CN113461830B

CN113461830B - 一种脐带血来源的靶向cd19的car-nk细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN113461830B
Application number: CN202110827960.5A
Authority: CN
Inventors: 李慧忠; 王刚; 郑骏年; 曹培育; 刘宜林
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113461830A

Abstract

本发明提供了一种CAR‑NK细胞，所述CAR‑NK细胞能够地提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了所述一种CAR‑NK在制备药物中的应用，从而提供了一种具有应用前景的安全、可靠、高效肿瘤治疗的新手段。

Description

一种脐带血来源的靶向CD19的CAR-NK细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种脐带血来源的靶向CD19的CAR-NK细胞及其制备方法。

背景技术

利用免疫学治疗手段来攻克肿瘤，一直是免疫学在转化医学方面应用的重要方向。随着各种组学(基因组学，蛋白组学等)的发展，肿瘤细胞由于突变产生的免疫原性得到了广泛的认可，这为肿瘤免疫治疗奠定了理论的基础。同时，随着肿瘤免疫学研究自身的积累，肿瘤免疫治疗近期取得了巨大的进步，一系列新的免疫治疗手段逐步进入临床。

CD19为I型单次跨膜糖蛋白，在B细胞发育早期表达，并在成熟B细胞阶段持续表达，是B细胞最可靠的表面生物标志物之一。同时CD19与补体受体CD2 1，四跨膜蛋白CD81一起，是成熟B细胞表面上多分子复合物的主要信号传导成分，在维持体液，抗原诱导的反应和耐受诱导之间的平衡中起着关键作用。大量的研究证明，CD19可作为治疗B细胞相关疾病的靶点用于CAR细胞的构建。

CD19已成为CAR-T细胞疗法领域成功且热门的一大靶点。目前经过大量的临床实践证明，以该CD19为靶点开发的CAR-T药物取得了显着的疗效。诺华制药公司2017年3月29日宣布其CAR-T产品CTL019进入FDA加速审批通道。2 015年12月，FDA授予了Kite Pharma的CAR-T疗法KTE-C19的突破性疗法认证(BTD)，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的适应症疗法。2017年 4月1日，Kite Pharma也宣布正式向FDA完成提交CAR-T疗法KTE-C19(后改名为“axicabtagene ciloleucel”)的生物制品许可申请(BLA)滚动申报。

自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的功能，而且不需要提前致敏或H LA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞(包括NK细胞) 来治疗癌症是近年来的新趋势，经过CAR结构修饰后的NK细胞，能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。

发明内容

本发明提供了一种脐带血来源的CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞能够提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了所述一种CAR-NK在制备药物中的应用，从而提供了一种具有应用前景的安全、可靠、高效肿瘤治疗的新手段。

CAR

本发明提供了一种包含抗CD19的特异性抗体的CAR。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区。

优选地，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR。

优选地，所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR分别是SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的第26-33位，51-57位，96-109位。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR。

优选地，所述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR分别是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的的第27-32位，第50-51位，第89-97位。

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述重链可变区可在轻链可变区的N端(氨基端)或C端(羟基端)。

优选地，所述重链可变区在轻链可变区的C端(羟基端)。

优选地，所述重链可变区和轻链可变区之间由接头(linker)连接。

优选地，所述linker包括柔性linker或刚性linker。

优选地，所述linker由G(Gly，甘氨酸)和/或S(Ser，丝氨酸)组成。

优选地，所述linker是(GGGGS)n。

优选地，n＝1,2,3,4,5,6。

优选地，n＝4。

优选地，所述linker还可以包括其他氨基酸。

优选地，所述其他氨基酸是谷氨酸和/或赖氨酸。

优选地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体选自以下一种：

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

2)与SEQ ID NO:4相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；

3)与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述CAR-NK细胞的CAR还包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。

优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5 铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

优选地，所述铰链区选用CD8α铰链区。

优选地，所述跨膜结构域包括蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质包括：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，C D22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD123，CD134，CD137和CD154。

优选地，所述跨膜结构域选用CD8α跨膜结构域。

优选地，所述共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、 DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、C D30、CD40、CD244(2B4)、DAP10、DAP12的胞内结构域或其组合。

