JP2018196396A

JP2018196396A - 免疫治療のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2018196396A
Application number: JP2018174681A
Authority: JP
Inventors: ディー．フェドロフビクター; D Fedorov Victor; サデレインミシェル; Sadelain Michel
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2018-12-13
Also published as: KR20220013592A; KR20220156663A; MY195733A; KR20150128997A; EP2968492B1; JP2022186837A; MX2015013104A; BR112015023679A2; AU2014386824B2; AU2019213338A1; AU2014386824A1; JP2021052800A; KR102466666B1; EP2968492A1; NZ712693A; RU2015143207A3; WO2015142314A1; SA515361180B1; WO2015142314A8; PH12015502271B1

Abstract

【課題】抗原認識レセプターおよび阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を発現する免疫応答細胞（Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる）を提供すること。【解決手段】上記免疫応答細胞を使用するための方法は、抗原特異的免疫応答の増大が望ましい新生物形成および他の病状の処置のための方法を含む。上記第１の抗原への上記抗原認識レセプターの結合は、上記免疫応答細胞を活性化し、上記第２の抗原への上記ｉＣＡＲの結合は、上記免疫応答細胞を阻害する。本発明はまた、上記免疫応答細胞を生産するための方法、および上記免疫応答細胞を使用することによって癌を処置するための方法を提供する。【選択図】なし

Description

（優先権の主張）
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０２，１１８
号の優先権を主張し、当該出願の内容はその全体が本明細書に参考として援用される。

（導入）
本発明は、第１の抗原と結合抗原と結合する抗原認識レセプターおよび第２の抗原と結合
する阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を含む免疫応答細胞を提供し、ここで上記
第１の抗原への上記抗原認識レセプターの結合は、上記免疫応答細胞を活性化し、上記第
２の抗原への上記ｉＣＡＲの結合は、上記免疫応答細胞を阻害する。本発明はまた、上記
免疫応答細胞を生産するための方法、および上記免疫応答細胞を使用することによって癌
を処置するための方法を提供する。

（発明の背景）
Ｔ細胞ベースの治療は、骨髄移植および臓器移植、癌免疫療法、ウイルス感染、ならびに
自己免疫疾患において治癒の可能性を有する。しかし、主要な処置関連合併症は、ドナー
リンパ球注入もしくは自己由来の標的化Ｔ細胞療法における「オンターゲット・オフ腫瘍
反応性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）」後の移
植片対宿主病（ＧＶＨＤ）におけるような、正常な組織に対する意図しないＴ細胞反応性
から生じる。

同種異系骨髄移植（ＢＭＴ；全世界で１年に２５，０００症例）におけるドナーリンパ球
注入（ＤＬＩ）の使用は、ある種の患者部分セットにおいて有意な治癒の増加を生じた。
近年、ＤＬＩは、転移性腎細胞癌、乳癌、結腸癌、および卵巣癌を有する患者に対する有
効な治療を提供することが示されており、治験が転移性固形腫瘍を処置するために進行中
である。ＤＬＩの重要な効力（血液の悪性腫瘍の状況で移植片対白血病（ＧＶＬ）といわ
れる）は、いくつかのグループが、ＧＶＨＤ誘発の低下が達成されなければＤＬＩの現在
のスキームが生存を改善できないと結論づけるほどまでに、急性および慢性の移植片対宿
主病（ＧＶＨＤ）の両方の誘発によって制限される（４０％を超える割合）。

同様に、癌免疫療法治験は、ＴＣＲおよびＣＡＲがそうされたＴ細胞に由来する「オンタ
ーゲットであるが、オフ組織（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｂｕｔｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ）」
の有害事象（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞で処置した慢性リンパ性白血病
（ＣＬＬ）患者におけるＢ細胞形成不全、肺上皮に対する抗ＥＲＢＢ２ＣＡＲＴ細胞
交叉反応性に由来する胎児急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、およびＭａｇｅ−Ａ３Ｔ
ＣＲで処置した黒色腫および骨髄腫患者における心筋壊死による死亡が挙げられる）を報
告した。

非特異的免疫抑制およびＴ細胞排除は、治療利益を捨てて重症の二次合併症を引き起こす
という代償を払って、望ましくないＴ細胞応答を制御する現在唯一の手段である。それら
は、重症かつときおり御しがたい、従って、別の点で効果的な細胞処置の使用を制限し得
る症状の出現に依拠する。

細胞性の副作用という帰結を防止するストラテジーは、実際に必要とされている。現在の
アプローチでは、望ましくない副作用を制御することにおける利点としてＴ細胞療法のよ
り高次の複雑性を利用できない。よって、新規な治療ストラテジーが切迫して必要とされ
る。

（発明の要旨）
本発明は、一般に、免疫細胞活性化活性を有する抗原結合レセプター（例えば、ＣＡＲも
しくはＴＣＲ）および上記免疫応答細胞の免疫活性を選択的に低下もしくは除去する阻害
性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を発現する免疫応答細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および制御性Ｔ細胞）を提
供する。従って、上記免疫応答細胞のオフターゲット効果は、低下される。いくつかの実
施形態において、免疫活性の低下は、可逆的である。よって、本発明は、新生物形成、感
染性疾患、および他の病状の処置のためにこのような免疫応答細胞を使用するための方法
を提供する。

一局面において、本発明は、単離された免疫応答細胞を提供し、上記免疫応答細胞は、第
１の抗原と結合し、ここで上記結合が上記免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター
、および第２の抗原と結合し、ここで上記結合が上記免疫応答細胞を阻害する阻害性キメ
ラ抗原レセプターを含む。

別の局面において、本発明は、被験体における腫瘍量を低下させるための方法を提供し、
上記方法は、有効量の免疫応答細胞を投与し、それによって、上記被験体における腫瘍細
胞死を誘発する工程を包含し、上記免疫応答細胞は、第１の抗原と結合し、ここで上記結
合が上記免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター、および第２の抗原と結合し、こ
こで上記結合が上記免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む。上記方
法は、非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞を選択的に標的とし得る。いくつかの実施形態に
おいて、上記方法は、腫瘍細胞の数を減少させる。いくつかの実施形態において、上記方
法は、腫瘍サイズを低下させる。他の実施形態において、上記方法は、上記被験体におけ
る腫瘍を根絶する。

別の局面において、本発明は、新生物形成を有する被験体の生存を増大させるための方法
を提供し、上記方法は、有効量の免疫応答細胞を投与し、それによって、上記被験体にお
ける新生物形成を処置もしくは予防する工程を包含し、上記免疫応答細胞は、第１の抗原
と結合し、ここで上記結合が上記免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター、および
第２の抗原と結合し、ここで上記結合が上記免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レ
セプターを含む。ある種の実施形態において、上記新生物形成は、血液の癌、Ｂ細胞白血
病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリ
ンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肉腫、ならびに急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）からなる群より選択される。

別の局面において、本発明は、第１の抗原と結合する抗原認識レセプターを含む抗原特異
的免疫応答細胞を生産するための方法を提供し、上記方法は、上記免疫応答細胞に、第２
の抗原と結合し、ここで上記結合が上記免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプ
ターをコードする核酸配列を導入する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、抗原と結合する細胞外ドメイン；上記細胞外ドメインに作
動可能に連結された膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達を活性化して免疫応答を
低下させる細胞内ドメインであって、上記膜貫通ドメインに作動可能に連結されている、
細胞内ドメインを含む、阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を提供する。いくつか
の実施形態において、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、
ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡ
ポリペプチドからなる群より選択される。ある種の実施形態において、上記膜貫通ドメイ
ンは、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１
ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプ
チドからなる群より選択される。さらに、上記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）
は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドをさらに含み
得る。いくつかの実施形態において、上記ｉＣＡＲへの抗原の結合は、免疫応答を低下さ
せる上記細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する。

関連する局面において、本発明は、抗原と結合する阻害性キメラ抗原レセプターをコード
する核酸配列を提供し、ここで上記結合は、免疫応答を低下させる細胞内シグナル伝達ド
メインを活性化する。

別の関連する局面において、本発明は、抗原と結合する阻害性キメラ抗原レセプターをコ
ードする核酸配列を含むベクターを提供し、ここで上記結合は、免疫応答を低下させる細
胞内シグナル伝達ドメインを活性化する。

関連する局面において、本発明は、有効量の本発明の免疫応答細胞を薬学的に受容可能な
賦形剤中に含む、（新生物形成もしくは病原体感染の処置のための）薬学的組成物を提供
する。

別の局面において、本発明は、新生物形成、病原体感染、自己免疫障害、もしくは同種異
系移植の処置のためのキットを提供し、上記キットは、第１の抗原と結合し、上記免疫応
答細胞を活性化する抗原認識レセプター、および第２の抗原と結合し、上記免疫応答細胞
を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む免疫応答細胞を含む。種々の実施形態にお
いて、上記キットは、新生物形成、病原体感染、自己免疫障害、もしくは同種異系移植を
有する被験体を処置するために上記細胞を使用するための書面による説明書をさらに含む
。

別の局面において、本発明は、被験体における移植片対白血病応答もしくは移植片対腫瘍
応答を調節するための方法を提供し、上記方法は、上記被験体に対して同種異系の免疫応
答細胞の有効量を投与し、それによって上記被験体における移植片対白血病応答もしくは
移植片対腫瘍応答を調節する工程を包含し、上記免疫応答細胞は、抗原と結合し、ここで
上記結合が上記同種異系の免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む。
ある種の実施形態において、上記被験体は、転移性乳癌、血液の悪性腫瘍、もしくは固形
腫瘍を有し、上記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ−Ｉである。ある種の実施形態に
おいて、上記被験体は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を既に受けた腫瘍を有し、上記抗原は、
上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、Ｅ−カドヘリン、およびサイトケラチンのうちの１種以上
である。種々の実施形態において、上記阻害性キメラ抗原レセプターおよび上記抗原の結
合は、上記抗原を含む細胞における細胞死を減少させる。上記方法は、上記被験体におけ
る移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、もしくはその症状を低下させ得る。

本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記第１の抗原もしくは上記抗原
認識レセプターの抗原は、腫瘍抗原もしくは病原体抗原である。特定の実施形態において
、上記抗原認識レセプターの抗原は、以下からなる群より選択される１種以上の腫瘍抗原
である：ＣＤ１９、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２
、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５
６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、Ｆ８Ｐ
、胎児型アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２
、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−α２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、Ｍ
ＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−Ｅ
ＳＯ−１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、Ｖ
ＥＧＦ−Ｒ２、およびＷＴ−１。

本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記第２の抗原もしくは上記阻害
性キメラ抗原レセプターの抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、器
官特異的抗原、血液脳関門特異的抗原、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、Ｅ−カドヘリン、
サイトケラチン、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２
、結腸直腸癌欠失（ＤｅｌｅｔｅｄｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａ
）（ＤＣＣ）、足場／マトリクス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面炭
水化物、もしくはムチンタイプＯ−グリカンである。本明細書で詳述される局面の種々の
実施形態において、上記ｉＣＡＲへの抗原の結合は、免疫応答を低下させる上記細胞内シ
グナル伝達ドメインを活性化する。

本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記阻害性キメラ抗原レセプター
は、組換え発現される。本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記阻害
性キメラ抗原レセプターは、ベクターから発現される。本明細書で詳述される局面の種々
の実施形態において、上記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＴＬＡ−４ポ
リペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、お
よびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む
。本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記阻害性キメラ抗原レセプタ
ー（ｉＣＡＲ）は、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチ
ド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴ
ＬＡポリペプチドからなる群より選択される膜貫通ドメインを含む。本明細書で詳述され
る局面の種々の実施形態において、上記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、Ｆ
ａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドを含む。ある種の実
施形態において、上記細胞は、１９−２８ｚ、Ｐ２８ｚ、Ｍ２８ｚ、および５６−２８ｚ
からなる群より選択される組換えもしくは内因性の抗原レセプターを発現する。

本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記抗原認識レセプターは、Ｔ細
胞レセプター（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である。本明細書で詳
述される局面の種々の実施形態において、抗原認識レセプターは、外因性もしくは内因性
である。本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、抗原認識レセプターは、
組換え発現される。本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記抗原認識
レセプターは、ベクターから発現される。本明細書で詳述される局面のうちのいずれかの
種々の実施形態において、同種異系細胞は、内因性Ｔ細胞レセプターを有する。

