct cataa 1125

<210> 111

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VL 核苷酸序列 (9个残基)

<400> 111

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gatccggcgg aggcggcagc ggagacatcc agatgaccca gaccacctcc 780

tccctgtctg cctccctggg cgacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt 840

agaaattatt taaactggta tcaacagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac 900

tacacatcaa gattacactc aggagtccca tcaaagttca gtggcagtgg gtctggaaca 960

gattattctc tcaccattag caacctggag caagaggata ttgccactta cttttgccaa 1020

cagggtaata cgcttccgtg gacgttcgct ggaggcacca agctggaaat caaacggtaa 1080

<210> 112

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-05-VH和ACE-05-VL的接头

<400> 112

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VH的接头

<400> 113

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-12-VL的接头

<400> 114

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 115

<211> 362

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00-VH氨基酸序列

<400> 115

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

245 250 255

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

260 265 270

Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

275 280 285

Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser

290 295 300

Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

305 310 315 320

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

325 330 335

Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp

340 345 350

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 116

<211> 349

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00-VL氨基酸序列

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

245 250 255

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn

260 265 270

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

275 280 285

Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

290 295 300

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

305 310 315 320

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro

325 330 335

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

340 345

<210> 117

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00-LC 氨基酸序列 (抗CD19抗体轻链)

<400> 117

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 118

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H1 的Fab区 (抗Her2)

<400> 118

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H2 的Fab区 (抗Her2)

<400> 119

Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 120

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H3 的Fab区 (抗Her2)

<400> 120

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 121

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L1 的Fab区 (抗Her2)

<400> 121

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 122

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L2 的Fab区 (抗Her2)

<400> 122

Ser Ala Ser

1

<210> 123

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L3 的Fab区 (抗Her2)

<400> 123

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H1的Fv区 (TNFα)

<400> 124

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 125

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H2的Fv区 (TNFα)

<400> 125

Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile

1 5

<210> 126

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR H3的Fv区 (TNFα)

<400> 126

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 127

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L1的Fv区 (TNFα)

<400> 127

Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

1 5

<210> 128

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L2的Fv区 (TNFα)

<400> 128

Ala Ala Ser

1

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACE-00的CDR L3的Fv区 (TNFα)

<400> 129

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

Claims

1.一种结合分子，其包括：

(b)第三多肽，所述第三多肽包含第一可变重链(VH)区、第一恒定重链1(CH1)区以及第二VH区；和

(c)第四多肽，所述第四多肽包含第三VH区、第二CH1区，以及可变轻链(VL)区；

其中，所述第一多肽、以及所述第三多肽的第一VH区和第一CH1区形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽、以及所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区形成第二抗原结合Fab区；

其中，所述第三多肽的第二VH区和所述第四多肽的VL区形成抗原结合Fv区；

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区，所述柔性肽区包括抗体铰链区；和

其中，所述接合分子不包含CH2结构域和CH3结构域。

2.如权利要求1所述的结合分子，其中，所述柔性肽区还包括接头。

3.如权利要求2所述的结合分子，其中，所述接头包含氨基酸序列GGGGS(G4S)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区结合不同的抗原或相同的抗原。

5.如权利要求4所述的结合分子，其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区形成第一抗原结合结构域，并且所述Fv区域为第二抗原结合结构域。

6.如权利要求5所述的结合分子，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的抗原，并且其中，所述第一抗原结合结构域结合第一抗原，并且所述第二抗原结合结构域结合第二抗原。

7.如权利要求6所述的结合分子，其中，所述第一抗原为癌症抗原。

8.如权利要求7所述的结合分子，其中，所述第二抗原在选自由淋巴细胞和单核细胞组成的组中的免疫细胞上表达。

9.如权利要求6所述的结合分子，其中，所述第二抗原在T细胞上表达。

10.如权利要求9所述的结合分子，其中，所述第二抗原为CD3。

11.如权利要求6所述的结合分子，其中，所述第一抗原为癌症抗原，并且所述第二抗原为CD3。

12.如权利要求11所述的结合分子，其中，所述第一抗原为PD-L1，并且所述第二抗原为CD3。

13.如权利要求12所述的结合分子，

其中，每个Fab区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示的CDR；

其中，每个Fab区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示的CDR；

其中，所述Fv区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQID NO:15所示的CDR；和

其中，所述Fv区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQID NO:19所示的CDR。

14.如权利要求11所述的结合分子，其中，所述第一抗原为CD20，并且所述第二抗原为CD3。

15.如权利要求14所述的结合分子，

其中，每个Fab区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的CDR；

其中，每个Fab区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的CDR；

16.如权利要求11所述的结合分子，其中，所述第一抗原为EGFR，并且所述第二抗原为CD3。

17.如权利要求16所述的结合分子，

其中，每个Fab区的所述VH区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43所示的CDR；

其中，每个Fab区的所述VL区包含三个氨基酸序列如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的CDR；

18.一种生产如权利要求1所述的结合分子的方法，包括将一种或多种载体转染到宿主细胞中，其中所述一种或多种载体包括：

(a)第一核酸，所述第一核酸编码第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自包含抗体轻链；

(b)第二核酸，所述第二核酸编码第三多肽，所述第三多肽包含第一VH区、第一CH1区、以及第二VH区；和

(c)第三核酸，所述第三核酸编码第四多肽，所述第四多肽包含第三VH区、第二CH1区、和VL区；

其中，所述第一多肽与所述第三多肽的第一VH区和一CH1区能够形成第一抗原结合Fab区；

其中，所述第二多肽与所述第四多肽的第三VH区和第二CH1区能够形成第二抗原结合Fab区；

其中，所述第三多肽的第二VH区与所述第四多肽的VL区能够形成抗原结合Fv区；

其中，所述第一Fab区和所述第二Fab区通过柔性肽区连接至所述Fv区，所述柔性肽区包括抗体铰链区；和，

其中，所述接合分子不包含CH2结构域和CH3结构域。

19.一种用于治疗受试者疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1-17中任一项所述的结合分子和药学上可接受的载体。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述疾病或病症为癌症。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中，所述癌症为肺癌或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

22.如权利要求19的药物组合物，其中，所述疾病或病症为PD-L1阳性癌症。