优选地，所述共刺激结构域选用CD137的胞内结构域。

优选地，所述胞内信号传导结构域(也称为“一级信号传导结构域”或“初级信号传导结构域”)含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(Immunoreceptor tyro sine-based activation motif，ITAM)的信号传导基序。

优选地，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ(CD3 zeta)、FcRγ(FCER1G)、 FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10 和DAP12的含有ITAM的细胞质信号传导序列。

优选地，所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ的胞内信号传导结构域。

优选地，所述铰链区、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和共刺激结构域是人为合成的或天然存在的。

优选地，所述包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域的CAR的完整结构是：抗CD19的特异性抗体的重链可变区-Linker抗CD19的特异性抗体的轻链可变区-CD8α铰链区-CD8α跨膜结构域-CD137的胞内结构域-C D3ζ的胞内信号传导结构域。

优选地，所述包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域的CAR的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述CAR-NK细胞的CAR还连接有自我剪切序列和免疫调节剂的氨基酸序列。

优选地，所述自我剪切序列和免疫调节剂的氨基酸序列可以连接在CAR的N 端或C端。

优选地，所述连接顺序是：CAR-自我剪切序列-免疫调节剂的氨基酸序列

优选地，所述自我剪切序列是2A肽(又称2A自剪切肽，2A self-cleaving peptides)。

优选地，所述2A肽是来源于病毒。

优选地，所述2A肽包括P2A，E2A，F2A和T2A。

优选地，所述2A肽选用T2A。

优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

优选地，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述免疫调节剂可包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、红血球生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-α(TNF)、TNF-i3、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素_λ、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素 (TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、纤维母细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、苗勒抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、NGF- β、血小板生长因子、TGF-a、TGF-f3、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子- II、巨噬细胞43、IL-l、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、 LIF、FLT-3、血管抑素、血栓反应素、内皮抑素或淋巴毒素。

优选地，所述免疫调节剂是IL-15。

优选地，所述免疫调节剂的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述免疫调节剂的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

CAR-免疫细胞

本发明提供了一种表达前述CAR的免疫细胞。

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、K细胞和NK细胞中的一种或多种。

优选地，所述免疫细胞是NK细胞。

优选地，所述表达前述CAR的免疫细胞是CAR-NK细胞。

经改造的NK细胞

本发明还提供了一种经改造的NK细胞，所述细胞包含编码前述CAR的核酸分子或其所在载体。

优选地，所述编码前述CAR的核酸分子为与SEQ ID NO:8所示的序列有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的核酸分子。

优选地，所述编码前述CAR的核酸分子为SEQ ID NO:8所示的序列。

优选地，所述载体上还可以包括以下任意一种组成的编码核酸：信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列。

优选地，所述免疫调节剂的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述载体上还包括信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列的编码核酸。

优选地，所述载体上的CAR、信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列的连接顺序是信号肽-CAR-自我剪切序列-免疫调节剂。

优选地，所述载体上包含如SEQ ID NO:12所示的核酸序列的部分序列。

优选地，所述载体上包含如SEQ ID NO:12所示的核酸序列。

优选地，所述载体包含慢病毒表达载体(慢病毒载体)、逆转录病毒表达载体 (逆转录病毒载体)、腺病毒表达载体、DNA载体，RNA载体或质粒。

优选地，所述载体是成熟的商品化载体或根据需求自行构建的载体。

优选地，所述载体是逆转录病毒载体。

优选地，所述逆转录病毒载体包括但不限于以下成熟商品化载体：MSCV、M SCV-NWU ER、MSCV-N SM、MSCV.IRES.hCD4、mscv2.2、pMSCVII、pMSC VpuroATT、pMSCV_puro_41584、pMSCV_puro_41585、pMSCVII-LO、pMSCV_ puro_41589、pMSCVII-AM、HOXA10-MSCV、HOXB4-NA-MSCV、HOXB6-NA- MSCV、HOXB6-WG-MSCV、HOXD4-WV-MSCV、PRRX2-MSCV、MEIS1B-MSCV、MSCV JMJD3、MSCV FLIP FF、MSCV P2Gm FF、pMSCV-FlagBcl10、 MSCV-N GFP和MSCV-CGFP。

