JP7052059B2 - ヒト原形質膜小胞関連蛋白質ｐｖ－１と特異的に結合するモノクローナル抗体およびその製造方法と使用 - Google Patents

ヒト原形質膜小胞関連蛋白質ｐｖ－１と特異的に結合するモノクローナル抗体およびその製造方法と使用 Download PDF

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Description

本発明は、生物技術のモノクローナル抗体の分野に属する。本発明は、ヒト原形質膜小胞関連蛋白質（Ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａ ｖｅｓｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、すなわちＰＬＶＡＰ、ＰＶ－１とも略称される。）と特異的に結合するモノクローナル抗体およびそのコード配列ならびに製造方法と使用に関する。
体内において、各器官・組織の内側にある血管最内層の内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ＥＣ）と周囲を囲む周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）および基質などからなる血管系は、主に以下の２つの相補的な作用を果たす。
１） 血管壁内を循環する血液と血管壁外の組織を隔てることで、物理的バリア（ｂａｒｒｉｅｒ）の作用を果たす。
２） 血管周囲組織との酸素、二酸化炭素、水、電解質の交換、ホルモン／タンパク質または他の栄養素および代謝物の輸送、炎症細胞／免疫細胞の移動などを仲介することで、透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）の作用を果たす。
血液－組織間の物質交換と代謝が盛んな組織・器官、例えば、内分泌腺、肝類洞、糸球体、骨髄、脾臓、胃腸管上皮、脳や網膜脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）などの領域においては、その血管内皮は必ずしも完全に繋がっているか（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）周皮細胞によって囲まれているというわけではなく、断続的（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）または類洞（Ｓｉｎｕｓｏｉｄ）である（Ｃｒｉｖｅｌｌａｔｏ Ｅ，Ｎｉｃｏ Ｂ ａｎｄ Ｒｉｂａｔｔｉ Ｄ，２００７ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａ ｍｏｄｅｒｎ ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ａｎ ｏｌｄ Ａｒｉｓｔｏｔｅｌｉａｎ ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｊ Ａｎａｔ ２１１：４１５－４２７を参照のこと）。これらの領域の血管内皮の表面または血管壁には、さらに、多くの直径が一般的に６０～８０ｎｍの開口部または孔（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ ｏｒ ｐｏｒｅｓ）あるいはカベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ、原形質膜小胞（ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ）とも呼ばれる。）のような構造がある。これらの微細な開口部または孔は、通常、数十または百個以上で規則的に等間隔で集合して配列しており、電子顕微鏡において篩板（ｓｉｅｖｅ ｐｌａｔｅ）またはハニカム状の形状をする。一部の開口部または孔の内部には、さらに厚さがわすか６～７ｎｍ程度の枝状の隔膜（ｆｅｎｅｓｔａｌ ｄｉｐｈｒａｇｅｍ）構造が入っている（Ｂｅａｒｅｒ ＥＬ ａｎｄ Ｏｒｃｉ Ｌ．１９８５ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１００：４１８-,４２８；Ｐｅｔｅｒｓ ＫＲ，Ｃａｒｌｅｙ ＷＷ，Ｐａｌａｄｅ ＧＥ．９８５ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０１：２２３３－８；Ｌｏｍａｒｄｉ Ｔら，１９８６ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０２：１９６５-,１９７０を参照のこと）。
血管－組織間の物質交換および細胞の移動は、一般的に、１）血管内皮細胞間を通過する傍細胞移動（ｐａｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、２）血管内皮／血管壁における開口部またはカベオラを介して血管壁の一方の側から血管壁のもう一方の側へ通過または反転する経内皮移動（ｔｒａｎｓ－ｅｎｄｏｔｈｅｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）という、二つの経路がある。内皮血管の周囲を囲む周皮細胞の有無、内皮血管間の連結の緊密度と隙間の大きさ、内皮血管壁における開口部の有無、および開口部内に枝状の隔膜があるかどうかなどの要因によって、血管のバリア構造と透過性に影響を与え、それにより、血管－組織間の物質交換および細胞の移動の効率と程度がコントロールされる。それらの中で、周皮細胞で周囲を囲まれ、緊密に連結し、かつ血管壁に開口部のない内皮血管は、透過性が最も劣り、その物質交換の効率および細胞移動の程度も相応的に最も低い。周皮細胞に囲まれず、断続的で、かつ血管壁に開口部のある内皮血管（例えば、肝類洞領域）は、透過性が最も高く、物質交換の効率および細胞移動の程度も相応的に最も高い。また、開口部内に枝状の隔膜が含まれる有孔内皮血管は、透過性が一般的に開口部内に枝状の隔膜が含まれない有孔内皮血管よりも低い。
現在既知の唯一の内皮血管の開口部における隔膜（ｆｅｎｅｓｔａｌ ｄｉｐｈｒａｇｅｍ）または原形質膜のカベオラ部の隔膜（ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｉａｐｈｒａｇｍ）を構成する物質は原形質膜小胞関連蛋白質（Ｐｌａｓｍａｌｅｍｍａ ｖｅｓｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＬＶＡＰ）である。ＰＬＶＡＰは、ＰＶ－１とも略称され、内皮血管において特異的に発現する糖タンパク質で、そのｃＤＮＡおよびそれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、Ｓｔａｎ ＲＶらによってはじめてラットの肺組織からクローニングして得られ、そして報告された （Ｓｔａｎ ＲＶ，Ｇｈｉｔｅｓｃｕ Ｌ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＢＳ，Ｐａｌａｄｅ ＧＥ：１９９９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：１１８９－９；Ｓｔａｎ ＲＶ，Ｋｕｂｉｔｚａ Ｍ，Ｐａｌａｄｅ ＧＥ．１９９９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９６：１３２０３-,１３２０７）。その後、Ｓｔａｎ ＲＶによって、ヒトおよびマウスのＰＬＶＡＰ／ＰＶ１遺伝子およびそのｃＤＮＡとコードアミノ酸配列も報告された（Ｓｔａｎ ＲＶ，Ａｒｄｅｎ ＫＣ，Ｐａｌａｄｅ ＧＥ ２００１ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７２：３０４-,３１３；Ｓｔａｎ ＲＶ．２００７ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｏｍａｔａｌ ａｎｄ ｆｅｎｅｓｔｒａｌ ｄｉａｐｈｒａｇｍｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．６２１-,６４３を参照のこと）。
ＰＶ－１は、１回膜貫通のＩＩ型膜貫通タンパク質（ｔｙｐｅ－ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）で、タンパク質の分子量は約５５～６０ｋＤである。ラットおよびマウスのＰＶ－１タンパク質は、全長で４３８個のアミノ酸（ヒトのＰＶ－１タンパク質は４４２個のアミノ酸）で、その細胞内領域が比較的短く（２７個のアミノ酸を含む）、Ｎ末端に位置し、Ｃ末端に位置する細胞外領域が比較的長く（３５８個のアミノ酸を含む）、血管腔に露出する。
正常の生理状態において、ＰＶ－１遺伝子は、一部の内分泌腺、例えば、脳下垂体（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｇｌａｎｄ）、副腎、脳または網膜脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）および肺組織では比較的高度に発現する以外、体内の他の組織のいずれでも発現レベルが比較的低いか（一般的にバックグラウンド発現のみで維持する）発現しない（Ｈｎａｓｋｏ Ｒら，２００２ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１．７５：６４９－６１）。しかし、例えば、腫瘍、酸欠／外傷および炎症などの血管新生を伴う病理的変化が生じると、これらの組織におけるＰＶ－１遺伝子の発現が顕著に上方調節される（Ｍａｄｄｅｎ ＳＬら，２００４ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６５：６０１-,６０８；Ｃａｒｓｏｎ－Ｗａｌｔｅｒ ＥＢら，２００５ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：７６４３－５０；Ｌｉｕ Ｙら，２０１０ Ｊ Ｎｅｕｒｏｎｃｏｌ．９９：１３-,２４；Ｍｏｚｅｒ ＡＢら，２０１０ Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．７：２３８－５０）。
血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）（Ｌｅｕｎｇ ＤＷら，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０６－０９）は、血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ、ＶＰＦ）（Ｋｅｃｋ ＰＪら，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０９－１２）とも呼ばれ、現在既知の最も強力で最も重要な血管新生と透過を刺激する物質である（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐら，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５－４３８；Ｆｅｒｒａｒａ Ｎら，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９－４１２）。ＶＥＧＦ／ＶＰＦは、現在既知の血管内皮の原形質膜の細孔構造の形成を誘導し、そしてＰＶ－１遺伝子の発現を上方調節する、最も重要な因子でもある（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＷＧ ａｎｄ Ｐａｌａｄｅ ＧＥ．１９９５ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：２３６９-,２３７９；Ｒｏｂｅｒｔｓ ＷＧ ａｎｄ Ｐａｌａｄｅ ＧＥ．１９９７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：７６５－７７２；Ｒｏｂｅｒｔｓ ＷＧら １９９８ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１２３９－４８；Ｅｓｓｅｒ Ｓら，１９９８ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４０：９４７-,９５９；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＬＡら，２００５ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０６：４６６-,４７５；Ｉｏａｎｎｉｄｏｕ Ｓら ２００６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０３：１６７７０－１６７７５）。
他の一部の因子、例えば、腫瘍壊死因子－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α、ＴＮＦ－α）、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６、ＩＬ－６）、腫瘍促進因子であるホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）なども、内皮の原形質膜の細孔の形成を誘導し、そしてＰＶ－１遺伝子の発現を上方調節することができる（Ｌｏｍｂａｒｄｉ Ｔら １９８６ ＪＣＢ １０２：１９６５－１９７０；Ｓｔａｎ ＲＶら ２００４ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １５： ３６１５-,３６３０；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＬＡら，２００５ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０６：４６６-,４７５）。
最初のＰＶ－１の生理的機能に関する研究の報告は、Ｋｅｕｓｃｈｎｉｇｇ Ｊらによって２００９年にＢｌｏｏｄ雑誌で発表されたものである（Ｋｅｕｓｃｈｎｉｇｇ Ｊら，２００９ Ｂｌｏｏｄ． １１４：４７８－８４．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ＰＡＬ－Ｅ ｉｓ ａ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）。ＰＡＬ－Ｅは、実は一つのマウス由来モノクローナル抗体の略称で、その完全な名称はＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ ＲＯら，１９８５ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．５２：７１－６）で、それによって認識される抗原は主に血管に特異的に発現する。Ｎｉｅｍｅｌａ Ｈらによって、ＰＡＬ－Ｅモノクローナル抗体によって認識される抗原がヒト原形質膜小胞関連蛋白質（ＰＶ－１）であることが報告された（Ｎｉｅｍｅｌａ Ｈら，２００５ Ｂｌｏｏｄ．；１０６：３４０５－３４０９）。Ｋｅｕｓｃｈｎｉｇｇ Ｊらによって、ＴＮＦ－αで活性化されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ＨＵＶＥＣ）において、ＰＡＬ－Ｅ／ＰＶ－１タンパク質が顕著に内皮細胞膜の周辺に凝集し、そして臍帯静脈内皮細胞を通過しているリンパ球を囲むこと、ＰＡＬ－Ｅ／ＰＶ－１抗体を入れると、リンパ球の傍細胞移動を抑制できること、マウスの体内急性腹膜炎および気嚢炎のモデルにおいて、尾静脈からコード番号がＭＥＣＡ－３２の抗体を注射した後、マウスの腹腔における単核細胞またはリンパ球の数が８５％低下したことが見出された（Ｋｅｕｓｃｈｎｉｇｇ Ｊら，２００９ Ｂｌｏｏｄ．１１４：４７８－８４）。
