JP6807606B2 - 多価及び多重特異性ｄｒ５結合融合タンパク質 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１５年７月１６日に出願された米国仮出願番号６２／１９３、３０９号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれている。

発明の分野
本開示は、一般に、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである細胞死受容体５（ＤＲ５）に特異的に関与する分子に関する。より具体的には、本開示は、少なくともＤＲ５に結合する多価及び多重特異性分子に関する。

発明の背景
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーは、いくつかの構造的に関連する細胞表面受容体からなる。多量体リガンドによる活性化は、これらの受容体の多くの共通の特徴である。ＴＮＦＲＳＦの多くのメンバーは、適切に活性化されれば、多数の病状の治療に有用である。重要なことに、この受容体ファミリーを正しく刺激するためには、しばしばより高次のクラスター化を必要とし、従来の二価抗体はこれに対して理想的ではない。従って、ＴＮＦＲＳＦのより強力なアゴニスト分子が治療的には必要である。

発明の概要
本開示は、少なくとも細胞死受容体５（ＤＲ５、またＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）としても知られている）に結合する多価融合ポリペプチドを提供する。これらのＤＲ５結合融合ポリペプチドは、本明細書ではＤＲ５標的分子とも呼ばれる。ＤＲ５は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）に結合するＴＮＦ−受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。ＴＲＡＩＬは、健康な細胞集団から望ましくない感染細胞及び悪性細胞を選択的に根絶することによって、哺乳動物の発達及び宿主防御において重要な役割を果たすように進化した。ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーＤＲ４またはＤＲ５に結合すると、カスパーゼ依存性アポトーシスを介して細胞死を誘導する。ＤＲ５は、ＴＲＡＩＬ経路で観察される腫瘍偏向活性を促進する腫瘍細胞上の主要な受容体のようである。ＤＲ５は天然のリガンドＴＲＡＩＬによって活性化され、３つのＤＲ５受容体を近接させ、これにより細胞内カスパーゼ−８を活性化し、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３等の他の死誘導性カスパーゼの活性化を開始する。従って、この細胞死経路の開始には、効率的な細胞死のためのＤＲ５受容体のクラスター化が必要である。

ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを標的とする従来の抗体は、ＤＲ４、ＤＲ５、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０に対する活性抗体のためのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）の必要性によって証明されるように、十分なアゴニスト活性を達成するために外因性架橋を必要とすることが示されている（Ｉｃｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ ２００１ ａｌ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９５４−９６０，Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．６９，６９−８２；Ｐｕｋａｃ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９２，１４３０−１４４１；Ｙａｎｄａ ｅｔ ａｌ ２００８ Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９，１０６０−１０６７ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２５１：１４６−１５７；Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ ２０１３ ＪＥＭ ２１０（９）：１６８５；Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｉｍｍｕｎｏｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９２：４７５−４８０）。ＦｃγＲを介しての架橋に加えて、オリゴマーリガンドまたは抗体結合エンティティ（例えば、プロテインＡ及び二次抗体）が添加された他の外因性薬剤が、抗ＴＮＦＲＳＦ抗体クラスター化及び下流シグナリングを増強することが実証されている。例えば、ＣＤ１３７抗体、ＰＦ−０５０８２５６６のインビトロアゴニスト活性は、二次抗体を介して架橋することが必要である（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１２ ６１：１７２１−１７３３）。これらの知見は、二量体を超えたＴＮＦＲＳＦのクラスター化の必要性を示唆している。

癌治療のためにＴＲＡＩＬ経路を臨床的に利用する努力は、天然リガンドＴＲＡＩＬの組換え型及びＤＲ５に特異的な抗体に依存して行われてきた。ＤＲ５を標的とする抗体アゴニストは、前臨床的インビトロ実験において架橋剤を必要とした。例えば、ＤＲ５リガンドＴＲＡＩＬの添加は、抗ＤＲ５抗体ＡＭＧ６５５のアポトーシス誘導能力を増強した（Ｇｒａｖｅｓ ｅｔ ａｌ ，２０１４ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２６：１７７−１８９）。従来の抗体は２価であり、２つのＤＲ５受容体のみをクラスター化することができる（各ＦＡＢアームにつき１つ）。ＴＮＦＲＳＦの他のメンバーと一致しての、２つのＤＲ５レセプターのクラスター化は、シグナル伝達を仲介し、インビトロで細胞死経路を活性化するには不十分である。ヒト癌の前臨床マウスモデルにおけるＤＲ５標的抗体のインビボ投与は、驚くべきことに、多種多様な腫瘍型において有意な活性を示した。この活性は、後に、マウスＦｃガンマＲ（ＦｃγＲ）受容体に依存することが示された。ヒトにおける臨床研究は、これらの前臨床マウスモデルで見られた安定した応答を再現することができなかった。ヒトにおける活性の欠如は、不十分な抗体架橋に起因すると仮定される。これは、免疫不全マウスとヒト癌患者との間の血清ＩｇＧ、ＦｃγＲ及び／またはＴＲＡＩＬの差異に起因し得る。

本開示は、直接細胞死を媒介するＤＲ５シグナル伝達に強力に作用することができる、ＤＲ５を標的とする多価融合タンパク質を提供する。本開示の融合タンパク質は、２価、３価、４価、５価または６価であり得る。重要なことには、本開示の融合タンパク質は、外因性架橋剤とは独立して、ＤＲ５発現細胞のアポトーシスを誘発することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５に結合する結合ドメイン（ＤＲ５ＢＤ）を組み込んでいる。好ましい実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ４、デコイＲ１、デコイＲ２、オステオポンチン、または任意の他のＴＮＦＲＳＦメンバーに結合しない。好ましい実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ヒト及びカニクイザルＤＲ５に結合する。いくつかの実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ５及びそのリガンドＴＲＡＩＬの相互作用を妨害する。他の実施形態では、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ５及びそのリガンドＴＲＡＩＬの相互作用を妨害しない。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５上の異なるエピトープを認識する複数のＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、いくつかのＤＲ５ＢＤがＤＲ５−ＴＲＡＩＬ相互作用を妨害し、他のものがＤＲ５−ＴＲＡＩＬ相互作用を妨害しない、複数のＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。好ましい実施形態では、本開示の融合タンパク質を標的とするＤＲ５は、腫瘍細胞の直接細胞死を誘導する。本開示のＤＲ５標的融合タンパク質は、本来、血液学的及び固体的である両方の腫瘍を治療するのに有用である。

本開示は、２つ以上のＤＲ５結合ドメイン（ＤＲ５ＢＤ）を含む多価ＤＲ５結合融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は新生物の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、腫瘍細胞上に発現したＤＲ５に結合する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、各ＤＲ５ＢＤはＤＲ５に結合する２つ以上の異なるＤＲ５ＢＤを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの複数のコピーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの少なくとも２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの少なくとも３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの少なくとも４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの少なくとも５つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの少なくとも６つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤの６つ以上のコピーを含む。

本開示の多価ＤＲ５結合融合タンパク質は、外因性架橋剤を必要とせずに、損傷細胞、形質転換細胞、ウイルス感染細胞、または新生物細胞を直接細胞死に誘導することができる。さらに、本開示のＤＲ５結合融合タンパク質は、正常な、非形質転換細胞、非ウイルス感染細胞または非新生物細胞を直接細胞死に誘導しない。重要なこととして、本開示のＤＲ５ＢＤ及びこれらから構成される融合タンパク質は、いくつかのヒト被験体に存在する単一ドメイン抗体に向けられる既存の抗体による認識を低減または排除している。

ＴＡＳ２６６は、ＦｃγＲによるさらなる架橋を必要とせずに、２価抗体と比較して優れたアポトーシス誘発能力を示す４価ヒト化ＤＲ５標的ナノボディベース治療剤である。（Ｈｕｅｔ、Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５ ｅｌｉｃｉｔ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．（細胞死受容体５を標的とする多価ナノボディは、効率的なカスパーゼ誘導を介して優れた腫瘍細胞死滅を誘発する）ｍＡｂｓ Ｖｏｌ．６，Ｉｓｓ．６，２０１４）。