优选地，所述逆转录病毒载体是MSCV。

制备方法

本发明还提供了一种制备前述CAR-NK细胞的方法，所述方法包括将编码前述CAR的核酸分子所在的载体引入NK细胞。

优选地，所述NK细胞是由自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK细胞系。

优选地，所述NK细胞系包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1和NK L。

优选地，所述人源NK细胞来自于人体脐带血或外周血。

优选地，所述人源NK细胞来自于人体脐带血。

优选地，所述人源NK细胞是自体的或异体的。

优选地，所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、诱导NK细胞的步骤、收集细胞的步骤。

优选地，所述单个核细胞包括外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞。

优选地，所述单个核细胞是脐带血单个核细胞(CBMCs)。

优选地，所述诱导NK细胞所使用的培养基是NK细胞诱导培养基。

优选地，所述NK细胞诱导培养基是X-VIVO15培养基。

优选地，所述X-VIVO15培养基中还添加了FBS、抗生素、Glutamine(谷氨酰胺)中的一种或多种。

优选地，所述X-VIVO15培养基中还添加了青霉素和/或链霉素。

优选地，所述NK细胞诱导培养基是X-VIVO15培养基中添加5％FBS、1％P/S(青霉素、链霉素双抗)、2mM Glutamine中的至少一种。

优选地，所述诱导NK细胞包括使用NK细胞诱导培养基重悬前述单个核细胞。优选地，所述重悬的细胞密度是1～2×10⁶/mL。

优选地，所述诱导NK细胞还包括将NK细胞诱导培养基重悬的细胞液在抗体预包被板上培养；

优选地，所述抗体预包被板是CD16抗体预包被板；

优选地，所述培养是4℃培养。

优选地，所述培养的时长是过夜培养。

优选地，所述抗体预包被板在使用前弃去包被液，PBS清洗2次

优选地，所述诱导NK细胞还包括向添加了细胞液的抗体预包被板的孔中添加活化因子；

优选地，所述活化因子包括4-1BBL、OK432、IL-2。

优选地，所述活化因子是50ng/mL 4-1BBL、0.01KE/mL OK432、1000U/mL IL-2的组合。

优选地，所述添加活化因子后，细胞在37℃5％CO₂培养箱中培养3天。

优选地，所述收集细胞的步骤包括用前述NK细胞培养基添加IL-2重悬细胞。

优选地，所述收集细胞的步骤包括用前述NK细胞培养基添加1000U/mL IL- 2重悬细胞。

优选地，所述收集细胞的步骤包括用前述NK细胞培养基添加1000U/mL IL- 2重悬细胞，并在37℃5％CO₂培养箱中培养2天。

优选地，所述收集细胞的步骤中需要隔天换液。

优选地，所述引入的方法包括电穿孔、脂质体转染、病毒转染。

优选地，所述引入的方法是病毒转染。

优选地，所述病毒转染包括使用慢病毒或逆转录病毒。

优选地，所述病毒转染使用的是逆转录病毒。

优选地，所述方法还包括对病毒进行包装的步骤。

优选地，所述对病毒进行包装使用人类细胞株或非人细胞株。

优选地，所述人类细胞株包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆。SW480细胞、u87MG细胞、 HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、T E671细胞。

优选地，所述人类细胞株是293T细胞。

组合物

本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含前述CAR-NK细胞或经改造的 NK细胞。

优选地，所述组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

优选地，所述药学上可接受的载体包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂，蜡，动植物油脂，石蜡，有机硅，膨润土，硅酸，氧化锌；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物制剂中使用的任何其他相容性物质。

优选地，所述药物组合物还也可以伴有其他抗癌药或治疗性治疗(例如肿瘤的手术切除)的施用。任何合适的抗癌药可以与本文公开的组合物组合施用。

优选地，所述抗癌药包括但不限于化疗剂，例如有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素(例如抗雄激素) 和抗血管生成剂。