ＰＬＶＡＰ／ＰＶ－１の内皮血管の細孔における枝状隔膜の形成および血管バリア／透過性における重要性は、最近、すでに遺伝子ノックアウトマウスにおいて明確に証明されている。例えば、Ｓｔａｎ ＲＶらによって、２０１２年にＤｅｖ Ｃｅｌｌ．雑誌で、ＰＶ－１遺伝子ノックアウトマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ背景下では、胚が生存できず、混合遺伝的背景では、少数の胚が出生まで生存できたことが報告された。ＰＶ－１遺伝子ノックアウトマウスは、血管内皮の原形質膜の細孔の隔膜またはカベオラの隔膜が形成できず、隔膜の欠失によって内皮細胞の透過性が高くなり、タンパク質の血管外への大量の漏出につながり、組織浮腫が生じ、生まれた動物が発育早期で重度な非炎症性のタンパク喪失性腸炎によって死亡する（Ｓｔａｎ ＲＶら，２０１２ Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２３：１２０３－１８）。
同様に、Ｈｅｒｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｌらによって、２０１２年にＨｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ雑誌で、Ｐｌｖａｐ（ＰＶ－１）遺伝子ノックアウトマウスのホモ接合体（Ｐｌｖａｐ－／－）胚は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ遺伝的背景では、出生前に死亡し、皮下浮腫、出血および皮下毛細管の血管壁欠損などの異常が現れたことが報告された。また、Ｐｌｖａｐ－／－ 胚の心臓には、心室中隔欠損およびより薄い心室壁として現れた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ／ＦＶＢ－Ｎ混合遺伝的背景では、Ｐｌｖａｐ－／－胚は出生まで発育できたが、生まれたマウスは多くとも４週間しか生存できなかった（Ｈｅｒｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｌら，２０１２ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３８：７０９－２４）。
正常の状態において、体内に血管－組織バリアによって守られる領域、例えば、中枢神経系における血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）、眼における血液網膜関門（ｂｌｏｏｄ－ｒｅｔｉｎａｌ ｂａｒｒｉｅｒ）が存在し、その内皮の血管壁には一般的に原形質膜の細孔がなく、ＰＶ－１／ＰＡＬ－Ｅ抗原も発現しない。しかし、一部の病理的状態、例えば、虚血性脳卒中（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）、脊髄損傷、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ、ＥＡＥ）／多発性脳脊髄硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脳部原発性または転移性腫瘍、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）などの場合において、これらの領域の血管－組織バリア構造は破壊されることが多く、その内皮の血管壁に細孔が現れ、そしてＰＶ－１／ＰＡＬ－Ｅ抗原の発現の上方調節が伴う（Ｃａｒｓｏｎ－Ｗａｌｔｅｒ ＥＢら，２００５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：７６４３－５０； Ｓｈｕｅ ＥＨら，２００８ ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９：２９； Ｍｏｚｅｒ ＡＢら，２０１０ Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．７：２３８－５０８）。例えば、Ｓｈｕｅ ＥＨらは、マウスの脳動脈塞栓による急性脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）モデルにおいて、ＰＶ－１／ＰＡＬ－Ｅ抗原は急性脳虚血から４８時間で塞栓領域の少数の脳血管に発現し始め、約７日目で塞栓領域の脳血管におけるＰＶ－１／ＰＡＬ－Ｅ抗原の発現がピーク値に達したことを見出した（Ｓｈｕｅ ＥＨら ２００８ ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９：２９）。
同様に、Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ ＲＯらは、糖尿病網膜症患者および血液網膜関門の構造が破壊された糖尿病マウスＡｋｉｍｂａにおいて、網膜の内皮の血管壁でＰＶ－１／ＰＡＬ－Ｅ抗原の発現が上方調節され、そして上方調節された発現レベルの高さが血液網膜関門の構造の破壊程度および透過性と正の相関があることを見出した（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ ＲＯら，１９９９，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４２：５９６－６０２；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ－Ｋｒｕｋ Ｊら，２０１４，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１２２：１２３－３１）。レンチウイルスによる干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術により、内皮細胞におけるＰＶ－１遺伝子の発現を阻害すると、ＶＥＧＦによって誘導される内皮血管の原形質膜の細孔／カベオラの形成および血液網膜関門の構造に対する破壊を防止または軽減することができる（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ－Ｋｒｕｋ Ｊら ２０１６ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８６：１０４４－５４）。
そのため、ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）は、内皮の原形質膜の細孔の隔膜（ｆｅｎｅｓｔａｌ ｄｉｐｈｒａｇｅｍ）およびカベオラの隔膜（ｓｔｏｍａｔａｌ ｄｉａｐｈｒａｇｍ）を構成する主要成分で、内皮血管の原形質膜の細孔またはカベオラを支えるのみならず、直接血管新生と透過の調節に関与する。
発明の概要
本発明の解決しようとする技術的課題の一つ目は、ヒト原形質膜小胞関連蛋白質ＰＬＶＡＰ（またはＰＶ－１）抗原を特異的に認識・結合するモノクローナル抗体またはその誘導体、例えば、抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）などを提供することである。
当該モノクローナル抗体またはその誘導体は、単独で主要活性成分として、適切な薬物製剤に調製し、ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）による血管新生／透過を干渉することで、関連疾患を治療するかその発生・発症を遅延する効果を果たすことができる。なお、当該抗体による治療に適している血管新生／透過と密接に関連する疾患は、各種の悪性腫瘍、加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、例えば、糖尿病性黄斑浮腫（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍａｃｕｌａｒ ｅｄｅｍａ、ＤＭＥ）などを含む。
抗ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、上記疾患を治療する場合、さらに現在すでに市販または研究されている他の薬物と逐次的にまたは組み合わせて使用することができる。
本発明が解決しようとする技術的課題の二つ目は、上記抗体をコードするＤＮＡ分子または遺伝子を提供することである。
本発明が解決しようとする技術的課題の三つ目は、上記抗体を含有する薬物または薬物組成物を提供することである。
本発明が解決しようとする技術的課題の四つ目は、血管新生／透過と関連する疾患、特に脈絡膜新生血管性眼底疾患の治療における上記抗体を含有する薬物または薬物組成物の使用を提供することである。
本発明が解決しようとする技術的課題の六つ目は、ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）タンパク質を検出・分析するため、あるいは体内外でＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）発現陽性で標識された組織細胞を追跡するための上記抗体を含有する試薬またはキットを提供することである。
本発明が解決しようとする技術的課題の七つ目は、上記抗体を製造する方法を提供することである。
ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗原が一般的に炎症、腫瘍、糖尿病網膜症などの病理的状態のみにおいて、選択的に病変領域の内皮の血管壁の細孔で発現することから、体内にＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）タンパク質を特異的に認識する抗体を投与すると、抗体が血管壁の細孔における隔膜とカップリングまたは結合し、物理的に血管壁の細孔を塞ぐことで、血管の透過／漏出を防止または低減することができる。このような内皮の血管壁におけるＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）タンパク質を特異的に認識・結合する抗体またはその誘導体を活性成分として、適切な薬物製剤を製造して血管新生／透過と密接に関連する疾患の治療または干渉に使用することができる。これらのモノクローナル抗体またはその誘導体は、新生血管または内皮血管の管壁に集まって結合するため、標的ベクターとして他の薬物、例えば、抗腫瘍化学薬物、放射線薬物または毒素と連結または抱合し、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）を形成し、共に腫瘍領域の新生血管の管腔に輸送されて集合し、腫瘍領域の血管の封鎖と薬物による腫瘍細胞の殺傷という二重の作用効果を果たすことができる。また、ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗原と特異的に結合する抗体またはその誘導体、例えば、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）は、すでに市販または研究中の他の薬物と逐次的にまたは組み合わせて血管新生／透過に関連する疾患の治療に使用することもできる。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策は、以下のものを使用する。
本発明の第一の側面では、ヒト原形質膜小胞関連蛋白質ＰＶ－１の細胞膜外領域と特異的に結合する、まったく新しいモノクローナル抗体またはその誘導体を提供する。当該モノクローナル抗体またはその誘導体は、第一の可変領域および第二の可変領域を含み、ここで、前記第一の可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示されるアミノ酸配列であり、前記第二の可変領域は抗体重鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４で示されるアミノ酸配列である。
前記抗体は、マウス由来抗体、ヒト－マウスキメラ抗体、ヒト化抗体などを含み、前記誘導体は、抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）などを含む。
本発明の好適な技術的解決策として、前記第一の可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であり、前記第二の可変領域は抗体重鎖可変領域であり、配列番号２１で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好適な技術的解決策として、前記抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域を含み、かつ前記抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域のヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。
本発明の好適な技術的解決策として、前記ヒト抗体軽鎖定常領域はヒト抗体κ鎖またはヒト抗体λ鎖由来のもので、前記ヒト抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのサブタイプ、ＩｇＡまたはＩｇＭ由来のもので、中でも、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブタイプが好ましい。
本発明の第二の側面では、上記抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子または遺伝子ヌクレオチド配列であって、その抗体軽鎖可変領域の遺伝子ヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、その抗体重鎖可変領域の遺伝子ヌクレオチド配列は配列番号２０で示されるものを提供する。
本発明の第三の側面では、上記抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子／遺伝子ヌクレチオド配列および当該配列と機能的に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する。
