CN113533729A - 一种鉴定aml患者骨髓中nk细胞耗竭的研究方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用。其中,该方法为:研究AML患者复发时骨髓中NK细胞的成熟度表型,并在确定所述NK细胞的成熟度后,基于受体标志物研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达;接着,进一步通过研究所述AML患者复发后NK细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析,来鉴定AML患者骨髓中NK细胞的耗竭现象。本发明提供的方法,首次为白血病引起的NK细胞耗竭,提供了系统地研究方法,并证实了HSCT后AML复发患者存在NK细胞耗竭现象,同时,NKG2A+NK细胞的高频率表达与复发风险相关。因此,本申请提供的研究方法,在研究和判断HSCT后AML患者NK细胞是否耗竭中具有巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞相关技术领域,特别是涉及一种鉴定移植后AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用。
背景技术
急性髓系白血病是一种恶性血液肿瘤,五年生存率仅为25%。虽然造血干细胞移植(HSCT)是作为治疗中/高危急性髓系白血病化疗后复发或耐药疾病患者的挽救治疗,提供最大的长期生存潜力。然而,高达30%的患者最终会因中危白血病而复发,而高危或难治性复发白血病的复发风险更高,因此复发仍然是HSCT治疗失败的主要原因。以往的研究已经观察到T细胞耗竭与HSCT后AML的复发率有关。然而该发现已不能满足当下技术人员对HSCT后AML是否复发的判断需求。
因此,本技术领域中,亟需一种帮助技术人员判断HSCT后AML是否复发的研究方法。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题,本发明提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用。该研究方法通过检测健康供者、AML患者和HSCT后AML复发患者的NK细胞表型、细胞毒性、增殖能力以及转录组学分析,以鉴定AML患者骨髓中是否存在NK细胞耗竭现象。具体内容如下:
第一方面,本发明提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法,所述方法为:
研究AML患者复发时骨髓中NK细胞的成熟度表型,并在确定所述NK细胞的成熟度后,基于受体标志物研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达;接着,进一步通过研究所述AML患者复发后NK细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析,来鉴定AML患者骨髓中NK细胞的耗竭现象。
优选地,所述方法包括以下步骤:
步骤1,设置复发组、CR组和HC组,并收集各组中每例的骨髓采集物BM;其中,所述CR组为移植后AML完全缓解的患者,所述HC组为健康供者组;
步骤2,根据对所述复发组、所述CR组和所述HC组进行的NK细胞表型分析,研究AML复发患者NK细胞的耗竭表型;并根据所述耗竭表型,进一步研究所述AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化;
步骤3,分别与原代AML细胞共培养4小时、24小时和48小时,并用7-AAD和AnnexinV标记,研究所述NK细胞对原代AML细胞的杀伤作用;
步骤4,通过组学分析,研究移植后所述AML复发患者NK细胞的耗竭表型。
优选地,在所述步骤1中,所述复发组由至少15例HSCT后首次血液学复发的AML患者组成。
优选地,在所述步骤2中,所述耗竭表型包括AML复发患者NK细胞的成熟和表型变化。
优选地,在所述步骤2中,进行所述NK细胞表型分析时,所有NK细胞在血样中用抗CD3、抗CD56的组合进行标记,采用受体标志物,以研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达。
优选地,所述受体标志物为NKG2A。
优选地,在所述步骤3中,通过分析IFN-γ的产生、CD107a的表达以及对原代AML细胞的杀伤能力,来研究所述AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化。
优选地,在所述步骤3中,每一个培养体系中的E:T比为1:1。