本明細書で詳述される局面の種々の実施形態において、上記細胞は、Ｔ細胞、ナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞
、先天性免疫系の細胞、およびリンパ球へ分化し得る多能性幹細胞のうちの１種以上であ
る。いくつかの実施形態において、上記免疫応答細胞は、自己由来である。他の実施形態
において、上記免疫応答細胞は、非自己由来である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
１）第１の抗原と結合する抗原認識レセプターであって、ここで該結合は、該免疫応答細胞を活性化する、抗原認識レセプター、および
２）第２の抗原と結合する阻害性キメラ抗原レセプターであって、ここで該結合は、該免疫応答細胞を阻害する、阻害性キメラ抗原レセプター、
を含む、単離された免疫応答細胞。
（項目２）
前記第１の抗原は、腫瘍抗原もしくは病原体抗原である、項目１に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目３）
前記第２の抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、上皮間葉転換（ＦＭＴ）抗原、器官特異的抗原、血液脳関門特異的抗原、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２、結腸直腸癌欠失（ＤｅｌｅｔｅｄｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）、足場／マトリクス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面炭水化物、ムチンタイプＯ−グリカンである、項目１に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目４）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、組換え発現される、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目５）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、ベクターから発現される、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目６）
前記抗原認識レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、項目１〜５のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目７）
前記抗原認識レセプターは、外因性もしくは内因性である、項目１〜６のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目８）
前記抗原認識レセプターは、組換え発現される、項目１〜７のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目９）
前記抗原認識レセプターは、ベクターから発現される、項目１〜８のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１０）
前記細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、先天性免疫系の細胞、およびリンパ球へ分化し得る多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１〜９のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１１）
前記免疫応答細胞は、自己由来である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１２）
前記免疫応答細胞は、非自己由来である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１３）
前記第１の抗原は、ＣＤ１９、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−α２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、およびＷＴ−１からなる群より選択される腫瘍抗原である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１４）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１５）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−ｌポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される膜貫通ドメインをさらに含む、項目１４に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１６）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドをさらに含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１７）
前記細胞は、１９−２８ｚ、Ｐ２８ｚ、Ｍ２８ｚ、および５６−２８ｚからなる群より選択される組換えもしくは内因性の抗原レセプターを発現する、項目１〜１６のいずれか１項に記載の単離された免疫応答細胞。
（項目１８）
被験体における腫瘍量を低減するための方法であって、該方法は、有効量免疫応答細胞を投与し、それによって該被験体における腫瘍細胞死を誘発する工程を包含し、該免疫応答細胞は、第１の抗原と結合し、ここで該結合が該免疫応答細胞を活性化させる抗原認識レセプター、および第２の抗原と結合し、ここで該結合が該免疫細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む、方法。
（項目１９）
非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞を選択的に標的とする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
腫瘍細胞の数を減少させる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
腫瘍サイズを低下させる、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体における前記腫瘍を根絶する、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
新生物形成を有する被験体の生存を増進するための方法であって、該方法は、有効量の免疫応答細胞を投与し、それによって、該被験体における新生物形成を処置もしくは防止する工程を包含し、該免疫応答細胞は、第１の抗原と結合し、ここで該結合は該免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター、および第２の抗原と結合し、ここで該結合は該免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む、方法。
（項目２４）
前記新生物形成は、血液の癌、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、および肉腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の抗原は、腫瘍抗原もしくは病原体抗原である、項目１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記第２の抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、器官特異的抗原、血液脳関門特異的抗原、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２、結腸直腸癌欠失（ＤｅｌｅｔｅｄｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）、足場／マトリクス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面炭水化物、もしくはムチンタイプＯ−グリカンである、項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、組換え発現される、項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、ベクターから発現される、項目１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記抗原認識レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、項目１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記抗原認識レセプターは、外因性もしくは内因性である、項目１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記抗原認識レセプターは、組換え発現される、項目１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記抗原認識レセプターは、ベクターから発現される、項目１８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、先天性免疫系の細胞、およびリンパ球へ分化し得る多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記免疫応答細胞は、自己由来である、項目１８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記免疫応答細胞は、非自己由来である、項目１８〜３３のいずれか１項に記載の方法。（項目３６）
前記第１の抗原が、ＣＤ１９、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−α２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、およびＷＴ−１からなる群より選択される腫瘍抗原である、項目１８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される膜貫通ドメインをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドをさらに含む、項目１８〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記方法は、前記被験体において腫瘍量を低下させるかもしくは根絶する、項目１８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記方法は、前記被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、もしくはその症状を低下させる、項目１８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
第１の抗原と結合する抗原認識レセプターを含む抗原特異的免疫応答細胞を生産するための方法であって、該方法は、第２の抗原と結合し、ここで該結合が該免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターをコードする核酸配列を該免疫応答細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目４３）
前記第１の抗原は、腫瘍抗原もしくは病原体抗原である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第２の抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、器官特異的抗原、血液脳関門特異的抗原、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２、結腸直腸癌欠失（ＤｅｌｅｔｅｄｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）、足場／マトリクス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面炭水化物、もしくはムチンタイプＯ−グリカンである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、組換え発現される、項目４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記阻害性キメラ抗原レセプターは、ベクターから発現される、項目４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記抗原認識レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である、項目４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記抗原認識レセプターは、外因性もしくは内因性である、項目４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記抗原認識レセプターは、組換え発現される、項目４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記抗原認識レセプターは、ベクターから発現される、項目４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、先天性免疫系の細胞、およびリンパ球へ分化し得る多能性幹細胞からなる群より選択される、項目４２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記免疫応答細胞は、自己由来である、項目４２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記免疫応答細胞は、自己由来である、項目４２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の抗原が、ＣＤ１９、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−α２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、およびＷＴ−１からなる群より選択される腫瘍抗原である、、項目４２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される膜貫通ドメインをさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドをさらに含む、項目４２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
（ｉ）抗原と結合する細胞外ドメイン；
（ｉｉ）該細胞外ドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達を活性化して、免疫応答を低下させる細胞内ドメインであって、該細胞内ドメインは、該膜貫通ドメインに作動可能に連結されている、細胞内ドメイン、
を含む、阻害性キメラ抗原レセプター。
（項目５９）
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される、項目５８に記載の阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）。
（項目６０）
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、およびＢＴＬＡポリペプチドからなる群より選択される、項目５９に記載の阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）。
（項目６１）
Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、リガンド、特異的リガンド、もしくは多価リガンドをさらに含む、項目５８〜６０のいずれか１項に記載の阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）。
（項目６２）
前記ｉＣＡＲへの前記抗原の結合は、前記免疫応答を低下させる細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する、項目５８〜６１のいずれか１項に記載の阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）。
（項目６３）
前記抗原と結合する阻害性キメラ抗原レセプターをコードする核酸配列であって、ここで該結合は、免疫応答を低下させる細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する、核酸配列。（項目６４）
抗原と結合する阻害性キメラ抗原レセプターをコードする核酸配列を含むベクターであって、ここで該結合は、免疫応答を低下させる細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する、ベクター。
（項目６５）
項目１〜１７のいずれか１項に記載の免疫応答細胞の有効量を、薬学的に受容可能な賦形剤中に含む、薬学的組成物。
（項目６６）
新生物形成の処置のための薬学的組成物であって、項目１〜１７のいずれか１項に記載の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の有効量を、薬学的に受容可能な賦形剤中に含む、薬学的組成物。（項目６７）
新生物形成、病原体感染、自己免疫障害、もしくは同種異系移植の処置のためのキットであって、該キットは、免疫応答細胞を含み、該免疫応答細胞は、第１の抗原と結合し、該免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター、および第２の抗原と結合し、該免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む、キット。
（項目６８）
前記キットは、新生物形成、病原体感染、自己免疫障害、もしくは同種異系移植を有する被験体を処置するために該細胞を使用するための書面による説明書をさらに含む、項目６７に記載のキット。
（項目６９）
被験体における移植片対白血病応答もしくは移植片対腫瘍応答を調節するための方法であって、該方法は、該被験体に同種異系の免疫応答細胞の有効量を投与し、それによって、該被験体における移植片対白血病応答もしくは移植片対腫瘍応答を調節する工程を包含し、該免疫応答細胞は、抗原と結合し、ここで該結合が該同種異系免疫応答細胞を阻害する阻害性キメラ抗原レセプターを含む、方法。
（項目７０）
前記同種異系細胞は、内因性Ｔ細胞レセプターを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、器官特異的抗原、血液脳関門特異的抗原、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子（ＯＰＣＭＬ）、ＨＹＬＡ２、結腸直腸癌欠失（ＤｅｌｅｔｅｄｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＣＣ）、足場／マトリクス付着領域結合タンパク質１（ＳＭＡＲ１）、細胞表面炭水化物、もしくはムチンタイプＯ−グリカンである、項目６９または７０に記載の方法。
（項目７２）
前記被験体は、転移性乳癌、血液系悪性腫瘍、もしくは固形腫瘍を有し、前記ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ−Ｉである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記被験体は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を既に受けた腫瘍を有し、前記抗原は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）抗原、Ｅ−カドヘリン、およびサイトケラチンのうちの１種以上である、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記阻害性キメラ抗原レセプターおよび前記抗原の結合は、前記抗原を含む細胞の細胞死を減少させる、項目６９〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記方法は、前記被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、もしくはその症状を低下させる、項目６９〜７４のいずれか１項に記載の方法。

（定義）
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明
が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発
明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏ
ｎｅｔａｌ．、ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄｅｄ．１９９４）；ＴｈｅＣａ
ｍｂｒｉｄｇｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒｅｄ．、１９８８）；ＴｈｅＧｌｏｓｓａｒｙｏｆ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５ｔｈＥｄ．、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．（ｅｄｓ．
）、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈ
ａｍ、ＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌ
ｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段特定されなけれ
ば、以下に与えられた意味を有する。

「免疫応答細胞を活性化する」とは、免疫応答の開始を生じる細胞におけるシグナル伝達
の誘発もしくはタンパク質発現の変化を意味する。例えば、ＣＤ３鎖クラスターがリガン
ド結合および免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔ
ｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｏｔｉｆｓ）（ＩＴＡ
Ｍ）に応答すると、シグナル伝達カスケードが生じる。ある種の実施形態において、内因
性ＴＣＲもしくは外因性ＣＡＲが抗原と結合する場合、結合したレセプター付近の多くの
分子（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）のクラスター形成を
含む免疫シナプスの形成が起こる。膜結合したシグナル伝達分子のこのクラスター形成は
、ＣＤ３鎖内に含まれるＩＴＡＭモチーフがリン酸化されることを可能にする。このリン
酸化は、翻って、Ｔ細胞活性化経路を開始し、最終的に、転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ
およびＡＰ−１）を活性化する。これら転写因子は、上記Ｔ細胞の全体的な遺伝子発現を
誘発して、Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始するために、主要調節因子Ｔ細胞タンパク質の増
大および発現のためにＩＬ−２生成を増大させる。「免疫応答細胞を刺激する」とは、強
くかつ持続した免疫応答を生じるシグナルを意味する。種々の実施形態において、これは
、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化後に起こるか、またはＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−
１ＢＢ）、ＯＸ４０、およびＩＣＯＳが挙げられるが、これらに限定されないレセプター
を通じて同時に媒介される。特定の理論に拘束されないが、複数の刺激シグナルを受容す
ることは、強くかつ長期間のＴ細胞媒介性免疫応答を展開するために重要である。これら
刺激シグナルを受容しなければ、Ｔ細胞は、迅速に阻害され抗原に非応答性になる。これ
ら共刺激シグナルの効果は変動し、部分的に理解されてはいるものの、それらは一般に、
完全かつ持続した根絶のために抗原に強く応答する、長く生きている、増殖性の、および
抗アポトーシス性のＴ細胞を生成するために、遺伝子発現の増大を生じる。

用語「抗原認識レセプター」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合に応じて免疫細
胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化し得るレセプターをいう。例示的抗原認識レセプターは、
天然のもしくは内因性のＴ細胞レセプター、細胞に導入される外因性Ｔ細胞レセプターお
よび／または主要抗原結合ドメインが免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化し得る細胞内
シグナル伝達ドメインに融合されているキメラ抗原レセプターであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、無傷の抗体分子のみならず、免疫原結合
能を保持する抗体分子の配列もまた意味する。このようなフラグメントはまた、当該分野
で周知であり、インビトロおよびインビボの両方で適切に使用される。よって、本明細書
で使用される場合、用語「抗体」とは、無傷の抗体分子のみならず、周知の活性フラグメ
ントＦ（ａｂ’）_２、およびＦａｂもまた意味する。Ｆ（ａｂ’）_２、および無傷の抗体
のＦｃフラグメントを欠いているＦａｂフラグメントは、循環からより迅速に消失し、無
傷の抗体の非特異的組織結合がより少なくなり得る（Ｗａｈｌｅｔａｌ．、ＪＮｕ
ｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）。本発明の抗体は、完全な天然
の抗体、二重特異的抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓ
ｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および慣例に従わない抗体を含む。

「アフィニティー」とは、結合強度の尺度を意味する。理論には拘束されないが、アフィ
ニティーは、抗体結合部位と抗原決定基との間での立体化学的フィットの緊密さ、それら
の間の接触の面積、および荷電した基および疎水性基の分布に依存する。アフィニティー
はまた、用語「アビディティー」を含み、この用語は、可逆的複合体の形成後の抗原−抗
体結合の強さをいう。抗原に対する抗体のアフィニティーを計算するための方法は、当該
分野で公知であり、上記方法は、結合実験を使用して、アフィニティーを計算することを
包含する。機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）における抗体活性
はまた、抗体アフィニティーを反映する。抗体およびアフィニティーは、表現型として特
徴付けられ得、機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を使用して比
較され得る。

用語「キメラ抗原レセプター」もしくは「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用される場合、免
疫細胞を活性化もしくは刺激し得る細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている抗原結
合ドメインをいう。最も一般的には、上記ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスモノク
ローナル抗体もしくはヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の融
合に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。あるいは、ｓｃＦｖは
、Ｆａｂに由来するものが使用され得る（抗体に由来する代わりに、例えば、Ｆａｂライ
ブラリーから得られる）。種々の実施形態において、このｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに
融合され、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。「第１世代」ＣＡＲは、
抗原結合の際にＣＤ３ζシグナルを提供するのみのものを含み、「第２世代」ＣＡＲは、
共刺激（例えば、ＣＤ２８もしくはＣＤ１３７）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供
するものを含む。「第３世代」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１
３７）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。種々の実施形態において、上記
ＣＡＲは、上記抗原に対して高アフィニティーもしくはアビディティーを有するように選
択される。

用語「阻害性キメラ抗原レセプター」もしくは「ｉＣＡＲ」とは、本明細書で使用される
場合、免疫細胞の免疫活性を阻害もしくは抑制し得る細胞内シグナル伝達ドメインに融合
されている抗原結合ドメインをいう。ｉＣＡＲは、免疫細胞阻害能力を有し、免疫細胞活
性化能力を有するレセプターであるＣＡＲとは異なりかつ区別可能である。例えば、ＣＡ
Ｒは、ＣＤ３ζを含むので、活性化レセプターである。ｉＣＡＲは、活性化ドメインを含
まない。従って、ｉＣＡＲは、ＣＡＲとは異なり、ＣＡＲの下位グループではない。ある
種の実施形態において、上記抗原結合ドメインは、膜貫通ドメイン、および免疫阻害レセ
プターの細胞内ドメインに融合される。上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペ
プチド、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡ
Ｇ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、もしくはＢＴＬＡポリペプチドであり得る。
上記ｉＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、
ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、もしくはＢＴＬＡポリペプチドであり得
る。種々の実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスモノクロー
ナル抗体もしくはヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来す
る単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。ある種の実施形態において、上記
ｓｃＦＶは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して特異的なｓｃＦＶである。あるい
は、ｓｃＦｖは、Ｆａｂに由来するものが使用され得る（抗体に由来する代わりに、例え
ば、Ｆａｂライブラリーから得られる）。ｉＣＡＲは、抗原認識の際にＴ細胞機能を特異
的に阻害する免疫抑制活性を有する。

「免疫応答細胞を阻害する」もしくは「免疫応答細胞を抑制する」とは、免疫応答の抑制
（例えば、サイトカイン生成の減少）を生じる細胞におけるシグナル伝達の誘発もしくは
タンパク質発現の変化を意味する。好ましい実施形態において、免疫応答細胞の阻害もし
くは抑制は、選択的および／もしくは可逆的である。

用語「免疫抑制活性」とは、免疫応答の低下を生じる細胞（例えば、活性化免疫応答細胞
）におけるシグナル伝達の誘発もしくはタンパク質発現の変化を意味する。免疫応答を抑
制もしくは低下させることが公知のポリペプチドとしては、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、
ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、もしくはＢＴＬ
Ａポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、それらの対応するリガ
ンドへの結合による）。最低でも、ｉＣＡＲシグナル伝達は、このような分子の細胞内部
分を使用し、機能的ｉＣＡＲを生成するために必要な場合、上記分子の膜貫通ドメインお
よび／もしくは細胞外ドメインの部分を含み得る。用語「免疫刺激活性」とは、免疫応答
の増大を生じる細胞（例えば、活性化免疫応答細胞）におけるシグナル伝達の誘発もしく
はタンパク質発現の変化を意味する。免疫刺激活性は、炎症促進活性を含み得る。それら
の結合によって免疫応答を刺激もしくは増大させることが公知のポリペプチドとしては、
ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびそれらの対応するリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７
−２、ＯＸ−４０Ｌ、および４−１ＢＢＬが挙げられる）が挙げられる。このようなポリ
ペプチドは、腫瘍微小環境に存在し、新生物細胞への免疫応答を活性化する。種々の実施
形態において、炎症促進性ポリペプチドおよび／もしくはそれらのリガンドを促進、刺激
もしくは作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）ことは、上記免疫応答細胞の免疫応答を増強する。

