KR20200118447A - 인간 원형질막 소포 관련 단백질 pv-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도 - Google Patents

인간 원형질막 소포 관련 단백질 pv-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에서 항체 경쇄 가변영역의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열이며; 항체 중쇄 가변영역의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 원형질막 소포 관련 단백질(plasmalemma vesicle-associated protein, PLVAP, PV-1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체를 제공하였다. 본 발명은 또한 상기 항체의 인간-마우스 키메라항체의 제조과정 및 상기 인간-마우스 키메라항체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 제공하였다. 상기 항체 또는 이의 유도체는 약학조성물의 성분으로 또는 적합한 약제학적 제제로 제조될 수 있으며, 맥락막혈 혈관신생 안저 질환 등 맥락막 혈관신생/침투와 관련된 질환의 치료를 위해 단독으로 또는 항-VEGF 단일클론항체와 같은 다른 치료 수단과 함께 사용된다.

Description

인간 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도
본 발명은 생명공학-단일클론항체 분야에 속한다. 본 발명은 인간 원형질막 소포 관련 단백질(Plasmalemma vesicle-associated protein, 즉 PLVAP이며, PV-1이라고도 함)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 코딩서열 및 제조방법과 용도에 관한 것이다.
체내에서, 다양한 기관 및 조직에서 혈관의 가장 안쪽 층의 내피세포(endothelial cells, EC) 및 그 주변을 감싸는 주피세포(pericyte) 및 기질 등으로 구성된 혈관계는 주로 하기와 같은 이중 및 보완 역할을 한다:
1) 혈관벽 내에서 순환하는 혈액을 혈관벽 외부의 조직으로부터 분리시켜, 물리적 장벽(barrier)의 역할을 한다.
2) 혈관 주변조직과의 산소, 이산화탄소, 물, 전해질의 교환, 호르몬/단백질 또는 기타 영양소 및 대사물질의 수송, 염증세포/면역세포의 전이 등을 매개하여 투과성(permeability)의 역할을 한다.
혈액-조직 사이의 물질교환 및 내분비선, 간동양혈관, 사구체, 골수, 비장, 위장상피, 뇌 및 망막맥락막신경총(choroid plexus)과 같은 대사가 아주 강한 조직기관에서, 혈관 내피는 완전히 연결되거나(continuous) 또는 주피세포(pericyte)에 의해 둘러싸여 있는 것이 아니며, 불연속적(discontinuous)이거나 유동모양(Sinusoid)을 나타낸다(리뷰문헌참조: Crivellato E, Nico B and Ribatti D, 2007 Contribution of endothelial cells to organogenesis, a modern reappraisal of an old Aristotelian concept. J Anat 211:415-427). 이들 영역의 혈관 내피표면 또는 혈관벽은 종종 직경이 60 내지 80nm인 많은 미세기공(fenestrae or pores) 또는 카베올라(caveolae, 원형질막소포로도 알려짐, plasmalemmal vesicle)모양의 구조를 갖는다. 이들 미세기공은 종종 수십 또는 수백 개가 질서 있고 또한 등간격으로 배열되며, 전자현미경 하에서 체판(sieve plate) 또는 벌집 모양처럼 보인다. 일부 미세기공에는 두께가 약 6 내지 7 nm인 분지형 격막(fenestal diphragem) 구조가 내장되어 있다(Bearer EL and Orci L. 1985 J Cell Biol. 100:418-428; Peters KR, Carley WW, Palade GE. 1985 J Cell Biol. 101:2233-8; Lomardi T et al., 1986 J Cell Biol. 102: 1965-1970 참조).
혈관-조직 사이의 물질교환 및 세포 이동에는 일반적으로 두 가지 방법이 있다: 1)혈관내피세포 사이의 간격을 통한 파라세포이동(para-cellular migration); 2)혈관내피/혈관벽의 미세기공(fenestrae) 또는 카베올라(caveolae)를 통해 혈관벽의 한 쪽에서 혈관벽의 다른 쪽으로 통과 또는 반전하는 경내피 이동(trans-endotheial migration)이다. 내피혈관의 주위를 둘러싸는 주피세포(pericyte)가 있는지 여부, 내피혈관 사이의 연결의 견고성과 간극의 크기, 내피혈관벽에 미세기공(fenestrae)이 있는지 여부, 및 미세기공 내에 분지형격막(diphragem)이 있는지 여부 등 요소는 모두 혈관의 장벽구조 및 투과성에 영향을 미치고, 혈관-조직 사이의 물질교환 및 세포이동의 효율 및 정도를 제어한다. 그 중에서 주피세포(pericyte)에 의해 둘러싸여 있고, 긴밀히 연결되여 있으며, 또한 혈관벽에 미세기공이 없는 내피혈관의 투과성이 가장 낮고, 물질교환 효율 및 세포이동 정도도 상응하게 가장 낮다. 주피세포(pericyte)에 둘러싸여 있지 않고, 간헐적이며, 또한 혈관벽에 미세기공이 있는 내피혈관(예를 들어 간동양혈관영역)의 투과성이 가장 높고, 물질교환 효율 및 세포이동의 정도도 이에 따라 가장 높다. 반면에 미세기공 내에 분지형 격막을 갖는 천공된 내피혈관은 일반적으로 미세기공 내에 분지형격막이 없는 천공된 내피혈관보다 투과성이 낮다.
현재 유일하게 알려진 내피혈관의 미세기공중의 격막(fenestal diphragem) 또는 원형질막 카베올라 경부의 격막(stomatal diaphragm)을 구성하는 물질은 원형질막 소포관련 단백질(Plasmalemma vesicle-associated protein, PLVAP)이다. PLVAP는 PV-1이라고도 하며, 내피혈관에서 특이적으로 발현되는 당단백질이고; 이의 cDNA 및 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 Stan RV 등이 최초로 랫트 폐 조직으로부터 클로닝하여 얻었다고 보고되었다(Stan RV, Ghitescu L, Jacobson BS, Palade GE: 1999 J Cell Biol. 145:1189-9; Stan RV, Kubitza M, Palade GE. 1999 Proc Natl Acad Sci 96:13203-13207). 그 후, Stan RV 등은 인간 및 마우스의 PLVAP/PV1 유전자와 이의 cDNA 및 암호화 아미노산 서열도 보고하였다(Stan RV, Arden KC, Palade GE 2001 Genomics 72: 304-313; 리뷰문헌참조: Stan RV. 2007 Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. J Cell Mol Med. 621-643).
PV-1은 단백질 분자량이 55 내지 60 kD인 단일 막관통 II형 단백질(type-II transmembrane protein)이다. 랫트 및 마우스의 PV-1 단백질의 총 길이는 438개 아미노산(인간 PV-1단백질은 442개 아미노산을 가짐)이며, 이의 세포 내 영역은 비교적 짧고(27개 아미노산 함유), N-말단에 위치하며; C-말단에 위치한 세포 외 영역은 비교적 길고(358개 아미노산 함유), 혈관 내강에 노출된다.
정상적인 생리조건 하에서, PV-1유전자는 뇌하수체(pituitary gland), 부신, 뇌 또는 망막 맥락막신경총(choroid plexus) 및 페조직과 같은 일부 내분비선에서 높게 발현되는 외에, 생체 내 기타 조직에서의 발현수준은 비교적 낮거나(일반적으로 백그라운드 발현 정도만큼 유지) 또는 발현되지 않는다(Hnasko R et al. 2002 J Endocrinol1. 75:649-61). 그러나 종양, 저산소증/외상 및 염증 등과 같이 혈관신생을 수반하는 병리학적 변화가 발생할 때, 이들 조직에서 PV-1유전자의 발현은 유의하게 상향조절된다(Madden SL et al., 2004 Am J Pathol. 165:601-608; Carson-Walter EB et al., 2005 Clin Cancer Res. 11:7643-50; Liu Y et al., 2010 J Neuroncol. 99:13-24; Mozer AB et al., 2010 Curr Neurovasc Res. 7:238-50).
혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) (Leung DW et al., 1989 Science 246:1306-09)는 혈관투과성인자(vascular permeability factor, VPF) (Keck PJ et al., 1989 Science 246:1309-12)로도 알려져 있으며 현재 혈관 신생 및 침투를 자극하는 가장 강력하고 가장 중요한 물질(Carmeliet P et al., 1996 Nature 380: 435-438; Ferrara N et al., 1996 Nature 380: 439-412)이다. VEGF/VPF는 또한 현재 혈관내피 원형질막에서 미세기공 구조의 형성을 유도하고 PV-1유전자의 발현을 상향 조절하는 것으로 알려진 가장 중요한 인자이다(Roberts WG and Palade GE. 1995 J Cell Sci. 108:2369-2379; Roberts WG and Palade GE. 1997 Cancer Res. 57:765-772; Roberts WG et al. 1998 Am J Pathol. 153:1239-48; Esser S et al., 1998 J Cell Biol 140:947-959; Strickland LA et al., 2005 J Pathol. 206:466-475; Ioannidou S et al. 2006 Proc Natl Acad Sci 103: 16770-16775).
종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6), 종양촉진인자인 포볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA) 등과 같은 일부 인자도 내피 원형질막 미세기공의 형성을 자극하고 PV-1유전자의 발현을 상향 조절할 수 있다(Lombardi T et.al. 1986 JCB 102:1965-1970; Stan RV et al. 2004 Mol Biol Cell 15: 3615-3630; Strickland LA et al., 2005 J Pathol. 206:466-475).
PV-1의 생리기능에 관한 최초의 연구보고서는 Keuschnigg J등이 2009년 Blood저널에 발표한 기사에서 발췌한 것이다(Keuschnigg J et al., 2009 Blood. 114:478-84. The prototype endothelial marker PAL-E is a leukocyte trafficking molecule). PAL-E는 실제로 마우스유래 단일클론 항체의 코드명이고, 전체 명칭은 Pathologische Anatomie Leiden-endothelium(Schlingemann RO et al., 1985 Lab Invest. 52:71-6)이며, 그가 인식하는 항원은 주로 혈관에서 특이적으로 발현되고; Niemela H 등은 PAL-E단일클론 항체에 의해 인식된 항원이 인간 원형질막 소포 관련 단백질(PV-1)(Niemela H et al., 2005 Blood.;106:3405-3409)이라고 보고하였다. Keuschnigg J 등은 TNF-α 활성화 후 인간 제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)에서, PAL-E/PV-1 단백질이 내피세포막의 주변에 유의하게 응집되고, 또한 제대정맥내피세포를 관통하고 있는 림프구주위를 둘러싸며; PAL-E/PV-1 항체를 추가하면 림프구의 관통이동을 억제할 수 있으며; 급성복막염 및 기낭염 마우스 모델에서, 꼬리정맥으로 코드번호 MECA-32 항체를 주사한 후, 마우스의 복강 내 단핵구 또는 림프구의 수는 85% 감소하였다(Keuschnigg J et al., 2009 Blood. 114:478-84).
PLVAP/PV-1이 내피혈관 미세기공에서 분지형 격막의 형성 및 혈관장벽/투과성 조절에 있어서의 중요성은 최근 유전자 녹아웃 마우스에서 명확하게 입증되었다.: 예를 들어 Stan RV등에 의해 2012년 Dev Cell.저널에 보고된 바와 같이: PV-1유전자 녹아웃 마우스는, C57BL/6N 배경 하에서, 배아는 생존할 수 없으며; 혼합된 유전적 배경에서, 몇 개의 배아는 태어날 때까지 생존할 수 있다. PV-1유전자 녹아웃 된 마우스는 혈관내피 원형질막에서 미세기공 격막 또는 카베올라 격막을 형성할 수 없었으며; 격막의 결실은 내피세포의 누출을 증가시키고, 다량의 단백질의 혈관 밖으로의 누출을 초래하여, 조직에서 부종이 나타나게 되고, 태어난 동물은 발육초기에 심각한 비염증성 단백질손실성 장염으로 사망하게 된다(Stan RV et al., 2012 Dev Cell. 23:1203-18).