第二方面,本发明提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法的应用,具体为:将上述第一方面所述的方法,用于研究急性髓系白血病HSCT后复发患者骨髓NK细胞的耗竭。
本发明提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用。其中,该方法为:研究AML患者复发时骨髓中NK细胞的成熟度表型,并在确定NK细胞的成熟度后,基于受体标志物研究AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达;接着,进一步通过研究AML患者复发后NK细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析,来鉴定AML患者骨髓中NK细胞的耗竭现象。
本发明提供的该方法,首次为白血病引起的NK细胞耗竭,提供了系统地研究方法,并证实了HSCT后AML复发患者存在NK细胞耗竭现象,同时,NKG2A+NK细胞的高频率表达与复发风险相关,以及单独抑制NK细胞上的NKG2A可以显著降低肿瘤负担,从而提高体内长期存活率。因而,本申请提供的研究方法,在研究NK细胞耗竭和判断HSCT后AML是否复发中具有巨大的应用价值。
附图说明
图1A示了本发明实施例中运用流式Flowjo软件画出NK细胞的圈图策略;图1B示了本发明实施例中在三组间NK细胞占淋巴细胞比例的结果;图1C示了本发明实施例中CD56brightNK占总体NK细胞的比例;图1D示了本发明实施例中CD56dimNK占总体NK细胞的比例;图1E示了本发明实施例中KIR+NK占总体NK细胞的比例;图1F示了本发明实施例中CD57+NK占总体NK细胞的比例;
图2A示出了本发明实施例中NKG2A+NK占总体NK细胞的比例;图2B示出了本发明实施例中的PD-1+NK占总体NK细胞的比例;图2C示出了本发明实施例中的TIM-3+NK占总体NK细胞的比例;图2D示出了本发明实施例中的TIGIT+NK占总体NK细胞的比例;图2E示出了本发明实施例中NKG2C+NK占总体NK细胞的比例;图2F示出了本发明实施例中NKP30+NK占总体NK细胞的比例;图2G示出了本发明实施例中NKG2D+NK占总体NK细胞的比例;图2H示出了本发明实施例中NKP46+NK占总体NK细胞的比例;图2I示出了本发明实施例中抑制性和活化性受体在NK细胞上平均荧光强度的表达;
图3A示出了本发明实施例中NK细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌CD107a的功能;图3B示出了本发明实施例中的NK细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌IFN-γ的功能;图3C示出了本发明实施例中的NK细胞与AML母细胞共培养后,杀伤AML母细胞的能力;
图4A示出了本发明实施例中经GO富集分析得出复发患者NK细胞相比于健康供者,相关信号通路受损的结果;图4B示出了本发明实施例中的复发患者相比于健康供者,NK细胞基因上表达差异的结果;图4C示出了本发明实施例中的复发患者相比于缓解患者,NK细胞上基因表达差异的结果;图4D示出了本发明实施例中Ki-67+在Ki-67抗体中的占比;图4E示出了本发明实施例中的复发组、CR组以及HC组中各自的骨髓NK细胞周期结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在当下的技术研究中,虽然已经观察到T细胞耗竭与HSCT后AML的高复发率有关。但目前的研究结果中,尚不足以证明AML中是否存在NK耗竭,并且还缺乏对抑制性受体和转录因子的探索。
也就是说,现有技术中,AML中是否存在NK耗竭的研究极少,并且,关于NK细胞耗竭是否会导致AML控制失败的研究,也非常缺乏。同时,复发性AML患者是否诱导NK细胞耗竭,以及NK细胞耗竭是否与复发率相关,均尚不清楚。此外,针对NKG2A的过度表达是否导致白血病中NK细胞耗竭,也不清楚。
本发明的发明人为了解决上述现有技术中存在的问题,在本实施例中提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法及其应用。具体内容如下:
第一方面,本发明实施例提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法。该方法为:
研究AML患者复发时骨髓中NK细胞的成熟度表型,并在确定所述NK细胞的成熟度后,基于受体标志物研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达;接着,进一步通过研究所述AML患者复发后NK细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析,来鉴定AML患者骨髓中NK细胞的耗竭现象。
本实施例中,优选地,该研究方法包括以下步骤:
步骤1,设置复发组、CR组和HC组,并收集各组中每例的骨髓采集物BM;其中,CR组为移植后AML完全缓解的患者,HC组为健康供者组。
在本实施步骤中,优选地,复发组由至少15例HSCT后首次血液学复发的AML患者组成。
具体实施时,收集72例骨髓标本,包括12例健康献血者(HC组)和30例HSCT后首次血液学复发的AML患者(复发组,排除单纯髓外复发患者)以及30例缓解期匹配的AML患者(CR组,于2018年5月至2020年11月在北京大学人民医院血液病研究所进行。所有患者在未经治疗的情况下至少30天内出现免疫表型明确的急性髓系细胞白血病。AML的诊断与CR或复发状态与先前报告一致。供体选择和干细胞采集如前所述。移植方案和移植后时间在复发和非复发患者中进行分类和匹配(54-885对73-897d)。所有患者在复发或骨髓采集前均达到完全供体嵌合。所有存活时间超过100天的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)患者中,仅有9例发生局限性慢性cGVHD,无轻度或重度cGVHD。复发和非复发患者cGVHD的发生率具有可比性。
发明人在治疗前或治疗后至少收集一次Bone Marrow(骨髓采集物)。在样本采集之前,患者和捐赠者都提供了书面知情同意书。根据《赫尔辛基宣言》,本研究由北京大学人民医院人类伦理审查委员会批准。
步骤2,根据对步骤1中的复发组、CR组和HC组进行的NK细胞表型分析,研究AML复发患者NK细胞的耗竭表型;并根据耗竭表型,进一步研究AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化。
在本实施步骤中,耗竭表型包括AML复发患者NK细胞的成熟和表型变化。
在本实施步骤中,进行NK细胞表型分析时,优选地,所有NK细胞在血样中用抗CD3、抗CD56的组合进行标记;采用受体标志物,以研究AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达。在本实施步骤中,优选地,受体标志物为NKG2A。
由本实施步骤可以得出以下结果(即:急性髓细胞白血病复发时骨髓NK细胞的耗竭表型):
为探讨AML复发患者NK细胞的成熟和表型是否发生改变,发明人对复发组、CR组和HC组进行了NK细胞表型分析。图1A示出了本发明实施例中运用流式Flowjo软件画出NK细胞的圈图策略;由图1A可知NK细胞是由CD3,CD56抗体标记后圈出再进行下一步分析的。
在本实施步骤中,发明人通过流式细胞术分析上述三组间的受体标志物是否与移植后AML复发相关。图1B示出了本发明实施例中在三组间NK细胞占淋巴细胞比例的结果;图1C示出了本发明实施例中CD56brightNK占总体NK细胞的比例;图1D示出了本发明实施例中CD56dimNK占总体NK细胞的比例;图1E示出了本发明实施例中KIR+NK占总体NK细胞的比例;图1F示出了本发明实施例中CD57+NK占总体NK细胞的比例。由图1B-图1F可知,对NK细胞表面受体的分析显示,与HC相比,AML患者的抑制性受体(包括NKG2A、PD-1和TIM-3)(P<0.05)显著过度表达。
并且,图2A示出了本发明实施例中NKG2A+NK占总体NK细胞的比例;图2B示出了本发明实施例中的PD-1+NK占总体NK细胞的比例;图2C示出了本发明实施例中的TIM-3+NK占总体NK细胞的比例;图2D示出了本发明实施例中的TIGIT+NK占总体NK细胞的比例;图2E示出了本发明实施例中NKG2C+NK占总体NK细胞的比例;图2F示出了本发明实施例中NKP30+NK占总体NK细胞的比例;图2G示出了本发明实施例中NKG2D+NK占总体NK细胞的比例;图2H示出了本发明实施例中NKP46+NK占总体NK细胞的比例;图2I示出了本发明实施例中抑制性和活化性受体在NK细胞上平均荧光强度的表达。
由图2A-I可知,复发患者NKG2A受体在NK细胞上的表达明显高于CR组(P=0.00346)或HC组(P=0.0018),各抑制性受体的MFI(平均荧光强度)分析与上述频率结果相似;同时,NK细胞活化受体(如NKP30、NKP46、NKG2D和NKG2C)的百分比和MFI在这些组之间具有可比性。