健康なヒト被験体の約半分が、ヒトＶＨドメイン内のエピトープを標的とするヒト抗ＶＨ自己抗体（ＨＡＶＨ）として知られている、ヒト単一ドメイン抗体を認識する既存の抗体を有することが以前から予測されている（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３）３３：１１９２−１２０３））。従って、ヒト化ラクダ科動物由来のＶＨＨは、標的エピトープが潜在的であり且つヒト生殖系列フレームワーク領域内に位置するようであるので、ＨＡＶＨ自己抗体によっても認識されると予想された。ＨＡＶＨ自己抗体（本明細書中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）または抗単一ドメイン抗体（ＡＳＤＡ）とも呼ばれる）の相互作用は、クラスター化及び活性化の増強を引き起こし得る。この仮説と一致して、第Ｉ相臨床試験において、ＴＡＳ２６６の投与は、肝毒性を示す上昇したＡＳＴ及びＡＬＴレベルを誘導した。上昇した酵素レベルは、４人の患者のうち３人に発生し、ＴＡＳ２６６試験の終了に至った。肝毒性の臨床的徴候を示す３人の患者にはＡＤＡが既存していたため、治験研究者が、毒性を引き起こすＤＲ５受容体のＡＤＡ誘発過剰クラスター化を疑うようになったことが注目された。ＡＤＡを持たない１人の患者は毒性の兆候がなかったことが注目された（Ｉｓａａｃｓ Ｒ，Ｂｉｌｉｃ Ｓ，Ｋｅｎｔｓｃｈ Ｋ，Ｈｕｅｔ ＨＡ，Ｈｏｆｍａｎｎ Ｍ，Ｒａｓｃｏ Ｄ，Ｋｕｎｄａｍａｌ Ｎ，Ｔａｎｇ Ｚ，Ｃｏｏｋｓｅｙ Ｊ，Ｍａｈｉｐａｌ Ａ．ＤＲ５受容体を標的とする新規４価アゴニストのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であるＴＡＳ２６６の第Ｉ相試験における予期せぬ肝毒性。Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＫＰ１，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５ Ｍａｙ； ７５（５）：８８７−９５．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２８０−０１５−２７１２−０．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｆｅｂ．２７．）。この考えを支持するために、ＤＲ５アゴニストの凝集形態は肝毒性を誘導するが、非凝集形態は誘導しないことが文書で十分に証明されている（Ｊ Ｌｅｍｋｅ，Ｓ ｖｏｎ Ｋａｒｓｔｅｄｔ，Ｊ Ｚｉｎｎｇｒｅｂｅ及びＨ Ｗａｌｃｚａｋ．Ｇｅｔｔｉｎｇ ＴＲＡＩＬ ｂａｃｋ ｏｎ ｔｒａｃｋ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１４）２１，１３５０−１３６４）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤＲ５ＢＤを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＲ５ＢＤの２つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＲ５ＢＤの３つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＤＲ５ＢＤの４つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＤＲ５ＢＤの５つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＤＲ５ＢＤの６つ以上のコピーを含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；を含む、少なくとも１つのＤＲ５ＢＤを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含む、ＤＲ５ＢＤの２つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含む、ＤＲ５ＢＤの３つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含む、ＤＲ５ＢＤの４つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含む、ＤＲ５ＢＤの５つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含む、ＤＲ５ＢＤの６つ以上のコピーを含有する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含む少なくとも１つのＤＲ５ＢＤを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含むＤＲ５ＢＤの２つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含むＤＲ５ＢＤの３つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含むＤＲ５ＢＤの４つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含むＤＲ５ＢＤの５つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列と、配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドとを含むＤＲ５ＢＤの６つ以上のコピーを含有する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、少なくとも１つのＤＲ５ＢＤを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、ＤＲ５ＢＤの２つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、ＤＲ５ＢＤの３つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、ＤＲ５ＢＤの４つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、ＤＲ５ＢＤの５つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１、１２８、１３４、１３８、１４１、１４２、１５９、１６２、１６３、１６８、１７３、１７６、１７８、１８１、及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８、１２９、１３１〜１３３、１３５、１３７、１３９、１４３、１６０、１６４、１６６、１６７、１６９、１７１、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８５及び１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１３０、１３６、１４０、１４４〜１５８、１６１、１６５、１７０、１７５、１８０、１８３、１８６、１８７、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；及び配列番号１〜５及び１２７から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む、ＤＲ５ＢＤの６つ以上のコピーを含有する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２〜１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９２〜１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１９〜１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本開示の融合タンパク質は、非架橋２価抗体と比較して、ＴＮＦＲＳＦメンバーのクラスター化を増強することができる。本開示の融合タンパク質によって媒介されるＴＮＦＲＳＦメンバーの増強クラスター化は、非架橋２価抗体と比較して増強されたＴＮＦＲＳＦ依存性シグナル伝達を誘導する。大部分の実施形態では、融合タンパク質は、２超の、例えば３つ、４つ、５つ、または６つの、ＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＤＲ５ＢＤ、及び非ＴＮＦＲＳＦメンバー抗原に向けられた結合ドメインを組み込んでいる。これらの実施形態において、非ＴＮＦＲＳＦ抗原の相互作用は、追加の架橋機能を提供することができ、ＴＮＦＲＳＦ活性化は、１つまたは２つのＤＲ５ＢＤのみで達成される。これらの実施形態では、融合タンパク質は多重特異性であり、２つの異なる抗原に結合する。他の実施形態では、融合タンパク質は、３つ以上のＤＲ５ＢＤ、及びＤＲ５以外の抗原に向けられた結合ドメインを組み込んでおり、この追加の抗原との相互作用は、ＤＲ５クラスター化を、ＤＲ５ＢＤ含有部分のみによって達成されるものを超えては増強せずに、生物学的分布の利点をもたらし、融合タンパク質のＤＲ５アゴニスト活性を被験体内の特定の部位に集中させる。例えば、本開示の４価ＤＲ５結合融合タンパク質は、特定の部位に活性を集中させる追加の抗原結合ドメインを含み得るが、この追加の抗原結合を欠く４価のＤＲ５結合融合タンパク質によって達成されるアゴニスト活性を超えてはアゴニスト活性を増強することは無い。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲ５ＢＤは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｖ_ＮＡＲまたはＶＨＨ等の抗体または抗体断片に由来する。好ましい実施形態では、ＤＲ５ＢＤはヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、Ｖ_ＮＡＲ、操作されたＶＨまたはＶＫドメインに由来し得る。ＶＨＨは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から作製することができる。Ｖ_ＮＡＲは、軟骨魚重鎖のみの抗体から作製することができる。界面工学及び特定の生殖系列ファミリーの選択を含む、従来のヘテロ二量体ＶＨ及びＶＫドメインから単量体ｓｄＡｂを作製するための様々な方法が実施されている。他の実施形態では、ＤＲ５ＢＤは、非抗体骨格タンパク質、例えば、アンキリンリピートタンパク質（ダルピン）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン及びフィノマー（これらに限定されない）、に由来する。