마찬가지로, Herrnberger L등에 의해 2012년에 Histochem Cell Biol 저널에 보고된 바와 같이: Plvap(PV-1)녹아웃 마우스의 동형접합(Plvap-/-)배아는, C57BL/6N유전자 배경에서 태어나기 전에 사망했으며, 피하 부종, 출혈 및 피하모세혈관 결함 등과 같은 이상이 나타났다. 또한, Plvap-/-배아의 심장은 심실중격 결손과 더 얇은 심실벽이 나타났다. C57BL/6N/FVB-N 혼합유전자 배경에서, Plvap-/-배아는 태어날 때까지 발육할 수는 있지만, 태어난 마우스는 최대 4주 동안만 생존할 수 있다(Herrnberger L et al., 2012 Histochem Cell Biol. 138:709-24).
정상적인 상태에서, 생체 내에는 중추 신경계의 혈액뇌장벽(blood-brain barrier), 눈의 혈액망막장벽(blood-retinal barrier)과 같은 혈관-조직 장벽에 의해 보호되는 영역이 있으며, 이 내피 혈관벽에는 일반적으로 원형질막 미세기공이 없으며, PV-1/PAL-E항원을 발현하지 않는다. 하지만 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 척수손상, 실험적 알러지성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)/다발성경화증(multiple sclerosis, MS), 뇌의 원발성 또는 전이성 종양, 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 등 일부 병리학적 조건하에, 이 영역의 혈관-조직 장벽구조는 종종 파괴되며, 이의 내피 혈관벽에는 미세기공이 나타나며 또한 상향 조절된 PV-1/PAL-E항원의 발현을 동반한다(Carson-Walter EB et al., 2005, Clin Cancer Res. 11:7643-50; Shue EH et al., 2008 BMC Neurosci 9:29; Mozer AB et al., 2010 Curr Neurovasc Res. 7:238-508). 예를 들어, Shue EH 등은 마우스의 뇌동맥색전증에 의해 유도된 급성 대뇌허혈(cerebral ischemia)모델에서, 급성 뇌허혈 발생 48시간 후 색전된 영역의 소수 뇌혈관에서 PV-1/PAL-E항원이 발현되기 시작하고, 7일 정도에 색전술 영역의 뇌혈관에서 PV-1/PAL-E항원의 발현은 정점에 도달함을 발견하였다(Shue EH et al. 2008 BMC Neurosci 9:29).
마찬가지로, Schlingemann RO 등은 당뇨망막병증환자 및 혈관-망막 장벽 구조가 손상된 당뇨병성 마우스 Akimba에서, PV-1/PAL-E항원이 망막 내피 혈관벽에서 상향 조절되고, 또한 이의 상향 조절된 발현 수준이 혈관-망막 장벽 구조의 손상정도 및 투과도와 정적 상관관계가 있음을 발견했다(Schlingemann RO et al., 1999, Diabetologia. 42:596-602; Wisniewska-Kruk J et al., 2014, Exp Eye Res. 122:123-31). 렌티바이러스-매개 침묵간섭 RNA(siRNA)기술은, 내피세포에서 PV-1유전자의 발현을 억제하며, VEGF-유도 내피 혈관 원형질막 미세기공/카베올라의 형성 및 혈관-망막 장벽구조의 손상을 방지하거나 감소시킬 수 있다(Wisniewska-Kruk J et al. 2016 Am J Pathol. 186:1044-54).
따라서, PLVAP(PV-1)는 내피 원형질막 미세기공 격막(fenestal diphragem) 및 카베올라 격막(stomatal diaphragm)의 주요 구성요소를 구성할 뿐만 아니라, 내피 혈관 원형질막의 미세기공 또는 카베올라 구조를 지지하며, 또한 혈관 신생 및 침투의 조절에 직접적으로 참여한다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제중 하나는 인간 원형질막 소포 관련 단백질PLVAP(또는 PV-1)항원을 특이적으로 인식 및 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체, 예를 들어 항체Fab-단편, Fv-단편, 단일사슬 항체, 이중특이성 항체(bi-specific), 항체-약물-복합체(antibody-drug-conjugated, ADC), 키메라항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T-Cell , CAR-T) 등을 제공하는 것이다.
상기 단일클론항체 또는 이의 유도체는 주요 활성성분으로서 단독으로 사용되어, 적합한 의약 제제를 제조할 수 있으며 PLVAP(PV-1)-매개 혈관신생/침투의 간섭에 사용되어 관련 질환의 발생 및 발전을 치료 또는 지연시키는 효과에 도달할 수 있다. 그 중에서 상기 항체의 치료에 적합하고 혈관신생/침투와 밀접한 관계가 있는 질병에는 다양한 악성종양, 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema, DME)과 같은 당뇨망막병증 등이 포함된다.
항-PLVAP(PV-1)-항체는 상기 질환을 치료할 때, 현재 시판 중에 있거나 연구 중에 있는 기타 약물과 순차적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 두 번째 기술적 과제는 상기 항체를 암호화하는 DNA 분자 또는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 세 번째 기술적 과제는 상기 항체를 함유하는 약물 또는 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 네 번째 기술적 과제는 혈관신생/침투 관련 질환, 특히 맥락막 신생혈관 안저질환과 같은 질환의 치료에서의 상기 항체를 함유하는 약물 또는 약학조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 여섯 번째 기술적 과제는 PLVAP(PV-1) 단백질의 검출 분석, 또는 생체 내 및 시험관 내 PLVAP(PV-1) 발현양성으로 표식된 조직세포의 추적을 위한 상기 항체를 함유하는 시약 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 일곱 번째 기술적 과제는 상기 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
PLVAP(PV-1) 항원은 일반적으로 염증, 종양, 당뇨망막병증 등 병리학적 상태에서만, 병변 영역의 내피 혈관벽의 미세기공에서 선택적으로 발현된다는 사실에 따라, PLVAP(PV-1) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체가 생체 내에 투여된 후, 항체는 혈관벽의 미세기공의 격막과 커플링 또는 결합하여, 물리적 막힘을 형성하거나 혈관벽의 미세기공을 폐쇄하여, 혈관의 침투/누출을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 혈관 내피 벽에서 PLVAP(PV-1) 단백질을 특이적으로 인식하고 결합하는 이러한 항체 또는 이의 유도체를 활성성분으로 하여 혈관신생/침투와 밀접한 관련이 있는 질환의 치료 또는 간섭에 사용되는 적합한 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 이들 단일클론항체 또는 이의 유도체는, 그들이 특이적으로 신생혈관 또는 내피혈관벽에 응집 결합됨으로 인해, 항종양 화학약물, 방사선 약물 또는 독소와 같은 기타 약물과 함께 이식 또는 랩핑하여 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC)를 형성하고, 이들을 종양 영역의 신생혈관 내강으로 함께 수송하여, 종양영역의 혈관을 색전화시키고 약물로 종양세포를 죽이는 이중 효과를 달성하기 위한 표적화 담체로서 사용될 수 있다. 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC)와 같은 PLVAP(PV-1) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 유도체는 또한 이미 시판중이거나 또는 연구중인 혈관신생/침투와 관련된 질병을 치료하기 위해 기타 약물과 순차적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 실시형태를 채택한다:
본 발명의 첫 번째 측면에 있어서, 인간 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1 단백질의 세포 외 영역에 특이적으로 결합하는, 신규한 단일클론항체 또는 이의 유도체를 제공한다. 상기 단일클론항체 또는 이의 유도체는 제1가변 영역 및 제2가변 영역을 포함하고, 상기 제1가변 영역은 항체 경쇄 가변영역이고, 이의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열이고; 여기서 상기 제2가변 영역은 항체 중쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열이다.
상기 항체는 마우스 유래 항체, 인간-마우스 키메라 항체, 인간 유래 항체 등을 포함하며, 상기 유도체는 항체 Fab 단편, Fv 단편, 단일사슬 항체(single-chain antibody), 이중특이성 항체(bi-specific antibody), 항체-약물-복합체(antibody-drug-conjugated, ADC), 키메라항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T-Cell, CAR-T) 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 기술 실시형태로서, 상기 제1가변 영역은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열인 항체 경쇄 가변영역이고; 상기 제2가변 영역은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열인 항체 중쇄 가변영역이다.
본 발명의 바람직한 기술 실시형태로서, 이는 상기 항체 경쇄 가변영역 및 인간 항체 경쇄 불변영역을 포함하며, 또한 상기 항체 중쇄 가변영역 및 인간 항체 중쇄 불변영역의 힌지 영역, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 기술 실시형태로서, 상기 인간 항체 경쇄 불변영역은 인간 항체 kappa 사슬 또는 인간 항체 lamda 사슬로부터 유래되고, 상기 인간 항체 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등 아형, IgA 또는 IgM으로부터 유래되며, 여기서 바람직하게 IgG1 또는 IgG４ 아형이다.
본 발명의 제2측면에 있어서, 상기 항체 또는 이의 유도체를 암호화하는 DNA분자 또는 유전자 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 상기 항체 경쇄 가변영역 유전자 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 기재되고, 상기 항체 중쇄 가변영역 유전자 뉴클레오티드 서열은 서열번호 20이다.
본 발명의 제3측면에 있어서, 상기 항체 또는 유도체를 암호화하는 DNA 분자/유전자 뉴클레오티드 서열 및 상기 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어서열을 함유하는 발현벡터를 제공하는 것이다
본 발명의 제4측면에 있어서, 상기 발현벡터로부터 형질 전환된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 상기 재조합 숙주세포 또는 이의 자손세포는 상기 항체 또는 이의 유도체를 발현한다. 상기 항체는 마우스 유래 항체, 인간-마우스 키메라항체, 인간 유래 항체 등을 포함하고; 유도체는 항체 Fab-단편, Fv-단편, 단일사슬 항체, 이중특이성 항체(bi-specific antibody), 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC), 키메라항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T-Cell , CAR-T) 등을 포함한다.
본 발명의 제5측면에 있어서 약학적으로 유효량의 상기 항체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 함유하는 약물 또는 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 제6측면에 있어서 혈관신생 또는 침투와 관련된 질환의 치료에 있어서 상기 항체의 약물 또는 약학조성물의 용도를 제공하는 것이다. 여기서 혈관신생/침투와 밀접하게 관련된 질환에는 다양한 악성종양 및 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD)과 같은 맥락막 신생혈관 안저 질환, 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema, DME), 망막정맥폐색(retinal vein occlusion)과 같은 당뇨망막병증 등이 포함된다.
본 발명의 바람직한 기술 실시형태로서, 상기 약학조성물은 약학적 유효량의 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 또는 이의 수용체(VEGF-R)를 길항, 차단하는 활성성분, 및 약학적으로 허용되는 담체를 더 함유한다. 본 발명중의 PLVAP(PV-1) 항체는 악성종양 또는 안저 맥락막 신생혈관 질환과 같은 혈관신생/침투와 밀접한 관련이 있는 질환을 치료하기 위한 약제학적 성분으로 사용될 경우, VEGF/ 또는 VEGF 수용체(VEGF-R)를 표적으로 하는 약물을 순차적으로 또는 병용하여 사용할 수 있다. 여기서 VEGF/또는 VEGF 수용체를 표적으로 하는 바람직한 약물은 거대분자 생물학적 약물, 예를 들어 항-VEGF 단일클론항체 약물인 베바시주맙(Bevacizumab, 상품명 Avastin), 항-VEGF 단일클론항체 Fab 단편 라니비주맙(Ranibizumab, 상품명Lucentis); 항-VEGFR2 단일클론 항체 라무시루맙(Ramucirumab, 상품명 Gyramza) 및 코드명 hPV19인 항-인간VEGF 단일클론항체(STAINWEI사에서 현재 연구중인 약물은, 중국 특허문서를 참조: 등록된 특허번호: 201210540692X, 특허명칭: 혈관내피세포 성장인자 및 이의 수용체에 대한 결합을 길항 및 억제하기 위한 단일클론 항체 및 이의 코딩서열 및 용도(Monoclonal antibody for antagonizing and inhibiting binding of vascular endothelial growth factor to its receptor, and coding sequence); 등록된 특허번호 US9580498B2인 미국 특허문서); 또는 VEGF 수용체-Fc 융합단백질 약물 예를 들어 애플리버셉트(Aflibercept, 상품명: Eylea), 캉바이시푸(conbercept) 등이 포함된다. VEGF/또는 VEGF 수용체를 표적으로 하는 바람직한 소분자 화학 약물에는 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 아파티닙(apatinib), 파조파닙(Pazopanib)등이 포함된다.