「ＣＤ３ζポリペプチド」とは、活性化活性もしくは刺激活性を有するＮＣＢＩＲｅｆ
ｅｒｅｎｃｅＮｏ：ＮＰ＿９３２１７０もしくはそのフラグメントと少なくとも８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性を有する
タンパク質を意味する。例示的ＣＤ３ζは、以下に提供される［配列番号１］。

「ＣＤ３ζ核酸分子」とは、ＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味
する。

「ＣＤ２８ポリペプチド」とは、刺激活性を有するＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＮｏ
：ＮＰ＿００６１３０もしくはそのフラグメントと少なくとも８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性を有するタンパク質を意味す
る。例示的ＣＤ２８は、以下に提供される［配列番号２］。

「ＣＤ２８核酸分子」とは、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味
する。

「１９−２８ｚ」とは、以下に提供される配列［配列番号３］と少なくとも８５％、９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性を有し、アミノ酸
１〜１８でリーダー配列を含み、ＣＤ１９に結合し得るタンパク質を意味する。

１９−２８ｚポリペプチド（リーダー配列を含む）をコードする例示的核酸配列は、以下
に提供される［配列番号４］。

本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドもしくはそのフラグメン
トをコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００
％同一である必要はないが、代表的には、実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実
質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、代表的には、２本鎖核酸分子のうちの少なく
とも一方の鎖とハイブリダイズし得る。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジ
ェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書で記載される遺伝子）
もしくはその一部の間で２本鎖分子を形成するように対になることを意味する（例えば、
Ｗａｈｌ、Ｇ．Ｍ．ａｎｄＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏ
ｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ、Ａ．Ｒ．（１９８７）
ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。

例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭのＮａＣｌおよび７５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム未満、好ましくは、約５００ｍＭＮａＣｌおよび５０ｍＭクエ
ン酸三ナトリウム未満、およびより好ましくは、約２５０ｍＭＮａＣｌおよび２５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、
有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の非存在下で得られ得る一方で、高ストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、およびより好ましく
は、少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得られ得る。ストリンジェントな温度
条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは、少なくとも約３７℃、および最も
好ましくは、少なくとも約４２℃の温度を含む。さらなるパラメーター（例えば、ハイブ
リダイゼーション時間、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃
度、およびキャリアＤＮＡを含めるか排除するか）を変化させることは、当業者に周知で
ある。ストリンジェンシーの種々のレベルは、必要に応じてこれら種々の条件を組み合わ
せることによって達成される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、
３０℃において、７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％
ＳＤＳ中で起こる。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、３７
℃において、５００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、
３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中
で起こる。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、４２℃において
、２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホ
ルムアミド、および２００μｇ／ｍｌｓｓＤＮＡ中で起こる。これら条件に関する有用
なバリエーションは、当業者に容易に明らかである。

大部分の適用に関しては、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程はまた、ストリンジェン
シーで変動する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、および温度によって
規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによ
って、もしくは温度を上昇させることによって、増大され得る。例えば、洗浄工程に関す
るストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭＮａＣｌおよび３ｍＭクエ
ン酸三ナトリウム未満、および最も好ましくは、約１５ｍＭＮａＣｌおよび１．５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程に関するストリンジェントな温度条件は、
通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは、少なくとも約４２℃、およびさらにより好
ましくは、少なくとも約６８℃の温度を含む。好ましい実施形態において、洗浄工程は、
２５℃において、３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％
ＳＤＳ中で起こる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、４２℃において、１
５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中で起
こる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、６８℃において、１５ｍＭＮａＣ
ｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中で起こる。これら条
件に関するさらなるバリエーションは、当業者に容易に明らかである。ハイブリダイゼー
ション技術は、当業者に周知であり、例えば、ＢｅｎｔｏｎａｎｄＤａｖｉｓ（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ１９６：１８０、１９７７）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎａｎｄＨｏｇｎ
ｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ７２：３９６１、
１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
、ＮｅｗＹｏｒｋ、２００１）；ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉ
ｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８７、
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ
ａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、
ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。

「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書で記載されるアミノ酸配列
のうちのいずれか１つ）もしくは核酸配列（例えば、本明細書で記載される核酸配列のう
ちのいずれか１つ）と少なくとも５０％同一性を示すポリペプチドもしくは核酸分子を意
味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸
レベルもしくは核酸レベルで、少なくとも６０％、より好ましくは、８０％もしくは８５
％、およびより好ましくは、９０％、９５％もしくはさらには９９％同一である。

配列同一性は、代表的には、配列分析ソフトウェア（例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａ
ｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃｓＣ
ｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕ
ｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、も
しくはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このよう
なソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失、および／もしくは他の改変に割り
当てることによって、同一もしくは類似の配列を適合させる。保存的置換は、代表的には
、以下の群内での置換を含む：グリシン、アルギニン；バリン、イソロイシン、ロイシン
；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リ
ジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定することへ
の例示的アプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムは、密接に関連した配列を示す、ｅ
^−３〜ｅ^−１００の間の確率スコアとともに使用され得る。

「アナログ」とは、参照ポリペプチドもしくは核酸分子の機能を有する構造的に関連した
ポリペプチドもしくは核酸分子を意味する。

用語「リガンド」とは、本明細書で使用される場合、レセプターに結合する分子をいう。
特に、上記リガンドは、別の細胞上のレセプターを結合し、細胞間認識および／もしくは
相互作用を可能にする。

用語「構成的発現」とは、本明細書で使用される場合、全ての生理学的条件下での発現を
いう。

「疾患」とは、細胞、組織、もしくは器官の正常な機能に損害を与えるかもしくは妨害す
る任意の状態もしくは障害を意味する。疾患の例としては、細胞の新生物形成もしくは病
原体感染が挙げられる。

「有効量」とは、治療効果を有するために十分な量を意味する。一実施形態において、「
有効量」とは、新生物形成の継続する増殖、成長、もしくは転移（例えば、新生物の浸潤
もしくは移動）を停止、改善もしくは阻害するために十分な量である。

「内因性」とは、細胞もしくは組織において通常発現される核酸分子もしくはポリペプチ
ドを意味する。

「寛容を強化する（ｅｎｆｏｒｃｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは、移植した器官も
しくは組織を標的とする自己反応細胞もしくは免疫応答細胞の活性を妨げることを意味す
る。

「外因性」とは、細胞中に内因的に存在しないか、または過剰発現される場合に得られる
機能的効果を達成するために十分なレベルで存在する、核酸分子もしくはポリペプチドを
意味する。用語「外因性」は、従って、細胞中で発現される任意の組換え核酸分子もしく
はポリペプチド（例えば、外来の、異種の、および過剰発現される核酸分子およびポリペ
プチド）を包含する。

「異種核酸分子もしくはポリペプチド」とは、細胞または細胞から得られるサンプル中に
通常は存在しない核酸分子（例えば、ａｃＤＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）またはポ
リペプチドを意味する。この核酸は、別の生物に由来し得るか、またはそれは、例えば、
細胞もしくはサンプル中で通常発現されないｍＲＮＡ分子であり得る。

「免疫応答細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、またはその先祖もしくは子孫を
意味する。

「増大する」とは、少なくとも５％程度正に変化することを意味する。変化は、５％、１
０％、２５％、３０％、５０％、７５％程度、もしくはさらには１００％程度であり得る
。

「単離された細胞」とは、細胞に天然に付随する分子成分および／もしくは細胞成分から
分離されている細胞を意味する。

用語「単離された」、「精製された」、もしくは「生物学的に純粋」とは、物質がその天
然の状態で見出されるように通常は上記物質に付随する成分から、種々の程度離れている
物質を意味する。「単離する」とは、元の供給源もしくは環境からのある程度の分離を示
す。「精製する」とは、単離より高度の分離の程度を示す。「精製された」もしくは「生
物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も、上記タンパク質の生物学的特性に本
質的に影響を及ぼさず、他の有害な結果を引き起こさないように、他の物質から十分に離
れている。すなわち、本発明の核酸もしくはペプチドは、これが、組換えＤＮＡ技術によ
って生成される場合には細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地を、または化学合成
される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されてい
る。純度および均質性は、代表的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動もしくは高速液体クラマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製され
た」とは、核酸もしくはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１本のバンドを生じるこ
とを示し得る。改変（例えば、リン酸化もしくはグリコシル化）に供され得るタンパク質
に関しては、種々の改変が、別個に精製され得る異なる単離されたタンパク質を生じ得る
。

用語「腫瘍抗原結合ドメイン」とは、本明細書で使用される場合、特定の抗原決定基もし
くは腫瘍に存在する抗原決定基のセットを特異的に結合し得るドメインをいう。

「薬剤を得る」におけるような用語「得る」とは、上記薬剤（または示された物質もしく
は材料）を購入するか、合成するか、または別の手段で獲得することを含むことが意図さ
れる。

「リンカー」とは、本明細書で使用される場合、２個以上のポリペプチドもしくは核酸を
、これらが互いに接続されるように共有結合する官能基（例えば、化学物質もしくはポリ
ペプチド）を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」と
は、２個のタンパク質を一緒に繋ぐ（例えば、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを繋ぐ）
ために使用される１個以上のアミノ酸をいう。本発明において使用される例示的なリンカ
ー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号１０］である。

「調節する」とは、正にもしくは負に変化させることを意味する。例示的な調節は、１％
、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、もしくは１００％の変化を含む。

「新生物形成」とは、細胞もしくは組織の病的な増殖およびその後の他の組織もしくは器
官への移動もしくは侵襲によって特徴付けられる疾患を意味する。新生物形成の成長は、
代表的には、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないかまたは正常細胞
の増殖の中止を引き起こす条件下で起こる。新生物形成は、種々の細胞タイプ、組織、も
しくは器官（膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、
肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、
精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群より選択
される器官、またはこれらの組織もしくは細胞タイプが挙げられるが、これらに限定され
ない）に影響し得る。新生物形成は、癌（例えば、肉腫、癌腫、もしくは形質細胞腫（形
質細胞の悪性腫瘍）)を含む。本発明が使用され得る例示的新生物としては、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、
急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血
病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白
血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレーム高ガ
ンマグロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例えば、線維
肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏ
ｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉ
ｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉
腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、
腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細
胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌
、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽
頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起神経腫、シュワン細胞腫、髄
膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫。

「作動可能に連結された」とは、本明細書で使用される場合、生体分子と関連する生物学
的機能、活性、および／もしくは構造が、少なくとも保持されるようにされている２種以
上の生体分子の連結を意味する。ポリペプチドに関して、上記用語は、２個以上のポリペ
プチドの連結が、各ポリペプチド成分のそれぞれの個々の活性のうちの少なくともいくつ
かを保持する融合ポリペプチドを生じることを意味する。上記２個以上のポリペプチドは
、直接もしくはリンカーを介して連結され得る。核酸に関して、上記用語は、第１のポリ
ヌクレオチドが、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が第２のポリヌ
クレオチドに結合される場合に、上記第１のポリヌクレオチドの転写を指向する上記第２
のポリヌクレオチドに隣接して配置されることを意味する。

「病原体」とは、疾患を引き起こし得るウイルス、細菌、真菌、寄生生物もしくは原生動
物を意味する。

例示的ウイルスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｒｅｔｒｏｖｉ
ｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、
ＬＡＶＥもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、もしくはＨＩＶ−ＩＩＩともいわれる））
；および他の分離株（例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば
、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、
ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き
起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆ
ｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；Ｃｏｒ
ｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例え
ば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボ
ラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス
、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉ
ｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、
ハンタンウイルス、ブニヤウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよび
ナイロウイルス）；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄ
ａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒ
ｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄ
ａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマ
ウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉ
ｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイ
ルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびｌｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例
えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、デルタ型肝
炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損性サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎
の因子（クラス１＝内部伝播（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）；クラ
ス２＝非経口伝播（すなわち、Ｃ型肝炎））；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス
、およびアストロウイルス。

例示的細菌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ
ｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種。感染性細
菌の具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｉｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｓｐｓ（例えば、Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ
、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓｇｒｏｕｐ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒ
ｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒ
ｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄ
ａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕ
ｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ
、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｌｉ。

「レセプター」とは、１種以上のリガンドを選択的に結合する細胞膜に存在するポリペプ
チドもしくはその部分を意味する。

「低下、減少」とは、少なくとも５％程度負に変化させることを意味する。変化は、５％
、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％程度、もしくはさらには１００％程度であり
得る。

「認識する」とは、標的を選択的に結合することを意味する。ウイルスを認識するＴ細胞
は、代表的には、ウイルスによって発現される抗原と結合するレセプターを発現する。

「参照」もしくは「コントロール」とは、比較標準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｉ
ＣＡＲを発現する細胞の免疫応答は、ＣＡＲのみを発現する対応する細胞の免疫応答と比
較され得る。

本明細書で使用される場合、用語「単鎖可変フラグメント」もしくは「ｓｃＦｖ」とは、
ＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを形成するために共有結合される免疫グロブリンの重鎖（Ｖ
Ｈ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（
ＶＬ）は、直接結合されるか、またはペプチドコードリンカー（例えば、１０個、１５個
、２０個、２５個のアミノ酸）によって結合されるかのいずれかであり、ＶＨのＮ末端と
ＶＬのＣ末端とが、またはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とが繋がれる。上記リンカーは、
通常、可撓性のためにグリシンが、ならびに溶解度のためにセリンもしくはスレオニンが
豊富である。定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質
は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏ
ｎ、ｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５
８７９−５８８３、１９８８）によって記載されるように、ＶＨコード配列およびＶＬコ
ード配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３
２，４０５号および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９
６７５４号および同第２００５０１９６７５４号もまた参照のこと。

「分泌（された）」とは、小胞体、ゴルジ装置を通る分泌経路を介して、および細胞形質
膜に一時的に融合する小胞として細胞から放出され、細胞の外にタンパク質を放出される
ポリペプチドを意味する。

「シグナル配列」もしくは「リーダー配列」とは、分泌経路に入るように指向する、新た
に合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（５個、１０個、１５個、２０
個、２５個、３０個のアミノ酸長）を意味する。

「可溶性」とは、水性環境（例えば、膜結合されていない）に自由に拡散できるポリペプ
チドを意味する。

「特異的に結合する」とは、目的の生物学的分子（例えば、ポリペプチド）を認識および
結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含むサンプル（例えば、生物学的サンプル）
中の他の分子を実質的に認識および結合しないポリペプチドもしくはそのフラグメントを
意味する。