由上述的研究结果可知,NKG2A受体在NK细胞上的过度表达,能反映NK细胞的耗竭表型。即,这些结果表明NK细胞的耗竭表型在白血病HSCT后复发中起重要作用。
步骤3,分别与原代AML细胞共培养4小时、24小时和48小时,并用7-AAD和AnnexinV标记,研究所述NK细胞对原代AML细胞的杀伤作用。
在本实施步骤中,每一个培养体系中的E:T比为1:1。
在本实施步骤中,通过分析IFN-γ的产生、CD107a的表达以及对原代AML细胞的杀伤能力,来研究所述AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化。
具体实施时,测定NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌,用CD107a的表达和IFN-γ的分泌来进行测定,以MHC-Ⅰ类缺陷的人红白血病K562细胞株为靶细胞。BMMCs以1×106cells/mL在1640完全培养基中培养,如前所述,加入/不加入1000IU/mL白细胞介素-2(IL-2,北京双鹤制药)作为效应剂,培养12-16小时。BMMCs(骨髓单核细胞)和肿瘤细胞在含有抗CD107a(BD Biosciences)的新鲜培养基中,效应剂与靶点(E:T)的比率为5:1(即效靶比为5:1)。MHCⅠ类缺陷的人红白血病K562细胞株,在96孔圆形平板上共培养4小时,并在1h后加入高尔基氏阻断剂(0.7μL/mL,BD Biosciences)。CD107a表达与IFN-γ在使用抗CD3、抗CD56和其他表面标记物鉴定亚群后,通过细胞内标记量化NK淋巴细胞的产生。
将来源于骨髓基质细胞的纯化的NK细胞,分别与原代AML细胞共培养4小时、24小时和48小时,每一个培养体系中的E:T比例为1:1,并用7-AAD(BD Biosciences)和AnnexinV(BD Biosciences)标记,探讨其诱导AML细胞凋亡的细胞毒作用。
通过本实施步骤,得出的研究结果(AML复发时NK细胞功能失调),具体如下:
根据AML复发患者NK细胞的耗竭表型,进一步检测复发后AML患者BM-NK细胞的功能变化。为研究复发组NK细胞是否出现功能障碍,发明人通过分析IFN-γ的产生、CD107a的表达以及对原代AML细胞的杀伤能力来评价BM-NK细胞的功能。图3A示出了本发明实施例中NK细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌CD107a的功能;图3B示出了本发明实施例中的NK细胞与肿瘤细胞系共培养后分泌IFN-γ的功能。由图3A和图3B可知,与CR患者相比,在复发患者中观察到:IFN-γ的分泌(P=0.0003)和CD107a(P=0.0004)对K562的脱颗粒作用,显著降低。
图3C示出了本发明实施例中的NK细胞与AML母细胞共培养后,杀伤AML母细胞的能力。由图3C可知,在联合培养的整个动态过程中,复发患者的NK细胞对原发性AML细胞的靶向杀伤率明显低于CR组(P=0.0137)和HC组(P=0.0009),即,在复发患者中,NK细胞杀伤AML母细胞的能力是显著降低的。因而,复发组的NK细胞对靶向肿瘤细胞系和原发性白血病细胞的细胞毒作用,均存在缺陷。
由上述研究结果可知,NK细胞与AML母细胞共培养后,杀伤AML母细胞的能力在复发患者中是显著降低的。由此可知,在复发部位,BM-NK细胞表现出与耗竭表型一致的功能损害。
步骤4,通过组学分析,研究移植后所述AML复发患者NK细胞的耗竭表型。
本实施步骤的具体实施过程包括通过RNA-seq的分析方法,对基因的表达进行了分析。具体内容如下:
具体实施时,用流式细胞仪从复发和完全缓解的AML患者以及健康人的NK细胞中分离纯化NK细胞,并用含有10%β-巯基乙醇的RNeasy裂解缓冲液(RLT,QIAGEN)保存,然后放在冰上以避免RNA降解。根据制造商的规范,使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)提取BM NK细胞样本的RNA。使用Q-buit4荧光计(Invitrogen)定量RNA浓度。用NEB-Next-Poly(A)mRNA磁性分离模块试剂盒(NEB)和NEB-Next-Ultra-RNA文库制备试剂盒(NEB-E7500S)构建了用于Illumina双端复合测序文库(NEB-E7500S)的文库。最后在Agilent Bioanalyzer 2100系统上对产品质量进行了评价。样本在Illumina Nova-Seq平台上测序,并产生150bp配对末端读取。FASTQ格式的原始数据(Raw reads)首先通过内部perl脚本进行处理。