본 발명의 바람직한 기술 실시형태로서, 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체가 안저질환을 치료하기 위해 국소적으로 투여될 때, 주로 혈관벽의 미세기공 격막에 대한 항체의 특이적 결합에 의존하여, 혈관벽의 벽에 있는 개구부에 물리적 차단 또는 밀봉을 형성하여, 혈관의 침투를 예방하거나 감소시키고, 따라서, 약물 성분으로서, 상기 항체는 제조에 있어서 항체 의존세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존세포독성(complemnt-dependent cytotoxicity, CDC)을 감소시키거나 제거하여, 치료 영역에서 혈관 또는 조직세포의 직접적인 사멸을 감소시키기 위해 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG4, IgG2 서브타입 항체의 불변영역을 사용하거나, 또는 불변영역이 없는 항체 Fab-단편, Fv-단편, 단일사슬 항체 등을 제조하는 것을 더 많이 고려할 수 있다. 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG4, IgG2 아형 항체의 불변영역, 및 항체의 불변영역을 갖지 않는 항체 Fab-단편, Fv-단편, 단일사슬 항체 등은 당업자에게 공지된 유전공학 기술을 사용하여 클로닝되어 얻거나 또는 시험관 내에서 합성하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 기술 실시형태로서, 종양의 치료에서, 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체는 항체의 ADCC 또는 CDC를 유지하거나 또는 증가시켜 종양조직 및 세포에 대한 더 강력한 살상효과에 도달하기 위해 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG1, IgM 서브 타입 항체의 불변영역을 사용하는 것을 더 많이 고려할 수 있다. 야생형 또는 유전자 변형된 인간 IgG1, IgM 아형 항체의 불변영역은 당업자에게 공지된 유전공학 기술을 사용하여 클로닝되어 얻거나, 또는 시험관 내 합성하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 PLVAP(PV-1) 항체 또는 이의 유도체는, 이들이 종양 영역에서 특이적으로 신생혈관 내피 또는 혈관의 혈관벽에 결합됨으로 인해, 표적화된 담체로서 기타 항종양약물 또는 독소와 함께 이식 또는 랩핑하여, 항체-약물 복합체(antibody-drug-conjugated, ADC)를 형성하고, 이들을 종양 영역의 신생혈관 내강으로 함께 수송하여, 더 우수한 종양세포를 죽이는 효과를 달성하기 위한 표적화 담체로서 사용될 수 있다. 항체 및 약물 또는 독소와 함께 이식 또는 랩핑하는 방법은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 이러한 항체-약물 복합체는 교모세포종 또는 전이성 뇌종양과 같은 원발성 뇌종양을 포함한 뇌종양과 같이 일반적인 약물에 의해 쉽게 접근하기 어려운 종양의 치료에 특히 적합하다. 교모세포종과 같은 뇌종양의 치료에서, 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체 또는 항체-약물 복합체는 테모졸로마이드(temozolomide)와 같은 경구소분자 약물과 병용하여 사용될 수 있다. 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체 또는 항체-약물 복합체는 또한 원발성 간암 또는 전이성 간암과 같은 비교적 높은 PLVAP/PV1 유전자 발현을 갖는 악성종양의 치료에 특히 적합하며, 이러한 유형의 항체약물은 또한 간 혈관에 국소 주사하여 투여됨으로써, 보다 정확한 표적요법을 달성하고, 신체의 다른 부분에 대한 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 기술 실시형태로서, 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체는 또한 원발성(교모세포종과 같은) 또는 전이성 뇌종양, 폐암, 위/식도암, 간암, 신장암, 자궁경부암 및 기타 악성종양의 치료를 위한 면역관문억제포인트(inhibitory immune checkpoint molecules)를 표적으로 하는 단일클론 약물과 순차적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 그 중에서 PLVAP(PV-1) 항체와 순차적으로 또는 병용하여 사용되는 면역관문억제포인트 단일클론 항체 약물은 바람직하게 항-CTLA4(Cytotoxic T-lymphocyte Antigen-4, 세포독성 T 림프구 항원-4) 단일클론항체 이필리무맙(Ipilimumab, 상품명 Yervoy); 항 PD-1(programmed death protein 1,예정된 세포자살 단백질1) 단일클론항체 nivolumab(상품명 Opdivo), pembrolizumab(상품명 Keytruda) 및 코드번호가 hAB21인 단일클론항체(STAINWEI사에서 현재 연구중인 항-PD-1 단일클론항체, PCT 특허출원문서: PCT/CN2017/089282, 인간 PD-1 항원 및 이의 수용체에 대한 결합을 길항 및 억제하기 위한 단일클론 항체 및 이의 제조방법 및 용도)를 포함하며; 항PD-L1단일클론 항체는 atezolizumab (상품명 Tecentriq), avelumab(상품명 Bavencio), durvalumab(상품명 Imfinzi) 등을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 기술 실시형태로서, 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체는 또한 먼저 키메라항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T-Cell, CAR-T)로 제조되고, 이어서 시험관 내에서 종양환자의 말초혈액으로부터 분리된 T-림프구와 같은 면역세포에 도입되고, 다시 시험관 내에서 배양 및 증폭 후, PLVAP(PV-1) 항원 인식을 갖는 이들 림프구를 인체 내에 주입하여, 다시 체내에서 종양영역의 혈관 내피세포 및 신생혈관을 표적화하는 역할을 수행하게 함으로써, 종양 치료 효과를 달성할 수 있게 된다. CD19, CD20과 같은 종양항원을 직접 표적으로 하는 CAR-T와 비교하여, 본 발명의 CAR-T는 종양부위의 혈관 내피세포 및 혈관 신생을 특이적으로 표적하며, 이의 역할은 종양항원의 발현에 의존하지 않고, 다양한 유형의 고체종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 PLVAP(PV-1) 항체를 키메라항체 수용체 T 세포(CAR-T)로 제조하는데 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 사이노몰구스 원숭이의 맥락막 신생혈관 안저 질환의 치료에서 인간-마우스 키메라 PLVAP(PV-1) 항체를 단일성분으로 또는 항-VEGF 항체와 병용하여 사용하는 용도를 설명하였다.
본 발명의 제7 측면에서는 인간 및 원숭이의 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1에 결합할 수 있는 단일클론항체 또는 이의 유도체를 제공하고, 상기 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 25와 같은 아미노산 서열을 갖는 항원에 결합하며, PV-1에 결합하기 위해 상기 항체 또는 이의 유도체와 경쟁한다.
본 발명의 제8 측면에서는 적절한 양의 상기 항체 또는 이의 유도체를 투여하는 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1에 의해 매개되는 혈관신생 또는 침투를 길항 차단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제9측면에서는 조직 또는 세포샘플에서 원형질막 소포 관련 단백질 PLVAP(PV-1)를 검출 및 분석하기 위한, 또는 생체 내 또는 시험관 내에서 PLVAP(PV-1)발현양성으로 표식된 조직 세포를 추적하기 위한 상기 항체 또는 이의 유도체를 함유하는 측정 시약 또는 측정 키트를 제공한다..
본 발명의 제10측면에서는 상기 항체 또는 유도체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 항체 또는 이의 유도체를 암호화하는 상기 DNA 서열 및 상기 서열에 작동 가능하게 연결된 발현조절서열을 포함하는 발현벡터를 제공하며;
b) 단계a)에 기재된 발현벡터로 CHO 세포와 같은 숙주세포를 형질전환하며;
c) 상기 항체의 발현에 적합한 조건에서 단계b)에서 수득된 숙주세포를 배양하고; 및
d) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상기 숙주세포 배양액으로부터 상기 항체를 분리 및 정제하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "단일클론항체(mAb)"는 순수한 세포주로부터 수득된 면역글로불린을 지칭하고, 동일한 구조 및 화학적특성을 가지며, 단일 에피토프에 특이적이다. 단일클론항체는 통상적인 다클론항체의 조제(일반적으로 다른 결정기에 대해 다른 항체를 가짐)와 다르며, 각각의 단일클론항체는 항원상의 단일결정기를 타겟한 것이다. 그들의 특이성 외에, 단일클론항체의 장점은 하이브리도마 또는 재조합 조작된 세포배양에 의해 얻어지고 다른 면역글로불린과 혼합되지 않을 것이라는 점이다. 수식어 "단일클론항체"는 항체의 특성을 나타내며 균질한 항체군으로부터 얻어지며, 이는 항체를 생산하기 위해 특별한 방법을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간화 단일클론항체"는 상보성결정영역(complementarity-determining regions, CDR)을 제외한 마우스 단일클론항체의 아미노산 서열에서, 기타 서열(가변영역의 프레임 워크영역 서열 포함)의 전부 또는 대부분을 성인 면역글로불린의 아미노산 서열로 대체하여 유전공학을 통해 마우스의 단일클론항체의 면역원성을 최대한 감소시키는 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 동일한 구조적특징을 갖는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이며, 이는 2개의 동일한 경쇄(light chain) 및 2개의 동일한 중쇄(heavy chain)로 구성된다. 각각의 경쇄는 공유이황화 결합을 통해 중쇄에 연결되고, 상이한 면역글로불린 동종형의 중쇄 사이의 이황화결합의 수는 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화결합을 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 영역(VH)이 있고 그 뒤에 여러 불변 영역이 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 끝에 가변영역(VL)이 있고, 다른 한쪽 끝에 불변영역을 가지며; 경쇄의 불변영역은 중쇄의 제1불변영역과 대향이고, 경쇄의 가변영역은 중쇄의 가변영역과 대향한다. 특수 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변영역 사이의 계면을 형성한다.
본 명세서에 사용된 용어 "가변"은 항체의 가변영역의 특정부분이 서열상에서 상이하여 이들의 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성함을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변영역에 걸쳐 고르게 분포되지는 않는다. 이는 상보성결정영역(CDR) 또는 초가변 영역이 되는 경쇄 및 중쇄 가변영역에서 3개의 단편에 집중된다. 가변영역의 보다 보수적인 부분을 프레임 워크영역(Framework regions, FR)이라고 한다. 항체 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 각각 4개의 FR 영역을 함유하며, 이들은 대략 β-시트구성이고, 연결루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에는 부분 β-시트 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역을 통해 밀접하게 기대어 있고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합부위를 형성한다.(Kabat 등을 참조, NIH Publ. No. 91-3242, 권1, 647-669 페이지(1991)). 항체 불변영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체의존세포독성(ADCC) 또는 보체의존세포독성(CDC)에 참여하는 것과 같은 상이한 효과기능을 나타낸다.
본 발명의 항체는 일반적으로 하기 방법으로 제조할 수 있다:
먼저, 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자를 적절한 발현조절서열을 함유하는 발현벡터에 삽입한다.