用語「腫瘍抗原」とは、本明細書で使用される場合、正常もしくは非新生物細胞と比較し
て、腫瘍細胞で特有にもしくは差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド、糖タン
パク質、もしくは糖脂質）をいう。本発明に関して、腫瘍抗原は、抗原認識レセプターに
よって認識され得る（例えば、ＣＤ１９、Ｍｕｃ−１）か、またはレセプター−リガンド
結合を介して免疫応答を抑制し得る（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２、８７．１１
２）、腫瘍によって発現される任意のポリペプチドを含む。

「組織抗原」とは、腫瘍細胞と比較して、正常もしくは非新生物の細胞もしくは組織で特
有にもしくは差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチドもしくは糖タンパク質もし
くは糖脂質）を意味する。

「ウイルス抗原」とは、免疫応答を誘発し得る、ウイルスによって発現されるポリペプチ
ドを意味する。

用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む、包含する）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含
する）」は、米国特許法でそれらに与えられた広い意味を有すると解釈され、「ｉｎｃｌ
ｕｄｅｓ（含む、包含する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む、包含する）」などを意味
し得る。

本明細書で使用される場合、「処置」とは、処置されている個体もしくは細胞の疾患過程
を変化させようとの試みにおける臨床介入をいい、予防のために、または臨床病理の過程
の間のいずれかに行われ得る。処置の治療効果としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：疾患の発生もしくは再発の防止、症状の緩和、上記疾患の任意の直接的も
しくは間接的な病的転帰の減少、転移の防止、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善も
しくは軽減、ならびに緩解もしくは予後の改善。疾患もしくは障害の進行を防止すること
によって、処置は、罹患した被験体もしくは診断された被験体、または障害を有すると疑
われる被験体の上記障害に起因する悪化を防止し得るが、同様に、処置は、上記障害のリ
スクがあるか、もしくは上記障害を有すると疑われている被験体における上記障害の始ま
りまたは上記障害の症状を防止し得る。

用語「被験体」とは、本明細書で使用される場合、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、よ
り好ましくは、ヒトをいう。

用語「免疫システムが損なわれている」とは、本明細書で使用される場合、免疫不全を有
する被験体をいう。上記被験体は、日和見感染、健康な免疫系を有する個体では疾患を通
常引き起こさないが、十分に機能しないかもしくは抑制された免疫系を有する人々には影
響を及ぼし得る生物によって引き起こされる感染症に対して非常に攻撃されやすい。

本発明の他の局面は、以下の開示に記載され、本発明の範囲内にある。

以下の詳細な説明は、例示によって与えられるが、本発明を記載される具体的実施形態に
限定するとは意図されず、添付の図面に関連して記載され得る。

図１Ａ〜１Ｄは、ｉＣＡＲストラテジー、設計および初代ヒトＴ細胞における発現を表す。（Ａ）腫瘍およびオフターゲット組織の両方に対して特異性を有するＴ細胞は、オフターゲット組織を保護するために、上記Ｔ細胞に導入される抗原特異的ｉＣＡＲを使用することによって、腫瘍のみに制限され得る。（Ｂ）ｉＣＡＲおよびＰｄｅｌのために使用されるバイシストロンベクターの模式図。ｉＣＡＲ−Ｐ：各阻害レセプターのスペーサー、膜貫通、および細胞内テールを、ＣＤ８リーダー配列（ＬＳ）を有する以前に記載されたレトロウイルスベクターにクローニングした。ＩＲＥＳ、内部リボソーム侵入部位；ｈｒＧＦＰ、ヒト化Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質レセプター。Ｐｄｅｌコントロールベクターを、スペーサーおよびＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメインで、および細胞内テールを欠如させて設計した。（Ｃ）上記ｉＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって、形質導入した初代ヒトＴ細胞において評価した。ドットプロットは、８種の異なるドナーの代表である。ＧＡＭ、上記ＣＡＲのマウス由来細胞外ドメインに結合する、ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧＦ（ａｂ’）２抗体。（Ｄ）形質導入した初代ヒトＴ細胞においてヤギ抗マウス（ＧＡＭ）染色を使用する上記ｉＣＡＲの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。図１Ａ〜１Ｄは、ｉＣＡＲストラテジー、設計および初代ヒトＴ細胞における発現を表す。（Ａ）腫瘍およびオフターゲット組織の両方に対して特異性を有するＴ細胞は、オフターゲット組織を保護するために、上記Ｔ細胞に導入される抗原特異的ｉＣＡＲを使用することによって、腫瘍のみに制限され得る。（Ｂ）ｉＣＡＲおよびＰｄｅｌのために使用されるバイシストロンベクターの模式図。ｉＣＡＲ−Ｐ：各阻害レセプターのスペーサー、膜貫通、および細胞内テールを、ＣＤ８リーダー配列（ＬＳ）を有する以前に記載されたレトロウイルスベクターにクローニングした。ＩＲＥＳ、内部リボソーム侵入部位；ｈｒＧＦＰ、ヒト化Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質レセプター。Ｐｄｅｌコントロールベクターを、スペーサーおよびＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメインで、および細胞内テールを欠如させて設計した。（Ｃ）上記ｉＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって、形質導入した初代ヒトＴ細胞において評価した。ドットプロットは、８種の異なるドナーの代表である。ＧＡＭ、上記ＣＡＲのマウス由来細胞外ドメインに結合する、ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧＦ（ａｂ’）２抗体。（Ｄ）形質導入した初代ヒトＴ細胞においてヤギ抗マウス（ＧＡＭ）染色を使用する上記ｉＣＡＲの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。図１Ａ〜１Ｄは、ｉＣＡＲストラテジー、設計および初代ヒトＴ細胞における発現を表す。（Ａ）腫瘍およびオフターゲット組織の両方に対して特異性を有するＴ細胞は、オフターゲット組織を保護するために、上記Ｔ細胞に導入される抗原特異的ｉＣＡＲを使用することによって、腫瘍のみに制限され得る。（Ｂ）ｉＣＡＲおよびＰｄｅｌのために使用されるバイシストロンベクターの模式図。ｉＣＡＲ−Ｐ：各阻害レセプターのスペーサー、膜貫通、および細胞内テールを、ＣＤ８リーダー配列（ＬＳ）を有する以前に記載されたレトロウイルスベクターにクローニングした。ＩＲＥＳ、内部リボソーム侵入部位；ｈｒＧＦＰ、ヒト化Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質レセプター。Ｐｄｅｌコントロールベクターを、スペーサーおよびＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメインで、および細胞内テールを欠如させて設計した。（Ｃ）上記ｉＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって、形質導入した初代ヒトＴ細胞において評価した。ドットプロットは、８種の異なるドナーの代表である。ＧＡＭ、上記ＣＡＲのマウス由来細胞外ドメインに結合する、ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧＦ（ａｂ’）２抗体。（Ｄ）形質導入した初代ヒトＴ細胞においてヤギ抗マウス（ＧＡＭ）染色を使用する上記ｉＣＡＲの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。

図２Ａ〜２Ｆは、ｉＣＡＲが、ＴＣＲ媒介性同種異系反応からｉＰＳ−ｆｉｂを保護したことを示す。同種異系ｍｏＤＣで刺激した、コントロールＰｄｅｌ形質導入もしくはｉＣＡＲ形質導入したＴ細胞を、ある範囲のＥ／Ｔ比を使用して、ｍｏＤＣに同系のコメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬ）を発現するｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ）とともにインキュベートした。（Ａ）標的ｉＰＳ−ｆｉｂに対して反応するＰｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞（ｎ＝３／条件）。上記ｉＰＳ−ｆｉｂの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した。（Ｂ）４：１Ｅ／Ｔ比での（Ａ）からの細胞培養上清中のサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＦＮ−γ、インターフェロン−ｇ；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−ａ。（Ｃ）Ｐｄｅｌ陽性もしくはｉＣＡＲ陽性のＴ細胞を、２４時間、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともにインキュベートし、ルシフェラーゼシグナル（左）を、定量した（右）（ｎ＝３／各条件）。（Ｄ〜Ｆ）（Ｃ）からの細胞培養上清中で、２４時間で測定したサイトカイン分泌。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲとＰｄｅｌとを比較する分散分析（ＡＮＯＶＡ）、およびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｔｅｓｔｓ）での事後分析によって、^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図１９Ａ〜１９Ｅに提供する。図２Ａ〜２Ｆは、ｉＣＡＲが、ＴＣＲ媒介性同種異系反応からｉＰＳ−ｆｉｂを保護したことを示す。同種異系ｍｏＤＣで刺激した、コントロールＰｄｅｌ形質導入もしくはｉＣＡＲ形質導入したＴ細胞を、ある範囲のＥ／Ｔ比を使用して、ｍｏＤＣに同系のコメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬ）を発現するｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ）とともにインキュベートした。（Ａ）標的ｉＰＳ−ｆｉｂに対して反応するＰｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞（ｎ＝３／条件）。上記ｉＰＳ−ｆｉｂの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した。（Ｂ）４：１Ｅ／Ｔ比での（Ａ）からの細胞培養上清中のサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＦＮ−γ、インターフェロン−ｇ；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−ａ。（Ｃ）Ｐｄｅｌ陽性もしくはｉＣＡＲ陽性のＴ細胞を、２４時間、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともにインキュベートし、ルシフェラーゼシグナル（左）を、定量した（右）（ｎ＝３／各条件）。（Ｄ〜Ｆ）（Ｃ）からの細胞培養上清中で、２４時間で測定したサイトカイン分泌。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲとＰｄｅｌとを比較する分散分析（ＡＮＯＶＡ）、およびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｔｅｓｔｓ）での事後分析によって、^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図１９Ａ〜１９Ｅに提供する。図２Ａ〜２Ｆは、ｉＣＡＲが、ＴＣＲ媒介性同種異系反応からｉＰＳ−ｆｉｂを保護したことを示す。同種異系ｍｏＤＣで刺激した、コントロールＰｄｅｌ形質導入もしくはｉＣＡＲ形質導入したＴ細胞を、ある範囲のＥ／Ｔ比を使用して、ｍｏＤＣに同系のコメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬ）を発現するｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ）とともにインキュベートした。（Ａ）標的ｉＰＳ−ｆｉｂに対して反応するＰｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞（ｎ＝３／条件）。上記ｉＰＳ−ｆｉｂの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した。（Ｂ）４：１Ｅ／Ｔ比での（Ａ）からの細胞培養上清中のサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＦＮ−γ、インターフェロン−ｇ；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−ａ。（Ｃ）Ｐｄｅｌ陽性もしくはｉＣＡＲ陽性のＴ細胞を、２４時間、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともにインキュベートし、ルシフェラーゼシグナル（左）を、定量した（右）（ｎ＝３／各条件）。（Ｄ〜Ｆ）（Ｃ）からの細胞培養上清中で、２４時間で測定したサイトカイン分泌。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲとＰｄｅｌとを比較する分散分析（ＡＮＯＶＡ）、およびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｔｅｓｔｓ）での事後分析によって、^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図１９Ａ〜１９Ｅに提供する。

図３Ａ〜３Ｄは、ｉＣＡＲが化学量論的様式で機能したことを示す。（Ａ）Ｐｄｅｌ形質導入したかもしくはＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞を、図１３Ａに示されるように、各それぞれのレセプターの高発現もしくは低発現についてソートし、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ発現ＣＢＬに播種した。未処理細胞と比較したｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で評価した（各条件につきｎ＝３）。（Ｂ）４：１Ｅ／Ｔ比率で（Ａ）からの細胞培養上清中で２４時間で測定したサイトカイン分泌，。（Ｃ）ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞を、図１３Ｂに示されるようにＰＳＭＡ発現の高レベルもしくは低レベルについてソートしたｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡとともにインキュベートした。未処理細胞と比較した各集団の死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した（ｎ＝３／条件）。Ｄ）（Ｃ）からのサイトカインを、２４時間で評価した。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定による^＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。高Ｐｄｅｌ群に対して比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析による^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図２０Ａおよび図２０Ｂに提供する。図３Ａ〜３Ｄは、ｉＣＡＲが化学量論的様式で機能したことを示す。（Ａ）Ｐｄｅｌ形質導入したかもしくはＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞を、図１３Ａに示されるように、各それぞれのレセプターの高発現もしくは低発現についてソートし、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ発現ＣＢＬに播種した。未処理細胞と比較したｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で評価した（各条件につきｎ＝３）。（Ｂ）４：１Ｅ／Ｔ比率で（Ａ）からの細胞培養上清中で２４時間で測定したサイトカイン分泌。（Ｃ）ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞を、図１３Ｂに示されるようにＰＳＭＡ発現の高レベルもしくは低レベルについてソートしたｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡとともにインキュベートした。未処理細胞と比較した各集団の死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した（ｎ＝３／条件）。Ｄ）（Ｃ）からのサイトカインを、２４時間で評価した。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定による^＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。高Ｐｄｅｌ群に対して比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析による^＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図２０Ａおよび図２０Ｂに提供する。

図４Ａおよび図４Ｂは、ｉＣＡＲがインビボで同種異系応答を制限したことを示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスに、ＣＢＬ／ＰＳＭＡを発現する１×１０^６ｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）を腹腔内注射し、７日後、５×１０^５ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入もしくはＰｄｅｌ形質導入し、ソートしたアロ反応性Ｔ細胞を腹腔内に処置した。未処置マウス（Ｔ細胞なし）をコントロールとして使用した。（Ａ）ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡの生存を、Ｔ細胞注入の前および後の選択された時点でＢＬＩによって評価した。各群の４匹の代表的マウスの画像を示す。（Ｂ）各マウスの全ボディーフラックス（Ｔｏｔａｌｂｏｄｙｆｌｕｘ）（光子／秒）を、定量し、１群あたりで平均した（ｎ＝５／群）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。Ｐｄｅｌと比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析によって、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。生データおよびＰ値を、図２１Ａおよび図２１Ｂに提供する。