本発明の第四の側面では、上記発現ベクターから形質転換された組み換え宿主細胞を提供する。当該組み換え宿主細胞またはその後代細胞は上記抗体またはその誘導体を発現する。当該抗体は、マウス由来抗体、ヒト－マウスキメラ抗体、ヒト化抗体などを含み、誘導体は、抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）などを含む。
本発明の第五の側面では、薬学的有効量の上記抗体またはその誘導体と、薬学的に許容される担体または補助剤とを含む薬物または薬物組成物を提供する。
本発明の第六の側面では、血管新生または透過に関連する疾患を治療する薬物の製造における上記抗体の薬物または薬物組成物の使用を提供する。なお、血管新生／透過と密接に関連する疾患は、各種の悪性腫瘍および脈絡膜新生血管性眼底疾患、例えば、加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、例えば、糖尿病性黄斑浮腫（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍａｃｕｌａｒ ｅｄｅｍａ、ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）などを含む。
本発明の好適な技術的解決策として、前記の薬物組成物は、さらに、薬学的に有効量の血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）またはその受容体（ＶＥＧＦ－Ｒ）を拮抗・遮断する活性成分、および薬学的に許容される担体を含有する。本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、薬物製剤の成分として血管新生／透過と密接に関連する疾患、例えば、悪性腫瘍または脈絡膜新生血管性眼底疾患の治療に使用される場合、さらにＶＥＧＦ／またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ－Ｒ）を標的とする薬物と逐次的に使用するか併用することができる。なお、好適なＶＥＧＦ／またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ－Ｒ）を標的とする薬物は、高分子生物薬物、例えば、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体薬物であるベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名Ａｖａｓｔｉｎ）、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ｆａｂ断片であるラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、抗－ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体であるラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ、商品名Ｇｙｒａｍｚａ）およびコード番号がｈＰＶ１９の抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｓｔａｉｎｗｅｉ社の現在研究中の薬物。中国特許文献：特許登録番号：２０１２１０５４０６９２Ｘ、特許の名称：血管内皮細胞増殖因子とその受容体の結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびそのコード配列と使用、ならびに授権特許番号ＵＳ９５８０４９８Ｂ２の米国特許文献を参照のこと）、あるいはＶＥＧＦ受容体－Ｆｃ融合タンパク質薬物、例えば、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ、商品名：Ｅｙｌｅａ）、コンベルセプト（ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）などを含む。好適なＶＥＧＦ／またはＶＥＧＦ受容体を標的とする低分子化学薬物は、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、アパチニブ（ａｐａｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）などを含む。
本発明の好適な技術的解決策として、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、局所投与で眼底疾患を治療する場合、主に当該抗体が血管壁における細孔の隔膜と特異的に結合し、形成されるものによって血管壁の穴が物理的に塞がれることで、血管の透過を防止または低減するため、薬物成分として、当該抗体は製造する上で野生型または遺伝子改変されたヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ２サブタイプの抗体の定常領域を使用するか、あるいは抗体の定常領域のない抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体などにすることにより、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を低減または解消し、治療領域の血管または組織に対する直接の殺傷を減少させることができる。野生型または遺伝子改変されたヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ２サブタイプの抗体の定常領域、ならびに抗体の定常領域のない抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体などは、それぞれ当業者に知られている遺伝工学技術によってクローニングして得るか、体外で合成して製造することができる。
本発明の好適な別の技術的解決策として、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、腫瘍を治療する場合、野生型または遺伝子改変されたヒトＩｇＧ１、ＩｇＭサブタイプの抗体の定常領域を使用することにより、抗体のＡＤＣＣまたはＣＤＣを維持または向上させ、より強力な腫瘍組織と細胞を殺傷する効果を実現することができる。野生型または遺伝子改変されたヒトＩｇＧ１、ＩｇＭサブタイプの抗体の定常領域は、当業者に知られている遺伝工学技術によってクローニングして得るか、体外で合成して製造することができる。
本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体またはその誘導体は、腫瘍領域の新生血管内皮または血管の管壁と特異的に結合するという特徴を有するため、標的ベクターとして他の抗腫瘍薬または毒素と連結または抱合し、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）を形成し、共に腫瘍領域の新生血管の管腔に輸送されて集合することにより、より優れた腫瘍を殺傷する効果を果たすことができる。抗体と薬物または毒性の連結または抱合方法は当業者に知られている通常の技術を使用することができる。このような抗体－薬物複合体は、特に、原発性脳腫瘍、例えば、神経膠芽細胞腫や転移性脳腫瘍を含む、通常の薬物が届きにくい部位、例えば、脳部の腫瘍の治療に適している。脳部の腫瘍、例えば、神経膠芽細胞腫を治療する場合、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体または抗体－薬物複合体は、経口投与低分子薬物、例えば、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）と併用することができる。また、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体または抗体－薬物複合体は、特に、ＰＬＶＡＰ／ＰＶ１遺伝子の発現が比較的高い、一部の悪性腫瘍、例えば、原発性肝臓癌または転移性肝臓癌などの治療に適しており、このような抗体薬物は、肝臓内血管への注射による局所投与によって、より正確な標的治療を実現し、そして薬物の身体の他の部位に対する副作用を低下させることもできる。
本発明の好適な別の技術的解決策として、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、免疫抑制チェックポイント分子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を標的とするモノクローナル抗体薬物と逐次的に使用するか併用することで、原発性（例えば、神経膠芽細胞腫）または転移性脳腫瘍、肺癌、胃／食道癌、肝臓癌、腎臓癌、子宮頸癌などの多くの悪性腫瘍の治療に使用することもできる。なお、ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体と逐次的に使用するか併用する免疫抑制チェックポイント分子を標的とするモノクローナル抗体薬物は、好適に、抗ＣＴＬＡ４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－４、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）モノクローナル抗体であるイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、商品名Ｙｅｒｖｏｙ）、抗ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １、プログラム細胞死１）モノクローナル抗体であるニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、商品名Ｏｐｄｉｖｏ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ）およびコード番号がｈＡＢ２１のモノクローナル抗体（Ｓｔａｉｎｗｅｉ社の研究中の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、ＰＣＴ特許出願書類：ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０８９２８２、ヒトＰＤ－１抗原とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびその製造方法と使用を参照のこと）、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体薬物であるアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、商品名Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ、商品名Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、商品名Ｉｍｆｉｎｚｉ）などを含む。
本発明の好適な別の技術的解決策として、本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体は、まずキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）にし、体外で腫瘍患者の末梢血液から分離された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞に導入し、さらに体外で培養して増幅させた後、これらのＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗原を認識するリンパ球を再び体内に注入し、さらに体内で腫瘍領域の血管内皮細胞および新生血管を標的とすることで、腫瘍を治療する効果を果たすこともできる。直接、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０を標的とする通常のＣＡＲ－Ｔと比較して、本発明のＣＡＲ－Ｔは、腫瘍領域の血管内皮細胞および新生血管を特異的に標的とすることにより、その作用は腫瘍抗原の発現に依存せず、多くの固形腫瘍の治療に使用することができる。本発明のＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体のキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）への製造は、当業者に知られている通常の技術を使用することができる。
本発明の具体的な実施例には、ヒト－マウスキメラＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）抗体を単独の成分として、または抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて使用し、カニクイザルの体内で脈絡膜新生血管性眼底疾患を治療する使用が記載されている。
本発明の第七の側面では、ヒトとサルの原形質膜小胞関連蛋白質ＰＶ－１のいずれとも結合できるモノクローナル抗体またはその誘導体であって、前記抗体は、配列番号８または配列番号２５で示されるようなアミノ酸配列を有する抗原と結合し、そして上記の抗体またはその誘導体と競争してＰＶ－１と結合するものを提供する。
本発明の第八の側面では、原形質膜小胞関連蛋白質ＰＶ－１による体内における血管新生または透過を拮抗・遮断する方法であって、適切な投与量の前記の抗体またはその誘導体を投与することを含む方法を提供する。
本発明の第九の側面では、上記抗体またはその誘導体を含有する検出試薬または検出キットであって、組織または細胞のサンプルにおける原形質膜小胞関連蛋白質ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）を検出・分析するため、あるいは体内外でＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）発現陽性で標識された組織細胞を追跡するために使用される検出試薬または検出キットを提供する。
本発明の第十の側面では、上記抗体またはその誘導体を製造する方法であって、
ａ） 前記抗体または誘導体をコードする上記ＤＮＡ配列および当該配列と機能的に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
ｂ） 工程ａ）に記載の発現ベクターで宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を形質転換する工程、
ｃ） 前記抗体の発現に適切な条件で、工程ｂ）で得られた宿主細胞を培養する工程、ならびに
ｄ） アフィニティークロマトグラフィーによって当該宿主細胞の培養液から前記抗体を分離・精製する工程