본명세서에 사용된 용어 "발현조절서열"은 일반적으로 유전자 발현조절에 관여하는 서열을 지칭한다. 발현조절서열은 표적유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 종결신호를 포함한다. 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자(DNA)서열은 본 발명에 개시된 단백질 서열의 인공합성 또는 PCR에 의한 증폭과 같은 당업자에게 공지된 통상적인 수단에 의해 수득될 수 있다. 그 후, 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 합성 또는 PCR로 증폭된 DNA 단편을 적합한 발현벡터에 삽입할 수 있다. 본 발명에 사용된 발현벡터는 Invitrogen의 pCDNA3.1 발현벡터와 같이 당업자에게 공지된 상업적으로 이용 가능한 발현벡터 일 수 있다.
발현벡터를 수용함으로써 형질전환에 적합한 숙주세포는 일반적으로 원핵세포 및 진핵세포를 포함한다. 일반적으로 사용되는 원핵생물 숙주세포의 예는 대장균, 고초균 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 진핵생물 숙주세포는 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포 등을 포함한다. 본 발명에서, 바람직한 숙주세포는 포유동물세포, 특히 차이니즈햄스터 난소(CHO)세포이다.
발현벡터로 형질 전환된 숙주세포를 적합한 조건하에서(예를 들어, 세포배양 플라스크 또는 생물반응기에서 배양물을 부착 또는 현탁시키기 위해 무혈청배지를 사용함) 배양한 후, 배양 상청액을 수거한 후, 단백질-A 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피 및 필터멸균을 포함하는 등 당업자에게 공지된 통상적인 분리단계 또는 수단으로 정제하여 본 발명의 항체를 얻는다.
정제하여 얻은 본 발명의 항체는 멸균된 생리식염수와 같은 적합한 용매에 용해될 수 있으며, 용해도는 0.01 내지 100 mg/ml 사이에서 제조될 수 있으며, 이상적인 최종 용해도는 1 mg/ml 내지 40 mg/ml 사이이다.
PLVAP(PV-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론항체 및 이를 분비하는 하이브리도마 세포주를 얻기 위해, 본 발명은 포유동물세포(CHO 세포)에 의해 발현된 재조합 인간 PV-1 단백질의 세포막 외 영역을 면역항원으로서 선택하고, 소량으로 마우스를 반복적으로 피하 면역함으로써 항-인간 PV-1 단백질을 분비하는 다클론항체를 얻으며; 이어서 고역가 항체를 함유하는 마우스를 선별하여 비장세포를 수집하고, 시험관 내에서 마우스 골수종세포를 융합시킨 후, 약물 스크리닝 및 서브클로닝 등 단계를 거쳐 인간 PV-1 단백질에 대한 항체를 안정적으로 분비하는 다중 하이브리도마 단일클론세포를 구축하였다. 그 중에서 STW-139-15로 코딩 된 마우스 하이브리도마 세포주를 ELISA, 면역조직화학, 유세포분석 등과 같은 다양한 측정 방법으로 확인하여 이들이 분비한 단일클론항체가 인간 정상조직세포 및 종양조직에서 PV-1단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 원숭이 조직에서도 PV-1단백질에 결합한다는 것을 확인하였다.
본 발명은 유전자공학 등 수단에 의해 마우스 하이브리도마 세포균주 STW-139-15를 클로닝하여 마우스항체 중쇄 가변영역 단백질 및 경쇄 가변영역 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 얻었고; 이 기초상에서 상기 항체를 인간화하고, 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C 및 이의 발현 벡터를 얻었다. 상기 발현 벡터를 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포로 형질 감염시켜 인간-마우스 키메라 항체를 안정하고 효율적으로 분비하는 재조합 조작된 세포를 수득하였다. 상기 재조합공학 세포는 대규모로 배양된 후, 배양 상청액을 수확하였다. 상청액을 원심 분리하고 0.45 μm 필터막으로 여과한 후, 단백질-A를 함유하는 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하여 분리 정제하여 정제된 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C의 단백질을 수득하였다.
분리 및 정제된 STW-139-15-C 항체단백질은 여과 및 멸균 후 적합한 용매에 재용해되어 생체 내 및 시험 관내에서의 생물학적 또는 약리학적 활성을 시험하기 위한 약제학적 제제를 제조 할 수 있다.
그 중, 생체 내에서 상기 인간-마우스 키메라 항체의 약리학적 활성을 시험하는 방법 중 하나는 레이저 조사에 의해 유도 된 시노몰구스 원숭이의 망막맥락막 신생혈관 질환모델을 사용하고, 안구의 유리체 내 주사를 통해, STW-139-15-C 항체 단독 또는 항-VEGF 항체 약물과 병용 투여하여 맥락막 혈관 신생 및 누출에 대한 억제효과를 조사하며, 항-VEGF 항체 약물 단독투여의 억제효과와 비교한다. 시험결과는 PLVAP/PV-1에 특이적으로 결합하거나 항VEGF 단일클론항체와 병용하여 사용된 STW-139-15-C 단일클론항체는 레이저에 의해 유도된 시노몰구스 원숭이에서 맥락막 신생혈관 침투에 유의한 억제효과를 가지며, 신생혈관/침투과 관련된 질환의 치료에 사용할 수 있음을 보여주었다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 인간 PV-1 단백질 및 마우스PV-1 단백질의 아미노산서열 정렬 분석의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 재조합 인간 PV-1-His 단백질의 SDS-PAGE 분석 전기영동 도이고, 여기서 밴드 1은 DTT-환원샘플이고 마커는 단백질 분자량 표준품(kd)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC) 방법으로 인간 PV-1유전자가 일시적으로 형질 주입된 CHO 세포(CHO/PV-1)에 대한 면역화된 마우스의 혈청 및 하이브리도마 세포 상청액 샘플의 특이적 결합을 측정하는 대표적 결과 모식도이다. 여기서, 도 3A는 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양상청액(음성 대조군) 샘플이고; 도 3B는 인간 PV-1 단백질에 의해 면역된 후 마우스 혈청 샘플(1:200 희석)이며; 도 3C는 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15 배양상청액 샘플이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 ELISA 방법으로 96-웰 플레이트에 코팅된 재조합 인간 PV-1 세포막외 단백질에 대한 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15 배양 상청액 샘플의 결합을 측정한 결과 모식도이다. 여기서 mAb113은 마우스 단일클론항체(항-SOST 단일클론 항체)와 관련이 없는 샘플이고, 음성대조군 샘플은 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액 샘플이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에서 ELISA 방법으로 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플에 대한 재조합 인간 PV-1-Fc 융합단백질 및 기타 다수의 관련이 없는 유전자의 재조합단백질 또는 Fc 융합단백질의 결합을 측정하여 대조 분석한 결과모식도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에서 유세포분석기로 인간 PV-1 유전자가 안정적으로 형질 주입된 CHO 세포(CHO/PV-1)에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정하여 분석한 결과 모식도이다. 여기서 도 6A는 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액 샘플(음성대조군)이고, 도 6B는 마우스 단일클론항체 mAb21(anti-PD-1 단일클론)과 관련이 없는 샘플이며; 도 6C는 인간 PV-1 단백질에 의해 면역화된 후의 마우스 혈청샘플(1:200희석, 양성대조군)이고; 도 6D는 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15 배양 상청액 샘플이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에서 유세포분석기로 인간 PV-1 유전자가 안정적으로 형질 주입된 CHO 세포(CHO/PV-1)에 대한 연속적으로 희석된 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정한 항체의 용해도-평균형광값(mean fluorescence) 용량-반응그래프(dose-respone)도이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4에서 유세포분석기로 CHO 및 CHO/PV-1 세포의 혼합샘플(9: 1혼합)에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과 모식도이다. 도 8A는 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액 샘플(음성대조)이고; 도 8B는 마우스 단일클론항체 mAb21(anti-PD-1)과 관련이 없는 샘플이며; 도 8C는 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에서 유세포분석기로 인간 HUVEC 세포에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과 모식도이며; 여기서, A01NC은 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액샘플(음성대조)이다.
도 10은 본 발명의 실시예 6에서 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)방법으로 인간 정상조직의 조직절편에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정한 대표적 결과 모식도이다. 여기서, 도 10A는 폐 Lung의 조직 절편을 대표하고, 도 10B는 간 Liver의 조직절편을 대표하며, 도 10C는 뇌 Brian의 조직절편을 대표하고, 도 10D는 췌장 pancreatic tissue의 조직절편을 대표하며, 도 10E는 심장 Heart의 조직절편을 대표하고, 도 10F는 비장 spleen의 조직절편을 대표한다.
도 11은 본 발명의 실시예 7에서 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)방법으로 인간 종양조직 조직절편에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정한 대표적 결과 모식도이다. 여기서, 도 11A는 폐암 lung cancer 인간 종양조직 조직절편을 대표하고, 도 11B는 간암 liver cancer 인간 종양조직 조직절편을 대표하며, 도 11C는 뇌종양 brain tumor 인간 종양조직 조직절편을 대표하고, 도 11D는 췌장암 pancreatic cancer 인간 종양조직 조직절편을 대표하며, 도 11E는 난소암 ovarian cancer 인간 종양조직 조직절편을 대표하고, 도 11F는 림프종 Lymphoma 인간 종양조직 조직절편을 대표한다.
도 12는 본 발명의 실시예 8에서 인간 PV-1 단백질과 원숭이 PV-1 단백질의 아미노산서열 정렬분석 모식도이다.
도 13은 본 발명의 실시예 8에서 유세포분석기로 원숭이 PV-1 유전자가 형질 주입된 CHO 세포(CHO/monky PV-1)에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과모식도이다. 여기서 도 13A는 융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액 샘플(음성대조)이고; 도 13B는 마우스 단일클론항체mAB7(anti-PD-1)과 관련이 없는 샘플이며; 도 13C는 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플이다.
도 14는 본 발명의 실시예 10에서 ELISA 방법으로 96-웰 플레이트에 코팅된 재조합 인간 PV-1 세포막외 단백질에 대한 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C 샘플의 결합을 측정한 결과 모식도이다.
도 15A 내지 도 15D는 각각 본 발명의 실시예 11에서 시노몰구스 원숭이 레이저 광응고화 후 3주째에, 동물은 유리체를 통해 약물을 1회 주사 투여 받은 후 관찰기간 동안 다양한 시점의 안저 형광 이미지이다. 여기서 도 15A는 음성대조(0.9% NaCl 주사액)치료군의 조영 사진이고, 도 15B는 STW-139-15C 단일클론항체 시험 샘플 투여군의 조영 사진이며, 도 15C는 양성대조약물 hPV19 단일클론항체(항-VEGF 단일클론항체) 투여군 조영 사진이고, 도 15D는 시험샘플 TW-139-15C 단일클론 항체 및 양성대조약물 hPV19 단일클론항체 병용투여군의 조영 사진이다.
본 발명은 하기 실시예와 결합하여 더 한층 설명될 것이고, 이들 실시예는 단지 설명의 역할을 하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 항-인간 PV-1 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포주의 확립 및 선별동정
1.1 인간 PV-1 단백질의 아미노산 서열 및 마우스PD-1 단백질의 아미노산 서열의 대조분석
인간 PV-1 단백질의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_112600.1)(서열번호 1) 및 마우스 PV-1 단백질의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_115774.2)(서열번호 2)의 대조 분석은 도 1과 같다: 여기서 N-말단의 20여개 아미노산은 세포막 내(서열은 이탤릭 체로 표시)에 위치하며, 굵은 체 및 박스로 표기된 아미노산 서열은 PV-1 단백질의 막통과 지역(transmembrane region)이고, 그 뒤의 C-말단 아미노산 서열(인간: AA53-442; 마우스: AA53-438)은 모두 세포막 외에 위치하며, 그 중 4개의 N-글리코실화 부위(박스로 표기) 및 9개의 시스테인 Cysteine(밑줄 표기)을 포함한다. 아미노산 서열에서, 인간 PV-1 단백질 및 마우스 PV-1 단백질의 전체 상동성은 62%에 불과하며; 그 중 세포막 외 영역에서, 인간 PV-1 단백질 및 마우스 PV-1 단백질의 아미노산 차이 부위는 100개 이상이다. 따라서, 전통적인 항원단백질 면역화마우스 및 하이브리도마 제조기술을 사용하며, 인간 PV-1의 세포막 외 항원영역에 대한 마우스 항체를 제조할 수 있을 것으로 추측된다.