図５Ａ〜５Ｆは、ｉＣＡＲがヒトＴ細胞サイトカイン放出、増殖、および１９−２８ｚＣＡＲによって駆動される標的細胞排除を阻害したことを示す。（Ａ）二重ソートした１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ形質転換したかもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ形質転換したヒトＴ細胞を、３Ｔ３−ＣＤ１９（標的）もしくは３Ｔ３−ＣＤ１９−ＰＳＭＡ（オフターゲット）ＡＡＰＣに播種した２４時間後の培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データを、オフターゲット値／ターゲット値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（ｎ＝６ウェル／条件）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲをＰｄｅｌと比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析によって、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の絶対数。外因性のサイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｃ）標的ＡＡＰＣに関する増殖と比較する、０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の増殖。外因性サイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｄ）Ｔ細胞を、１：１比で標的およびオフターゲットｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＡＡＰＣに播種した。５回の独立した実験のうちの１回からの３８時間および５日の画像を示す。スケールバー、０．５ｍｍ。（ＥおよびＦ）材料および方法に記載されるように、ｍＣＤ１９標的（Ｅ）もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞（Ｆ）に対する（Ｄ）からのＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図２２Ａ〜図２２Ｃに提供する。図５Ａ〜５Ｆは、ｉＣＡＲがヒトＴ細胞サイトカイン放出、増殖、および１９−２８ｚＣＡＲによって駆動される標的細胞排除を阻害したことを示す。（Ａ）二重ソートした１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ形質転換したかもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ形質転換したヒトＴ細胞を、３Ｔ３−ＣＤ１９（標的）もしくは３Ｔ３−ＣＤ１９−ＰＳＭＡ（オフターゲット）ＡＡＰＣに播種した２４時間後の培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データを、オフターゲット値／ターゲット値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（ｎ＝６ウェル／条件）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲをＰｄｅｌと比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析によって、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の絶対数。外因性のサイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｃ）標的ＡＡＰＣに関する増殖と比較する、０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の増殖。外因性サイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｄ）Ｔ細胞を、１：１比で標的およびオフターゲットｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＡＡＰＣに播種した。５回の独立した実験のうちの１回からの３８時間および５日の画像を示す。スケールバー、０．５ｍｍ。（ＥおよびＦ）材料および方法に記載されるように、ｍＣＤ１９標的（Ｅ）もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞（Ｆ）に対する（Ｄ）からのＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図２２Ａ〜図２２Ｃに提供する。図５Ａ〜５Ｆは、ｉＣＡＲがヒトＴ細胞サイトカイン放出、増殖、および１９−２８ｚＣＡＲによって駆動される標的細胞排除を阻害したことを示す。（Ａ）二重ソートした１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ形質転換したかもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ形質転換したヒトＴ細胞を、３Ｔ３−ＣＤ１９（標的）もしくは３Ｔ３−ＣＤ１９−ＰＳＭＡ（オフターゲット）ＡＡＰＣに播種した２４時間後の培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データを、オフターゲット値／ターゲット値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（ｎ＝６ウェル／条件）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。ｉＣＡＲをＰｄｅｌと比較するＡＮＯＶＡおよびＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定での事後分析によって、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の絶対数。外因性のサイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｃ）標的ＡＡＰＣに関する増殖と比較する、０日目および７日目にオフターゲットＡＡＰＣで刺激した１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の増殖。外因性サイトカインは添加しなかった。データは、６回の独立した実験の代表である。（Ｄ）Ｔ細胞を、１：１比で標的およびオフターゲットｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＡＡＰＣに播種した。５回の独立した実験のうちの１回からの３８時間および５日の画像を示す。スケールバー、０．５ｍｍ。（ＥおよびＦ）材料および方法に記載されるように、ｍＣＤ１９標的（Ｅ）もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞（Ｆ）に対する（Ｄ）からのＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。生データおよびＰ値を、図２２Ａ〜図２２Ｃに提供する。

図６Ａ〜６Ｆは、ｉＣＡＲが１９−２８ｚＣＡＲ標的細胞特異性をインビボで制限したことを示す。（Ａ）ソートした１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスにおけるＮＡＬＭ／６もしくはＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡの腫瘍進行を示すＢＬＩ。未処置マウス（Ｔ細胞なし）をコントロールとして使用した。（Ｂ）各マウスの腫瘍量を定量し、平均総フラックス／群を示す。（Ｃ）２１日目に屠殺した（Ａ）のマウスの脾臓重量。各ドットは、１匹のレシピエントマウスを表す。（Ｄ）腫瘍細胞（ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋）およびＴ細胞（ＣＤ１９−１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）の存在に関する（Ｃ）の大腿骨髄のフローサイトメトリー分析。１９−２８ｚ発現を、ＬＮＧＦＲレセプター（その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が１９−２８ｚに連結され、検出マーカーとして使用される）を染色することによって評価した。（ＥおよびＦ）（Ｃ）の脾臓中の腫瘍細胞の絶対数（Ｅ）およびＣＤ１９−１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数（Ｆ）を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズでのフローサイトメトリーによって定量した（ｎ＝４）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図６Ａ〜６Ｆは、ｉＣＡＲが１９−２８ｚＣＡＲ標的細胞特異性をインビボで制限したことを示す。（Ａ）ソートした１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスにおけるＮＡＬＭ／６もしくはＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡの腫瘍進行を示すＢＬＩ。未処置マウス（Ｔ細胞なし）をコントロールとして使用した。（Ｂ）各マウスの腫瘍量を定量し、平均総フラックス／群を示す。（Ｃ）２１日目に屠殺した（Ａ）のマウスの脾臓重量。各ドットは、１匹のレシピエントマウスを表す。（Ｄ）腫瘍細胞（ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋）およびＴ細胞（ＣＤ１９−１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）の存在に関する（Ｃ）の大腿骨髄のフローサイトメトリー分析。１９−２８ｚ発現を、ＬＮＧＦＲレセプター（その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が１９−２８ｚに連結され、検出マーカーとして使用される）を染色することによって評価した。（ＥおよびＦ）（Ｃ）の脾臓中の腫瘍細胞の絶対数（Ｅ）およびＣＤ１９⁻１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数（Ｆ）を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズでのフローサイトメトリーによって定量した（ｎ＝４）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図６Ａ〜６Ｆは、ｉＣＡＲが１９−２８ｚＣＡＲ標的細胞特異性をインビボで制限したことを示す。（Ａ）ソートした１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスにおけるＮＡＬＭ／６もしくはＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡの腫瘍進行を示すＢＬＩ。未処置マウス（Ｔ細胞なし）をコントロールとして使用した。（Ｂ）各マウスの腫瘍量を定量し、平均総フラックス／群を示す。（Ｃ）２１日目に屠殺した（Ａ）のマウスの脾臓重量。各ドットは、１匹のレシピエントマウスを表す。（Ｄ）腫瘍細胞（ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋）およびＴ細胞（ＣＤ１９−１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）の存在に関する（Ｃ）の大腿骨髄のフローサイトメトリー分析。１９−２８ｚ発現を、ＬＮＧＦＲレセプター（その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が１９−２８ｚに連結され、検出マーカーとして使用される）を染色することによって評価した。（ＥおよびＦ）（Ｃ）の脾臓中の腫瘍細胞の絶対数（Ｅ）およびＣＤ１９⁻１９−２８ｚ／ＧＦＰ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対数（Ｆ）を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズでのフローサイトメトリーによって定量した（ｎ＝４）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

図７Ａ〜７Ｄは、ｉＣＡＲ機能が一時的かつ可逆的であったことを示す。（Ａ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（Ｔ）もしくはオフターゲット（Ｏ）ＡＡＰＣとともに最初の刺激の間インキュベートする。３日後もしくは７日後、各群の細胞を、いずれかの標的［Ｔ→Ｔ（１）もしくはＯ→Ｔ（２）］またはオフターゲット［Ｔ→Ｏ（３）もしくはＯ→Ｏ（４）］ＡＡＰＣで、その後のＴ細胞機能に対する第１の刺激の効果を分析するために、三目並べ様式（ｃｒｉｓｓｃｒｏｓｓｍａｎｎｅｒ）で再刺激した。（Ｂ）各Ｔ細胞群（第２の刺激）でのインキュベーション後２４時間における標的（Ｔ）もしくはオフターゲット（Ｏ）ＡＡＰＣの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で分析した（各条件につきｎ＝３）。（Ｃ）（Ｂ）からの細胞培養上清中のエフェクターサイトカインの分泌を、第２の刺激の２４時間後に分析した。インターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−ｇ）を、代表的結果として示す（各条件につきｎ＝３）。（Ｄ）第２の刺激後７日目でのＴ細胞増殖（各条件につきｎ＝３）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。統計比較を、各条件内で行った（すなわち、Ｔ→ＴＰｄｅｌ対ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ）。スチューデントｔ検定によって^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図７Ａ〜７Ｄは、ｉＣＡＲ機能が一時的かつ可逆的であったことを示す。（Ａ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（Ｔ）もしくはオフターゲット（Ｏ）ＡＡＰＣとともに最初の刺激の間インキュベートする。３日後もしくは７日後、各群の細胞を、いずれかの標的［Ｔ→Ｔ（１）もしくはＯ→Ｔ（２）］またはオフターゲット［Ｔ→Ｏ（３）もしくはＯ→Ｏ（４）］ＡＡＰＣで、その後のＴ細胞機能に対する第１の刺激の効果を分析するために、三目並べ様式（ｃｒｉｓｓｃｒｏｓｓｍａｎｎｅｒ）で再刺激した。（Ｂ）各Ｔ細胞群（第２の刺激）でのインキュベーション後２４時間における標的（Ｔ）もしくはオフターゲット（Ｏ）ＡＡＰＣの死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で分析した（各条件につきｎ＝３）。（Ｃ）（Ｂ）からの細胞培養上清中のエフェクターサイトカインの分泌を、第２の刺激の２４時間後に分析した。インターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−ｇ）を、代表的結果として示す（各条件につきｎ＝３）。（Ｄ）第２の刺激後７日目でのＴ細胞増殖（各条件につきｎ＝３）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。統計比較を、各条件内で行った（すなわち、Ｔ→ＴＰｄｅｌ対ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ）。スチューデントｔ検定によって^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

図８Ａ〜８Ｅは、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＡＲ発現Ｔ細胞が、インビトロおよびインビボで標的を識別したことを示す。（Ａ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋，緑）およびオフターゲット（ＣＤ１９^＋ＰＳＭＡ^＋ｍＣｈｅｒｒｙ^＋，赤）ＡＡＰＣの１：１ミックスとともにインキュベートし、微速度顕微鏡検査法（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、各集団のリアルタイム死滅を３８時間にわたって可視化した。代表的画像を示し、ノーカット動画（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｍｏｖｉｅｓ）を作製した。スケールバーは０．１ｍｍ。（Ｂ）（Ａ）のように、１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（ＣＤ１９＋）およびオフターゲット（ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋）ＡＡＰＣの１：１ミックスとインキュベートした。各ＡＡＰＣ集団の死滅を、各ＡＡＰＣタイプのうちの１つをＣＢＬ（ＣＤ１９＋ＣＢＬ＋／ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋ミックスもしくはＣＤ１９＋／ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋ＣＢＬ＋ミックス）で標識する並行実験において評価した。死滅を、３８時間でＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した（各条件につきｎ＝３）。（Ｃ〜Ｅ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスに、ＮＡＬＭ／６細胞およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ細胞の１：１混合物を注射し、１９−２８ｚもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置した。（Ｃ）屠殺の際に、骨髄の中の標的およびオフターゲットＮＡＬＭ／６細胞の存在を、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｄ）屠殺したマウスの骨髄の中の標的／オフターゲットＮＡＬＭ／６細胞の比を、フローサイトメトリーによって定量した。（Ｅ）処置したマウスの脾臓重量もまた、屠殺時に記録した。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図８Ａ〜８Ｅは、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＡＲ発現Ｔ細胞が、インビトロおよびインビボで標的を識別したことを示す。（Ａ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（ＣＤ１９^＋ＧＦＰ^＋，緑）およびオフターゲット（ＣＤ１９^＋ＰＳＭＡ^＋ｍＣｈｅｒｒｙ^＋，赤）ＡＡＰＣの１：１ミックスとともにインキュベートし、微速度顕微鏡検査法（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、各集団のリアルタイム死滅を３８時間にわたって可視化した。代表的画像を示し、ノーカット動画（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｍｏｖｉｅｓ）を作製した。スケールバーは０．１ｍｍ。（Ｂ）（Ａ）のように、１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞を、標的（ＣＤ１９＋）およびオフターゲット（ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋）ＡＡＰＣの１：１ミックスとインキュベートした。各ＡＡＰＣ集団の死滅を、各ＡＡＰＣタイプのうちの１つをＣＢＬ（ＣＤ１９＋ＣＢＬ＋／ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋ミックスもしくはＣＤ１９＋／ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ＋ＣＢＬ＋ミックス）で標識する並行実験において評価した。死滅を、３８時間でＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系で定量した（各条件につきｎ＝３）。（Ｃ〜Ｅ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスに、ＮＡＬＭ／６細胞およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ細胞の１：１混合物を注射し、１９−２８ｚもしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置した。（Ｃ）屠殺の際に、骨髄の中の標的およびオフターゲットＮＡＬＭ／６細胞の存在を、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｄ）屠殺したマウスの骨髄の中の標的／オフターゲットＮＡＬＭ／６細胞の比を、フローサイトメトリーによって定量した。（Ｅ）処置したマウスの脾臓重量もまた、屠殺時に記録した。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。スチューデントｔ検定によって^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

図９Ａ〜Ｃは、ＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ細胞表面発現がＴ細胞活性化の後に増大したことを示す。（Ａ）形質転換した初代ヒトＴ細胞でのＣＴＬＡ４ｉＣＡＲ−Ｐの細胞表面および細胞内発現。（Ｂ）形質導入していない（２）およびＣＴＬＡ４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入した（１）初代ヒトＴ細胞でのＣＴＬＡ４の細胞内ドメインに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析。マウスＥＬ４細胞（３）を、陰性コントロールとして供した。（Ｃ）１９−２８ｚ／ＣＴＬＡ４ｉＣＡＲＴ細胞を、３Ｔ３−１９ＡＡＰＣを使用して活性化し、活性化の７時間後および３０時間後での細胞表面ＣＴＬＡ４ｉＣＡＲ発現を分析した（ｎ＝３）。

図１０は、ｉＣＡＲ−ＰがＰＳＭＡ発現細胞に結合したことを示す。ＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞（親油性ＤｉＤ色素で標識した）を、細胞結合体化アッセイ（ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ）においてｉＣＡＲ／ＧＦＰ発現Ｔ細胞とともにインキュベートした。結合体を、ＤｉＤ／ＧＦＰ二重陽性事象としてフローサイトメトリーによって検出した。