一般に、本開示の融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを介して操作可能に連結された少なくとも２つ以上のＤＲ５ＢＤからなる。本開示の融合物中の特異性ＤＲ５ＢＤとしてのｓｄＡｂ断片の利用は、多くの二重／多重特異性抗体アプローチに共通する重鎖：軽鎖ミスペアリングの問題を回避するとの利点を有する。さらに、本開示の融合タンパク質は、多くの二重特異性抗体によって必要とされる長いリンカーの使用を回避する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のすべてのＤＲ５ＢＤがＤＲ５上の同じエピトープを認識する。例えば、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５上の様々なエピトープに対して異なる認識特異性を有する２、３、４、５または６個のＤＲ５ＢＤを組み込むことができる。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５の異なる領域を標的とする複数のＤＲ５ＢＤを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ５上の異なるエピトープを認識し得るか、またはＤＲ５上のエピトープ及び異なる抗原を認識し得る。例えば、本開示は、ＤＲ５及び少なくとも第２の抗原に結合するＤＲ５ＢＤを組み込んだ多重特異性融合タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単一のポリペプチドから構成される。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、２つ以上のポリペプチドから構成される。例えば、ヘテロ二量体化ドメインが融合タンパク質に組み込まれて、非対称融合タンパク質を構築する。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域が融合タンパク質に組み込まれる場合、ＣＨ３ドメインはホモ二量体化ドメインとして使用され得るか、またはＣＨ３二量体界面領域が、ヘテロ二量化が可能になるように突然変異され得る。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、両端にＤＲ５ＢＤを含む。例えば、ＤＲ５ＢＤは、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分及び融合タンパク質のカルボキシ末端（Ｃ末端）部分の両方に位置する。他の実施形態では、全てのＤＲ５ＢＤが、融合タンパク質の同じ末端に存在する。例えば、ＤＲ５ＢＤは、融合タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端部分のいずれかに存在する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、及びＩｇＧ４サブクラスからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプである。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片はＩｇＧアイソタイプである。 例えば、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、アミノ酸配列：
を有する。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のグリコシル化を防ぐために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をアミノ酸Ａｓｎ２９７（枠内、Ｋａｂａｔ番号付け）で修飾する、例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、アミノ酸Ｌｅｕ２３５（枠内、Ｋａｂａｔ番号付け）で修飾される、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）またはＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、アミノ酸Ｌｅｕ２３４（枠内、Ｋａｂａｔ番号付け）で修飾される、例えばＬｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸２３４及び２３５の両方で変更される、例えばＬｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）またはＬｅｕ２３４Ｖａｌ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ）。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を減少させるためにＧｌｙ２３５で変更される。例えば、ここでは融合タンパク質からＧｌｙ２３５が除去される。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ＣＤ３２Ａとの相互作用を増強するためにアミノ酸Ｇｌｙ２３６で修飾される、例えば、Ｇｌｙ２３６Ａｌａ（Ｇ２３６Ａ）。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠いている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体結合を減少させるために、融合タンパク質のＦｃ領域を以下：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）の１つ以上の位置で変更する。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域内の修飾は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合への影響を最初に抑える一方、Ｆｃ受容体−ガンマ受容体への結合を低下させる。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を減少させるために、以下の位置：Ｇｌｕ２３３（Ｅ２３３）、Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、またはＬｅｕ２３５（Ｌ２３５）の１つ以上でアミノ酸を欠いている。これらの実施形態において、これらの３つのアミノ酸のＦｃ欠失は、補体タンパク質Ｃ１ｑ結合を減少させる。

いくつかの実施形態において、融合またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ２ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプであり、アミノ酸配列：
を有する。

いくつかの実施形態において、融合またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ２ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域は、アミノ酸Ａｓｎ２９７で修飾される（枠内、抗体のグリコシル化を防ぐために、例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）を欠いている。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、ヒトＩｇＧ３アイソタイプであり、アミノ酸配列：
を有する。

いくつかの実施形態において、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ３ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域は、抗体のグリコシル化を防ぐために、アミノ酸Ａｓｎ２９７（枠内、Ｋａｂａｔ番号付け）で修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域は、半減期を延長するためにアミノ酸４３５で修飾される、例えばＡｒｇ４３５Ｈｉｓ（Ｒ４３５Ｈ）。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠いている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、アミノ酸配列：
を有する。

いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域または免疫学的に活性な断片は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、アミノ酸配列：
を有する。

いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。

他の実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変化させるために、アミノ酸２３５で修飾される、例えばＬｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、抗体のグリコシル化を防ぐために、アミノ酸Ａｓｎ２９７（枠内、Ｋａｂａｔ番号付け）で修飾される、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠いている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）。

いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を増強するために修飾される。ＦｃＲｎへの結合を増強するＦｃ突然変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（それぞれＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔ番号付け、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ．２８１（３３）２３５１４−２３５２４）、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ，２０１０ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖｏｌ．２８（２）１５７−１５９）、またはＭｅｔ２５２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５６Ａｓｐ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ（それぞれＭ２５２Ｉ、Ｔ２５６Ｄ、Ｍ４２８Ｌ）、（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｔｅｒｅｓｔのＥＵインデックス）である。

本開示の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含むいくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは突然変異または修飾される。これらの実施形態では、突然変異または修飾されたＦｃポリペプチドは、以下の突然変異：Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いた、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ及びＭｅｔ４２８ＬｅｕまたはＭｅｔ２５２Ｔｙｒ及びＭｅｔ４２８Ｖａｌ（Ｍ２５２Ｙ、Ｍ４２８Ｌ、またはＭ２５２Ｙ、Ｍ４２８Ｖ）を含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に変えるために修飾される、例えばＮａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ，２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６８（１０）：３８６３−７２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６（４）：２５７１−５；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，２０１０ ｍＡｂｓ，２（２）：１８１−１８９；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ，２００６ ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５−４０１０，Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００１ ＪＢＣ，２７６（９）：６５９１−６６０４；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２−８８９０；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８ Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．，４８：１５２−１６４；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：３４６１−３４６８；Ｋａｎｅｋｏ及びＮｉｗａ，２０１１ Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２５（１）：１−１１での報告、に記載されたアミノ酸修飾。ＡＤＣＣを増強する突然変異の例としては、Ｓｅｒ２３９及びＩｌｅ３３２、例えばＳｅｒ２３９Ａｓｐ及びＩｌｅ３３２Ｇｌｕ（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）における修飾が挙げられる。ＣＤＣを増強する突然変異の例には、Ｌｙｓ３２６及びＧｌｕ３３３における修飾が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いた、これらの位置の一方または両方、例えばＬｙｓ３２６Ａｌａ及び／またはＧｌｕ３３３Ａｌａ（Ｋ３２６ＡｏｙｏｂｉＥ３３３Ａ）で修飾される。

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を修飾してヘテロ二量体化を誘導する。例えば、Ｔｒｙ（Ｔ３６６Ｗ）のような、より嵩高いアミノ酸で置換されたＴｈｒ３６６のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸修飾を有することは、Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、及びＴｙｒ４０７、例えば、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ及びＶａｌ（Ｔ３６６Ｓ ／ Ｌ３６８Ａ ／ Ｙ４０７Ｖ）の位置で、アミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３ドメインと優先的に対合して、嵩高さがより少ないアミノ酸とすることを可能にする。ＣＨ３修飾によるヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、Ｓｅｒ３５４をＣｙｓ（Ｓ３５４Ｃ）に、そしてＹ３４９を対向するＣＨ３ドメイン上のＣｙｓ（Ｙ３４９Ｃ）に変更することによって、さらに安定化され得る（Ｃａｒｔｅｒ，２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８：７−１５での報告）。

いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、二量化を防止するために修飾される。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は単量体である。例えば、残基Ｔｈｒ３６６での荷電残基への修飾、例えば、Ｔｈｒ３６６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３６６Ａｒｇ、Ｔｈｒ３６６Ａｓｐ、またはＴｈｒ３６６Ｇｌｕ（それぞれＴ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｄ、またはＴ３６６Ｅ）は、ＣＨ３−ＣＨ３二量化を防止する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低下させるために以下の位置：Ｌｅｕ ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）の内の１つ以上で変更される。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域内の修飾は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合に及ぼす影響を最小にする一方、Ｆｃ受容体−ガンマ受容体への結合を低下させる。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するポリペプチドを含む。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧサブクラスのいずれかから選択することができる。例えば、融合タンパク質は、軽鎖のＣ末端システインを有するジスルフィドを形成するＣｙｓ２２０がセリンに突然変異した、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号６）の配列を有する修飾ＩｇＧ１ヒンジ、例えばＣｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ）、を含むことができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号７）を有する短縮ヒンジを含む。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ（配列番号８）を有する鎖置換を防止または低減するように修飾されたＩｇＧ４由来の修飾ヒンジ、例えばＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）を有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はリンカーポリペプチドを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、リンカー及びヒンジポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、Ｎ２９７でＮ結合グリカン鎖に結合した還元フコースを欠くか、または有している。フコシル化を防止する多くの方法があり、限定されないが、ＦＵＴ８欠損細胞株における産生；、哺乳動物細胞培養培地への付加阻害剤、例えばＣａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ；及び産生細胞株の代謝工学を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＲ５ＢＤは、ヒトに存在する既存の抗体による認識を排除するように操作される。いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、位置Ｌｅｕ１１、例えばＬｅｕ１１Ｇｌｕ（Ｌ１１Ｅ）またはＬｅｕ１１Ｌｙｓ（Ｌ１１Ｋ）、における突然変異によって修飾される。他の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、カルボキシ末端領域における変化によって修飾され、例えば、その末端配列はＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＧＧ（配列番号９）またはＧＱＧＴＬＶＴＶＥＰＧＧ（配列番号１０）またはその修飾体からなる。いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、位置１１の突然変異及びカルボキシ末端領域の変化によって修飾される。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質のＤＲ５ＢＤは、アミノ酸リンカーを介して操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、本明細書においてＧＳ−リンカーとして示される、アミノ酸グリシン及びセリンから主に構成される。本開示の融合タンパク質のＧＳ−リンカーは、様々な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長であり得る。