1.2 재조합인간 PV-1 단백질(면역항원)의 발현 및 제조
본 발명의 실시예에 있어서, 우선 인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)에서 총 RNA를 추출하고, 역전사 PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)로 cDNA를 수득하였다. 다시 상기 cDNA를 주형으로 하여, PCR 기술을 사용하여 인간 PV-1 단백질을 암호화하는 유전자 단편을 클로닝하였다. DNA 서열로 정확하게 식별하고 제한효소로 처리한 후, CHO 세포에서 외래 유전자를 효율적으로 발현 할 수 있는 DNA 플라스미드로 클로닝하여 상응하는 재조합 발현 플라스미드를 수득하였다.
1.2.1 인간 PV-1전장 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 구축
상기 플라스미드 발현의 구축과정은 하기와 같다:
우선 상기 cDNA를 주형으로 하여, 하기와 같은 한 쌍의 프라이머를 사용함으로써, PCR로 인간 PV-1전장 단백질을 암호화하는 표적 유전자 단편을 성공적으로 증폭시켰다(길이는 1345bp 좌우):
포워드 프라이머 hPV-1-His-F-HindIII: AACTAAGCTTGCCACCATGGGTCTGGCCATGGAGCACGGA(서열번호 3);
리버스 프라이머 hPV-1-His-R-XhoI:
ACCACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCACTGGATGGGGCTACAGGGAT(서열번호 4)
PCR 증폭에 의해 수득된 DNA를 회수하고 제한효소로 처리한 후, pCDNA3.1 발현 플라스미드(Inivtrogen)에 클로닝하여; 재조합 플라스미드를 얻었다. 재조합 플라스미드는 엔도뉴클레아제 소화 및 DNA 시퀀싱 식별을 통해, CHO 세포막에서 외래 인간 PV-1 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드(플라스미드 명칭: pQY-PV-1)가 성공적으로 수득되었음을 확인하였다.
1.2.2 C-말단에서 His-6 태그를 갖는 인간 PV-1 세포막외 재조합 단백질의 발현 플라스미드의 구축
상기 섹션(1.2.1)중의 PCR 회수 산물을 주형으로 하고, 하기 한 쌍의 프라이머를 사용하여, PCR의 성공적 증폭으로 C-말단에 6개의 히스티딘(Histidine)의 태그서열을 갖는 인간 PV-1 세포막외 단백질을 코딩하는 유전자 단편(PV-1-His)을 얻었다:
포워드 프라이머 hPV-1-Fc-F-BglII: GTGGAGATCTCACGTGAGCACAGAGTCCAACCTG(서열번호 5); 리버스 프라이머 hPV-1-His-R-XhoI: ACCACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCACTGGATGGGGCTACAGGGAT(서열번호 4)
PCR 증폭에 의해 수득된 DNA를 회수하고 제한효소로 처리한 후, 신호 펩타이드를 가진 발현벡터 pCDNA3.1-DHFR에 도입하여, 재조합 플라스미드를 얻었다. 재조합 플라스미드는 엔도뉴클레아제 소화 및 DNA 시퀀싱 식별을 통해, CHO세포에서 hPV-1-His의 재조합 유전자를 발현 분비할 수 있는 발현 플라스미드(플라스미드 명칭: pQY-DHFR-PV1-His)를 성공적으로 수득되었음을 확인하였다.
1.2.3 재조합 인간 PV-1-Fc 융합단백질의 발현 플라스미드의 구축-
상기 발현 플라스미드의 구축 과정은 하기와 같다:
우선 상기 섹션(1.2.1)중의 PCR 회수 산물을 주형으로 하고, 하기 한 쌍의 프라이머를 사용하여, PCR의 성공적 증폭으로 hPV-1 세포외 영역 유전자단편(길이 약 1176bp)을 얻었다:
포워드 프라이머 hPV-1-Fc-F-BglII: GTGGAGATCTCACGTGAGCACAGAGTCCAACCTG(서열번호 5)
리버스 프라이머 hPV-1-Fc-R-BamHI: GTGGGCATGTGTGAGTGGATCCGCCACTGGATGGGGCTACAG(서열번호 6)
그 다음, 다시 이 PCR 회수 산물을 주형으로 하고, 하기 한 쌍의 프라이머를 사용하여, 다시 PCR의 성공적 증폭으로 hPV-1세포외 영역 유전자 및 인간 IgG1-Fc단편을 코딩하는 유전자의 융합에 의해 수득된 재조합 유전자(길이는 1859bp 좌우)를 얻었다:
포워드 프라이머 hPV-1-Fc-F-BglII: GTGGAGATCTCACGTGAGCACAGAGTCCAACCTG(서열번호 5)
리버스 프라이머 PV1-DHFR-XbaI-R: TAACTCTAGATCATTTACCCGGGGACAGGG(서열번호 7)
상기 PCR 증폭에 의해 수득된 재조합 유전자 DNA를 회수하고 엔도뉴클레아제로 처리한 후, 발현벡터 pCDNA3.1-DHFR에 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 얻었다. 재조합 플라스미드는 엔도뉴클레아제 소화 및 DNA 시퀀싱 식별을 통해, CHO세포에서 인간 PV-1-Fc의 융합 단백질을 발현 분비할 수 있는 발현 플라스미드(플라스미드 명칭: pQY-DHFR-PV1-Fc)를 성공적으로 수득되었음을 확인하였다.
1.3 인간 PV-1-His 재조합 단백질 및 PV-1-Fc 융합 단백질(면역항원)의 발현 및 제조
상기 발현 플라스미드 DNA(pQY-DHFR-PV1-His, pQY-DHFR-PV1-Fc)를 각각 Fugen-6 리보솜(Roche)과 혼합하여 DHFR 유전자 결핍형 CHO 세포(CHO-dhfr-)에 형질 주입하였다. 형질주입 후 약물(메토트렉세이트, MTX)로 스크리닝을 하여, 각각 인간 PV-1-His 재조합 단백질 및 인간 PV-1-Fc 융합 단백질을 효과적으로 발현 및 분비 할 수 있는 세포주를 얻었다. 스크리닝에 의해 수득된 발현세포주는 무혈청배지에서 확장 및 배양되고, 각각 Ni-친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 Protein-A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 의해 세포 상청액에서 분리 정제되어, 순도가 90%이상인 인간 PV-1-His 재조합 단백질 및 인간 PV-1-Fc 융합 단백질을 얻었다.
도 2는 분리정제에 의해 수득된 인간 PV-1-His 재조합 단백질(DTT-환원)의 SDS-PAGE 전기영동 분석도이고, 결과는 DTT-환원 인간 PV-1-His 단백질 샘플에서, 이의 주요 밴드가 55 kd 좌우임을 보여주며, 이는 이론적으로 예상되는 단백질의 분자량과 일치하다.
1.4 재조합인간 PV-1 단백질 면역동물
우선 인간 PV-1-His 재조합 단백질을 프로인트 완전 항원보강제(미국 Sigma사 제품)와 혼합한 후, Balb/c 마우스의 여러 부위에 피하주사하였다(100 μl/마리, 매회 10 μg PV-1-His 단백질). 첫 번째 면역화 후 2 내지 3주 뒤에, 마우스의 피하 여러 부위에 다시 인간 PV-1-Fc 융합단백질 및 프로인트 완전 항원보강제(미국 Sigma사 제품)의 혼합물을 주사하여, 면역력을 3 내지 4회 강화시킨 후, 소량의 마우스 혈청을 취하여, 인간 PV-1-Fc 융합단백질이 코팅된 96-플레이트를 사용하여 효소면역측정(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) 방법으로 마우스 혈청 중에 있는 항-PV-1항체의 역가를 측정하였고, 역가가 높은 마우스의 비장세포를 취하여 다음 단계 세포융합에 사용하였다.
1.5 세포융합
마지막 면역화 후 3 내지 4일에, 마우스 비장세포 현탁액을 무균적으로 제조하고, 50% PEG-1000(미국 Sigma사 제품) 작용하에 마우스 SP2/0 골수종세포(중국과학원 상하이 생명과학원 세포수집센터에서 구입)와 5:1 또는 10:1의 비율로 융합시켰다. 융합은 통상적인 방법(Kohler G and Milstein C: Nature 1975; 256:495-497)에 따라, 1ml의 PEG용량을, 60초 내에 천천히 첨가하였다. 90초 동안 반응시킨 후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 반응을 종결하고, 1000rpm으로 10분 동안 원심 분리하여, 상청액을 제거하고, 다시 원심분리에 의해 침전된 세포를 10% HAT(H는 히포크산틴, A는 아미놉테린, T는 티미딘, 미국 Sigma사 제품)가 함유된 RPMI 1640-10% FCS 배지로 세포 농도를 1Υ106/ml이 되게끔 조절하여, 96-웰 평바닥 세포배양 플레이트(웰당 200μl)에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(미국 Thermo사 제품)에서 2 내지 3주 동안 배양하였다.
1.6 PV-1 항체를 분비하는 양성 마우스 하이브리도마세포의 면역조직화학적(Immunohistochemistry, IHC) 스크리닝
본 발명의 실시예에 있어서, 면역조직화학적 방법으로 마우스의 하이브리도마 세포에서 PV-1항체를 분비하는 양성 세포주를 스크리닝하였다
방법은 다음과 같다:
1) 인간 PV-1 유전자를 형질 주입한 CHO세포(CHO/PV1) 및 형질 주입하지 않은 CHO 세포를 1:6의 비율로 혼합하여 96-웰 세포배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였으며;
2) 세포배양 플레이트를 꺼내어, 배양액을 흡입제거하고, 2% paraformaldehyde를 함유한 phosphate buffered saline(PBS)(2% 파라포름 알데히드 PBS 용액)으로 고정하고, 90% 메탄올로 펀칭하였으며;
3) PBS로 세척한 후, 1차 항체 첨가: 마우스 하이브리도마 상청액 또는 PV-1면역화 된 마우스 혈청(1: 200희석)을 양성 대조군으로 하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며;
4) PBS로 세척한 후, 2차 항체 첨가: HRP-Goat anti Mouse IgG (1:400), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며;
5) PBS로 세척한 후, 기질(DAB, 0.1% H2O2)을 첨가하여 발색시켰다.
도 3은 상기 면역조직화학(IHC)으로 스크리닝한 대표적 결과이다:
도 3에 도시된 바와 같이: 그 중 번호가 STW-139-15인 마우스 하이브리도마세포의 배양상청액(도 3C)은 유의하게 CHO/PV-1 및 CHO 혼합 배양세포와 특이하게 결합할 수 있으며, 그 발색 강도 및 양성세포가 발색되는 비율은 양성대조군 샘플(PV-1항원 면역 후 마우스의 혈청샘플, 도 3B)과 동일하고; SP2/0 골수종세포 상청액 샘플의 발색결과는 음성(도 3A)이며, 이 또한 예상된 결과와 일치한다.
실시예 2 ELISA 방법으로 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15 상청액 샘플과 재조합 인간 PV-1-Fc 융합단백질의 결합을 측정
상기 예비 스크리닝에 의해 수득된 양성 하이브리도마세포를 RPMI-1640-10% FCS 배지로 웰당 1 내지 10개의 세포가 되게끔 희석하고, 96-웰 세포배양 플레이트에 플레이팅하였으며, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2 내지 3주 동안 배양하였다. 클론이 성장한 후, 상청액을 취하여 ELISA로 다시 항-PV-1항체를 검출 동정하였다.