优选地，所述烷基化剂的非限制性实例包括氮芥(如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶氮芥或苯丁酸氮芥、烷基磺酸盐(如白消安)、亚硝基脲(如卡莫司汀、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲霉素或达卡巴嗪)。

优选地，所述抗代谢物的非限制性实例包括叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-FU或阿糖胞苷)和嘌呤类似物(例如巯基嘌呤或硫代鸟嘌呤)。

优选地，所述药物组合物的给药途径为肠道给药或非肠道给药，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔黏膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

优选地，所述组合物可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。

优选地，所述液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括 o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。

优选地，所述固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂等。

优选地，所述半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

应用

本发明还提供了前述CAR-NK细胞、经改造的NK细胞或组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病是与B细胞相关的淋巴瘤和白血病。

优选地，所述疾病包括B型急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、 B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见的急性淋巴细胞性白血病和一些空急性(Null-acu te)淋巴细胞性白血病。

附图说明

图1为培养不同天数NK细胞纯度检测流式代表图，ABCD图分别为第0天、第7 天、第10天、第14天的检测图，其横坐标为Alexa Fluor488的荧光强度，纵坐标为APC的荧光强度；E图也是第14天的检测图，其横坐标为APC的荧光强度，纵坐标为PerCP/Cy5.5的荧光强度。

图2为CD19.CAR-NK转染效率检测流式代表图；左图是空白对照，中图是表达不包含IL-15的CAR的NK细胞，右图是包含IL-15的CAR的NK细胞。

图3为CD19.CAR-NK转染效率统计图。

图4为人源化CD19.CAR-NK细胞CD107a表达情况流式图；左图是空白对照，中图是表达不包含IL-15的CAR的NK细胞，右图是包含IL-15的CAR的NK细胞。

图5为CD19.CAR-NK体外杀伤流式检测图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅是为了举例的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1人源化CD19.CAR-NK细胞的制备方法

一、步骤

(1)制备脐带血NK细胞；

1)分离CBMCs：收集脐带血，加等量生理盐水稀释，将淋巴细胞分离液与稀释脐带血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得脐带血单个核细胞CBM Cs。

2)诱导NK细胞：用NK细胞培养基(X-VIVO15+5％FBS+1％P/S+Gluta mine)重悬CBMCs细胞，调整细胞密度至1～2×10⁶/mL，转移至CD16抗体预包被板(加1μg/ml CD16抗体溶液，4℃过夜，使用前弃去包被液，PBS清洗2次)；加入活化因子组合：50ng/mL 4-1BBL、0.01KE/mL OK432、1000U/mL IL-2，置于37℃5％CO₂培养箱中培养3天。离心收集细胞，用新鲜NK细胞培养基重悬并添加1000U/mL IL-2，转移至普通培养瓶，置于37℃5％CO₂培养箱进行扩增2 周。每日观察细胞状态，隔天半量换液。

3)NK纯度检测：培养第7、10、14天，取2×10⁵细胞，清洗后加入Alexa Fluor488CD3、APC CD56、PerCP/Cy5.5 CD314，抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。

(2)构建含有CAR结构的穿梭质粒：所述CAR结构有包含IL-15和不包含 IL-15两种，不包含IL-15的CAR的编码序列如SEQ ID NO:8所示，包含IL-15 的CAR的编码序列如SEQID NO:12的第58-2040位所示；将以上序列连接到逆转录病毒载体MSCV上，然后转化Stbl3感受态细胞，挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认。

(3)包装病毒

将含有CAR结构的穿梭质粒6μg、辅助质粒pCL-Ampho 4μg混合在300μl o pti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入30μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293 T细胞培养皿中，轻摇混匀，48-72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。

(4)病毒感染NK细胞

将CD19-CAR病毒液加入10μM HEPES和6μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的NK细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g、 30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200U/ml IL-2、10ng/ml IL-21 和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基，继续培养扩增，即可。

(5)CAR-NK细胞检测

待病毒感染后72小时，取2×10⁵细胞进行染色，首先加入1μg/mL biotin-Protein L蛋白4℃孵育30分钟，清洗细胞再加入PE Strepavidin 4℃避光孵育30分钟，清洗细胞，最后加入Alexa Fluor488 CD3、APC CD56抗体4℃避光孵育30 分钟，清洗后上机检测。