いくつかの実施形態では、ＧＳ−リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１１）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_３（配列番号１２）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_４（配列番号１３）；及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_５（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は４価である。いくつかの実施形態では、４価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＶＨＨは少なくともＤＲ５に結合するヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。

いくつかの実施形態では、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は４価である。いくつかの実施形態では、４価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造：ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＤＲ５ＢＤは、ヒト化ＶＨＨまたは完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。

いくつかの実施形態では、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は６価である。いくつかの実施形態では、６価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＶＨＨは、少なくともＤＲ５に結合するヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。

いくつかの実施形態では、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は６価である。いくつかの実施形態では、６価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造：ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＤＲ５ＢＤはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲ５を標的とする多価融合タンパク質は、アミノ酸リンカーを介して操作可能に連結される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、本明細書においてＧＳ−リンカーとして示されるアミノ酸グリシン及びセリンから主に構成される。本開示の融合タンパク質のＧＳ−リンカーは、様々な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長であり得る。

いくつかの実施形態では、ＧＳ−リンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）_２（配列番号１１）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_３（配列番号１２）；ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_４（配列番号１３）；及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち（ＧＧＳ）_５（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、多価ＤＲ５結合融合タンパク質は４価である。いくつかの実施形態では、４価のＤＲ５結合融合タンパク質は、以下の構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー −ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ配列は、配列番号１５〜９１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４価のＤＲ５結合融合タンパク質は、配列番号９２〜１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、多価ＤＲ５結合融合タンパク質は６価である。いくつかの実施形態では、６価のＤＲ５結合融合タンパク質は、以下の構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ（但し、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である）を有する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ配列は、配列番号１５〜９１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、６価のＤＲ５結合融合タンパク質は、配列番号１１９〜１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本開示の多価及び多重特異性融合タンパク質の例の概略図である。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇは、代表的なＤＲ５ ＶＨＨまたはそのヒト化変異体の、ヒトＤＲ５（図２Ａ、２Ｂ、２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇ）及びｃｙｎｏ ＤＲ５（図２Ｃ及び２Ｄ）のどちらかへの結合を示す一連のグラフである。図２Ａ、２Ｂ、２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇは、ＤＲ５を発現するＣＨＯ細胞上のフローサイトメトリーによって評価したヒトＤＲ５に結合するいくつかのＶＨＨ及びヒト化ＶＨＨの結合を実証する。図２Ｃ及び２Ｄは、組換えｃｙｎｏ ＤＲ５を用いたＥＬＩＳＡによって評価した、ｃｙｎｏ ＤＲ５に結合するＶＨＨ及びヒト化ＶＨＨの結合を示す。図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥにおいて、使用されるＤＲ５標的融合タンパク質は２価であり、使用されるフォーマットはＶＨＨ−Ｆｃまたはヒト化（ｈｚ）ｈｚＶＨＨ−Ｆｃであった。図２Ｆ及び２Ｇにおいて、Ｆｃ融合タンパク質を標的とするヒト化４価（ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−Ｆｃ）ＤＲ５を使用した。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、本開示のＤＲ５標的融合タンパク質の直接アポトーシス誘発能力を実証する一連のグラフである。全てのアッセイにおいて、Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用し、ＤＲ５標的ＶＨＨは、（Ａ）Ｈ１０−Ｆｃ（２価）、（Ｂ）Ｈ１０−リンカー−Ｈ１０−Ｆｃ（４価）、または（Ｃ）Ｈ１０−リンカー−Ｈ１０−リンカー−Ｈ１０−Ｆｃ（６価）としてフォーマットされたＨ１０であった。図３Ａは、架橋剤が使用される場合の２価ＤＲ５標的融合タンパク質のアポトーシス誘発能力の増強を実証するグラフである。図３Ｂは、２価ＤＲ５標的化融合タンパク質と比較した、４価ＤＲ５標的融合タンパク質の増強されたアポトーシス誘導能力を実証するグラフである。図３Ｃは、２価ＤＲ５標的融合タンパク質及びＴＲＡＩＬと比較した、４価及びさらに６価のＤＲ５標的融合タンパク質の増強されたアポトーシス誘発能力を実証するグラフである。 耐性細胞株Ｐａｎｃ−１のアポトーシスを誘発するための６価ＤＲ５標的融合タンパク質の能力を実証するグラフである。比較のためにＣｏｌｏ２０５を示す。Ｈ１０ ＤＲ５標的ＶＨＨが示される。 ドキソルビシンが添加された場合の４価ＤＲ５標的融合タンパク質に対するＰａｎｃ−１の増強された感受性を実証するグラフである。示されたＤＲ５標的ＶＨＨは、ヒト化Ｆ０３（ｈｚＦ０３）であり、ｈｚＦ０３−リンカー−ｈｚＦ０３−Ｆｃとしてフォーマットされている。 Ｃｏｌｏ−２０５細胞を有するネズミ腫瘍異種移植モデルにおける、本開示の４価ＤＲ５標的融合タンパク質の抗腫瘍活性を実証するグラフである。融合タンパク質は、１週間に１ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与により４週間投与された。投与は、腫瘍が約３００ｍｍ^３に達したときに開始された。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、６Ｉ及び６Ｊは、様々の癌細胞系（図６Ａ及び６Ｂ）Ｃｏｌｏ−２０５、Ｐａｎｃ−１（図６Ｃ及び６Ｊ）、ＪＬ−１（図６Ｄ）、ＨＣＴ１１６（図６Ｅ）、ＮＣＩ−Ｈ２８（図６Ｆ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（図６Ｇ）、ＨＴ−２９（図６Ｈ）及びＭＳＴＯ−２１１Ｈ（図６Ｉ）について、ＴＡＳ２６６（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０９８５２０Ａ１に記載の４価のＤＲ５ナノボディ）と比較して、本開示の４価ＤＲ５標的融合タンパク質のいくつかの直接的細胞死誘発能を実証する一連のグラフである。図６Ａ〜６Ｄにおいて、ＤＲ５標的ＶＨＨは、ｈｚＶＨＨ−リンカー−ｈｚＶＨＨ−Ｆｃとしてフォーマットされた１Ｆ５（ｈｚ１Ｆ５）のヒト化変異体である。図６Ｅ〜６Ｊにおいて、ＤＲ５標的ＶＨＨは、ｈｚＶＨＨ−リンカー−ｈｚＶＨＨ−Ｆｃ変異体としてフォーマット化された１Ｆ２（ｈｚ１Ｆ２）または２Ｃ６（ｈｚ２Ｃ６）のいずれかのヒト化変異体である。 ＴＡＳ２６６（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１１／０９８５２０Ａ１に記載された４価ＤＲ５のナノボディ）と本開示のヒト化４価１Ｆ５（Ｔｅｔ−ｈｚ１Ｆ５ｖ５）の自己抗体認識における差異を実証するグラフである。このグラフは、４５人のヒトドナーの血清からの結果を示している。カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかを含む自己抗体は、それぞれの抗ヒトＩｇカッパまたは抗ヒトＩｇラムダＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いた別個のアッセイで検出された。データは、ラムダまたはカッパ軽鎖のいずれかをそれぞれ有するＩｇＧ抗体の陽性対照に対して正規化される。ＴＡＳ２６６は有意な自己抗体認識を示し、Ｔｅｔ−ｈｚ１Ｆ５ｖ５の自己抗体認識はＩｇＧ対照バックグラウンド認識のそれに減少している。 複数のヒトドナー（ＩＶＩＧ、Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）−Ｃ、Ｇｒｉｆｏｌｓ）からのプールされた血清が、ＴＡＳ２６６を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を認識するいくつかのＩｇＧ抗体を含むことを実証するグラフである。 ＩＶＩＧ内の自己抗体によるＴＡＳ２６６の認識が、初代ヒト肝細胞のアポトーシスを誘導することを実証するグラフである。 図８Ａ及び８Ｂは、肝前駆細胞株に由来する最終分化した肝細胞であるＨｅｐＲＧ（商標）上において、ＴＡＳ２６６（Ｔｅｔ−ｈｚ１Ｆ５ｖ５ではない）の自己抗体認識依存性肝毒性を実証する一連のグラフである。図８Ａでは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ生細胞イメージャ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有するカスパーゼ−３／７特異性蛍光発生基質を用いて、アポトーシスをモニターし、データは４８時間で示されている。図８Ｂでは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４８時間後にアポトーシスをモニターした。ＩＶＩＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）−Ｃ、Ｇｒｉｆｏｌｓ）を、ｓｄＡｂ指向自己抗体含有抗体プールに使用した。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄは、本開示の４価のＤＲ５標的融合タンパク質ではなく、ＴＡＳ２６６の自己抗体認識依存性肝毒性を実証する一連のグラフである。ＨｅｐＲＧ（商標）細胞を、ヒト肝細胞の代用物として使用した。ＩＶＩＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）−Ｃ、Ｇｒｉｆｏｌｓ）を、ｓｄＡｂ指向自己抗体含有抗体プールに使用した。図９Ａ及び９Ｃは、独立した４８時間のアッセイを示し、ＴＡＳ２６６が自己抗体によって架橋された場合に肝毒性を誘導することを実証している。架橋抗ヒトＦｃ二次抗体を、ｈｚＶＨＨ−リンカー−ｈｚＶＨＨ−Ｆｃとしてフォーマットされた、本発明の４価ＤＲ５標的融合タンパク質、ｈｚ１Ｆ５、ｈｚ１Ｆ２またはｈｚ２Ｃ６に添加すると、中程度の肝毒性が観察された。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。図９Ｄは、アミノ酸位置Ｌｅｕ１１及び４つのＤＲ５ ｓｄＡｂ（ＦＩＸ−ＴＡＳ２６６、配列番号１２６）のそれぞれのＣ末端領域で修飾された場合のＴＡＳ２６６の減少した自己抗体認識依存性肝毒性を示す。このデータは、ＩＶＩＧの存在下でのＦＩＸ−２６６の肝細胞毒性が、ＩＶＩＧの非存在下でのＴＡＳ２６６の肝細胞毒性まで減少することを示す。ＨｅｐＲＧ細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。図９Ｂは、Ｔｅｔ−ｈｚ１Ｆ５ｖ６の二次抗体架橋依存性肝毒性と同様に、ＴＡＳ２６６の自己抗体認識依存性肝毒性の動態を示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ生細胞イメージャ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有するカスパーゼ−３／７特異性蛍光発生基質を用いて、４６時間にわたってアポトーシスをモニターした。本開示の４価のＤＲ５標的融合タンパク質は、抗体を含むｓｄＡｂ指向自己抗体の存在下または非存在下で肝毒性を誘導しない。