상기 ELISA 측정 방법은 다음과 같다:
1) 재조합 인간 PV-1-Fc 융합 단백질(2 μg/ml, pH 9.6, 0.1 M NaHCO3액)로 96-웰 플레이트를 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 코팅한 후, 다시 2% 소혈청알부민(BSA)을 첨가하여 하룻밤 동안 4℃에서 블로킹하였다.
2) 다음날, 코팅된 플레이트를 PBS-0.1% Tween20 액으로 세척한 후, 시험할 하이브리도마세포의 배양 상청액(융합되지 않은 SP2/0 골수종세포 배양 상청액을 음성대조로 함)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였고;
3) PBS-0.1% Tween20 액으로 세척한 후, horseradish peroxidase HRP-표식 된 염소 항-마우스IgG(미국 Sigma사 제품)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고;
4) 다시 PBS-0.1% Tween20 액으로 세척한 후, 기질액(O-페닐렌다이아민 OPD, 0.1% H2O2)을 넣어 10 내지 15분 동안 발색시켰으며;
5) 0.1M HCl을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, Multiskan-FC 마이크로 플레이트리더기(미국 Thermo Scientific사 제품)의 492nm에서 OD값을 읽었다.
도 4는 이 ELISA의 대표적 결과 모식도이다.
도 4에 도시된 바와 같이: 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15상청액 샘플은 인간 PV-1-Fc 융합단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 높은 역가의 항체를 함유하며, 반면에 관련이 없는 단일클론항체 mAb113 샘플(anti-SOST 단일클론항체, SOST는 Sclerostin의 약자, 중국명칭: 경화단백질) 및 SP2/0골수종세포 상청액 샘플은 모두 음성이었다.
실시예 3 ELISA로 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체와 인간 PV-1-Fc 융합단백질 및 기타 관련이 없는 단백질에 대한 결합을 측정 및 분석
본 실시예에 있어서, ELSIA를 사용하여 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체에 대한 인간 PV-1-Fc 융합단백질 및 기타 관련이 없는 단백질의 결합을 측정 분석하였다.
이를 위해, 인간 PV-1-Fc 융합단백질 및 기타 관련이 없는 단백질(CD3, TIGIT-His, SIRPa-His)또는 Fc-융합단백질(PD1-Fc, PDL1-Fc, PDL2-Fc, mPDL1-Fc, CTLA4-Fc, CD28-Fc, B7-Fc 및 BTLA-Fc)을 1μg/ml의 농도로 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고, 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플을 1차 항체, Horseradish peroxidase(HRP)-표식된 염소 항-마우스-IgG(Jackson사 제품)를 2차 항체로 하며, 다시 기질액(O-페닐렌다이아민 OPD, 0.1% H2O2)으로 발색시키고, 1M HCl로 반응을 종결시켰으며; Multiskan MC-마이크로플레이트 리더기(Thermo Scientific사 제품)의 492nm에서 OD값을 읽었다.
도 5는 상기 ELISA 측정 결과이다. 결과에 나타난 바와 같이: 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플은 인간 PV-1-Fc 융합단백질에만 특이적으로 결합(OD값>1.0)하며, CD3 및 기타 연관이 없는 재조합 단백질(His-태그, 또는 IgG-Fc 융합단백질)에 대해 유의한 결합은 없었다(OD값은 모두 0.1이하). 이 결과는 STW-139-15단일클론항체는 항원의 인식 및 결합에 있어서 모두 높은 특이성을 가지며, PV-1단백질에만 결합한다는 것을 나타내었다.
실시예 4 유세포분석기로 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체 및 인간 PV-1 유전자가 형질 주입된 CHO 세포(CHO/PV-1)에 대한 결합을 측정 분석
본 실시예에 있어서, 마우스 유래 단일클론항체 STW-139-15 샘플을 1차 항체, FITC 형광이 표식된 토끼 항-마우스 IgG를 2차 항체로 하여, 유세포분석기를 사용하여 STW-139-15 단일클롤항체 샘플 및 인간 PV-1유전자를 발현하는 CHO 세포(CHO/PV-1)의 결합을 측정 및 분석하였다.
이를 위해, 안정적으로 형질 주입되어 인간 전장 PV-1 재조합 단백질 유전자를 발현하는 CHO/PV-1 세포를 각각 마우스 하이브리도마 STW-139-15 상청액 샘플, 관련이 없는 마우스 하이브리도마 mAb21 샘플(anti-PD-1 단일클론항체), PV-1 항원 면역화된 마우스 혈청(양성대조군 샘플, 1:200 희석) 및 마우스 SP2/0 세포상청액(음성대조군 샘플)과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, PBS-0.1% FCS로 헹군 후, FITC-표식된 토끼 항-마우스-IgG(1:200 희석; Southern Biotech사 제품)를 넣어; 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 다시 PBS-0.1% FCS 액으로 헹군 다음, BD Accuri C6Plus Flow Cytometer 유세포분석기에 로딩하여(미국 BD Biosciences사 제품) 측정하였다.
도 6은 상기 유세포분석기로 측정한 대표성 결과 모식도이다. 도 6에 도시된 바와 같이: 양성대조군 샘플(도 6C, PV-1단백질 면역 후 마우스 혈청)과 마찬가지로, 마우스 하이브리도마 STW-139-15 상청액 샘플은 유의하게 CHO/PV-1 세포에 특이적으로 결합할 수 있으며(도 6D), 관련이 없는 하이브리도마 샘플(도 6B) 및 음성대조 샘플의 마우스 SP2/0세포 상청액(도 6A)은 CHO/PV-1 세포에 모두 특이적으로 결합하지 않았다.
도 7은 유세포분석기로 측정한 인간 PV-1유전자가 안정적으로 형질 주입된 CHO 세포(CHO/PV-1)에 대한 연속적으로 희석된 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정한 항체의 용해도-평균형광값(mean fluorescence) 그래프이며, 결과는 용해도가 0.1 내지 10 μg/ml 범위 내에 있는 STW-139-15 단일클론샘플이 CHO/PV-1 세포에 대한 결합이 유의하게 용량-반응그래프(dose-respone)를 나타냄을 보여주었다.
도 8은 유세포분석기로 CHO 및 CHO/PV-1 세포의 혼합샘플(9:1 혼합)에 대한 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정하여 분석한 대표적 결과모식도이다. 도 8에 도시된 바와 같이: 마우스 SP2/0 세포상층액 음성대조 샘플(도 8A) 및 관련이 없는 하이브리도마 상층액 샘플(도 8B)과 비교하여, 마우스 하이브리도마 STW-139-15 상청액 샘플은 유의하게 혼합샘플중의 부분 세포와 특이적으로 결합할 수 있으며(도 8C), 결합한 양성세포의 비율은 9.67%이고, 이는 혼합샘플에 첨가한 CHO/PV-1 세포의 비율(10%)과 일치하다. 이 결과는 STW-139-15가 PV-1 항원만을 특이적으로 인식하고, CHO의 다른 단백질 또는 항원물질에 결합하지 않음을 더 한층 입증하였다.
실시예 5 유세포분석기로 인간 HUVEC 세포에 대한 마우스 유래 STW-139-15단일클론항체의 결합을 측정 및 분석
본 실시예에 있어서, 마우스 단일클론항체 STW-139-15 샘플은 1차 항체이고, FITC 형광이 표식된 염소 항-마우스 IgG는 2차 항체이며, 유세포분석기를 사용하여 인간 HUVEC 세포에 대한 STW-139-15 단일클론항체의 결합을 더 한층 측정 및 분석하였다.
이를 위해, 우선 HUVEC 세포를 0.1% Triton X-100로 고정하고 투과성(permembilzation)을 높여주며; 마우스 하이브리도마 STW-139-15 상청액 샘플 또는 음성대조 샘플로 마우스 SP2/0 세포 상청액을 넣고; 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하며 PBS-0.1% FCS 액으로 헹군 후, 다시 FITC-표식된 염소 항-마우스IgG(FITC-Goat anti Mouse IgG(H+L), Sigma 사 제품)를 첨가하여; 4℃에서 1시간동안 인큐베이션하고 다시 PBS-0.1% FCS 액으로 헹군 다음, BD Accuri C6Plus Flow Cytometer 유세포분석기(미국 BD Biosciences사 제품)에 로딩하여 측정하였다.
도 9는 유세포분석기로 측정한 대표적 결과모식도이다. 도 9에 도시된 바와 같이: 마우스 SP2/0 세포상청액 음성대조 샘플(A01 NC)과 비교시, 마우스 하이브리도마 STW-139-15 상청액은 유의하게 인간 HUVEC 세포와 결합할 수 있다.
실시예 6 면역조직화학(IHC) 방법으로 인간 정상조직의 조직절편에 대한 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체의 결합을 측정
본 실시예에 있어서, 면역조직화학(IHC) 방법으로 인간의 부분적정상 조직에서 유래한 절편에 대한 마우스 유래 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정 및 분석하였으며 그 측정절차는 다음과 같다:
인간 정상조직의 파라핀 섹션의 재수화 및 및 항원복원 처리 후, 마우스 유래 단일클론항체 STW-139-15 샘플을 1차 항체로 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며 세척 후, 다시 희석된 HRP 표식된 염소 항-마우스 IgG(2차 항체)를 첨가하여, 상온 하에서 1시간 동안 인큐베이션하고 세척한 다음, 기질 DAB를 넣어 발색하며, 헤마톡실린으로 카운터염색을 하고, 마운팅을 하여, 사진촬영을 하였다.
도 10은 면역조직화학의 대표적 결과이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 폐, 간, 뇌, 심장 및 최장, 비장 등 정상조직의 면역조직화학 염색 절편에서, STW-139-15 단일클론항체는 폐 조직에만 특이적으로 결합하며, 기타 조직 절편에서의 발색 결과는 유의하지 않았다. 폐 조직의 면역조직화학에서 STW-139-15 단일클론항체가 양성으로 측정된 이 결과는 PV-1유전자가 폐 조직에서 발현한다고 한 참고문헌 중 결과와 일치하며, PV-1 항원을 코딩하는 cDNA은 기존에 랫트 폐 조직으로부터 분리 및 클로닝된 것이었다(Stan RV et al., 1999 J Cell Biol. 145:1189-98).
실시예 7 면역조직화학(IHC) 방법으로 인간 종양조직의 조직절편에 대한 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체의 결합을 측정
본 실시예에 있어서, 면역조직화학(IHC) 방법으로 인간 부분 종양에서 유래한 조직절편에 대한 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체의 결합을 측정 및 분석하였으며 그 측정절차는 다음과 같다:
인간 종양조직의 재수화 및 항원복원 처리 후, 마우스 유래 STW-139-15 단일클론 항체를 1차 항체로 하여 첨가하고, 상온 하에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며 세척 후, 다시 희석된 HRP 표식된 염소 항-마우스 IgG(2차 항체)를 첨가하여, 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 세척한 후, 기질 DAB를 넣어 발색하며, 헤마톡실린으로 카운터염색을 하고, 마운팅을 하여, 사진촬영을 하였다.
도 11은 면역조직화학의 대표적 결과이다. 도 11에 도시된 바와 같이, STW-139-15 단일클론항체 샘플은 다양한 종양조직(폐암, 간암, 뇌암, 췌장암, 난소암 등을 포함) 영역의 혈관샘플 구조에 특이적으로 결합할 수 있으나; 림프종 조직의 절편에서는 발색의 결과가 분명하지 않았다.
STW-139-15 단일클론항체가 다양한 악성종양 조직에 결합하고, 반면에 대부분의 정상조직에는 결합하지 않기 때문에(실시예 6 결과를 참조), 상기 단일클론항체는 종양영역의 혈관을 특이적으로 표적화하는 약물 또는 제제를 제조하기 위한 이상적인 물질 또는 담체이다.