を含む方法を提供する。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、一つの純粋な細胞から得られる免疫グロブリンであって、同様の構造および化学的特徴を有し、単一の抗原決定基に対して特異性を有するものである。モノクローナル抗体は通常のポリクローナル抗体製剤（通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である）と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基に対するものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマまたは組み換えエンジニアリング細胞の培養によって得られ、他の免疫グロブリンが混在することがない。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。
本明細書で用いられる用語「ヒト化モノクローナル抗体」とは、マウス由来モノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を残す以外、他の配列（可変領域におけるフレームワーク領域の配列を含む）の全部または大半をヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列に変えることで、遺伝子工学の手段によってマウス由来モノクローナル抗体の免疫原性を最大限に低下させたものである。
本明細書で用いられる用語「抗体」と「免疫グロブリン」は、同一の構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ））と２つの同じ重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
本明細書で用いられる用語「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的保存的な部分は、フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２，Vol.１，６４７－６６９頁（１９９１）を参照のこと）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するように、異なるエフェクター機能を示す。
本発明の抗体は一般的に以下の方法によって製造することができる。
まず、本発明の抗体をコードする遺伝子を適切な発現調節配列を含有する発現ベクターに挿入する。
本明細書で用いられる用語「発現調節配列」とは、通常、遺伝子発現の制御に関与する配列を指す。発現調節配列は、目的遺伝子と機能的に連結したプロモーターおよび終結シグナルを含む。本発明の抗体をコードする遺伝子（ＤＮＡ）配列は、当業者に周知の通常の手段によって得られ、例えば、本発明で開示されたタンパク質配列から人工合成されるかＰＣＲ法によって増幅することによって得られる。その後、本分野で周知の様々な方法によって合成またはＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡ断片を適切な発現ベクターに挿入する。本発明で用いられる発現ベクターは、当業者に公知の市販の発現ベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでもよい。
発現ベクターの形質転換を受ける適切な宿主細胞は、一般的に原核細胞と真核細胞を含む。常用の原核宿主細胞の例として、大腸菌、枯草菌などを含む。常用の真核宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などを含む。本発明において、好適な宿主細胞は哺乳動物の細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適切な条件で（例えば、細胞培養瓶またはバイオリアクター内の無血清培地での付着培養または懸濁培養）培養した後、培養上清液を収集し、さらにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過除菌などを含む当業者に周知の通常の分離工程または手段によって精製して本発明の抗体を得る。
精製して得られる本発明の抗体は、適切な溶媒、例えば、無菌生理食塩水に溶解させてもよく、溶解濃度は０．０１～１００ｍｇ／ｍｌの間でもよいが、理想の最終溶解濃度は１～４０ｍｇ／ｍｌの間でもよい。
ＰＬＶＡＰ（ＰＶ－１）タンパク質と特異的に結合するマウス由来モノクローナル抗体およびそれを分泌するハイブリドーマ細胞系を得るために、本発明では、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）によって発現する組み換えヒトＰＶ－１タンパク質の細胞膜外領域を免疫抗原とし、低投与量のマウス皮下免疫を数回繰り返すことによって、抗ヒトＰＶ－１タンパク質のポリクローナル抗体を分泌するマウスを得、さらにその中から高力価の抗体を含有するマウスを選び、その脾臓細胞を取り、体外でマウス骨髄腫細胞と融合させ、さらに薬物スクリーニングおよびサブクローニングなどの工程を行うことによって抗ヒトＰＶ－１タンパク質の抗体を安定的に分泌する複数株のハイブリドーマモノクローナル細胞を構築した。その中でも、コード番号がＳＴＷ－１３９－１５のマウスハイブリドーマ細胞株は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、フローサイトメーターなどの複数の検出方法によって検証され、それによって分泌されるモノクローナル抗体はヒトの正常組織の細胞および腫瘍組織におけるＰＶ－１タンパク質のみならず、サルの組織におけるＰＶ－１タンパク質とも特異的に結合することができることが実証された。
本発明は遺伝子工学などの手段によってマウスハイブリドーマ細胞株ＳＴＷ－１３９－１５からクローニングして当該マウス由来抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のタンパク質をコードする遺伝子配列を得、これに基づいて当該抗体に対してヒト化して、ヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃおよびその発現ベクターを得た。当該発現ベクターは形質移入によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に入り、当該ヒト－マウスキメラ抗体を安定的かつ効率的に分泌する遺伝子改変細胞を得た。当該遺伝子改変細胞を大規模培養した後、培養液の上清を得た。上清液は、遠心および０．４５μｍのフィルターによるろ過を経た後、プロテインＡ含有アフィニティークロマトグラフィーカラムにかけて分離・精製し、精製したヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃタンパク質を得た。
分離・精製したＳＴＷ－１３９－１５－Ｃ抗体タンパク質は、ろ過によって除菌した後、適切な溶媒に再溶解させ、薬物製剤にし、体内外のその生物または薬理的活性の測定に使用することができる。
そのうちの一つの体内で当該ヒト－マウスキメラ抗体の薬理的活性を測定する方法は、レーザーによる照射で誘導されたカニクイザルの脈絡膜新生血管疾患モデルを利用し、硝子体内への注射による局所投与により、ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃ抗体の単独投与または抗ＶＥＧＦ抗体薬物の併用の脈絡膜新生血管の生長および透過に対する抑制作用を考察し、そして抗ＶＥＧＦ抗体薬物の単独投与の抑制作用の効果と比較した。測定結果から、ＰＬＶＡＰ／ＰＶ－１と特異的に結合するＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体の単独投与または抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体との併用は、いずれもカニクイザル体内におけるレーザーによって誘導された脈絡膜新生血管の透過に明らかな抑制作用があり、血管新生／透過に関連する疾患の治療に使用することができることが示された。
本発明の実施例１におけるヒトＰＶ－１タンパク質とマウスＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析の概略図である。 本発明の実施例１における組み換えヒトＰＶ－１－Ｈｉｓタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析のパターンであり、ここで、バンド１はＤＴＴ－還元サンプルであり、マーカーはタンパク質の分子量の標準品（ｋｄ）を示す。 本発明の実施例１における免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）方法によって免疫マウス血清およびハイブリドーマ細胞の上清液のサンプルとヒトＰＶ－１遺伝子を一過性形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の特異的な結合を検出した代表的な結果の概略図である。ここで、図３Ａは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプル（陰性対照）であり、図３ＢはヒトＰＶ－１タンパク質で免疫されたマウスの血清サンプル（１：２００で希釈）であり、図３Ｃはマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５の培養上清液のサンプルである。 本発明の実施例２におけるＥＬＩＳＡ法によってマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５の培養上清液のサンプルと９６ウェルプレートにコーティングされた組み換えヒトＰＶ－１細胞膜外タンパク質の結合を検出した結果の概略図である。ここで、ｍＡｂ１１３は１株の非関連のマウスモノクローナル抗体（抗ＳＯＳＴモノクローナル抗体）のサンプルであり、陰性対照サンプルは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプルである。 本発明の実施例３におけるＥＬＩＳＡ法によってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５と組み換えヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質および他のいくつかの非関連遺伝子の組み換えタンパク質またはＦｃ融合タンパク質の結合を検出して比較・分析した結果の概略図である。 本発明の実施例４におけるフローサイトメーターによってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒトＰＶ－１遺伝子を安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、図６Ａは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプル（陰性対照）であり、図６Ｂは非関連のマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２１（抗ＰＤ－１モノクローナル抗体）のサンプルであり、図６ＣはヒトＰＶ－１タンパク質で免疫されたマウスの血清サンプル（１：２００で希釈され、陽性対照である）であり、図６Ｄはマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５の培養上清液のサンプルである。 本発明の実施例４におけるフローサイトメーターによって勾配希釈されたマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒトＰＶ－１遺伝子を安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の結合を検出した抗体溶解度－平均蛍光値（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の投与量－反応曲線（ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｅ）図である。 本発明の実施例４におけるフローサイトメーターによってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとＣＨＯおよびＣＨＯ／ＰＶ－１細胞の混合サンプル（９：１で混合）の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、図８Ａは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプル（陰性対照）であり、図８Ｂは非関連のマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２１（抗ＰＤ－１）のサンプルであり、図８Ｃはマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルである。 本発明の実施例５におけるフローサイトメーターによってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒトＨＵＶＥＣ細胞の結合を検出・分析した代表的な結果の概略図であり、ここで、Ａ０１ＮＣは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプル（陰性対照）である。 本発明の実施例６における免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）方法によってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒト正常組織の組織切片の結合を検出した代表的な結果の概略図である。ここで、図１０Ａは組織切片が肺Ｌｕｎｇであるものを、図１０Ｂは組織切片が肝臓Ｌｉｖｅｒであるものを、図１０Ｃは組織切片が脳Ｂｒｉａｎであるものを、図１０Ｄは組織切片が膵臓ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅであるものを、図１０Ｅは組織切片が心臓Ｈｅａｒｔであるものを、図１０Ｆは組織切片が脾臓ｓｐｌｅｅｎであるものを表す。 本発明の実施例７における免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）方法によってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒト腫瘍組織の組織切片の結合を検出した代表的な結果の概略図である。ここで、図１１Ａはヒト腫瘍組織の組織切片が肺癌ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒであるものを、図１１Ｂはヒト腫瘍組織の組織切片が肝臓癌ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒであるものを、図１１Ｃはヒト腫瘍組織の組織切片が脳腫瘍ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒであるものを、図１１Ｄはヒト腫瘍組織の組織切片が膵臓癌ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒであるものを、図１１Ｅはヒト腫瘍組織の組織切片が卵巣癌ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒであるものを、図１１Ｆはヒト腫瘍組織の組織切片がリンパ腫Ｌｙｍｐｈｏｍａであるものを表す。 