二、结果

图1为培养不同天数NK细胞纯度检测流式代表图，结果显示本发明制备得到的NK细胞纯度大于95％，且高表达CD314；

图2为CD19.CAR-NK转染效率检测流式代表图；

图3为CD19.CAR-NK转染效率统计图，结果显示利用逆转录病毒介导的CA R体系能够高效感染诱导的NK细胞，CAR阳性率达60-85％。

实施例2流式检测人源化CD19.CAR-NK细胞CD107a表达情况

一、步骤

选取白血病细胞Nalm-6(CD19⁺)作为靶细胞，未转染CB-NK、CD19.CAR- NK、CD19.CAR/IL15-NK作为效应细胞。

首先收集清洗肿瘤细胞和淋巴细胞，用NK细胞培养基重悬，密度分别调整为1×10⁶/mL和5×10⁶/mL，效靶比设定为5：1；U型底96孔板，加肿瘤细胞和淋巴细胞各100μL，总体积为200μl；然后每孔各加10μL PE-Cy7 CD107a抗体，置于37℃、5％CO₂孵育；孵育1h后，每孔各加5μL monensin solution，上下吹打混匀，继续孵育；孵育4h后，将每孔的细胞收集转移至流式管，PBS清洗， 400g离心5min；加PerCP/Cy5.5 CD3、APC CD56抗体，4℃避光孵育30min，清洗重悬上机检测。

二、结果

图4为人源化CD19.CAR-NK细胞和CD19.CAR/IL15-NK细胞CD107a表达情况流式图，结果显示本发明制备的人源化CD19.CAR-NK细胞和CD19.CAR/IL1 5-NK细胞与肿瘤细胞共培养后脱颗粒标志分子CD107a表达上调。

实施例3人源化CD19.CAR-NK细胞的体外杀伤功能验证

一、步骤

选取白血病细胞Nalm-6-Luc-GFP(CD19+)作为靶细胞，未转染CB-NK、C D19.CAR-NK、CD19.CAR/IL15-NK作为效应细胞。

接种Nalm6-FFluc-GFP细胞：按照5×10⁴/孔接种于48孔板，按照效靶比10/1、 5/1、1/1加入效应细胞与肿瘤细胞混匀培养；24h后收集细胞至流式管，染色AP C CD56，4℃孵育20min，清洗离心后，300μL PBS重悬，加2μL 7-AAD，上机流式分析残留的存活的肿瘤细胞比例。

二、结果

图5为CD19.CAR-NK体外杀伤流式检测图，结果显示与未进行基因修饰CB -NK细胞相比，随着E:T比例降低，残留靶细胞Nalm-6比例逐渐增加；而且与对照CD19.CAR-NK细胞相比，CD19.CAR/IL15-NK在低效靶比时表现出更强的杀伤能力，Nalm-6only作为染色对照。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种脐带血来源的靶向CD19的CAR-NK细胞及其制备方法

<141> 2021-07-21

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

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Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

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Ser Ser

<210> 5

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

260 265 270

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

275 280 285

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

290 295 300

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg

305 310 315 320

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

325 330 335

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

340 345 350

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

355 360 365

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

370 375 380

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

385 390 395 400

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

405 410 415

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

420 425 430

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

435 440 445

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

450 455 460

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 6

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

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Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

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<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60

ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120

ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180

aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240

gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300

ggcaccaagc tcgagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360

ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420

tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480

cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctctga gactacttac 540

tactcttcat ccctcaagtc acgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600

tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660

tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720

tccagcacgc gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 780

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 840

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 900

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 960

ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcctttca tgaggcccgt gcagactacc 1020

caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 1080

agaagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1140

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1200

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1260

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1320

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1380

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1419

<210> 9

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagacctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttga 489

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatctggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cct 63

<210> 11

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

130 135 140

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

165 170 175

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile

180 185 190

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val

195 200 205

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser

210 215 220

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

225 230 235 240

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

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Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe

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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

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Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

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Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

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Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

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Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

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Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Cys Gly Ser