図１１Ａ〜１１Ｄは、ｉＰＳ由来線維芽細胞および同遺伝子型ｍｏＤＣを使用する同種異系反応性モデルを表す。（Ａ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、ドナー１ＰＢＭＣから生成し、これを使用して線維芽細胞を得た。ドナー１ＰＢＭＣもまた使用して、ｍｏＤＣを得、これに、線維芽細胞溶解物を適用したところ、第２のドナーのＰＢＭＣからの同種異系反応を刺激できた。（Ｂ）培養物中で増殖させた奇形腫由来ｉＰＳ線維芽細胞の形態を示す顕微鏡写真。（Ｃ）多能性マーカーの発現を欠いているｉＰＳ−ｆｉｂは、線維芽細胞形態を示し、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−ｂ２、およびＣＤ１０を含むいくつかの線維芽細胞表面マーカーについて陽性染色であった。（ＲＥＤ＝アイソタイプコントロール；ＢＬＵＥおよびＧＲＥＥＮは、２つの独立した単離された系統である）（Ｄ）ｉＰＳ−ｆｉｂは、ＨＬＡクラスＩに対しては基本的に陽性染色されるが、クラスＩＩに対しては染色されず、組換えＩＮＦγ処置の際に両方の発現を休息にアップレギュレートした。図１１Ａ〜１１Ｄは、ｉＰＳ由来線維芽細胞および同遺伝子型ｍｏＤＣを使用する同種異系反応性モデルを表す。（Ａ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、ドナー１ＰＢＭＣから生成し、これを使用して線維芽細胞を得た。ドナー１ＰＢＭＣもまた使用して、ｍｏＤＣを得、これに、線維芽細胞溶解物を適用したところ、第２のドナーのＰＢＭＣからの同種異系反応を刺激できた。（Ｂ）培養物中で増殖させた奇形腫由来ｉＰＳ線維芽細胞の形態を示す顕微鏡写真。（Ｃ）多能性マーカーの発現を欠いているｉＰＳ−ｆｉｂは、線維芽細胞形態を示し、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−ｂ２、およびＣＤ１０を含むいくつかの線維芽細胞表面マーカーについて陽性染色であった。（ＲＥＤ＝アイソタイプコントロール；ＢＬＵＥおよびＧＲＥＥＮは、２つの独立した単離された系統である）（Ｄ）ｉＰＳ−ｆｉｂは、ＨＬＡクラスＩに対しては基本的に陽性染色されるが、クラスＩＩに対しては染色されず、組換えＩＮＦγ処置の際に両方の発現を休息にアップレギュレートした。

図１２Ａ〜１２Ｃは、同種異系ｉＰＳ由来線維芽細胞に対するｉＣＡＲ形質導入初代ヒトＴ細胞の強力な反応性を示す。（Ａ）一方のドナーに由来するｉＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、異なるドナーのｉＰＳ−ｆｉｂ溶解物を添加したｍｏＤＣで刺激し、６日後に、活性化マーカーＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲに対して染色した。（Ｂ）２回刺激したｉＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ｌｕｃとともに１８時間インキュベートし、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して死滅を定量した（各条件につきｎ＝３）。（Ｃ）サイトカインを、４：１Ｅ：Ｔ比で（Ｂ）の細胞培養上清中、１８時間で測定した。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。統計比較を、各条件内で行った（すなわち、Ｔ_１Ｔ）。スチューデントｔ検定によって^＊＊＊ｐ＜０．００１。

図１３Ａおよび１３Ｂは、ｉＣＡＲもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の形質導入およびソートストラテジーを表す。（Ａ）ＰＤ１−ｉＣＡＲ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞もしくはＰｄｅｌ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現レベルに基づいて、導入遺伝子発現に関してソートした。各ドナーは、別個の実験を表す。ソート後分析を行った、純度を検証した。（Ｂ）１９−２８ｚ（ＬＮＧＦＲ）／ｉＣＡＲ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞もしくは１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現およびＬＮＧＦＲレベルに基づいて、導入遺伝子発現に関してソートした。各ドナーは、別個の実験を表す。ソート後分析を行って、純度およびｉＣＡＲ発現を検証した。図１３Ａおよび１３Ｂは、ｉＣＡＲもしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞の形質導入およびソートストラテジーを表す。（Ａ）ＰＤ１−ｉＣＡＲ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞もしくはＰｄｅｌ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現レベルに基づいて、導入遺伝子発現に関してソートした。各ドナーは、別個の実験を表す。ソート後分析を行った、純度を検証した。（Ｂ）１９−２８ｚ（ＬＮＧＦＲ）／ｉＣＡＲ（ＧＦＰ）形質導入Ｔ細胞もしくは１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現およびＬＮＧＦＲレベルに基づいて、導入遺伝子発現に関してソートした。各ドナーは、別個の実験を表す。ソート後分析を行って、純度およびｉＣＡＲ発現を検証した。

図１４Ａおよび１４Ｂは、低／高ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＰＳＭＡ発現ｉＰＳ線維芽細胞のソートストラテジーを表す。（Ａ）ＰＤ１−ｉＣＡＲ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞もしくはＰｄｅｌ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現レベルに基づいて、低いもしくは高い導入遺伝子発現に関してソートした。（Ｂ）ｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ）を、ＰＳＭＡを発現するように形質導入し、抗ＰＳＭＡ抗体を使用してソートした（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡソートバルク＋）。これら細胞を、図２および図４における実験に使用した。第２の別個のソートを、抗ＰＳＭＡ抗体を使用して低いもしくは高い表面ＰＳＭＡ発現ｉＰＳ−ｆｉｂを精製するために使用し、これら細胞を、図３における実験に使用した。図１４Ａおよび１４Ｂは、低／高ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＰＳＭＡ発現ｉＰＳ線維芽細胞のソートストラテジーを表す。（Ａ）ＰＤ１−ｉＣＡＲ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞もしくはＰｄｅｌ／ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現レベルに基づいて、低いもしくは高い導入遺伝子発現に関してソートした。（Ｂ）ｉＰＳ由来線維芽細胞（ｉＰＳ−ｆｉｂ）を、ＰＳＭＡを発現するように形質導入し、抗ＰＳＭＡ抗体を使用してソートした（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡソートバルク＋）。これら細胞を、図２および図４における実験に使用した。第２の別個のソートを、抗ＰＳＭＡ抗体を使用して低いもしくは高い表面ＰＳＭＡ発現ｉＰＳ−ｆｉｂを精製するために使用し、これら細胞を、図３における実験に使用した。

図１５Ａ〜１５Ｄは、ｉＣＡＲが、１９−２８ｚ駆動ヒトＴ細胞サイトカイン放出および増殖を阻害したことを示す。（Ａ）ＣＤ１９もしくはＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）中でのヒトＴ細胞増殖。（Ｂ）ＣＤ１９（標的）陽性もしくはＣＤ１９／ＰＳＭＡ（オフターゲット）陽性ＡＡＰＣに、二重ソートした１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ形質導入ヒトＴ細胞もしくはｉＣＡＲ形質導入ヒトＴ細胞を播種して２４時間後および４８時間後での上清の代表的ＩＮＦγサイトカイン分析。データは、オフターゲット／標的値の比として表され、３回の独立した実験からプールした（各条件につきｎ＝６ウェル）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。（Ｃ）ＣＤ１９＋（標的）ＡＡＰＣで０日目および７日目に刺激した二重陽性１９−２８ｚ／ＰｄｅｌＴ細胞もしくはｉＣＡＲＴ細胞の絶対数。（Ｄ）異種移植片ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスモデルにおけるＮＡＬＭ／６細胞およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ細胞での治療的Ｔ細胞応答の比較。図１５Ａ〜１５Ｄは、ｉＣＡＲが、１９−２８ｚ駆動ヒトＴ細胞サイトカイン放出および増殖を阻害したことを示す。（Ａ）ＣＤ１９もしくはＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）中でのヒトＴ細胞増殖。（Ｂ）ＣＤ１９（標的）陽性もしくはＣＤ１９／ＰＳＭＡ（オフターゲット）陽性ＡＡＰＣに、二重ソートした１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ形質導入ヒトＴ細胞もしくはｉＣＡＲ形質導入ヒトＴ細胞を播種して２４時間後および４８時間後での上清の代表的ＩＮＦγサイトカイン分析。データは、オフターゲット／標的値の比として表され、３回の独立した実験からプールした（各条件につきｎ＝６ウェル）。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。（Ｃ）ＣＤ１９＋（標的）ＡＡＰＣで０日目および７日目に刺激した二重陽性１９−２８ｚ／ＰｄｅｌＴ細胞もしくはｉＣＡＲＴ細胞の絶対数。（Ｄ）異種移植片ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスモデルにおけるＮＡＬＭ／６細胞およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ細胞での治療的Ｔ細胞応答の比較。

図１６Ａ〜１６Ｉは、ｉＣＡＲの基礎発現が初代ヒトＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ，Ｂ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ、Ｔ細胞での形質導入後７日間は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを、２４時間後に評価した。（Ｃ）ビーズ活性化後８日間で、絶対Ｔ細胞増大を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して定量し、（Ｄ）各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を、非刺激細胞に対して正規化した。（Ｅ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞を、照射したＥＬ４−ＷＴ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞とともに５日間共培養し、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型を決定した。（Ｆ）は、親油性ＤｉＤ色素で標識し、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とともにインキュベートしたＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞の細胞結合体化アッセイを示す。（Ｇ）は、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲでの形質導入後７日間後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化後２４時間でのＴ細胞におけるＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを示すグラフを表す。（Ｈ）は、ビーズ活性化後８日間で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用する絶対Ｔ細胞増大の定量を示すグラフである。（Ｉ）は、非刺激細胞に対して計算した各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を示すグラフである。図１６Ａ〜１６Ｉは、ｉＣＡＲの基礎発現が初代ヒトＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ，Ｂ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ、Ｔ細胞での形質導入後７日間は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを、２４時間後に評価した。（Ｃ）ビーズ活性化後８日間で、絶対Ｔ細胞増大を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して定量し、（Ｄ）各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を、非刺激細胞に対して正規化した。（Ｅ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞を、照射したＥＬ４−ＷＴ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞とともに５日間共培養し、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型を決定した。（Ｆ）は、親油性ＤｉＤ色素で標識し、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とともにインキュベートしたＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞の細胞結合体化アッセイを示す。（Ｇ）は、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲでの形質導入後７日間後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化後２４時間でのＴ細胞におけるＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを示すグラフを表す。（Ｈ）は、ビーズ活性化後８日間で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用する絶対Ｔ細胞増大の定量を示すグラフである。（Ｉ）は、非刺激細胞に対して計算した各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を示すグラフである。図１６Ａ〜１６Ｉは、ｉＣＡＲの基礎発現が初代ヒトＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ，Ｂ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ、Ｔ細胞での形質導入後７日間は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを、２４時間後に評価した。（Ｃ）ビーズ活性化後８日間で、絶対Ｔ細胞増大を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して定量し、（Ｄ）各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を、非刺激細胞に対して正規化した。（Ｅ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞を、照射したＥＬ４−ＷＴ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞とともに５日間共培養し、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型を決定した。（Ｆ）は、親油性ＤｉＤ色素で標識し、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とともにインキュベートしたＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞の細胞結合体化アッセイを示す。（Ｇ）は、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲでの形質導入後７日間後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化後２４時間でのＴ細胞におけるＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを示すグラフを表す。（Ｈ）は、ビーズ活性化後８日間で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用する絶対Ｔ細胞増大の定量を示すグラフである。（Ｉ）は、非刺激細胞に対して計算した各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を示すグラフである。図１６Ａ〜１６Ｉは、ｉＣＡＲの基礎発現が初代ヒトＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ，Ｂ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ、Ｔ細胞での形質導入後７日間は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを、２４時間後に評価した。（Ｃ）ビーズ活性化後８日間で、絶対Ｔ細胞増大を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して定量し、（Ｄ）各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を、非刺激細胞に対して正規化した。（Ｅ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞を、照射したＥＬ４−ＷＴ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞とともに５日間共培養し、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型を決定した。（Ｆ）は、親油性ＤｉＤ色素で標識し、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とともにインキュベートしたＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞の細胞結合体化アッセイを示す。（Ｇ）は、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲでの形質導入後７日間後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化後２４時間でのＴ細胞におけるＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを示すグラフを表す。（Ｈ）は、ビーズ活性化後８日間で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用する絶対Ｔ細胞増大の定量を示すグラフである。（Ｉ）は、非刺激細胞に対して計算した各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を示すグラフである。図１６Ａ〜１６Ｉは、ｉＣＡＲの基礎発現が初代ヒトＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ，Ｂ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ、Ｔ細胞での形質導入後７日間は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、ＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを、２４時間後に評価した。（Ｃ）ビーズ活性化後８日間で、絶対Ｔ細胞増大を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して定量し、（Ｄ）各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を、非刺激細胞に対して正規化した。（Ｅ）１９−２８ｚ／ｉＣＡＲＴ細胞を、照射したＥＬ４−ＷＴ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞とともに５日間共培養し、フローサイトメトリーを使用して免疫表現型を決定した。（Ｆ）は、親油性ＤｉＤ色素で標識し、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とともにインキュベートしたＥＬ４−ｗｔ細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞の細胞結合体化アッセイを示す。（Ｇ）は、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲでの形質導入後７日間後に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化後２４時間でのＴ細胞におけるＩＬ−２／ＩＮＦγレベルを示すグラフを表す。（Ｈ）は、ビーズ活性化後８日間で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用する絶対Ｔ細胞増大の定量を示すグラフである。（Ｉ）は、非刺激細胞に対して計算した各ｉＣＡＲ群におけるＧＦＰ陽性細胞の％変化を示すグラフである。

図１７Ａ〜１７Ｃは、ＰＤ−１ｉＣＡＲのシグナル伝達経路および生化学的経路の特徴付けを示す。１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ細胞を、４：１のＥ：Ｔ比で６０分間、抗原なし（ＷＴ）、ＣＤ１９（標的）、もしくはＣＤ１９およびＰＳＭＡ（オフターゲット）を発現するＡＡＰＣに曝した。（Ａ）１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲＴ細胞およびそれぞれのＡＡＰＣに由来する１００μｇの溶解物とともにインキュベートしたヒトホスホイムノレセプターアレイ。全てのブロットを、同じＸ線フィルムでのケミルミネッセンスを使用して検出して、曝露レベルを正規化した。（Ｂ，Ｃ）スキャンしたＸ線フィルム画像を使用して、（Ａ）におけるアレイの定量を、画像分析ソフトウェアを使用して分析した。全てのピクセル密度を、内部ｐＹコントロールを使用して、各アレイで正規化する。（Ｂ）標的、オフターゲット、もしくはコントロールＡＡＰＣのＳＨＰ１およびＳＨＰ２リン酸化状態。（Ｃ）５９のＩＴＡＭ／ＩＴＩＭ関連イムノレセプターのリン酸化レベルの定量。図１７Ａ〜１７Ｃは、ＰＤ−１ｉＣＡＲのシグナル伝達経路および生化学的経路の特徴付けを示す。１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲ細胞を、４：１のＥ：Ｔ比で６０分間、抗原なし（ＷＴ）、ＣＤ１９（標的）、もしくはＣＤ１９およびＰＳＭＡ（オフターゲット）を発現するＡＡＰＣに曝した。（Ａ）１９−２８ｚ／ＰＤ−１ｉＣＡＲＴ細胞およびそれぞれのＡＡＰＣに由来する１００μｇの溶解物とともにインキュベートしたヒトホスホイムノレセプターアレイ。全てのブロットを、同じＸ線フィルムでのケミルミネッセンスを使用して検出して、曝露レベルを正規化した。（Ｂ，Ｃ）スキャンしたＸ線フィルム画像を使用して、（Ａ）におけるアレイの定量を、画像分析ソフトウェアを使用して分析した。全てのピクセル密度を、内部ｐＹコントロールを使用して、各アレイで正規化する。（Ｂ）標的、オフターゲット、もしくはコントロールＡＡＰＣのＳＨＰ１およびＳＨＰ２リン酸化状態。（Ｃ）５９のＩＴＡＭ／ＩＴＩＭ関連イムノレセプターのリン酸化レベルの定量。