本発明の実施例８におけるヒトＰＶ－１タンパク質とサルＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析の概略図である。 本発明の実施例８におけるフローサイトメーターによってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとサルＰＶ－１遺伝子を形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｍｏｎｋｅｙ ＰＶ－１）の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、図１３Ａは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞の培養上清液のサンプル（陰性対照）であり、図１３Ｂは非関連のマウスモノクローナル抗体ｍＡＢ７（抗ＰＤ－１）のサンプルであり、図１３Ｃはマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルである。 本発明の実施例１０におけるＥＬＩＳＡ法によってヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃのサンプルと９６ウェルプレートにコーティングされた組み換えヒトＰＶ－１細胞膜外タンパク質の結合を検出した結果の概略図である。 それぞれ本発明の実施例１１におけるカニクイザルがレーザーによって光凝固されてから３週間で動物の硝子体内注射によって投与された後の観察期間の各時点における眼底蛍光イメージング画像である。ここで、図１５Ａは陰性対照（０．９％ＮａＣｌ注射液）治療群のイメージング画像であり、図１５ＢはＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体試験サンプル投与群のイメージング画像であり、図１５Ｃは陽性対照薬物ｈＰＶ１９モノクローナル抗体（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）投与群のイメージング画像であり、図１５Ｄは試験サンプルＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体と陽性対照薬物ｈＰＶ１９モノクローナル抗体の合併投与群のイメージング画像である。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明を制限するものではない。
実施例１：抗ヒトＰＶ－１抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞系の構築と選別・同定
１．１ ヒトＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列とマウスＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析
ヒトＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿１１２６００．１）（配列番号１）とマウスＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿１１５７７４．２）（配列番号２）のアライメント解析は、図１に示す通りである。ここで、Ｎ末端の２０数個のアミノ酸が細胞膜内に位置し（配列は斜体で示す）、枠と太字で示されるアミノ酸配列はＰＶ－１タンパク質の膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、その先のＣ末端のアミノ酸配列（ヒト：ＡＡ５３－４４２、マウス：ＡＡ５３－４３８）はいずれも細胞膜外に位置し、それに４個のＮ－グリコシル化部位（枠で示す）および９個のシステインＣｙｓｔｅｉｎｅ（下線で示す）が含まれる。アミノ酸配列において、ヒトＰＶ－１タンパク質とマウスＰＶ－１タンパク質は全体的な相同性はわずか６２％であり、そのうち、細胞膜外領域では、ヒトＰＶ－１タンパク質とマウスＰＶ－１タンパク質のアミノ酸の異なる部位数が１００個超である。そのため、従来の抗原タンパク質によるマウスに対する免疫およびハイブリドーマの製造技術を使用すれば、ヒトＰＶ－１細胞膜外の抗原領域に対するマウス抗体を製造することができると推測される。
１．２ 組み換えヒトＰＶ－１タンパク質（免疫抗原）の発現と製造
本発明の実施例において、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ＨＵＶＥＣ）から全ＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを得た。さらに、当該ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ技術によってクローニングしてヒトＰＶ－１タンパク質をコードする遺伝子断片を得た。ＤＮＡ配列決定によって正しいことが確認され、ＤＮＡ制限酵素で処理した後、それをＣＨＯ細胞において外因性遺伝子を効率的に発現可能なＤＮＡプラスミドにクローニングし、対応する組み換え発現プラスミドを得た。
１．２．１ ヒトＰＶ－１全長タンパク質をコードする遺伝子クローンの獲得およびその発現プラスミドの構築
当該発現プラスミドの構築過程は、以下の通りである。
まず、上記ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のような一対のプライマーを使用し、ＰＣＲによって増幅させてヒトＰＶ－１全長タンパク質をコードする目的遺伝子断片（長さ：約１３４５ｂｐ）の獲得に成功した。
フォワードプライマーｈＰＶ－１－Ｈｉｓ－Ｆ－ＨｉｎｄＩＩＩ：ＡＡＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡ（配列番号３）
リバースプライマーｈＰＶ－１－Ｈｉｓ－Ｒ－ＸｈｏＩ：
ＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＴ（配列番号４）
ＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡは、回収およびＤＮＡ制限酵素による処理を経た後、ｐＣＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｉｖｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、組み換えプラスミドを得た。組み換えプラスミドは、制限酵素による切断およびＤＮＡ配列決定によって、ＣＨＯ細胞膜に外因性ヒトＰＶ－１遺伝子が発現可能な組み換えプラスミド（プラスミド名称：ｐＱＹ－ＰＶ－１）の獲得に成功したことが確認された。
１．２．２ Ｃ末端にＨｉｓ－６タグの付いたヒトＰＶ－１細胞膜外組み換えタンパク質の発現プラスミドの構築
前節（１．２．１）におけるＰＣＲ回収産物を鋳型とし、以下のような一対のプライマーを使用し、ＰＣＲによって増幅させてＣ末端に６ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグ配列の付いたヒトＰＶ－１細胞膜外タンパク質をコードする遺伝子断片（ＰＶ－１－Ｈｉｓ）の獲得に成功した。
フォワードプライマーｈＰＶ－１－Ｆｃ－Ｆ－ＢｇｌＩＩ：ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号５）；
リバースプライマーｈＰＶ－１－Ｈｉｓ－Ｒ－ＸｈｏＩ：
ＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＡＴ（配列番号４）
ＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡは、回収およびＤＮＡ制限酵素による処理を経た後、シグナルペプチドを有する発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＤＨＦＲに導入し、組み換えプラスミドを得た。組み換えプラスミドは、制限酵素による切断およびＤＮＡ配列決定によって、ＣＨＯ細胞においてｈＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換え遺伝子を発現・分泌する発現プラスミド（プラスミド名称：ｐＱＹ－ＤＨＦＲ－ＰＶ１－Ｈｉｓ）の獲得に成功したことが確認された。
１．２．３ 組み換えヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質の発現プラスミドの構築
当該発現プラスミドの構築過程は、以下の通りである。
前節（１．２．１）におけるＰＣＲ回収産物を鋳型とし、以下のような一対のプライマーを使用し、ＰＣＲによって増幅させてｈＰＶ－１細胞外領域の遺伝子断片（長さ：約１１７６ｂｐ）の獲得に成功した。
フォワードプライマーｈＰＶ－１－Ｆｃ－Ｆ－ＢｇｌＩＩ：ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号５）
リバースプライマーｈＰＶ－１－Ｆｃ－Ｒ－ＢａｍＨＩ：ＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＧ（配列番号６）
その後、さらに当該ＰＣＲ回収産物を鋳型とし、以下のような一対のプライマーを使用し、またＰＣＲによって増幅させてｈＰＶ－１細胞外領域の遺伝子とヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片をコードする遺伝子を融合した組み換え遺伝子（長さ：約１８５９ｂｐ）の獲得に成功した。
フォワードプライマーｈＰＶ－１－Ｆｃ－Ｆ－ＢｇｌＩＩ：ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号５）
リバースプライマーＰＶ１－ＤＨＦＲ－ＸｂａＩ－Ｒ：ＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧ（配列番号７）
当該ＰＣＲ増幅によって得られた組み換え遺伝子のＤＮＡは、回収およびＤＮＡ制限酵素による切断処理を経た後、発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＤＨＦＲにクローニングし、組み換えプラスミドを得た。組み換えプラスミドは、制限酵素による切断およびＤＮＡ配列決定によって、ＣＨＯ細胞においてヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質を発現・分泌する発現プラスミド（プラスミド名称：ｐＱＹ－ＤＨＦＲ－ＰＶ１－Ｆｃ）の獲得に成功したことが確認された。
１．３ ヒトＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換えタンパク質およびＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質（免疫抗原）の発現と製造
上記発現プラスミドのＤＮＡ（ｐＱＹ－ＤＨＦＲ－ＰＶ１－Ｈｉｓ、ｐＱＹ－ＤＨＦＲ－ＰＶ１－Ｆｃ）をそれぞれＦｕｇｅｎ－６リポソーム（Ｒｏｃｈｅ）と混合した後、ＤＨＦＲ遺伝子欠失型ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－）に形質移入した。形質移入後、薬物（メトトレキセート、ＭＴＸ）でスクリーニングし、それぞれヒトＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換えタンパク質およびヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質を効率的に発現・分泌することが可能な細胞株を得た。スクリーニングで得られた発現細胞株を無血清培地で増幅培養し、それぞれＮｉアフィニティークロマトグラフィーカラムまたはＰｒｏｔｅｉｎ－Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムによって細胞上清から分離・精製し、純度が９０％以上のヒトＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換えタンパク質およびヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質を得た。
図２は分離・精製して得られたヒトＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換えタンパク質（ＤＴＴ還元）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析のパターンであり、結果から、ＤＴＴ還元のヒトＰＶ－１－Ｈｉｓタンパク質のサンプルにおいて、その主要なバンドは５５ｋｄ程度であることが示され、これはその理論的に予想されるタンパク質の分子量の大きさに合致する。
１．４ 組み換えヒトＰＶ－１タンパク質による動物の免疫
まず、ヒトＰＶ－１－Ｈｉｓ組み換えタンパク質を完全フロインドアジュバント（米国Ｓｉｇｍａ社製）と混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下の数箇所に注射した（１００μｌ／マウス、１０μｇ ＰＶ－１－Ｈｉｓタンパク質／回）。最初の免疫から２－３週間後、さらにマウスの皮下の数箇所にヒトＰＶ－１－Ｆｃタンパク質と不完全フロインドアジュバント（米国Ｓｉｇｍａ社製）を含有する混合物を注射し、３－４回強化免疫した後、少量のマウスの血清を取り、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ融合タンパク質がコーティングされた９６ウェルプレートで酵素結合免疫吸着（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）法によってマウス血清における抗ＰＶ－１抗体の力価を検出し、高力価のマウスの脾臓細胞を取って次の工程の細胞融合に使用した。
１．５ 細胞融合
最後の免疫から３－４日後、無菌でマウス脾臓細胞懸濁液を調製し、マウスＳＰ２／０骨髄腫細胞（中国科学院上海生命科学院細胞寄託センターから購入）と、５：１または１０：１の比率で５０％のＰＥＧ－１０００（米国Ｓｉｇｍａ社製）の作用下で融合させた。融合は通常の方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ： Ｎａｔｕｒｅ １９７５；２５６：４９５－４９７）に従い、ＰＥＧ使用量は１ｍｌであり、６０秒以内にゆっくり添加を終えた。９０秒反応させた後、無血清のＲＰＭＩ－１６４０培地で反応を停止させ、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、上清液を除去し、さらに遠心で沈殿した細胞を１０％ＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン、米国Ｓｉｇｍａ社製）を含有するＲＰＭＩ １６４０－１０％ＦＣＳ培地で細胞濃度が１×１０６／ｍｌになるように調整し、９６ウェル平底細胞培養プレート（２００μｌ／ウェル）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（米国Ｔｈｅｒｍｏ社製）で２－３週間培養した。