485 490 495

Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

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Pro Gly Pro Arg Thr Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile

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Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr

530 535 540

Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu

545 550 555 560

Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys

565 570 575

Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr

580 585 590

Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe

595 600 605

Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile

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His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser

625 630 635 640

Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu

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Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val

660 665 670

Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

675

<210> 12

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgaa 60

attgtgatga cccagtcacc cgccactctt agcctttcac ccggtgagcg cgcaaccctg 120

tcttgcagag cctcccaaga catctcaaaa taccttaatt ggtatcaaca gaagcccgga 180

caggctcctc gccttctgat ctaccacacc agccggctcc attctggaat ccctgccagg 240

ttcagcggta gcggatctgg gaccgactac accctcacta tcagctcact gcagccagag 300

gacttcgctg tctatttctg tcagcaaggg aacaccctgc cctacacctt tggacagggc 360

accaagctcg agattaaagg tggaggtggc agcggaggag gtgggtccgg cggtggagga 420

agccaggtcc aactccaaga aagcggaccg ggtcttgtga agccatcaga aactctttca 480

ctgacttgta ctgtgagcgg agtgtctctc cccgattacg gggtgtcttg gatcagacag 540

ccaccgggga agggtctgga atggattgga gtgatttggg gctctgagac tacttactac 600

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agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

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cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

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tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260

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cctaaaacag aagccaactg ggtgaatgta ataagtgatt tgaaaaaaat tgaagacctt 1740

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gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc tagcaaacaa cagtttgtct 1920

tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg aggaactgga ggaaaaaaat 1980

attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa tgttcatcaa cacttcttga 2040

Claims

1.一种由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成的CAR，其特征在于，所述抗CD19的特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述抗CD19的特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述铰链区为CD8α铰链区、所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域、所述共刺激结构域为CD137的胞内结构域、所述胞内信号传导结构域为CD3ζ的胞内信号传导结构域；

所述由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述CAR还连接有自我剪切序列和免疫调节剂的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的CAR，其特征在于，所述自我剪切序列是2A肽。

4.如权利要求3所述的CAR，其特征在于，所述2A肽为T2A。

5.如权利要求4所述的CAR，其特征在于，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

6.如权利要求2所述的CAR，其特征在于，所述免疫调节剂是IL-15。

7.如权利要求6所述的CAR，其特征在于，所述免疫调节剂的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

8.一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞是表达权利要求1-7任一所述的CAR的NK细胞。

9.一种制备权利要求8所述CAR-NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1-7任一所述CAR的核酸分子所在的载体引入NK细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引入的方法包括电穿孔、脂质体转染、病毒转染。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒转染使用的是逆转录病毒。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述NK细胞包括自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK细胞系。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、诱导NK细胞的步骤、收集细胞的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞包括外周血单个核细胞和脐带血单个核细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述诱导NK细胞所使用的培养基是NK细胞诱导培养基。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述NK细胞诱导培养基是X-VIVO15培养基。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述X-VIVO15培养基中还添加了FBS、抗生素、Glutamine中的一种或多种。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述NK细胞诱导培养基是X-VIVO15培养基中添加5% FBS、1% P/S、2mM Glutamine中的至少一种。

19.如权利要求13所述的方法，所述诱导NK细胞还包括将NK细胞诱导培养基重悬的细胞液在抗体预包被板上培养。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗体预包被板是CD16抗体预包被板。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述诱导NK细胞还包括向添加了细胞液的抗体预包被板的孔中添加活化因子。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述活化因子包括4-1BBL、OK432、IL-2。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述活化因子是50ng/mL 4-1BBL、0.01KE/mL OK432、1000 U/mL IL-2的组合。

24.如权利要求15所述的方法，其特征在于，向NK细胞诱导培养基的培养基添加IL-2后，重悬离心收集到的细胞，并培养。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述IL-2的工作浓度是1000U/mL。

26.由权利要求1-7任一所述的CAR构成的CAR-NK细胞，或由所述CAR-NK细胞组成的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用，所述疾病是与B细胞相关的淋巴瘤和白血病；

所述B细胞相关的淋巴瘤和白血病包括B型急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病。