発明の詳細な説明

詳細な記載
本開示は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである細胞死受容体５（ＤＲ５）に特異的に関与する分子を提供する。より具体的には、本開示は、少なくともＤＲ５に結合する多価分子に関する。これらの多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、２つ以上のＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＤＲ５ＢＤ）を含み、且つ少なくとも１つのＤＲ５ＢＤがＤＲ５に結合している。これらの分子は、
本明細書においてＤＲ５標的分子と称される。

これらのＤＲ５標的分子は、ＤＲ５に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）配列の少なくとも１つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ５を標的とする分子は、ＤＲ５に特異的に結合するｓｄＡｂの２つ以上のコピー、例えばＤＲ５に特異的に結合するｓｄＡｂの３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のコピーを含む。

単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、特異性抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。わずか１２〜１５ｋＤａの分子量を有する、単一ドメイン抗体は、２つの重鎖タンパク質と２つの軽鎖タンパク質で構成される小さい一般的な抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、さらにＦａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）及び一本鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、１つは軽鎖から、もう１つは重鎖から）よりも小さい。

単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例としては、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠く抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体及び抗体由来のもの以外の単一ドメインのスカホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が含まれるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及び／またはウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体である。明確にするために、軽鎖を天然に欠いている重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨとして示される。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えばラクダ、ラマ、ドロマダール、アルパカ及びグアナコにおいて産生された抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖が天然に存在しない重鎖抗体を産生する可能性があり；このようなＶＨＨは本開示の範囲内である。

単一ドメイン抗体は、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを所望の抗原で免疫し、続いて重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応により、数百万のクローンを含む単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが作製される。ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイのようなスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンを同定するのに役立つ。（例えば、Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ ．； Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，Ａ． ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃａｍｅｌ ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ラクダ重鎖抗体からの単一ドメイン抗体断片の選択及び同定）”．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４（３）：５２１−５２６を参照。）

別の方法は、予め免疫化されていない動物の遺伝子ライブラリーを使用する。このようなナイーブなライブラリーは、通常、所望の抗原に対して低い親和性を有する抗体のみを含み、追加の工程としてランダム突然変異生成による親和性成熟を必要とする。（Ｓａｅｒｅｎｓ，Ｄ．； ｅｔ ａｌ．（２００８）．“Ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８（５）：６００−６０８。）

最も強力なクローンが同定されたとき、それらのＤＮＡ配列は、例えば酵素に対する安定性を改善するために、最適化される。別の目標は、抗体に対するヒト生物の免疫学的反応を防止するためのヒト化である。ヒト化は、ラクダ科のＶＨＨとヒトＶＨ断片との間に相同性があるため問題ではない。（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）．“Ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８（５）：６００−６０８を参照。）。最後のステップは、大腸菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは他の適切な生物において最適化された単一ドメイン抗体の翻訳である。

単一ドメイン抗体断片はまた、従来の抗体に由来する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する一般的なネズミまたはヒトＩｇＧから作製することができる。（Ｈｏｌｔ、Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００３），“Ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（１１）：４８４−４９０）。このプロセスも同様であり、免疫化されたまたはナイーブドナーからの遺伝子ライブラリー、及び最も特異的な抗原の同定のためのディスプレイ技術を含む。このアプローチの問題は、共通ＩｇＧの結合領域が、その親油性のために二量体化または凝集する傾向がある２つのドメイン（ＶＨ及びＶＬ）からなることである。単量体化は、親油性アミノ酸を親水性アミノ酸に置き換えることによって通常達成されるが、しばしば抗原に対する親和性の喪失をもたらす。（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｃ． Ａ． Ｋ．；Ｏｈｌｉｎ， Ｍ． （２００２）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｅｙｏｎｄ Ｎａｔｕｒｅ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（１２）：１１８９−９０を参照）。親和性が保持され得るならば、単一ドメイン抗体は、大腸菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは他の生物において同様に産生され得る。

一価の単一ドメイン抗体は、いくつかの方法によって多価にすることができる。例えば、第１のｓｄＡｂをコードするｃＤＮＡは、ＤＮＡ配列をコードするリンカー、続いてｓｄＡｂをコードする第２のｃＤＮＡ等に遺伝的に融合することができる。あるいは、ｓｄＡｂをコードするｃＤＮＡを、天然に多量体化するかまたは多量体化するように操作された、第２のタンパク質またはその断片をコードするｃＤＮＡに融合させることができる。例えば、ｓｄＡｂのＩｇＧ Ｆｃ領域への融合は、ｓｄＡｂを二量体化する。構築されたタンデムｓｄＡｂコード化がＦｃコード化構築物に連結されている場合、一度発現した得られる融合タンパク質は４価である。３つのｓｄＡｂをコードする構築物が、Ｆｃコード化構築物に連結されている場合、一度発現した得られる融合タンパク質は６価である。
本開示は、コラーゲンホモ３量化ドメイン及びヘテロ３量化ドメイン、ロイシンジッパードメイン、ｐ５３・４量化ドメイン、ｃ−Ｊｕｎ：Ｆｏｓヘテロ２量体ペプチド配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ４８）、３量体アディポネクチン、３量体界面活性タンパク質Ｄ、及び／またはシナプスアセチルコリンエステラーゼ四量体、等の追加の多量体化ドメインの使用を意図している。

死細胞受容体５（ＴＲＩＡＬ−Ｒ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）標的化
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、望ましくない感染細胞及び悪性細胞を健康な細胞集団から選択的に根絶することによって、哺乳類の発生及び宿主防御において重要な役割を果たすように進化した。ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーＤＲ４またはＤＲ５に結合すると、カスパーゼ依存性アポトーシスを介して細胞死を誘導する。ＤＲ５（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）は、ＴＲＡＩＬ経路で観察される腫瘍偏向活性を促進する腫瘍細胞上の主要な受容体であるようである。ＤＲ５は天然のリガンドＴＲＡＩＬによって活性化され、これが３つのＤＲ５受容体を近接させ、これにより細胞内カスパーゼ−８を活性化し、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３等の他の死誘導性カスパーゼの活性化を開始する。従って、この細胞死経路の開始には、効率的な細胞死のためのＤＲ５受容体のクラスター化が必要である。