図１８は、ｉＣＡＲが刺激レセプターに直接作用して、そのシグナル伝達をブロックすることを示す。

図１９Ａ〜１９Ｅは、図２Ａ〜２Ｆについての生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）上記ｉＰＳ線維芽細胞の死滅を、Ｐｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞についてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して定量した。（Ｂ）４：１Ｅ：Ｔ比での（Ａ）の細胞培養上清におけるサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。（Ｃ）ＰｄｅｌもしくはｉＣＡＲ陽性Ｔ細胞を、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともに２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼシグナルを定量した。（Ｄ）（Ｃ）の事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｅ）サイトカイン分泌を、（Ｃ）の細胞培養上清において２４時間で測定した。ＧＭ−ＣＳＦの生の値を示す。Ｅ：Ｔ比、エフェクター：標的比。図１９Ａ〜１９Ｅは、図２Ａ〜２Ｆについての生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）上記ｉＰＳ線維芽細胞の死滅を、Ｐｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞についてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して定量した。（Ｂ）４：１Ｅ：Ｔ比での（Ａ）の細胞培養上清におけるサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。（Ｃ）ＰｄｅｌもしくはｉＣＡＲ陽性Ｔ細胞を、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともに２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼシグナルを定量した。（Ｄ）（Ｃ）の事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｅ）サイトカイン分泌を、（Ｃ）の細胞培養上清において２４時間で測定した。ＧＭ−ＣＳＦの生の値を示す。Ｅ：Ｔ比、エフェクター：標的比。図１９Ａ〜１９Ｅは、図２Ａ〜２Ｆについての生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）上記ｉＰＳ線維芽細胞の死滅を、Ｐｄｅｌ形質導入Ｔ細胞、ＰＤ−１形質導入Ｔ細胞、もしくはｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入Ｔ細胞についてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して定量した。（Ｂ）４：１Ｅ：Ｔ比での（Ａ）の細胞培養上清におけるサイトカイン分泌を、１８時間で評価した。（Ｃ）ＰｄｅｌもしくはｉＣＡＲ陽性Ｔ細胞を、ＰＳＭＡを発現するオフターゲットｉＰＳ−ｆｉｂ（ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ）とともに２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼシグナルを定量した。（Ｄ）（Ｃ）の事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｅ）サイトカイン分泌を、（Ｃ）の細胞培養上清において２４時間で測定した。ＧＭ−ＣＳＦの生の値を示す。Ｅ：Ｔ比、エフェクター：標的比。

図２０Ａおよび２０Ｂは、図３Ａ〜３Ｄの生データおよび統計的有意性検定を表す。（Ａ）未処理細胞に対するｉＰＳｆｉｂ−ＰＳＭＡの死滅を、ソートした高いおよび低いＰｄｅｌ形質導入したかもしくはＰＤ１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞に関してＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用することによって評価した。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｂ）高いもしくは低いレベルのＰＳＭＡ発現に関してソートしたｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡのＰＤ１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して定量した。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。図２０Ａおよび２０Ｂは、図３Ａ〜３Ｄの生データおよび統計的有意性検定を表す。（Ａ）未処理細胞に対するｉＰＳｆｉｂ−ＰＳＭＡの死滅を、ソートした高いおよび低いＰｄｅｌ形質導入したかもしくはＰＤ１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞に関してＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用することによって評価した。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｂ）高いもしくは低いレベルのＰＳＭＡ発現に関してソートしたｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡのＰＤ１ｉＣＡＲ−Ｐ形質導入したアロ反応性Ｔ細胞死滅を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ系を使用して定量した。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。

図２１Ａおよび２１Ｂは、図４Ａおよび４Ｂに関する生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）Ｔ細胞注入の前および注入後の選択された時点でのｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡのバイオルミネッセント画像（ＢＬＩ）。（Ｂ）事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。

図２２Ａ〜２２Ｃは、図５Ａ〜５Ｆに関する生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）２４時間での培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データは、オフターゲット／標的値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（各条件につきｎ＝６ウェル。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｂ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌおよび１９−２８ｚ／ＰＤ１ｉＣＡＲの増殖を比較する図５Ｂに関しては、事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｃ）方法に記載されるとおり、ＣＤ１９標的もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞に対するｍＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。図２２Ａ〜２２Ｃは、図５Ａ〜５Ｆに関する生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）２４時間での培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データは、オフターゲット／標的値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（各条件につきｎ＝６ウェル。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｂ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌおよび１９−２８ｚ／ＰＤ１ｉＣＡＲの増殖を比較する図５Ｂに関しては、事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｃ）方法に記載されるとおり、ＣＤ１９標的もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞に対するｍＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。図２２Ａ〜２２Ｃは、図５Ａ〜５Ｆに関する生データおよび統計的有意性検定を示す。（Ａ）２４時間での培養上清のルミネックス多重サイトカイン分析。データは、オフターゲット／標的値の比として表し、３回の独立した実験からプールする（各条件につきｎ＝６ウェル。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｂ）１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌおよび１９−２８ｚ／ＰＤ１ｉＣＡＲの増殖を比較する図５Ｂに関しては、事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。（Ｃ）方法に記載されるとおり、ＣＤ１９標的もしくはＣＤ１９−ＰＳＭＡオフターゲット細胞に対するｍＣｈｅｒｒｙシグナルの定量。事後分析を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で較正した多重ｔ検定を使用して行った。

図２３は、ｉＣＡＲおよびＣＡＲに関する標的抗原の選択の模式図。

（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に、抗原認識レセプター（例えば、ＴＣＲもしくはＣＡＲ）および免疫応
答細胞の免役活性を選択的に低減するかもしくは排除する阻害性キメラ抗原レセプター（
ｉＣＡＲ）の組み合わせを少なくとも発現する、遺伝子改変免疫応答細胞（例えば、Ｔ細
胞（ＣＤ４、ＣＤ８、記憶、ナイーブ、エフェクター、Ｔ−ｒｅｇなどのような全てのサ
ブセットを含む）、先天性免疫系の細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）細胞）を含む細胞、ならびに「オフターゲット」免疫応答の低減が望
ましい新生物形成および他の病状の処置のためにこのような細胞を使用する方法を提供す
る。本発明は、少なくとも部分的に、標的抗原（例えば、本明細書で示されるとおりのＰ
ＳＭＡ）を結合する阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲｓ）が、免疫反応性細胞を選
択的に阻害および抑制するために有用であるという発見に基づく。特に、本発明のｉＣＡ
Ｒは、免疫反応性細胞の免疫応答の活性化を減少もしくは妨げる。本アプローチは、腫瘍
根絶の選択的免疫原性を提供すると同時に、非腫瘍組織に上記免疫応答を与えない。よっ
て、抗原認識レセプターおよびｉＣＡＲを発現するＴ細胞は、従来の養子Ｔ細胞療法を超
える顕著な利点を示す。

癌を処置するためのドナー白血球の幅広い使用は、移植片対腫瘍効果（ＧＶＴ）の治療効
力を移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の潜在的に致命的な効果から区別できないことによって
妨げられている。２つの一般的アプローチが、Ｔ細胞療法副作用を制御するために使用さ
れてきた。第１は、免疫抑制薬の使用であり、これらは、細胞分裂をブロックすることに
よって非特異的に作用し（細胞増殖抑制剤）、免疫応答を広く制限する（グルココルチコ
イド、イムノフィリンなど）か、またはクリアランス／死滅のためにＴ細胞を標的とする
（抗体）。強力ではあるものの、これらアプローチは、治療上機能するＴ細胞を区別する
という観点では非特異的であり、有害副作用を引き起こす。さらに、これらの全ての薬物
は、顕著な長期の二次的副作用（易感染性、心臓、腎臓、および神経的な損傷）を引き起
こす。

第２のアプローチは、Ｔ細胞を自殺遺伝子／死滅スイッチで操作する。これらは、いった
ん適切な合図をもたらした後に、上記操作された細胞を死滅させる遺伝的アプローチであ
る。それらのうちのいくつかは、毒性薬剤（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ））の選択的酵素メタボライザーの導入に基づく。さらに、ダイマー
化の特異的化学誘発因子を使用して活性化される誘発性カスパーゼ−９タンパク質の使用
は、活発に誘発される広い細胞死に対する有望なアプローチであった。これらアプローチ
の主な制限は、それらが全ての標的細胞において細胞死を誘発する（それによって、有益
な細胞を排除する）ことである。従来の免疫抑制と同様に、それらは通常、実施前に症状
の出現（従って、患者に対して起こり得る永続的な損傷）を要する。

対照的に、本明細書で記載されるｉＣＡＲストラテジーは、Ｔ細胞作用を選択的にフィル
ターにかけ、オフターゲット部位における活性を制限すると同時に、意図された標的に対
して治療的機能を与えない。本明細書で示されるように、ｉＣＡＲは、ｉＰＳ由来ヒト線
維芽細胞を使用して新規なインビトロモデルおよびインビボモデルにおいて「宿主」組織
を攻撃することから、ヒトアロ反応性Ｔ細胞を阻害し得た。ＧＶＨＤ標的組織（例えば、
骨髄系統に関するＣＤ３３もしくは器官特異的抗原）に存在するが、標的化悪性腫瘍には
存在しない特有の表面抗原は、ＧＶＨＤをＧＶＴから区別するためのｉＣＡＲ標的の候補
である。同様に、本明細書で記載される結果は、ｉＣＡＲ媒介性阻害が、ＣＡＲ操作され
たＴ細胞の「オンターゲットであるがオフターゲット」効果を成功裡に制限することを示
し、その例としては、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置した白血病患者にお
けるＢ細胞形成不全（Ｋａｌｏｓｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１．３（９５）：９５ｒａ７３）、肺上皮に対
する抗ＥＲＢＢ２ＣＡＲＴ細胞交叉反応性から生じると考えられる胎児急性呼吸窮迫症
候群（ＡＲＤＳ）（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１０．
１８（４）：８４３−５１）、およびＭａｇｅ−Ａ３ＴＣＲで処置した黒色腫および
骨髄腫患者における心筋壊死による死亡（Ｊｕｎｅ、ＵｐｄａｔｅｏｎＩｍｍｕｎｏ
ｔｈｅｒａｐｙＴｒｉａｌｓｆｏｒＨＩＶａｎｄＣａｎｃｅｒ、ｉｎＲｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅ、２０１２）が挙げ
られる。心筋細胞もしくは肺上皮で発現されるが、腫瘍細胞には存在しない表面抗原を認
識すれば、ｉＣＡＲは、Ｍａｇｅ−Ａ３ＴＣＲもしくは抗ＥＲＢＢ２ＣＡＲ交叉反応
性から保護するために潜在的に使用され得るので、別の点で有望な治療剤を復活させる。
あるいは、多くの腫瘍は、ＨＬＡ分子を活発にダウンレギュレートして、免疫認識から逃
れるので、ＨＬＡ標的化ｉＣＡＲは、いくつかの組織に対する同時保護を提供する能力を
有する。

ｉＣＡＲの臨床上の利用可能性の重要な要件は、ｉＣＡＲの事前シグナル伝達にも関わら
ず、Ｔ細胞機能性を維持することである。興味深いことには、ｉＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は
、阻害性抗原への曝露後に、標的抗原に対する応答をなお高めることが見出された。この
可逆性は、転写状態ではなくシグナル伝達分子のリン酸化状態が、細胞傷害性のような迅
速な機能的応答を制御するナチュラルキラー細胞の挙動を摸倣する。抗ＰＤ−１抗体およ
び抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｔ細胞応答を一時的に調節する能力をさらに議論して、アネルギ
ー化したかもしくは疲弊したＴ細胞の損なわれた機能を改善し得る。さらに、ＴＣＲ複合
体に対するＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４効果の生化学的分析から、リン酸化状態、下流の
キナーゼ、およびアポトーシスではなく運動性に依存することが示された。インビトロの
結果もインビボの結果も、オフターゲット細胞に応じた阻害と継続した治療機能性を示し
たが、細胞のうちのいくらかがアネルギー化され得るという可能性がある。Ｔ細胞で機能
することに加えて、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状
細胞でも機能する。従って、ｉＣＡＲは、他の免疫現象を操作する可能性もある。

本発明のｉＣＡＲは、例えば、ｉＣＡＲに抗原（例えば患者に注入された組換えＰＳＭＡ
−Ｉｇ）を導入することによって全身性のサイトカインストームもしくは免疫細胞応答を
制限するための減衰ツール（ｄａｍｐｅｎｉｎｇｔｏｏｌ）として使用され得る。上記
ＰＳＭＡ−Ｉｇは、ｉＣＡＲを結合および活性化し得、従って、Ｔ細胞活性化を一時的に
阻害し得る。これは、サイトカインストームを引き起こす循環スパイラルを一時的に壊し
得、全身性の副作用を制限してＴ細胞を活性化させ得る。上記ｉＣＡＲは、ｉＣＡＲを架
橋することによって示されるように、この機能性を有する。

本発明は、生理的機構を利用して、Ｔ細胞副作用を制限する。このアプローチは、天然に
存在するＴ細胞反応性の制限を摸倣し、従って、貴重な治療上生存可能な細胞の排除を要
しない。本アプローチは、Ｔ細胞を指示して、所望の機能のみを発揮させる合成レセプタ
ーを使用することによって、薬物として細胞の多面的な機能性を利用する。結論として、
抗原特異的阻害性レセプターは、特異的細胞表面抗原の結合の際にＴ細胞増殖、サイトカ
イン分泌、および細胞傷害性を成功裡に制限し、従って、正常な組織に対する保護を付与
すると同時に、重要なＴＣＲもしくはＣＡＲ媒介性の治療機能を保持する。従って、ｉＣ
ＡＲは、自己由来の状況でも同種異系の状況でもより安全でかつより抗過程なＴ細胞療法
を確立する新規なストラテジーを提供する。

移植片対白血病効果（ＧＶＬ）および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
同種異系骨髄移植物の最初の使用以来、白血病の根治はドナー由来免疫応答に依存性であ
ると認識されてきた。移植片対白血病効果（ＧＶＬ）は、同種異系骨髄移植（ＢＭＴ）後
のドナーリンパ球注入の成功後にさらに解明および認識された。ドナーリンパ球注入（Ｄ
ＬＩ）は、悪性腫瘍に関する養子免疫療法の最も確立され拡がっている用途である。不運
なことに、ＤＬＩ後の罹病率および死亡率の主な原因は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の
発生である。その発生および重症度の低下は、固形腫瘍および血液腫瘍におけるＤＬＩの
より幅広い潜在的に治癒力のある使用への重大な限界である。上記ｉＣＡＲストラテジー
は、ＧＶＬの有益な効果をＧＶＨＤの危険な転帰から区別することによって、この問題を
解決することを目的とする。ＧＶＨＤは、皮膚、肝臓、および腸管、標的悪性腫瘍に存在
し得ない微量のａｌｉａ抗原（ｍｉｎｏｒａｌｉａ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）のような特有
の抗原を有する部位に主に影響を及ぼす。このようなことが起こると、ｉＣＡＲがＧＶＬ
およびＧＶＨＤの効果を区別する、あり得る役割が裏付けられる。