在这一步中,通过从原始数据中删除包含适配器的读取、包含ploy-N的读取和低质量的读取来获得干净的数据(即,干净的读取)。同时计算了Q20、Q30和GC含量。参考直接从基因组网站下载的基因组和基因模型注释文件。使用Bowtie v2.2.3构建参考基因组的索引,并使用TopHatv2.0.12将成对末端清洁读数与参考基因组对齐,其中包含从Ensembl下载的人类基因组参考序列版本19(hg19)。HT-seqv0.6.1被用来计算每个基因的读取数。然后根据每个基因的长度计算出每个基因的FPKM,并对该基因进行读取计数。FPKM,即每百万碱基对中转录序列每千碱基的预期片段数,同时考虑了测序深度和基因长度对读取计数的影响,是目前估计基因表达水平最常用的方法。
在差异基因表达分析之前,对于每个测序文库,读取计数由edge-R程序包通过一个标度归一化因子进行调整。使用DEG-Seq R软件包(1.20.0)对两种情况进行差异表达分析。用Benjamini&Hochberg法调整P值。校正后的P值为0.05,log2(倍数变化)为1,作为显著差异表达的阈值。差异表达基因的基因本体(GO)富集分析是通过GO-seq-R软件包实现的,该软件包修正了基因长度偏差。校正P值小于0.05的GO项被认为是差异表达基因的显著富集。
KEGG是一个数据库资源,用于从分子级信息,特别是基因组测序等高通量生成的大规模分子数据集,了解细胞、生物体和生态系统等生物系统的高级功能和效用。因而,发明人使用KOBAS软件测试了KEGG通路中差异表达基因的统计富集情况。
图4A示出了本发明实施例中经GO富集分析得出复发患者NK细胞相比于健康供者,相关信号通路受损的结果。由图4A可知,利用GO富集分析发现复发患者的NK细胞相比于健供者来说,有以下途径受损:NK细胞脱颗粒作用,NK细胞分化,NK细胞活化,NK细胞介导的细胞毒作用,NK细胞介导的免疫。
图4B示出了本发明实施例中复发患者相比于健康供者,NK细胞基因上表达差异的结果。由图4B可知,复发患者骨髓NK细胞与健康供者相比,转录组水平上调与下调基因,其中与耗竭相关的TBX21,EOMES显著下调。
图4C示出了本发明实施例中复发患者相比于缓解患者,NK细胞上基因表达差异的结果。由图4C可知,复发患者骨髓NK细胞与健康供者相比,转录组水平上调与下调基因,其中与耗竭相关的TBX21显著下调。
由本实施步骤的组学分析数据(图4A-C)可知,复发患者的NK细胞也是耗竭的。
此外,在本实施例中,还通过对NK细胞周期的研究,来研究移植后所述AML复发患者NK细胞的增殖能力。
具体实施时,为检测NK细胞周期,用DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)加Ki-67抗体对新鲜BMMC标本进行NK细胞内染色。
在该增设的实施步骤中,为证实AML复发状态下细胞周期被阻断。发明人用DAPI加Ki-67抗体检测NK细胞的细胞周期,来测定骨髓NK细胞的增殖能力。图4D示出了本发明实施例中Ki-67+在Ki-67抗体中的占比。由图4D可知,与CR(0.002)和HC(<0.0001)组相比,复发患者的骨髓NK细胞显示Ki-67+比率显著增加,而Ki-67+表示增殖活跃的细胞,由此可见,复发患者骨髓NK细胞的增殖能力是显著更高的。图4E示出了本发明实施例中复发组、CR组以及HC组中各自的骨髓NK细胞周期结果。由图4E可知,在复发患者的NK细胞周期中,虽然有27.02%的细胞处于G1期,但是仅1.49%细胞进入了S/G2/M期,由此可见,复发患者的NK细胞的细胞周期被阻滞于G1向S/G2/M期分化;并且,与CR组相比可知,细胞周期结果显示复发组NK细胞G1期明显高于CR组(27.02%vs13.56%,P<0.001)。。
因此,由图4D-E可知,复发组只有1.49%的NK细胞从G1期进入S/G2/M期,与CR组相当。因此,复发性AML患者NK细胞周期从G1期限制到S/G2/M期。
由上述步骤2-4的研究数据表明,可以证实在移植后复发的AML患者的NK细胞是存在耗竭的,并且与患者预后是相关的,并且原始表型、抗肿瘤功能受损、细胞周期停滞和转录组异常应共同导致复发的AML患者NK耗竭。
本发明提供的该方法,首次为白血病引起的NK细胞耗竭,提供了系统地研究方法,并证实了HSCT后AML复发患者存在NK细胞耗竭现象,同时,NKG2A+NK细胞的高频率表达与复发风险相关,以及单独抑制NK细胞上的NKG2A可以显著降低肿瘤负担,从而提高体内长期存活率。因而,本申请提供的研究方法,在研究NK细胞耗竭和判断HSCT后AML是否复发中具有巨大的应用价值。