실시예 8 유세포분석기 방법으로 시노몰구스 원숭이 PV-1 단백질에 대한 마우스 유래 STW-139-15 단일클론 항체의 결합을 측정
1) 인간 및 원숭이 PV-1 단백질의 세포막외 영역 아미노산 서열 정렬분석
인간 PV-1 단백질의 세포막외 아미노산 서열(서열번호 8) 및 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis) PV-1 단백질(NCBI: GenBank: AKG92647.1)의 세포막 막 영역 아미노산 서열(서열번호 25)의 정렬분석 결과는 도 12에 나와 있다. 도 12에 도시된 바와 같이: 단백질의 서열에 있어서, 원숭이 PV-1 단백질과 인간 PV-1 단백질의 세포막외 영역의 상동성은 95%이며, 17개 아미노산 부위의 서열이 상이하다.
2) 원숭이 PV-1 유전자를 발현하는 CHO 세포주 구축
Genbank에 의해 공개된 시노몰구스 원숭이 PV-1 전장 단백질의 아미노산 서열(NCBI: GenBank: AKG92647.1)에 따라, 소주진웨이지생물학기술유한회사(Suzhou Jinweizhi Biological Technology Co., Ltd.)는 인공적으로 상응하는 원숭이 PV-1 cDNA 단편을 합성하도록 의뢰받았으며, 제한효소 처리 후, pCDNA3.1-DHFR 발현 플라스미드에 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 수득하였다. 재조합 플라스미드는 엔도뉴클레아제 소화 및 DNA 시퀀싱 식별에 의해 확인되었으며, CHO-dhfr-세포막에서 시노몰구스 원숭이 PV-1 전장단백질을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드(플라스미드 명칭: pCDNA3.1-DHFR-mkPV1)를 성공적으로 수득할 수 있음을 확인하였다.
상기 발현 플라스미드 DNA를 Fugen-6 리보솜(Roche)과 혼합한 후 DHFR 유전자결핍형 CHO세포(CHO-dhfr-)에 형질 주입하였다. 형질주입 후 8% FBS를 함유하는 일반적인 IMDM 배지로 스크리닝하여, 시노몰구스 원숭이 PV-1 전장 단백질을 발현하는 세포주를 수득하였다.
3) 유세포분석기로 CHO-/원숭이 PV-1세포에 대한 마우스 유래 단일클론항체STW-139-15 결합을 분석
실시예 4에 기재된 바와 같은 유세포분석 방법을 사용하여 상기 시노몰구스 원숭이 PV-1 전장 단백질을 발현하는 CHO 세포(CHO/ monkyPV-1)에 대한 마우스 유래 단일클론항체 STW-139-15 샘플의 결합을 측정 및 분석하였다. 상기 유세포분석기의 대표적인 검사 결과는 도 13에 도시된 바와 같이: 음성대조 샘플(SP2/0 골수종세포 배양 상청액, 도 13A) 및 관련이 없는 마우스 단일클론항체 샘플 mAB7(anti-PD-1 단일클론항체, 도 13B)와 비교하여, 마우스 유래 단일클론항체 STW-139-15는 CHO/monkyPV-1 세포에 유의하게 결합될 수 있다(도 13C). 이 결과는 시노몰구스 원숭이 PV-1 단백질의 세포막외 아미노산 서열 및 인간 PV-1단백질의 아미노산 서열의 차이가 STW-139-15 단일클론항체에 대한 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. STW-139-15 단일클론항체는 시노몰구스 원숭이 PV-1단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며 이 결과는 또한 시노몰구스 원숭이가 STW-139-15 단일클론 항체의 체내 연구를 수행하기에 이상적이며 관련된 동물임을 시사하였다.
실시예 9. 마우스 유래 STW-139-15 단일클론항체의 가변영역을 코딩하는 유전자의 클로닝, 증폭 및 분석
본 실시예에 있어서, 우선 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15에서 총 RNA를 추출하고, 다시 이 RNA를 주형으로 하여, 변성 프라이머(degenerate primers)를 사용하여, Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법으로 (Wang Y 등: Degenerated primer design to amplify the heavy chain variable region from immunoglobulin cDNA. BMC Bioinformatics. 2006; 7 Suppl (4): S9)각각 클로닝, 증폭으로 STW-139-15항체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 cDNA 유전자단편을 수득하였다. 여기서 cDNA 유전자 클로닝 단계는 다음과 같다:
단계 1, RNA 추출시약(RNAiso Plus, Takara사 제품)을 사용하여 마우스 하이브리도마세포 STW-139-15로부터 총 RNA를 추출하였다;
단계 2, 역전사 PCR(RT-PCR) 방법으로 eppendorf 튜브에서 cDNA 주형을 얻었다.
여기서 STW-139-15 항체 경쇄 가변영역 역전사 PCR 프라이머(STW-139-15-L)에 사용된 서열은: TGT CGT TCA CTG CCA TCA AT(서열번호 9)이고;
STW-139-15 항체 중쇄 가변영역 역전사 PCR 프라이머(STW-139-15-H)에 사용된 서열은: GCA AGG CTT ACA ACC ACA ATC(서열번호 10)이며;
RT-PCR 반응시스템은 하기와 같다:
프라이머 2μl
RNA주형 30μl
72℃ 에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 얼음 위에서 2분간 방치.
---------------------------------------------------------------
이어서 하기 물질을 첨가:
5ХRT-PCR 반응완충액 10μl
dNTPs 5μl
PrimeScript 역전사 효소 1.5μl
증류수 1.5μl
총 체적 50μl
42℃ 하에서 1시간 동안 반응시킨 후, 온도를 75℃까지 승온시켜, 15분동안 불활성화시킨 후 cDNA를 수득하여 -20℃에서, 사용할 때까지 저장하였다.
단계 3, STW-139-15 항체 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역 유전자의 PCR 클로닝 증폭
변성 프라이머(degenerate primers) PCR 방법으로 STW-139-15 항체의 경쇄 가변영역 유전자를 클로닝 및 증폭시키는데 사용되는 한 쌍의 프라이머:
포워드 프라이머: GAC ATT GTG ATG WCM CA(서열번호 11)
리버스 프라이머: CTG AGG CAC CTC CAG ATG TT(서열번호 12)
여기서 W=A 또는 T, M= A 또는 C.
변성 프라이머(degenerate primers) PCR 방법으로 STW-139-15 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 클로닝 및 증폭시키는데 사용되는 한 쌍의 프라이머:
포워드 프라이머: CAR CTG CAR CAR YCT G(서열번호 13)
여기서 R= A 또는 G, Y=C 또는 T.
리버스 프라이머: GTG CTG GAG GGG ACA GTC ACT(서열번호 14)
PCR 증폭에 의해 수득된 DNA 생성물을 1% agarose 겔에서 전기영동으로 분석하였다. 전기영동이 완료된 후, 분리된 DNA 밴드를 절단하여 각각 서열 분석하여 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 DNA의 뉴클레오티드 서열을 수득하였다. 여기서 측정된 상기 항체 경쇄 가변영역 DNA의 뉴클레오티드의 서열은 서열번호 15에 나타내고, 상기 DNA 뉴클리오티드의 서열로부터 추측된 항체 경쇄의 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 16에 나타냈다. 상기 경쇄의 항원 상보성 결정영역(complementarity-determining regions, CDR)의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에서 나타냈다.
측정된 상기 항체 중쇄의 가변영역 DNA의 뉴클리오티드 서열은 서열번호 20에 나타내고, 상기 DNA의 뉴클레오티드의 서열로부터 추측된 항체 중쇄의 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 21에 나타내고 있다. 상기 중쇄 항원 상보성 결정영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에서 보여지고 있다.
실시예 10 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C의 구축
실시예 9에서 클로닝 및 증폭으로 수득한 마우스 유래 STW-139-15 항체 경쇄의 가변영역 유전자 및 중쇄의 가변영역 유전자를 각각 인간-kappa경쇄 불변영역(C-domain) 및 인간 IgG1-중쇄 불변영역의 유전자 단편에 융합시켜, 인간-마우스 키메라 경쇄 유전자(STW-139-15-L) 및 인간-마우스 키메라 중쇄 유전자(STW-139-15-H)를 얻었다. 경쇄 키메라 유전자 및 중쇄 키메라 유전자를 각각 pcDNA3.1 발현 플라스미드(Invitrogen)에 클로닝하고, 대장균에 주입하여 증폭시키며, 인간-마우스 키메라항체 경쇄 유전자 인간-마우스 키메라항체 중쇄 유전자를 함유하는 발현 플라스미드를 분리하여 수득하였다.
이어서, 인간-마우스 키메라항체 경쇄 유전자를 함유하는 발현 플라스미드의 부분적 샘플(재조합 플라스미드 번호 L17, L18, L19) 및 인간-마우스 키메라항체 중쇄 유전자를 함유하는 발현 플라스미드의 부분적 샘플(재조합 플라스미드 번호: H12, H13, H15)을 각각 둘씩 병용하여, Fugen-6 리보솜(Roche사 제품)과 혼합한 후 CHO세포에 형질 주입하였다. 세포에 형질주입한 2 내지 3일 후, 배양상청액을 취하여, 인간 PV-1-Fc단백질이 코팅된 96-웰 플레이트에, HRP 효소로 표식된 Goat-anti-human-IgG(Fab Specific)를 2차 항체(상하이 서당생물회사 Shanghai Xitang Biological Company에서 구매)로 하였고, 2차 항체를 검출하기 위해, 마이크로 플레이트 리더기의 492nm에서 수치를 읽어, 상청액 중의 인간 PV-1 단백질에 대한 키메라항체의 결합을 측정하였다.
이 ELISA 대표적 검사결과(492nm판독값)는 하기 표 1 및 표 14에 나와 있다:
Figure pct00001
(주: L17, L19는 시퀀싱에 의해 완전히 정확하다고 판단된 경쇄, H15는 시퀀싱에 의해 완전히 정확하다고 판단된 중쇄; H12, H13 및 L18의 시퀀싱 결과는 정확하지 않았다.)
표 1 및 도 14의 결과에 나타난 바와 같이: 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15 중쇄 유전자를 정확하게 발현하는 플라스미드 및 경쇄 유전자를 정확하게 발현하는 플라스미드로 동시에 형질 주입된 CHO 세포 배양상청액(H15+L19) 샘플은 인간 PV-1-Fc 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 형질 주입된 세포 상청액을 원심분리하고 0.45 μm 필터막으로 여과한 후, Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼(proteinA-Sepharose Fast Flow, 미국General Electric사의 GE사 제품)에 로딩하여 순도가 95%이상인 인간-마우스 키메라항체(STW-139-15-C) 단백질을 분리 정제하여 얻었다.
정제된 STW-139-15-C 항체 단백질은 여과를 통해 멸균시킨 후, 다시 무균 PBS 액체에 용해시켜, 최종 단백질 용해도가 약 10mg/ml인 액체로 준비되고, 상기 제제는 2 내지 8℃의 저온에서 빛을 차단하여 장기적으로 보존할 수 있다.
실시예 11 시노몰구스 원숭이 체내에서 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C의 생물학적 효능 또는 활성의 측정
STW-139-15는 마우스PV-1을 인식하지 못하므로, 마우스체내에서 생물학적 효능 또는 활성을 측정할 수 없다. 이를 위해, 본 실시예에서, 시노몰구스 원숭이를 시험동물로 선택하고, 레이저에 의해 유도된 시노몰구스 원숭이 맥락막 혈관신생을 억제하기 위한 인간-마우스 키메라항체 STW-139-15-C의 생체 내 시험을 수행하였다. 이 연구는 청두화서해서의약기술유한회사(WestChina-Frontier PharmaTech Co., WCFP) 및 국제청두신약안정성평가센터(National Chengdu Center for Safety Evaluation of Drugs, NCCSED)에 의뢰하여 완성하였다.