１．６ 免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）によるＰＶ－１抗体分泌陽性のマウスハイブリドーマ細胞のスクリーニング
本発明の実施例において、免疫組織化学方法によってマウスハイブリドーマからＰＶ－１抗体分泌陽性の細胞株をスクリーニングした。
当該方法の概要は、以下の通りである。
１） ヒトＰＶ－１遺伝子が形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ１）と未形質移入のＣＨＯ細胞を１：６の比率で混合して９６ウェル細胞培養プレートに敷き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩放置した。
２） 細胞培養プレートを取り出し、培養液を吸い取った後、２％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）（２％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液）で固定し、９０％メタノールで透過化した。
３） ＰＢＳ液で洗浄した後、一次抗体であるマウスハイブリドーマ上清またはＰＶ－１免疫マウス血清（１：２００で希釈）を入れて陽性対照サンプルとし、３７℃で１時間インキュベートした。
４） ＰＢＳ液で洗浄した後、二次抗体であるＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧを入れ（１：４００）、３７℃で１時間インキュベートした。
５） ＰＢＳ液で洗浄した後、基質（ＤＡＢ、０．１％Ｈ２Ｏ２）を入れて呈色させた。
図３は当該免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニングの代表的な結果である。
図３に示すように、コード番号がＳＴＷ－１３９－１５のマウスハイブリドーマ細胞培養上清（図３Ｃ）は明らかにＣＨＯ／ＰＶ－１とＣＨＯの混合培養細胞と特異的に結合し、かつその呈色強度と呈色陽性細胞の比率が陽性対照サンプル（ＰＶ－１抗原で免疫されたマウスの血清サンプル、図３Ｂ）と同様であり、ＳＰ２／０骨髄腫細胞の上清液サンプルは呈色の結果が陰性であり（図３Ａ）、これも予想の結果と一致した。
実施例２ ＥＬＩＳＡ法によるマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５の上清液サンプルと組み換えヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質の結合の検出
上記の予備スクリーニングで得られた陽性ハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ－１６４０－１０％ＦＣＳ培地で１－１０個細胞／ウェルになるように希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに敷き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２－３週間培養した。クローンが成長したら、上清液を取ってＥＬＩＳＡで再度抗ＰＶ－１抗体を検出・同定した。
当該ＥＬＩＳＡ検出方法は以下の通りである。
１） 組み換えヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質（２μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．６、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３液）で９６ウェルマイクロプレートをコーティングし、３７℃で２時間コーティングした後、さらに２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を入れて４℃で一晩ブロッキングした。
２） 翌日、コーティングプレートをＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で洗浄した後、被験ハイブリドーマ細胞培養上清液（未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞培養上清は陰性対照である）を３７℃で２時間インキュベートした。
３） ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（米国Ｓｉｇｍａ社製）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。
４） さらにＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で洗浄した後、基質液（ｏ－フェニレンジアミンＯＰＤ、０．１％Ｈ２Ｏ２）を入れて１０－１５ｍｉｎ呈色させた。
５） ０．１Ｍ ＨＣｌを入れて反応を停止させた後、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ－ＦＣマイクロプレートリーダー（米国Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって４９２ｎｍにおけるＯＤ値を読み取った。
図４は当該ＥＬＩＳＡの代表的な結果の概略図である。
図４に示すように、マウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５の上清液サンプルには、高力価のヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質と特異的に結合可能な抗体が含まれていたが、非関連モノクローナル抗体ｍＡｂ１１３のサンプル（抗ＳＯＳＴモノクローナル抗体、ＳＯＳＴはスクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）の略称である）およびＳＰ２／０骨髄腫細胞の上清液サンプルがいずれも陰性であった。
実施例３ ＥＬＩＳＡ法によるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質および他の非関連タンパク質の結合の検出
本実施例において、ＥＬＩＳＡによってマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質および他の非関連タンパク質の結合を検出した。
そのため、ヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質および他の非関連タンパク質（ＣＤ３、ＴＩＧＩＴ－Ｈｉｓ、ＳＩＲＰａ－Ｈｉｓ）またはＦｃ－融合タンパク質（ＰＤ１－Ｆｃ、ＰＤＬ１－Ｆｃ、ＰＤＬ２－Ｆｃ、ｍＰＤＬ１－Ｆｃ、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ、ＣＤ２８－Ｆｃ、Ｂ７－ＦｃおよびＢＴＬＡ－Ｆｃ）を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５サンプルを一次抗体とし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を二次抗体とし、さらに基質液（ｏ－フェニレンジアミンＯＰＤ、０．１％Ｈ２Ｏ２）で呈色させ、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣマイクロプレートリーダー（米国Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって４９２ｎｍにおけるＯＤ値を読み取った。
図５は当該ＥＬＩＳＡ法による検出結果である。結果から、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５サンプルは、ヒトＰＶ－１－Ｆｃ融合タンパク質のみと特異的に結合し（ＯＤ値＞１．０）、ＣＤ３および他の非関連組み換えタンパク質（Ｈｉｓタグ付きのもの、またはＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質）にはいずれも明らかな結合がない（ＯＤ値はいずれも０．１以下である）ことが示された。この結果から、ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体は、抗原の認識と結合において高度な特異性を有し、ＰＶ－１タンパク質のみと結合することが示された。
実施例４ フローサイトメーターによるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒトＰＶ－１遺伝子が形質移入されて発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の結合の検出
本実施例において、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルを一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光標識のウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体とし、フローサイトメーターによってＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体のサンプルとヒトＰＶ－１遺伝子を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の結合を検出・分析した。
そのために、ヒト全長ＰＶ－１組み換えタンパク質の遺伝子を安定的に形質移入して発現するＣＨＯ／ＰＶ－１細胞をそれぞれマウスハイブリドーマＳＴＷ－１３９－１５上清サンプル、非関連マウスハイブリドーマｍＡｂ２１サンプル（抗ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＰＶ－１抗原で免疫されたマウスの血清（陽性対照サンプル、１：２００で希釈）およびマウスＳＰ２／０細胞上清（陰性対照サンプル）と４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＦＩＴＣで標識されたウサギ抗マウスＩｇＧ（１：２００で希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を入れた。４℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ－０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒフローサイトメーター（米国ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にセットして検出した。
図６は当該フローサイトメーターによって検出された代表的な結果の概略図である。図６に示すように、陽性対照サンプルと同様に（図６Ｃ、ＰＶ－１タンパク質で免疫されたマウスの血清）、マウスハイブリドーマＳＴＷ－１３９－１５上清サンプルは明らかにＣＨＯ／ＰＶ－１細胞と特異的に結合できたが（図６Ｄ）、非関連ハイブリドーマサンプル（図６Ｂ）および陰性対照サンプルのマウスＳＰ２／０細胞上清（図６Ａ）はいずれもＣＨＯ／ＰＶ－１細胞と特異的に結合しなかった。
図７はフローサイトメーターによって勾配希釈されたマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとヒトＰＶ－１遺伝子を安定的に形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＶ－１）の結合を検出した抗体溶解度－平均蛍光値（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）曲線であり、結果から、溶解度が０．１－１０μｇ／ｍｌの範囲内でＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体サンプルとＣＨＯ／ＰＶ－１細胞の結合が明らかな投与量－反応曲線（ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｅ）を示すことがわかった。
図８はフローサイトメーターによってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルとＣＨＯおよびＣＨＯ／ＰＶ－１細胞の混合サンプル（９：１で混合）の結合を検出・分析した結果の概略図である。図８に示すように、マウスＳＰ２／０細胞上清の陰性対照サンプル（図８Ａ）および非関連ハイブリドーマ上清サンプル（図８Ｂ）と比較して、マウスハイブリドーマＳＴＷ－１３９－１５上清サンプルは明らかに混合サンプルのうちの一部の細胞と特異的に結合し（図８Ｃ）、結合した陽性細胞の比率が９．６７％であり、これは混合サンプルに入れたＣＨＯ／ＰＶ－１細胞の比率（１０％）と合致した。この結果から、さらに、ＳＴＷ－１３９－１５はＰＶ－１抗原のみを特異的に認識して結合し、ＣＨＯにおける他のタンパク質または抗原物質と結合しないことが証明された。
実施例５ フローサイトメーターによるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒトＨＵＶＥＣ細胞の結合の検出
本実施例において、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルを一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光標識のヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体とし、フローサイトメーターによってさらにＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒトＨＵＶＥＣ細胞の結合を検出・分析した。
そのために、まず、ＨＵＶＥＣ細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で固定して透過化（ｐｅｒｍｅｍｂｉｌｚａｔｉｏｎ）した。マウスハイブリドーマＳＴＷ－１３９－１５上清サンプルまたは陰性対照サンプルとしマウスＳＰ２／０細胞上清を入れた。４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、さらにＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ－ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｓｉｇｍａ社製）を追加した。４℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ－０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒフローサイトメーター（米国ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にセットして検出した。