癌治療のためのＴＲＡＩＬ経路を臨床的に利用する努力は、天然リガンドＴＲＡＩＬの組換え型及びＤＲ５に特異的な抗体に依存して行われた。ＤＲ５を標的とする抗体アゴニストは、臨床前インビトロ実験において架橋剤を必要とした。これは、従来の抗体が２つのＤＲ５レセプター（各重鎖及び軽鎖につき１つ）のクラスター化をもたらしたという事実によった。２つのＤＲ５受容体は細胞死経路を活性化するには不十分であり、従って架橋剤が必要である。ヒト癌の前臨床マウスモデルにおけるＤＲ５標的抗体のインビボ投与は、驚くべきことに、多種多様な腫瘍型において有意な活性を示した。この活性は、後に、マウスＦｃガンマＲ（ＦｃγＲ）受容体に依存すると示された。ヒトにおける臨床研究は、これらの前臨床マウスモデルで見られた堅固な応答を再現することができなかった。ヒトにおける活性の欠如は、不十分な抗体架橋に起因すると仮定される。これは、免疫不全マウスとヒト癌患者との間の血清ＩｇＧ、ＦｃガンマＲ（ＦｃγＲ）及び／またはＴＲＡＩＬ濃度の差に起因し得る。

本開示は、直接細胞死を媒介するＤＲ５シグナル伝達を強力に刺激することができる、ＤＲ５を標的とする多価融合タンパク質を提供する。本開示の融合タンパク質は、３価、４価、５価または６価であり得る。重要なことに、本開示の融合タンパク質は、外因性架橋剤とは独立して、ＤＲ５発現細胞のアポトーシスを誘発することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５に結合するＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。好ましい実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ４、デコイＲ１、デコイＲ２、オステオポンチン、または任意の他のＴＮＦＲＳＦメンバーに結合しない。好ましい実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ヒト及びカニクイザルＤＲ５に結合する。いくつかの実施形態において、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ５とそのリガンドＴＲＡＩＬとの相互作用を妨害する。他の実施形態では、ＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤは、ＤＲ５とそのリガンドＴＲＡＩＬとの相互作用を妨害しない。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＤＲ５上の異なるエピトープを認識する多数のＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、いくつかのＤＲ５ＢＤがＤＲ５−ＴＲＡＩＬ相互作用を妨害し、他のものがＤＲ５−ＴＲＡＩＬ相互作用を妨害しない、多数のＤＲ５結合ＤＲ５ＢＤを組み込んでいる。好ましい実施形態では、本開示のＤＲ５標的融合タンパク質は、腫瘍細胞の直接細胞死を誘導する。本開示のＤＲ５標的融合タンパク質は、本来、血液学的及び固体的の両方の腫瘍を治療するのに有用性を有する。

ＤＲ５結合ｓｄＡｂの例
ＤＲ５ ＶＨＨ（ラマ由来）及びヒト化配列を以下に示し、そしてＣＤＲ配列を各配列の下に示す。いくつかの実施形態では、ＤＲ５結合ｓｄＡｂはＩｇＧ Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は分子当たり２つのＤＲ５結合ドメインを有する２価である。いくつかの実施形態では、２つのＤＲ５結合性ｓｄＡｂ（２ｘ）がＩｇＧ Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は分子当たり４つのＤＲ５結合ドメインを有する４価である。いくつかの実施形態では、３つのＤＲ５結合性ｓｄＡｂ（３ｘ）がＩｇＧ Ｆｃ領域に融合され、これらの実施形態では、融合タンパク質は分子当たり６つのＤＲ５結合ドメインを有する６価である．

本明細書に記載のＤＲ５標的タンパク質は、様々な治療的、診断的及び予防的の症状において有用である。例えば、ＤＲ５標的タンパク質は、被験体における様々な疾患及び障害の治療に有用である。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的タンパク質は、炎症性疾患または障害に罹患しているか、または炎症性疾患または障害に罹患しているとみなされた被験体における、疾患または障害の治療、その症状の軽減、その進行の改善及び／または遅延に有用である。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的タンパク質は、癌または他の新生物状態の治療、その症状の改善、その進行の緩和及び／または遅延に有用である。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頚部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫、中皮腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、及びウイルス関連癌である。特定の実施形態では、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発性癌である。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的タンパク質は、それを必要とする被験体の腫瘍においてＴ制御細胞の数を減少させるかまたは枯渇させるのに有用である。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的タンパク質は、被験体において免疫応答を刺激するのに有用である。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的タンパク質は、自己免疫疾患または障害の治療、その症状の軽減、その進行の改善及び／または遅延に有用である。いくつかの実施形態において、ＤＲ５標的化タンパク質は、ウイルス性、細菌性及び寄生虫感染症の治療、その症状の緩和、その進行の改善及び／または遅延に有用である。

本開示のＤＲ５標的分子を含む本開示の治療用製剤は、被験体におけるＤＲ５の異常な活性及び／または発現に関連する疾患または障害に関連する症状を治療または緩和するために使用される。治療レジメンは、被験体、例えばＤＲ５の異常な活性及び／または発現に関連する疾患または障害に罹患している（または発症する危険性がある）ヒト患者を、種々の臨床的及び／または実験室手続きを含む標準的方法を用いて同定することにより行われる。患者という用語には、ヒト及び獣医学の被験体が含まれる。被験体という用語には、ヒト及び他の哺乳類が含まれる

治療の有効性は、ＤＲ５の異常な活性及び／または発現に関連する特定の疾患または障害を診断または治療するための任意の既知の方法と関連して決定される。ＤＲ５の異常な活性及び／または発現に関連する疾患または障害の１つ以上の症状の緩和は、ＤＲ５標的分子が臨床的利益を与えることを示している。

本開示のＤＲ５標的化分子の治療的使用はまた、１つ以上のさらなる薬剤の投与を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的分子は、１つ以上のさらなる薬剤と組み合わせて治療中及び／または治療後に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、単一の治療組成物に製剤化され、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤が同時に投与される。あるいは、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、互いに別個であり、例えばそれぞれが別個の治療組成物に製剤化され、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、同時に投与されるか、またはＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、治療レジメンの間の異なる時間に投与される。例えば、ＤＲ５標的分子は、追加の薬剤の投与前に投与されるか、ＤＲ５標的分子は、追加の薬剤の投与後に投与されるか、またはＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、交互に投与される。本明細書に記載されるように、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤は、単回投与または複数回投与で投与される。

いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤（複数可）は同時に投与される。例えば、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤（複数可）は、単一の組成物中に製剤化することができ、或いは２つ以上の別個の組成物として投与することができる。いくつかの実施形態では、ＤＲ５標的分子及び追加の薬剤（複数可）を連続的に投与するか、或いはＤＲ５標的分子及び追加の薬剤を治療レジメンの間に異なる時間に投与する。

所望の特異性を有するＤＲ５標的分子のスクリーニングの方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素アッセイ、フローサイトメトリー、及び当該技術分野で知られている他の免疫学的媒介技術が含まれるが、これらに限定されない。

本開示はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣまたはエピソーム等の染色体外複製に適したベクターによって運ばれる。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを用いて、本明細書に記載のＤＲ５標的分子の調製方法を容易にすることができ、また有意な量の融合タンパク質を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むベクター、に挿入することができる。種々の宿主−ベクター系を利用して、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。利用される宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写及び翻訳要素のうちの任意の１つが使用され得る。

本開示はまた、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することによってＤＲ５標的分子を産生する方法であって、細胞が、本明細書に記載のＤＲ５標的分子をコードする単離された核酸分子、及び／またはこれらの単離された核酸配列を含むベクターを含む、前記方法を提供する。本開示は、ＤＲ５標的分子の発現をもたらす条件下で細胞を培養することによってＤＲ５標的分子を産生する方法であって、細胞が、本明細書に記載のＤＲ５標的分子をコードする単離された核酸分子、及び／またはこれらの単離された核酸配列を含むベクターを含む前記方法を提供する。

本開示の融合タンパク質（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、及びその誘導体、断片、類似体及びホモログ（同族体）は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことが意図されている。適切な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、この分野における標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び不揮発性油等の非水性ビヒクルも使用することができる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物においてこれらの使用が意図されている。補充活性化合物も組成物に組み込むことができる。

本開示の医薬組成物は、意図した投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜及び直腸投与等の非経口投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性調整剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに封入することができる。

注射使用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のための、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射針通過が容易な程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含ませることによってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体及び上記列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、予め滅菌ろ過されたその溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末を生じさせる、真空乾燥及び凍結乾燥である。