此外,本实施例的研究结果,提示了:NKG2A作为挽救白血病NK细胞衰竭耗竭的检查点,这是首次在白血病中得到证实。NKG2A可能是白血病发展过程中NK耗竭的一个潜在的天然免疫检查点。
在此,发明人需要指出的是,在上述的统计分析中,使用GraphPad Prism软件版本8进行分析。有关所用统计数据的详细信息,请参见上述各图例。采用Kaplan-Meier法和log-rank计数分析小鼠的复发率和生存率,多变量分析采用Cox模型。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。样本以平均值或中间值显示,带或不带显示SD的误差条。显著性假设为*p<0.05**p<0.01***p<0.001,****p<0.0001。
第二方面,本发明实施例提供了一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法的应用,具体为:将上述第一方面所述的方法,用于研究急性髓系白血病HSCT后复发患者骨髓NK细胞的耗竭。
对于方法实施例,为了简单描述,故将其都表述为一系列的动作组合,但是本领域技术人员应该知悉,本发明并不受所描述的动作顺序的限制,因为依据本发明,某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次,本领域技术人员也应该知悉,说明书中所描述的实施例均属于优选实施例,所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法,其特征在于,所述方法为:
研究AML患者复发时骨髓中NK细胞的成熟度表型,并在确定所述NK细胞的成熟度后,基于受体标志物研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达;接着,进一步通过研究所述AML患者复发后NK细胞的抗肿瘤功能变化、增殖能力以及转录组学分析,来鉴定AML患者骨髓中NK细胞的耗竭现象。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤1,设置复发组、CR组和HC组,并收集各组中每例的骨髓采集物BM;其中,所述CR组为移植后AML完全缓解的患者,所述HC组为健康供者组;
步骤2,根据对所述复发组、所述CR组和所述HC组进行的NK细胞表型分析,研究AML复发患者NK细胞的耗竭表型;并根据所述耗竭表型,进一步研究所述AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化;
步骤3,分别与原代AML细胞共培养4小时、24小时和48小时,并用7-AAD和Annexin V标记,研究所述NK细胞对原代AML细胞的杀伤作用;
步骤4,通过组学分析,研究移植后所述AML复发患者NK细胞的耗竭表型。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤1中,所述复发组由至少15例HSCT后首次血液学复发的AML患者组成。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤2中,所述耗竭表型包括AML复发患者NK细胞的成熟和表型变化。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤2中,进行所述NK细胞表型分析时,所有NK细胞在血样中用抗CD3、抗CD56的组合进行标记;采用受体标志物,以研究所述AML患者复发时抑制性受体在NK细胞上是否处于过度表达。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述受体标志物为NKG2A。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤3中,通过分析IFN-γ的产生、CD107a的表达以及对原代AML细胞的杀伤能力,来研究所述AML复发患者NK细胞的抗肿瘤功能变化。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在所述步骤3中,每一个培养体系中的E:T比为1:1。
9.一种鉴定AML患者骨髓中NK细胞耗竭的研究方法的应用,其特征在于,将上述权利要求1-8任意一项所述的方法,用于研究急性髓系白血病HSCT后复发患者骨髓NK细胞的耗竭。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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