図９は当該フローサイトメーターによって検出された代表的な結果の概略図である。図９に示すように、マウスＳＰ２／０細胞上清の陰性対照サンプル（Ａ０１ ＮＣ）と比較して、マウスハイブリドーマＳＴＷ－１３９－１５上清サンプルは明らかにヒトＨＵＶＥＣ細胞と結合した。
実施例６ 免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒト正常組織の組織切片の結合の検出
本実施例において、免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５サンプルとヒト由来の一部の正常組織の切片の結合を検出・分析したが、その検出工程は以下の通りである。
ヒト正常組織のパラフィン切片に対して再水和および抗原回復処理を行った後、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５サンプルを一次抗体として加え、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、さらに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体）を加え、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、基質であるＤＡＢを入れて呈色させ、ヘマトキシリンで二次染色し、封止し、撮影した。
図１０は当該免疫組織化学の代表的な結果の一つである。図１０に示すように、肺、肝臓、脳、心臓、膵臓、脾臓などの正常組織の免疫組織化学の染色切片では、ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体サンプルは肺組織のみと特異的に結合し、他の組織切片との呈色の結果が明らかではなかった。ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体の肺組織における免疫組織化学検出が陽性であるという結果も、文献で報告されたＰＶ－１遺伝子が肺組織で発現するという結果と合致し、ＰＶ－１抗原をコードするｃＤＮＡは当時はラットの肺組織から分離してクローニングされたものであった（Ｓｔａｎ ＲＶら，１９９９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：１１８９－９８）。
実施例７ 免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とヒト腫瘍組織の組織切片の結合の検出
本実施例において、免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によってマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体サンプルとヒト由来の一部の腫瘍組織の切片の結合を検出・分析したが、その検出工程は以下の通りである。
ヒト腫瘍組織に対して再水和および抗原回復処理を行った後、マウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体サンプルを一次抗体として加え、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、さらに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体）を加え、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、基質であるＤＡＢを入れて呈色させ、ヘマトキシリンで二次染色し、封止し、撮影した。
図１１は当該免疫組織化学の代表的な結果の一つである。図１１に示すように、ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体サンプルは多くの腫瘍組織（肺癌、肝臓癌、脳腫瘍、膵臓癌、卵巣癌など）の領域の血管様構造と特異的に結合できたが、リンパ腫組織の切片との呈色の結果は明らかではなかった。
ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体が多くの悪性腫瘍組織と結合するが、大半の正常組織と結合しない（実施例６の結果を参照のこと）ということから、当該モノクローナル抗体は腫瘍領域の血管を特異的に標的とする薬物または製剤の製造の理想的な物質またはベクターである。
実施例８ フローサイトメトリー法によるマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体とカニクイザルＰＶ－１タンパク質の結合の検出
１） ヒトおよびサルのＰＶ－１タンパク質の細胞膜外領域のアミノ酸配列のアライメント解析
ヒトＰＶ－１タンパク質の細胞膜外アミノ酸配列（配列番号８）とカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＶ－１タンパク質（ＮＣＢＩ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＧ９２６４７．１）の細胞膜外領域のアミノ酸配列（配列番号２５）のアライメント解析の結果を図１２に示す。図１２に示すように、タンパク質の配列では、サルＰＶ－１タンパク質とヒトＰＶ－１タンパク質の細胞膜外領域の相同性が９５％であり、１７個のアミノ酸部位の配列が異なる。
２） サルＰＶ－１遺伝子を発現させるＣＨＯ細胞株の構築
Ｇｅｎｂａｎｋで公開されたカニクイザルＰＶ－１全長タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＧ９２６４７．１）に準じ、蘇州金唯智生物科技有限公司に対応するサルＰＶ－１ ｃＤＮＡ断片の人工合成を依頼し、ＤＮＡ制限酵素で処理した後、ｐＣＤＮＡ３．１－ＤＨＦＲ発現プラスミドにクローニングし、組み換えプラスミドを得た。組み換えプラスミドは、制限酵素による切断およびＤＮＡ配列決定によって、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－細胞膜にカニクイザルＰＶ－１全長タンパク質が発現可能な組み換えプラスミド（プラスミド名称：ｐＣＤＮＡ３．１－ＤＨＦＲ－ｍｋＰＶ１）の獲得に成功したことが確認された。
上記発現プラスミドのＤＮＡをＦｕｇｅｎ－６リポソーム（Ｒｏｃｈｅ）と混合した後、ＤＨＦＲ遺伝子欠失型ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－）に形質移入した。形質移入後、８％ＦＢＳを含有する通常のＩＭＤＭ培地でスクリーニングし、カニクイザルＰＶ－１全長タンパク質を発現する細胞株を得た。
３） フローサイトメーターによるマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５とＣＨＯ－／サルＰＶ－１細胞の結合の分析
実施例４に記載のフローサイトメトリー法によってマウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５のサンプルと上記のカニクイザルＰＶ－１全長タンパク質を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｍｏｎｋｅｙ ＰＶ－１）の結合を検出・分析した。当該フローサイトメーターの代表的な検出結果は、図１３に示すように、陰性対照サンプル（ＳＰ２／０骨髄腫細胞培養上清液、図１３Ａ）および非関連マウスモノクローナル抗体サンプルｍＡＢ７（抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、図１３Ｂ）と比較して、マウス由来モノクローナル抗体ＳＴＷ－１３９－１５はＣＨＯ／ｍｏｎｋｅｙＰＶ－１細胞と明らかに結合できた（図１３Ｃ）。この結果から、予備的に、カニクイザルＰＶ－１タンパク質の細胞膜外アミノ酸配列とヒトＰＶ－１タンパク質のアミノ酸配列の異なる部位はＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体との結合に影響しないことが示された。ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体がカニクイザルＰＶ－１タンパク質と特異的に結合できるという結果から、カニクイザルがＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体の体内における研究の理想的な関連動物であることも示唆された。
実施例９．マウス由来ＳＴＷ－１３９－１５モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子のクローニング・増幅と分析
本実施例において、まずマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５から全ＲＮＡを抽出し、さらに当該ＲＮＡを鋳型とし、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）法（Ｗａｎｇ Ｙら：Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃＤＮＡ。ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００６；７ Ｓｕｐｐｌ（４）：Ｓ９）によってそれぞれクローニングして増幅してＳＴＷ－１３９－１５抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のｃＤＮＡ遺伝子断片を得た。ここで、ｃＤＮＡ遺伝子のクローニング工程は以下の通りである。
工程１．ＲＮＡ抽出試薬（ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ、Ｔａｋａｒａ社製）でマウスハイブリドーマ細胞ＳＴＷ－１３９－１５から全ＲＮＡを抽出した。
工程２．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法によってエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管においてｃＤＮＡ鋳型を得た。
ここで、ＳＴＷ－１３９－１５抗体の軽鎖可変領域の逆転写に使用されたＰＣＲプライマー（ＳＴＷ－１３９－１５－Ｌ）配列はＴＧＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＴ（配列番号９）である。
ＳＴＷ－１３９－１５抗体の重鎖可変領域の逆転写に使用されたＰＣＲプライマー（ＳＴＷ－１３９－１５－Ｈ）配列はＧＣＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＴＣ（配列番号１０）である。
Figure 0007052059000001
温度４２℃で１時間反応させた後、７５℃に昇温し、１５分不活性化させて得られたｃＤＮＡを－２０℃に置き、保存して使用に備えた。
工程３．ＳＴＷ－１３９－１５抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子のＰＣＲによるクローニング・増幅
縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）とＰＣＲ法によるＳＴＷ－１３９－１５抗体の軽鎖可変領域の遺伝子のクローニング・増幅に使用された１対のプライマーは以下の通りである。
フォワードプライマー：ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＷＣＭ ＣＡ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＴ（配列番号１２）
ここで、Ｗ＝ＡまたはＴであり、Ｍ＝ＡまたはＣである。
縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）とＰＣＲ法によるＳＴＷ－１３９－１５抗体の重鎖可変領域の遺伝子のクローニング・増幅に使用された１対のプライマーは以下の通りである。
フォワードプライマー：ＣＡＲ ＣＴＧ ＣＡＲ ＣＡＲ ＹＣＴ Ｇ（配列番号１３）
ここで、Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｙ＝ＣまたはＴである。
リバースプライマー：ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＴ（配列番号１４）
ＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡ産物を１％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。電気泳動終了後、分離されたＤＮＡバンドを切り出してそれぞれシークエンシングを行い、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列を得た。なお、測定された当該抗体の軽鎖可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１５に示し、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列から推測された抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示す。当該軽鎖の抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９に示す。
測定された当該抗体の重鎖可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号２０に示し、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列から推測された抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２１に示す。当該重鎖の抗原相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示す。
実施例１０ ヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃの構築
実施例９でクローニング・増幅されたマウス由来ＳＴＷ－１３９－１５抗体の軽鎖可変領域の遺伝子および重鎖可変領域の遺伝子をそれぞれヒトκ軽鎖定常領域（Ｃ－ｄｏｍａｉｎ）およびヒトＩｇＧ１－重鎖定常領域の遺伝子断片と融合させ、ヒト－マウスキメラ軽鎖の遺伝子（ＳＴＷ－１３９－１５－Ｌ）およびヒト－マウスキメラ重鎖の遺伝子（ＳＴＷ－１３９－１５－Ｈ）を得た。軽鎖キメラ遺伝子と重鎖キメラ遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌に導入して増幅し、分離してヒト－マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子およびヒト－マウスキメラ抗体重鎖遺伝子を含有する発現プラスミドを得た。