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤またはカプセルの形態で使用することができる。口腔用組成物はまた、口腔洗浄剤として使用するために流体担体を用いて調製することができ、この液体担体中の化合物は、経口的に塗布され、口すすぎされ、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン等のバインダ；デンプンまたは乳糖等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースまたはサッカリン等の甘味剤； またはペパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジフレーバーのような香味剤。

吸入による投与のために、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素等の気体またはネブライザー、を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中において使用される。このような浸透剤は、当該分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のために、洗剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該分野で一般的に知られている軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに処方される。

化合物は、直腸送達のための、坐薬（例えば、カカオバター及び他のグリセリド等の従来の座薬基剤を有する）または滞留浣腸剤、の形態で調製することもできる。

一実施形態では、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体と共に調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸、を使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも市販されており、入手することができる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

投与の容易さ及び投薬量（投与量）の均一性のために、投薬量単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投薬量単位形態とは、治療される被験体の単位投薬量として適した物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の投薬量単位形態の仕様は、活性化合物の独特な特徴及び達成すべき特定の治療効果、及びこのような活性化合物を個人の治療のために配合する技術における固有の制限によって、及びこれらに直接依存して決定される。

医薬組成物は、投与のための説明書と共に、キット、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。これらの医薬組成物は、使用説明書と共に診断キットに含めることができる。

他に定義されてない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって共通に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法は、当該技術分野において周知で共通に使用される命名法である。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な技術が使用される。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様に従って、または当該技術分野で共通に実施されているように、または本明細書に記載されているように実施される。前述の技術及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、そして本明細書全体にわたって引用及び議論されている様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。本明細書に記載された分析化学、合成有機化学、及び医薬及び製薬化学に関連して用いられる命名法ならびにこれらの化学の実験手順及び技法は、当該技術分野において周知で共通に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤、及び患者の送達及び治療に使用される。患者という用語には、ヒト及び獣医学の被験体が含まれる。

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：

本明細書で使用される場合、用語「標的融合タンパク質」及び「抗体」は同義語であり得る。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子、を指す。「特異的に結合する」または「免疫応答する」または「対して向けられた」とは、抗体が所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、またははるかに低い親和性で結合する（Ｋ_ｄ＞１０^−６）ことを意味する。抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ_’及びＦ（ａｂ’）_２断片、Ｆ_ｖ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ発現ライブラリー、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片、例えばＶ_ＨＨ、Ｖ_ＮＡＲ、操作されたＶ_ＨまたはＶ_Ｋ、が挙げられるが、これらに限定されない。

基本的な抗体構造単位は、４量体を含むことが知られている。各４量体は、２つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関連している。特定のクラスには、さらにＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２等のサブクラス（アイソタイプとも呼ばれる）を有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物及び独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の分子種を１つだけ含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子において同一である。ＭＡｂは、抗原に対する独特な結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。

用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）が、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の、間で且つ隣接して、天然に存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するために３次元空間において互いに関連して配置される。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。

本開示の融合タンパク質の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片部分は、本明細書においては、本明細書の標的ポリペプチドと互換的に呼ばれる。

本明細書で使用される用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはその断片、またはＴ細胞受容体に／により、特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に／により、特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。抗体は、解離定数が≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われる。

本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」及び「特異的結合」は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じる種類の非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_ｄ）により表すことができ、より小さいＫ_ｄはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる。このような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを必要とし、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、「オン速度定数」（ｋ_ｏｎ）及び「オフ速度定数」（ｋ_ｏｆｆ）の両方は、会合及び解離の、濃度及び実際の速度の計算によって決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１８６−８７（１９９３）参照）。ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの消去を可能にし、解離定数Ｋ_ｄに等しい。（一般的に、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９−４７３を参照）。本発明の抗体は、平衡結合定数（Ｋ_ｄ）が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われている。この平衡結合定数（Ｋ_ｄ）は、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイ、または当業者に公知の類似のアッセイ等のアッセイによって測定される。

好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸はセリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。

本明細書中で議論されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変化は、アミノ酸配列における変化が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％を保持するとの条件で、本開示に包含されるものと考えられる。特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に、ファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり；そして（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リシン、セリン、及びスレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンが含まれる。他のアミノ酸ファミリーには、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリン及びスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン及び；（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、が含まれる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単離置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単離置換、スレオニンのセリンとのアミノ酸の単離置換、或いはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換は、特に置換が骨格部位内のアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合または特性に大きな影響を及ぼさないと期待されるのは妥当である。アミノ酸変化が機能性ペプチドを生じるか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性度をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは本明細書において詳細に記載されている。抗体または免疫グロブリン分子の、断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。断片または類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで生じる。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列データと公的または専用の配列データベースとの比較によって同定することができる。コンピュータ化された比較方法は、既知の構造及び／または機能を有する他のタンパク質において生じる配列モチーフまたは予測されたタンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用されることが好ましい。既知の三次元構造に折り畳まれたタンパク質配列を同定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。従って、前述の例は、当業者が、本開示に従って構造及び機能ドメインを規定するために使用し得る配列モチーフ及び構造コンフォメーションを認識し得ることを、実証している。

好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させる置換、（２）酸化に対する感受性を低減する置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる置換、（４）結合親和性を変化させる置換、及び（４）このような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与えるか、修飾することができる置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な突然変異を含むことができる。例えば、天然に存在する配列（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分）において、単一または多数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を行うことができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスを破壊する傾向があってはならず、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊してはならない）。当該分野で認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））； 及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端欠失を有するが残りのアミノ酸配列は推定される天然配列（例えば全長ｃＤＮＡ配列由来）の対応位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常少なくとも５０アミノ酸長、及びさらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用する用語「類似体」は、推定アミノ酸配列の一部と実質的に同一であり、適切な結合条件下でＤＲ５と特異的な結合を有する少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類似体は、典型的には少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり、しばしば完全長天然ポリペプチドの長さであり得る。

ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものと類似の性質を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において一般的に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ． Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６），Ｖｅｂｅｒ及びＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３０：１２２９（１９８７）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化分子モデリングを用いて開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、同等の治療効果または予防効果を生じさせることができる。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体等のパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法により、任意に、以下：−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ_２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−及びＣＨ_２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって置換された１つ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）と系統的に置換して、より安定なペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変化を含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ及びＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、生成し得る。

用語「剤（ａｇｅｎｔ）」は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、及び／または生体物質から作られた抽出物を示すために使用される。

本明細書で使用される場合、用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、または顕著なアビジン（例えば、光学的または熱量的測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの結合により、検出可能なマーカーの取り込みを指す。特定の状況では、標識またはマーカーも治療的であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、潜在的な立体障害を低減するために、標識を様々な長さのスペーサーアームによって結合させる。本明細書で使用される用語「医薬品または薬剤」は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導することができる化合物または化学組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等の用語は、障害及び／またはそれに関連する症状を軽減及び／または改善することを指す。「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」及び／または「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」とは、例えば癌等の疾患の発症または進行を減少、抑制、減衰、減退、停止及び／または安定化させることを意味する。除外されることは無いが、障害または状態の治療は、それに関連する障害、状態または症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる；用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に米国特許法に帰せられる意味を有し、これらの用語は制限がなく、列挙されているものの基本的または新規な特徴が、列挙されているものより多くの存在によって変更されない限り、列挙されているものより多くの存在を可能にし、先行技術の態様を排除しないことは、当業者に明らかである。

「有効量」とは、未治療の患者と比較して疾患の症状を改善するために必要な量を意味する。疾患の治療的処置のために本開示を実施するために使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与方法、被験体の年齢、体重、及び全身の健康状態に依存して変化する。最終的に、主治医または獣医師が、適切な量及び投与レジメンを決定する。このような量は「有効」量と呼ばれる。

「被験体」は、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、げっ歯類、ヒツジ、霊長類、ラクダ科動物またはネコ等の非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物を意味する。

本明細書で使用される用語「投与する」は、そのような薬剤による治療を必要とする被験体に治療剤を移送し、送達し、導入し、または輸送する内の任意の様式を指す。このような様式には、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内及び皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。

「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この一部は、好ましくは参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。

本明細書で提供される範囲は、その範囲内のすべての値を簡便な形としたものと理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。

特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。本明細書中で使用される場合、特に明記されていないか、または文脈から明らかでない限り、用語「または」は包括的であると理解される。