실험목적
유리체 주사를 통해 투여된 인간-마우스 키메라항체(STW-139-15C, 샘플번호STW007)가 시노몰구스 원숭이에서 레이저에 의해 유도된 맥락막 신생혈관의 침투 및 생장에 대한 영향을 연구하여 약물의 더한층 연구에 대한 동물시험 근거를 제공하였다.
이 동물시험 연구는 두 단계로 나뉘며, 그 중 첫 단계의 시험 모델, 투여군 및 시험결과에 대한 설명은 하기와 같다:
동물시험 모델 및 투여군
11.1 모델 구축
11.1.1 마취
시노몰구스 원숭이를 펜토바르비탈나트륨(25 mg/kg, 정맥주사)으로 마취시키고, 마취기간에 소량의 Celluvisc를 비정기적으로 드롭하여 각막을 촉촉하게 유지하였다.
11.1.2 산동(mydriatic)
양측 눈에 Mydria 산동제(트로피카마이드 점안약)를 넣어 동공을 확대시켰다.
11.1.3 레이저광 응고
시노몰구스 원숭이의 머리를 안과 레이저광 응고기기 앞에 고정하고, 전체 망막거울을 통해 황반영역을 광응고시켰다. 광응고는 황반의 중심와를 둘러싸고 있지만 중심와의 손상을 피하면서, 눈마다 8 내지 9개 점을 촬영하였다. 레이저 매개변수: 광반직경 50μm, 에너지 0.6 내지 0.7W, 노출시간 0.05s. 광응고 성공여부 판정: 기포가 발생하면 Bruch's의 막이 파손되었음을 나타낸다.
레이저 광응고 후 2 내지 3주마다 한 번씩 플루오레세인 혈관 조영술을 수행하는데 이는 모델링의 성공여부를 판정하는 근거가 된다.
원숭이의 각 안구에 적어도 하나의 레벨4 광점을 가지고 있으면, 모델링이 성공하였음을 판단한다.
11.2 투여량 설계
각 군의 동물은 레이저 광응고 3주 후에 투여되었다. 투여량 설계는 하기 표2와 같다:
Figure pct00002
여기서, 양성약물 hPV19 단일클론항체는 인간 및 원숭이 VEGF 항원의 인간 유래 항체를 특이적으로 인식하고 결합한다(중국특허문서: 등록된 특허번호: 201210540692X, 특허명칭: 혈관내피 세포 성장인자 및 이의 수용체에 대한 결합을 길항 및 억제하기 위한 단일클론 항체 및 이의 코딩서열 및 용도; 및 미국특허문서: 등록된 특허번호: US9580498B2).
11.3 투여
투여경로: 양안 유리체내주사;
투여경로 및 선택이유: 임상약물과 투여경로 일치;
투여빈도: 단일투여량;
투여방법: 각 군의 시노몰구스 원숭이는 펜토바르비탈나트륨(약 25 mg/kg, 정맥주사, 원숭이의 마취상황에 따라 적절하게 마취용량을 조절할 수 있음)로 마취시킨 후, 포비돈요오드 용액으로 주사하려는 눈을 소독하였고, 표2에 기재된 양안 유리체내주사로 상응한 농도의 STW007, 양성약물 및 STW007+양성약물, 모델 대조군에 동일한 부피의 0.9% NaCl 주사액을 투여하였다. 필요 시, 1 내지 2방울의 옥시부카인염산염 점안액을 드롭하여 표면마취를 한 후 다시 주사 조작을 하였다.
유리체내 주사 후, 오플로사신 안연고를 1 내지 2방울 드롭하여 감염방지 및 각막을 습윤하게 하였다.
투여 당일을 시험 1일째로 정의하였다.
제2단계: 동물시험 결과:
표 3은 광응고 후 3주, STW-139-15C 단일클론항체(STW007) 및 양성 대조약물hPV19(항-VEGF 단일클론항체)의 유리체내주사가 시노몰구스 원숭이 플루오레세인 누출 영역의 감소 및 개선율에 미치는 영향(투여 후 49일째까지 데이타 통계);
도 15A 내지 도 15D는 각 군에서 동물의 유리체내주사 투여 후 7, 14 및 21일째의 안저 플루오레세인 조영사진이다.
Figure pct00003
참고: 투여 후 7일 내지 투여 후 36일까지 측 시점에서, 샘플 1+2군 4M001에서 오른쪽 눈 플로오레세인의 누출영역에 대한 데이터가 없으므로, 샘플의 양은 1이다. 표 3 및 도 15A에 도시된 바와 같이: 치료 전과 비교 시, 모델대조군(0.9%NaCl 주사액)은 약물투여 후, 안저 플루오레세인 누출이 개선되지 않았을 뿐만 아니라, 더 악화되었다(관찰기간 동안 플루오레세인 누출 면적의 개선율의 평균 수치는 -11.12% 내지 -54.73%이며; 7 내지 21일째 일련의 안저 형광사진은 도 15A를 참조한다). 반면에 STW-139-15C 단일클론항체 샘플(0.5mg/눈)을 투여 후 7일째부터, 안저 프루오레세인 누출이 유의하게 개선되었으며(관찰기간 동안 플루오레세인 누출영역의 개선율은 33.27% 내지 64.10%이며; 7 내지 21일 째 일련의 안저 형광사진은 도 15B를 참조한다); 이의 플루오레세인 누출 감소 정도는 동일한 투여량(0.5mg/눈)의 양성대조약물 hPV19(항VEGF 단일클론항체)군의 결과와 유사하였다(관찰기간 동안 플루오루세인 침투면적의 개선율의 범위는 45.75% 내지 71.12%이고, 7 내지 21일째 일련의 안저 형광사진은 도 15C에 도시된 바와 같다).
STW-139-15C 단일클론항체 샘플(0.25mg/눈) 및 양성대조약물 hPV19 단일클론항체(0.25mg/눈)를 병용하여 투여 후, 관철기간 동안 안저 플루오레세인 누출 면적의 개선율은 80.28% 내지 95.20% 사이를 유지하였으며(7 내지 21일 째 일련의 안저 형광사진은 도 15D를 참조한다), 단일 약물의 주사 투여량이 절반으로 감소된 조건하에서, 그 치료효능은 2배의 주사 투여량의 양성대조군 약물 hPV19 단일클론 항체(0.5mg/눈)보다 우수하다. 이 결과는 PLVAP/PV-1에 특이적으로 결합하는 STW-139-15C 단일클론항체가 시노몰구스 원숭이 체내의 레이저에 의해 유도된 맥락막 신생혈관 형성에 유의한 억제효과를 가지며; STW-139-15C 단일클론항체는 VEGF 단일클론항체 약물과 병용하면, 치료효과가 각각의 단일 약물치료보다 우수하였다.
SEQUENCE LISTING <110>Suzhou Stainwei Biotech Inc. <120> Monoclonal Antibody Specifically Binding Human Plasmalemma Vesicle-Associated Protein PV-1, as well as Preparation Method and Use Thereof <130> WH-PCT-18-100056 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 MGLAMEHGGS YARAGGSSRG CWYYLRYFFL FVSLIQFLII LGLVLFMVYG NVHVSTESNL 60 QATERRAEGL YSQLLGLTAS QSNLTKELNF TTRAKDAIMQ MWLNARRDLD RINASFRQCQ 120 GDRVIYTNNQ RYMAAIILSE KQCRDQFKDM NKSCDALLFM LNQKVKTLEV EIAKEKTICT 180 KDKESVLLNK RVAEEQLVEC VKTRELQHQE RQLAKEQLQK VQALCLPLDK DKFEMDLRNL 240 WRDSIIPRSL DNLGYNLYHP LGSELASIRR ACDHMPSLMS SKVEELARSL RADIERVARE 300 NSDLQRQKLE AQQGLRASQE AKQKVEKEAQ AREAKLQAEC SRQTQLALEE KAVLRKERDN 360 LAKELEEKKR EAEQLRMELA IRNSALDTCI KTKSQPMMPV SRPMGPVPNP QPIDPASLEE 420 FKRKILESQR PPAGIPVAPS SG 442 <210> 2 <211> 438 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 MGLSMDRSPY ARTGDQQRGC WYYLRYFFLF VSLIQFLIIL GLVLFMIYGN VHATTESSLR 60 ATEIRADSLY SQVVGLSASQ ANLSKQLNIS LLVKETVMQQ 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Claims (18)

  1. 제1가변 영역 및 제2가변 영역을 포함하고, 상기 제1가변 영역은 항체의 경쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열이고; 상기 제2가변 영역은 항체의 중쇄 가변영역이며, 이의 항원 상보성 결정영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 인간 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1가변 영역은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열인 항체 경쇄 가변영역이고; 상기 제2가변 영역은 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열인 항체 중쇄 가변영역인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 가변영역 및 인간 항체 경쇄 불변영역을 포함하며, 상기 항체 중쇄 가변영역 및 인간 항체 중쇄 불변영역의 힌지 영역, CH1 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인간 항체 경쇄 불변영역은 인간 항체 kappa 사슬 또는 항체 lamda 사슬로부터 유래되고, 상기 인간 항체 중쇄 불변영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4아형, IgA 또는 IgM으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체.
  5. 제1항 또는 2항에 있어서,
    상기 유도체는 항체 Fab 단편, Fv 단편, 단일사슬 항체, 이중특이성 항체, 항체-약물-복합체(antibody-drug-conjugated, ADC), 또는 키메라항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T-Cell, CAR-T)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 유도체.
  6. 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 15에 기재된 뉴클레오티드 서열이고, 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 제2항에 기재된 항체 또는 이의 유도체를 코딩하는 DNA 분자 또는 유전자.
  7. 제6항에 기재된 DNA 분자 서열 및 상기 서열과 작동 가능하게 연결된 발현조절서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  8. 제7항에 기재된 발현벡터로부터 형질전환되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포.
  9. 상기 재조합 숙주세포 또는 이의 자손세포가 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 이의 유도체를 발현시키는 제8항에 기재된 재조합 숙주세포 또는 이의 자손세포.
  10. 약학적으로 유효량의 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 또는 이의 유도체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약물 또는 약학조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    약학적 유효량의 혈관내피성장인자 VEGF 또는 이의 수용체 VEGF-R을 길항 및 차단하는 활성성분, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    혈관 신생 또는 침윤과 관련된 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 상기 약물 또는 약물적 조성물의 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 질환은 맥락막 신생혈관 안저 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 맥락막 신생혈관 안저 질환은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 및 노인황반변성(age-related macular degeneration)인 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 항체가 서열번호 8 또는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항원에 결합하며, 또한 PV-1에 결합하기 위해 제1항 또는 제2항에 기재된 항체 및 이의 유도체와 경쟁하는 것을 특징으로 하는 인간 및 원숭이의 원형질막 소포 관련 단백질PV-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 유도체.
  16. 적절한 투여량의 제1항, 제2항 또는 제15항에 기재된 항체 또는 이의 유도체를 투여하는 것을 특징으로 하는 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1에 의해 매개되는 혈관신생 또는 침투를 길항 및 차단하는 방법.
  17. 제1항, 제2항 또는 제15항에 기재된 단일클론항체 또는 이의 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 또는 세포 샘플 중 원형질막 소포 관련 단백질 PV-1을 측정하는데 사용되는 시약 또는 키트.
  18. a) 제6항에 기재된 DNA 분자서열 및 상기 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 단계;
    b) 단계 a)에 기재된 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
    c) 상기 항체의 발현에 적합한 조건에서 단계 b)에서 수득된 숙주세포를 배양하는 단계: 및
    d) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 숙주세포 배양액으로부터 상기 항체를 분리 및 정제하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항, 제2항 또는 제15항에 기재된 항체 또는 이의 유도체를 제조하는 방법.
KR1020207024552A 2018-03-30 2018-09-27 인간 원형질막 소포 관련 단백질 pv-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도 KR102608028B1 (ko)

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