その後、ヒト－マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドの一部のサンプル（組み換えプラスミド番号Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９）およびヒト－マウスキメラ抗体重鎖遺伝子を含有する発現プラスミドの一部のサンプル（組み換えプラスミド番号Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１５）をそれぞれペアで組み合わせ、Ｆｕｇｅｎ－６リポソーム（Ｒｏｃｈｅ社製）と混合した後、ＣＨＯ細胞に共形質移入した。 細胞の形質移入から２－３日後、培養上清液を取り、ヒトＰＶ－１－Ｆｃタンパク質をコーティングした９６ウェルプレートであり、ＨＲＰ酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を二次抗体とし（上海西塘生物公司から購入）、二次抗体を検出するために、マイクロプレートリーダーによって４９２ｎｍで数値を読み取り、上清におけるキメラ抗体とヒトＰＶ－１タンパク質の結合を検出した。
当該ＥＬＩＳＡの代表的な検出結果（４９２ｎｍにおける読み取り値）は、下記表１および図１４に示す。
Figure 0007052059000002
表１および図１４の結果から、同時に正確にヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５重鎖遺伝子を発現させるプラスミドおよび正確にヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５軽鎖遺伝子を発現させるプラスミドが形質移入されたＣＨＯ細胞の培養上清（Ｈ１５＋Ｌ１９）サンプルはヒトＰＶ－１－Ｆｃタンパク質と特異的に結合できることが示された。
上記形質移入細胞の上清液を遠心して０．４５μｍのフィルターでろ過した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ｐｒｏｔｅｉｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、米国ＧＥ社製）にセットし、分離して精製し、純度が９５％以上のヒト－マウスキメラ抗体（ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃ）タンパク質を得た。
精製したＳＴＷ－１３９－１５－Ｃ抗体タンパク質は、ろ過で除菌した後、無菌ＰＢＳ液に再溶解させ、タンパク質の最終溶解度が１０ｍｇ／ｍｌ程度の液体製剤とし、当該製剤は２－８℃の低温で光を避けて長期間保存することができる。
実施例１１ カニクイザル体内におけるヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃの生物的治療効果または活性の測定
ＳＴＷ－１３９－１５はマウスＰＶ－１を認識しないため、マウス体内においてその生物的治療効果または活性を測定することができる。そのため、本実施例において、試験動物としてカニクイザルを使用し、体内におけるヒト－マウスキメラ抗体ＳＴＷ－１３９－１５－Ｃのレーザーによるカニクイザルの脈絡膜新生血管に対する抑制の試験研究を行った。当該研究は、成都華西海圻医薬科技有限公司（ＷｅｓｔＣｈｉｎａ－Ｆｒｏｎｔｉｅｒ ＰｈａｒｍａＴｅｃｈ Ｃｏ．、ＷＣＦＰ）、すなわち、国家成都新薬安全性評価センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ、ＮＣＣＳＥＤ）に委託され完了した。
試験目的
ヒト－マウスキメラ抗体（ＳＴＷ－１３９－１５Ｃ、サンプル番号ＳＴＷ００７）の硝子体内注射による投与のレーザーによるカニクイザルの脈絡膜新生血管の透過および生長に対する影響を研究し、当該薬のさらなる研究に動物試験の根拠を提供する。
当該動物試験の研究は２段階に分け、その第１段階の試験モデル、投与群および試験結果の記載は以下の通りである。
動物試験モデルと投与群
１１．１ モデルの構築
１１．１．１ 麻酔
カニクイザルをペントバルビタールトンナトリウムで麻酔し（２５ｍｇ／ｋｇ、静脈注射）、麻酔中、不定期に角膜の潤いを維持するために少量のセルビスクを滴下した。
１１．１．２ 瞳孔拡大
両眼にミドリン（複合トロピカミド点眼液）を滴下して瞳孔を拡大させた。
１１．１．３ レーザー光凝固
カニクイザルの頭部を眼科レーザー光凝固装置の前に固定し、全網膜検影器によって黄斑領域を光凝固させた。光凝固は黄斑中心窩を囲むが、中心窩に傷づかないようにし、それぞれの目の８～９箇所に照射した。レーザーのパラメーター：スポット径５０μｍ、エネルギー０．６～０．７Ｗ、露出時間０．０５ｓ。光凝固の成功の判定：泡の生成が見られ、ブルッフ膜の破壊が示唆される。
レーザー光凝固から２～３週間でフルオロセイン血管イメージングを行い、モデル構築の成功の是非を判断する根拠とした。
サルの各眼球に少なくとも１つの４級の斑がある場合、モデル構築が成功したと判断する。
１１．２ 投与量の設計
各群の動物は、レーザー光凝固から３週間後、投与を開始した。投与量の設計は、表２の通りである。
Figure 0007052059000003
ここで、陽性薬物ｈＰＶ１９モノクローナル抗体はヒトおよびサルＶＥＧＦ抗原を特異的に認識して結合するヒト化抗体である（中国特許文献：授権特許番号：２０１２１０５４０６９２Ｘ、特許名称：血管内皮増殖因子とその受容体の結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびそのコード配列と使用、ならびに米国特許文献：授権特許番号：ＵＳ９５８０４９８Ｂ２を参照のこと）。
１１．３ 投与
投与経路：両眼の硝子体内注射
投与経路の選択理由：臨床用の投与経路と一致する
投与頻度：単回投与
投与方法：各群のカニクイザルをペントバルビタールトンナトリウムで麻酔した（約２５ｍｇ／ｋｇ、静脈注射。サルの麻酔状況によって適切な麻酔の投与量を調整することができる。）後、注射する目をポビドンヨード溶液で消毒し、表２に示す両眼の硝子体内注射によって対応する濃度のＳＴＷ００７、陽性薬およびＳＴＷ００７＋陽性薬を投与し、モデル対照群では、等体積の０．９％ＮａＣｌ注射液を投与した。必要な場合、注射する目にオキシブプロカイン塩酸塩点眼液を１～２滴滴下して表面麻酔した後、注射操作を行った。
硝子体内注射した後、抗感染および角膜に潤いを持たせるためにオフロキサシン眼軟膏を１～２滴滴下した。
投与の当日を試験の１日目と定義する。
第二段階：動物試験結果：
表３は、光凝固から３週間後の硝子体へのＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体（ＳＴＷ００７）および陽性対照薬物ｈＰＶ１９（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）の注射のカニクイザルのフルオロセイン漏出面積の減少量および改善率に対する影響（データの統計は投与後４９日目までである）である。
図１５Ａ～図１５Ｄは、それぞれ各群の動物の硝子体への注射による投与後７、１４および２１日目の時点における眼底蛍光イメージング画像である。
Figure 0007052059000004
注：投与後７日目～投与後３６日目の測定時点で、サンプル１＋２群４Ｍ００１には、右眼にフルオロセイン漏出面積のデータがなかったため、サンプルサイズは１である。
表３および図１５Ａに示すように、治療前と比較して、モデル対照群（０．９％ＮａＣｌ注射液）では、投与後、眼底のフルオロセイン漏出には、改善が見られず、むしろ重篤になった（観察期間中のフルオロセイン漏出面積の平均改善率は－１１．１２％～－５４．７３％であった。７－２１日目の眼底蛍光イメージングの一連の写真は図１５Ａを参照のこと）。一方、ＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体サンプル（０．５ｍｇ／目）では、投与後７日目から、眼底フルオロセイン漏出面積が明らかに改善した（観察期間中のフルオロセイン漏出面積の改善率は３３．２７％～６４．１０％であった。７－２１日目の眼底蛍光イメージングの一連の写真は図１５Ｂを参照のこと）。そのフルオロセイン漏出の減少程度は同投与量（０．５ｍｇ／目）の陽性対照薬物ｈＰＶ１９（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）群の結果に近かった（観察期間中のフルオロセイン漏出面積の改善率の範囲は４５．７５％～７１．１２％であった。７－２１日目の眼底蛍光イメージングの一連の写真は図１５Ｃを参照のこと）。
ＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体サンプル（０．２５ｍｇ／目）と陽性対照薬物ｈＰＶ１９モノクローナル抗体（０．２５ｍｇ／目）の併用後、観察期間中のフルオロセイン漏出面積の改善率は８０．２８％～９５．２０％の間に維持され（７－２１日目の眼底蛍光イメージングの一連の写真は図１５Ｄを参照のこと）、単独の薬物の注射投与量がそれぞれ半減した条件において、その治療効果は２倍の注射投与量の陽性対照薬物ｈＰＶ１９モノクローナル抗体（０．５ｍｇ／目）よりも優れている。この結果から、ＰＬＶＡＰ／ＰＶ－１と特異的に結合するＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体は、カニクイザル体内におけるレーザーによって誘導された脈絡膜新生血管の透過に明らかな抑制作用があり、ＳＴＷ－１３９－１５Ｃモノクローナル抗体とＶＥＧＦモノクローナル抗体薬物の併用は、それぞれ単独で治療する場合よりも治療効果が優れていることがわかる。

Claims (16)

  1. ヒト原形質膜小胞関連蛋白質ＰＶ－１と特異的に結合するモノクローナル抗体またはその誘導体であって、第一の可変領域および第二の可変領域を含み、ここで、前記第一の可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示されるアミノ酸配列であり、前記第二の可変領域は抗体重鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする抗体またはその誘導体。
  2. 前記第一の可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であり、前記第二の可変領域は抗体重鎖可変領域であり、配列番号２１で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその誘導体。
  3. 前記抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域を含み、かつ前記抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域のヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
  4. 前記ヒト抗体軽鎖定常領域はヒト抗体κ鎖または抗体λ鎖由来のものであって、前記ヒト抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプ、ＩｇＡまたはＩｇＭ由来のものであることを特徴とする請求項３に記載の抗体またはその誘導体。
  5. 前記誘導体は、抗体Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＡＤＣ）、またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
  6. 請求項２に記載の抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で示され、抗体重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２０で示されることを特徴とするＤＮＡ分子。
  7. 請求項６に記載のＤＮＡ分子の配列および当該配列と機能的に連結した発現調節配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターで形質転換されていることを特徴とする組み換え宿主細胞。
  9. 前記組み換え宿主細胞またはその後代細胞は請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体を発現することを特徴とする請求項８に記載の組み換え宿主細胞またはその後代細胞。
  10. 薬学的有効量の請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物または薬物組成物。
  11. 薬学的に有効量の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦまたはその受容体ＶＥＧＦ－Ｒを拮抗・遮断する活性成分、および薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする請求項１０に記載の薬物組成物。
  12. 血管新生または透過に関連する疾患を治療する薬物の製造における請求項１０または１１に記載の薬物または薬物組成物の使用。
  13. 前記疾患は脈絡膜新生血管性眼底疾患であることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
  14. 前記疾患は糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
  15. 組織または細胞サンプルにおける原形質膜小胞関連蛋白質ＰＶ－１を検出するための試薬またはキットであって、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその誘導体を含む試薬またはキット。
  16. 請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体を製造する方法であって、
    ａ） 請求項６に記載のＤＮＡ分子の配列および当該配列と機能的に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
    ｂ） 工程ａ）に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    ｃ） 前記抗体の発現する条件で、工程ｂ）で得られた宿主細胞を培養する工程、ならびに
    ｄ） アフィニティークロマトグラフィーによって宿主細胞の培養液から前記抗体を分離・精製する工程
    を含むことを特徴とする方法。
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