本明細書中で使用される場合、具体的に言及されない限り、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差以内と理解される。「約」は、記載された値の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％ 以内でと理解され得る。文脈から特段明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を限定するものではない。

実施例１：結合アッセイ
ＤＲ５標的融合タンパク質の結合を、完全ＤＲ５をコードするｃＤＮＡまたはＤＲ５を内因的に発現する癌細胞株をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を用いて、フローサイトメトリーによって評価した。融合タンパク質の滴定シリーズを、９６ウェルプレートにおいてＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３ ｐＨ７．４）中で、４℃で３０分間、ＤＲ５発現細胞株（およそ２．５〜５×１０^４細胞／ウェル）を用いてインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した後、ＡＰＣ−コンジュゲート抗ヒトＦｃγ特異性二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液中の３回の追加洗浄工程の後、結合した抗体を、フローサイトメトリー（ＩＱｕｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ）を介して検出した。ネズミＦｃ領域に融合したｃｙｎｏＤＲ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応する組換えタンパク質（ｍＦｃ）をＭｅｄｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に固定化したＥＬＩＳＡにより、カニクイザルＤＲ５（ｃｙｎｏＤＲ５）への融合タンパク質の結合を決定した。十分な遮断及び洗浄工程の後、結合した融合タンパク質を、ＨＲＰ−コンジュゲート抗ヒトＦｃγ特異性二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びＴＭＢ試薬及びＡ_{６５０ｎｍ}での吸光度読み取りを用いて検出した。

実施例２：アポトーシスアッセイ
抗体仲介による細胞の直接死滅は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７２）を用いて１６〜４８時間の処理期間後に存在するＡＴＰの量を測定することによって決定した。癌細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレートにおいて、７×１０^４細胞／ウェルにて１．５〜３×１０^４細胞／ウェルで播種した。細胞死を測定する別の方法は、抗体処理中にＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）カスパーゼ−３／７アポトーシス試薬（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ４４４０）を用いて細胞を蛍光染色し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭシステムを用いて蛍光細胞を定量することであり、いくつかの実施形態で融合タンパク質はポリペプチドを含んでいる。使用される細胞株には、Ｃｏｌｏ−２０５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２２２（商標））、Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４６９（商標））、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４７（商標））、ＪＬ−１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５９６）、ＮＣＩ−Ｈ２８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−５８２０（商標））、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１７７（商標））、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８（商標））が含まれる。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２０８１（商標））。いくつかの実験では、抗ヒトＩｇＧＦｃγ特異性二次（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）抗体を用いて、本開示のＤＲ５標的融合タンパク質を架橋させ、さらにクラスター化した。他の実験では、６μＭのドキシサイクリンを用いて細胞をＤＲ５媒介アポトーシスに感作させた。

実施例３：ｓｄＡｂを認識する既存の自己抗体
ヒト血漿中の既存のヒト抗ＶＨ（ＨＡＶＨ）またはＩＶＩＧ（プールされたヒト血漿由来の精製ＩｇＧ、商品名Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）−Ｃ）をＥＬＩＳＡによって測定した。試験品（ＴＡＳ２６６、融合タンパク質または治療抗体）をＰＢＳ中のＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、プレートをＰＢＳ中の３％ＢＳＡで遮断し、次いでヒト血漿またはＩＶＩＧ（天然ＨＡＶＨ源として）をＰＢＳ＋０．１％ポリソルベート−２０（ＰＢＳＴ）に溶解し、プレートに結合させた。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、結合した血漿抗体（ＨＡＶＨ）を、ＨＲＰとコンジュゲートした抗軽鎖二次抗体（抗ヒトＩｇＫａｐｐａまたは抗ＩｇＬａｍｂｄａ）によって検出し、ＴＭＢ基質で発生させた。抗軽鎖二次抗体によりＨＡＶＨを検出するこの方策は、ＴＡＳ２６６ならびに記載された多価ｓｄＡｂを含む軽鎖を欠く試験品に適合し、任意のアイソタイプのＨＡＶＨの検出を容易にする。カッパまたはラムダ軽鎖を有する治療用抗体をコーティングし、１００％結合参照データ点として使用して、データを正規化し、反対の二次抗体に対する対照ＩｇＧとして用いた。

実施例４：肝毒性アッセイ
肝前駆細胞株に由来する最終分化した肝細胞である、初代ヒト肝細胞またはＨｅｐＲＧ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、肝細胞のＤＲ５アゴニスト媒介アポトーシスを評価した。全てのアッセイは、癌細胞株を用いたアポトーシスアッセイ（実施例２）と同様の方法で行った。多数のドナー、ＩＶＩＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ（登録商標）−Ｃ、Ｇｒｉｆｏｌｓ）、からプールされたヒトＩｇＧを、ヒト抗ＶＨ（ＨＡＶＨ）自己抗体とも呼ばれる天然のｓｄＡｂ指向自己抗体の供給源として使用した。いくつかの実験では、ＩＶＩＧは滴定されたか、または一定濃度で使用した。いくつかのアッセイでは、ＨＡＶＨ自己抗体による認識を避けるように設計されたＴＡＳ２６６の修飾版であるＦＩＸ−ＴＡＳ２６６が含まれていた。ＦＩＸ−２ＴＡＳ６６は、Ｌｅｕ１１及びＴＡＳ２６６の４つのＤＲ５ ｓｄＡｂのそれぞれのＣ末端領域の修飾を含む。

Claims (35)

1. 少なくとも細胞死受容体５（ＤＲ５）に結合し、且つ複数のＤＲ５結合ドメイン（ＤＲ５ＢＤ）を含み、それぞれのＤＲ５ＢＤがＶＨＨであり、それぞれのＶＨＨが配列番号８７、８９、及び１７〜２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
2. 前記単離されたポリペプチドが単一特異性である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 前記単離されたポリペプチドが多重特異性である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
4. 前記単離されたポリペプチドが二重特異性である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、第２の抗原に結合する少なくとも第２の結合ドメイン（ＢＤ２）を含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
6. 前記複数のＤＲ５ＢＤが、少なくとも２つのＤＲ５ＢＤを含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
7. 前記複数のＤＲ５ＢＤが、少なくとも４つのＤＲ５ＢＤを含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
8. 前記複数のＤＲ５ＢＤが、少なくとも６つのＤＲ５ＢＤを含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
9. 前記複数のＤＲ５ＢＤの内のＤＲ５ＢＤのそれぞれが、配列番号８７、８９、及び１７〜２０からなる群より選択される同じアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
10. 前記複数のＤＲ５ＢＤの内のＤＲ５ＢＤのそれぞれが、配列番号８７のアミノ酸配列を含む請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
11. 前記複数のＤＲ５ＢＤの内のＤＲ５ＢＤのそれぞれが、リンカーポリペプチドを介して操作可能に連結されている請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
12. 前記単離されたポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
13. 前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域ポリペプチド、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域ポリペプチド、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域ポリペプチド、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域ポリペプチドである請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
14. 前記免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号１〜５または１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
15. 前記免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
16. 前記それぞれのＶＨＨがヒト化ＶＨＨである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
17. 前記ポリペプチドが４価である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
18. ポリペプチドが、構造：ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含み、前記それぞれのＤＲ５ＢＤがヒト化ＶＨＨ配列である請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
19. ポリペプチドが、配列番号８７のアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含む請求項１７又は１８に記載の単離されたポリペプチド。
20. ポリペプチドが、配列番号１１３及び１１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
21. ポリペプチドが、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む請求項２０に記載のポリペプチド。
22. 前記ポリペプチドが６価である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
23. 前記ポリペプチドが、構造：ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ＤＲ５ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含み、前記それぞれのＤＲ５ＢＤがヒト化ＶＨＨ配列である請求項２２に記載の単離されたポリペプチド。
24. ポリペプチドが、配列番号８７のアミノ酸配列の３つ以上のコピーを含む請求項２２又は２３に記載の単離されたポリペプチド。
25. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、新生物を治療するための医薬組成物。
26. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含有する、腫瘍破壊を増強するために免疫細胞を調節するための医薬組成物。
27. 前記新生物が、がんである請求項２５に記載の医薬組成物。
28. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
29. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
30. 請求項２９に記載の核酸を含むベクター。
31. 請求項２９に記載の核酸、又は請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
32. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
33. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドを分泌する、請求項３１又は３２に記載の宿主細胞。
34. ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生する方法。
35. さらにポリペプチドを単離することを含む、請求項３４に記載の方法。