養子治療において、再標的化Ｔ細胞は、いくつかの悪性腫瘍において潜在的な治癒力のあ
る役割を果たすことが示された。なお、この変形する傾向のあるアプローチは、その交叉
反応性およびその後の重要な正常組織（心臓、肺）に対する毒性が原因で制限されている
。従って、ｉＣＡＲストラテジーが計画している、Ｔ細胞の治療機能を減衰することなく
Ｔ細胞反応性を制御する方法を開発する重大な必要性がある心筋細胞もしくは肺上皮で発
現されるが、腫瘍細胞には存在しない表面抗原を認識すれば、ｉＣＡＲは、Ｍａｇｅ−Ａ
３ＴＣＲもしくは抗ＥＲＢＢ２ＣＡＲ交叉反応性から保護するために潜在的に使用さ
れ得、従って、別の方法で有望な治療剤を復活させ得る。あるいは、多くの腫瘍はＨＬＡ
分子を活発にダウンレギュレートして、免疫認識から逃れるので、ＨＬＡ標的化ｉＣＡＲ
は、いくつかの組織に対する同時保護を潜在的に提供し得る。

一実施形態において、同種異系リンパ球（ある程度の免疫ミスマッチがある）は、ｉＣＡ
Ｒ標的化ＨＬＡ−Ｉ（転移性乳癌（極めて活発なＨＬＡ−Ｉダウンレギュレーションを有
する癌のタイプ）の処置のために種々の組織で普遍的に発現される抗原）を発現するよう
に操作される。上記患者に、上記細胞が注入される。上記ｉＣＡＲは、ＨＬＡ−１を発現
する全ての正常なもしくは非新生物組織を保護する一方で、上記腫瘍は、陰性のもしくは
極めて低いＨＬＡ−Ｉ発現に起因して排除される。

別の実施形態において、患者は、血液悪性腫瘍の処置のために、または固形腫瘍の補助処
置としてＨＳＣＴを受ける。上記患者は、再発するかもしくは残っている疾患を有し、そ
れは、ＨＬＡ−Ｉ陰性であるかもしくはダウンレギュレートされていると分析される。ド
ナーリンパ球は、ｉＣＡＲ標的化ＨＬＡ−Ｉで操作される。上記患者に、上記細胞が注入
される。上記ｉＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｉを発現する全ての正常なもしくは非新生物組織を保
護する一方で、上記腫瘍は、陰性のもしくは極めて低いＨＬＡ−Ｉ発現に起因して排除さ
れる。

さらに別の実施形態において、患者は、皮膚、肝臓、もしくは消化管細胞に関連しない部
位に生じる腫瘍（ＧＶＨＤ関連死の腫瘍部位）を有する。ドナーリンパ球細胞は、皮膚、
肝臓、または消化管もしくは３種全てに発現される抗原を標的とするｉＣＡＲで操作され
る。例えば、上記腫瘍が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けた場合、腫瘍進行および転移性腫
瘍とともに見出されるように、Ｅ−カドヘリンおよびサイトケラチンは、このプロセスの
一部としてダウンレギュレートされることが示された。Ｅ−カドヘリンは、正常な皮膚、
肝臓、および消化管において高度に発現される（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅｔａｌ．、Ａｒ
ｃｈ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｃｙｔｏｌ．、６９（２）：１３５−１４５（２００６））
。従って、Ｅ−カドヘリンに対するｉＣＡＲを発現するドナーリンパ球は、ＧＶＬ様式で
上記腫瘍に対して反応するが、皮膚、肝臓、もしくは消化管を攻撃するそれらの能力が制
限される。

ｉＣＡＲおよびＣＡＲに関する標的抗原の選択
本発明は、免疫阻害性レセプター（上記ｉＣＡＲ）のシグナル伝達ドメインを利用する合
成レセプターを使用することによって、Ｔ細胞もしくは他の免疫調節細胞の応答を制御す
るための方法および新規な試薬セットを提供する。上記ｉＣＡＲに関する適切な抗原は、
腫瘍における天然のバリエーションに起因して、個別化医薬アプローチをときおり利用す
る。同時に、ｉＣＡＲの使用およびタイプに依存して、抗原のいくつかの潜在的「クラス
」が、同時にいくつかの組織に対して保護を提供する能力を有する。これらとしては、以
下が挙げられる：（１）腫瘍によってダウンレギュレートされるが、正常組織によっては
ダウンレギュレートされない、普遍的に発現される免疫原性抗原（例えば、ヒト白血球抗
原（ＨＬＡ））。（２）腫瘍進行、特に、転移性表現型の達成中にダウンレギュレートさ
れるが、ある種の正常組織においては維持される抗原。このような抗原としては、以下が
挙げられる：（３）細胞表面ＥＭＴ抗原（例えば、Ｅ−カドヘリンおよびサイトケラチン
）；（４）細胞表面腫瘍サプレッサー抗原（例えば、ＯＰＣＭＬ（Ｃｕｉｅｔａｌ．
、ＰＬｏＳＯＮＥ．２００８；３（８）：ｅ２９９０））；および（６）他の類
似の抗原（例えば、ＨＹＡＬ２、ＤＣＣ、ＳＭＡＲ１など）。ＯＰＣＭＬ−ｖ１は、全て
の正常な成体および胎児の組織（胎盤および末梢血単核細胞を除く）において種々のレベ
ルで広く発現される。（７）細胞表面炭水化物、脂質、および翻訳後修飾（例えば、ムチ
ン型Ｏ−グリカン（コア３Ｏ−グリカン）（ＬｅｅａｎｄＦｕｋｕｄａ、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２０１０；４７９：１４３−５４；Ｓｕｚｕｋｉ−Ａｎｅ
ｋｏｊｉｅｔａｌ．、ＪＢｉｏｉＣｈｅｍ．２０１１Ｓｅｐ１６；２８６
（３７）：３２８２４−３３；ＢａｏａｎｄＦｕｋｕｄａ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ．２０ｌ０；４７９：３８７−９６）。（８）さらには、腫瘍において
破壊される多くの他のプロセス（代謝、アポトーシス、移動（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）
、分化など）があり、各々、表面抗原のダウンレギュレーションをもたらし、これらのう
ちのいずれも、潜在的なｉＣＡＲ抗原標的として使用され得る。

一般に、本発明は、各患者に対して採用され得る個別のアプローチを提供する。本明細書
で記載されるように、上記ｉＣＡＲ抗原は、アルゴリズムプロセスを通じて選択され得、
その後、医師は、上記患者の腫瘍に合わせられた特異的レセプターを注文し得る。次いで
、このレセプターは、刺激レセプター（すなわち、ＴＣＲもしくはＣＡＲもしくはＧＶＬ
シグナル）のソバに導入されて、選択組織に対する保護を提供する。

上記ｉＣＡＲが、活性化ＣＡＲと同じ抗原と結合し得ることに注意することは、重要であ
る。例えば、抗原が腫瘍組織と正常組織との間でそれらの発現がバイナリーである（すな
わち、一方には完全に存在せず、他方には存在する）ことが見出されていない状況があり
得る。なお、腫瘍状の抗原が正常組織より遙かに高いレベルで発現される場合、上記刺激
性ＣＡＲおよび上記ｉＣＡＲレセプターの両方が、その同じ抗原を標的とし得る。腫瘍の
場合には、非常に多くの抗原が存在するので、上記刺激性ＣＡＲは、優位を占め、腫瘍を
排除させる。正常組織の場合、抗原発現レベルは低いので、上記ｉＣＡＲは、適切な阻害
を提供し得る。これは、両方／もしくは単一の上記標的抗原のレベル、および上記刺激性
および上記ｉＣＡＲのレベルが、免疫応答細胞の転帰応答（ｏｕｔｃｏｍｅｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ）に影響を及ぼし得るので真実である（図２３）。さらに、各レセプターのアフィ
ニティーを変化させることは、上記応答を調節および微調整するために使用され得る。

標的組織とオフターゲット組織との間の抗原不均衡は、発現の絶対的な非存在ではなく、
主に発現のレベルにおける差異で制限され得る。さらに、変動性の発現レベルは、いくつ
かの組織が、ｉＣＡＲを使用する保護に関する１つの共通抗原とともに示される場合に予
期され得る。１つのこのような例は、細胞タイプの大部分で広く見出されるが、しばしば
異なる発現レベルを伴うＨＬＡ分子の発現である。興味深いことには、ＨＬＡ分子のダウ
ンレギュレーションは、主な腫瘍機構がＴ細胞免疫応答から逃れることを表す。このよう
な筋書きでは、悪性腫瘍でダウンレギュレートされるＨＬＡ分子に対してｉＣＡＲで操作
されるＤＬＩＴ細胞は、種々の組織タイプのＧＶＨＤからの広い保護を提供し得ると同
時に、ＧＶＬ効果を維持する。

このような抗原選択の組み合わせの可能性は、利用可能な抗体、腫瘍表面抗原プロファイ
リング、および公知の組織特異的抗原によって制限されるのみである。

細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）
ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞によって発現される阻害性レセプターであり、これは、そ
の対応するリガンド（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６；Ｂ７−ｌおよびＢ７−２）
によって結合される場合に、活性化Ｔ細胞阻害もしくはアネルギーを媒介する。前臨床研
究および臨床研究の両方において、全身性の抗体注入によるＣＴＬＡ−４ブロックは、内
因性抗腫瘍応答を増強したが、臨床状況では、顕著な予見できなかった毒性を有した。

ＣＴＬＡ−４は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む。異な
るアイソフォームをコードする選択的スプライシング改変体が、特徴付けられた。膜結合
型アイソフォームは、ジスルフィド結合によって相互連結されたホモダイマーとして機能
する一方で、可溶性アイソフォームは、モノマーとして機能する。上記細胞内ドメインは
、本質的な触媒活性を有さず、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２ＡおよびＳＨＰ−２を結合し得る１個の
ＹＶＫＭモチーフおよびＳＨ３含有タンパク質を結合し得る１個のプロリンリッチモチー
フを含むという点で、ＣＤ２８のものに類似である。Ｔ細胞応答を阻害することにおける
ＣＴＬＡ−４の１つの役割は、ＴＣＲの近位にあるシグナル伝達タンパク質（例えば、Ｃ
Ｄ３およびＬＡＴ）のＳＨＰ−２およびＰＰ２Ａ脱リン酸化を直接媒介するようである。
ＣＴＬＡ−４はまた、ＣＤ８０／８６結合に関してＣＤ２８との競合を間接的に介してシ
グナル伝達に影響を及ぼし得る。ＣＴＬＡ−４はまた、ＰＩ３Ｋ、ＣＤ８０、ＡＰ２Ｍ１
、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａと結合および／もしくは相互作用することが示された。

ＣＴＬＡ−４は、配列番号５に示されるとおりのアミノ酸配列を有し得る。

本発明によれば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列を
有し得る（本発明中の相同性は、ＢＬＡＳＴもしくはＦＡＳＴＡのような標準ソフトウェ
アを使用して決定され得る）。非限定的実施形態において、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは
、少なくとも２０個、もしくは少なくとも３０個、もしくは少なくとも４０個、もしくは
少なくとも５０個、および最大２２２個までのアミノ酸の長さである配列番号５の連続部
分であるアミノ酸配列を有し得る。代わりにもしくはさらに、非限定的な種々の実施形態
において、上記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１〜２２３、１〜５
０、５０〜１００、１００〜１４０、１４１〜１６１、１６２〜１８２、１８３〜２２３
、１４１〜２２３、１６２〜２２３、もしくは１８３〜２２３のアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、上記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１８３〜
２２３のアミノ酸配列を有する。ある種の実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞内シグ
ナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸１８３〜２２３のアミノ酸配列を有するＣＴ
ＬＡ−４ポリペプチドを含む。ある種の実施形態において、上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメイ
ンは、配列番号５のアミノ酸１６２〜１８２のアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ−４ポリペ
プチドを含む。

本発明によれば、「ＣＴＬＡ−４核酸分子」とは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドをいう。

プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）
ＰＤ−１は、内因性マクロファージおよび樹状細胞で発現されるその対応するリガンドＰ
Ｄ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との結合の際に、活性化Ｔ細胞の負の免疫調節因子である。Ｐ
Ｄ−１は、２６８アミノ酸のタイプＩ膜タンパク質である。ＰＤ−１は、２つのリガンド
、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有し、これらは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。上
記タンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメイン、次に、膜貫通領域および細胞内テールを
含む。上記細胞内テールは、ＰＤ−１がＴＣＲシグナルを負に調節する、イムノレセプタ
ーチロシンベースの阻害性モチーフおよびイムノレセプターチロシンベースのスイッチモ
チーフに位置する２個のリン酸化部位を含む。ＳＨＰ−ＩおよびＳＨＰ−２ホスファター
ゼは、リガンド結合の際にＰＤ−１の細胞質テールに結合する。ＰＤ−Ｌ１のアップレギ
ュレーションは、腫瘍細胞が宿主免疫系を巧みにかわし得る１つの機構である。前臨床試
験および臨床試験において、拮抗抗体によるＰＤ−１ブロックは、宿主の内因性免疫系を
通じて媒介される抗腫瘍応答を誘発した。

ＰＤ−１は、配列番号６に示されるとおりのアミノ酸配列を有し得る。

本発明によれば、ＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列を有し
得る。非限定的実施形態において、ＰＤ−１ポリペプチドは、少なくとも２０個、もしく
は少なくとも３０個、もしくは少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個、および最
大２８７個までのアミノ酸の長さである配列番号６の連続部分であるアミノ酸配列を有し
得る。代わりにもしくはさらに、非限定的な種々の実施形態において、ＰＤ−１ポリペプ
チドは、配列番号６のアミノ酸１〜２８８、１〜５０、５０〜１００、１００〜１４４、
１４５〜１７０、１７１〜１９１、１９２〜２８８、１４５〜２８８、１７１〜２８８、
もしくは１９２〜２８８のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、上記ＰＤ−１ポ
リペプチドは、配列番号６のアミノ酸１９２〜２８８のアミノ酸配列を有する。ある種の
実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ
酸１９２〜２８８のアミノ酸配列を有するＰＤ−１ポリペプチドを含む。ある種の実施形
態において、上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸１７１〜１９１の
アミノ酸配列を有するＰＤ−１ポリペプチドを含む。

本発明によれば、「ＰＤ−１核酸分子」とは、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをいう。

リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）
リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）は、免疫細胞の負の免疫調節因子である。Ｌ
ＡＧ−３は、免疫グロブリン（ｌｇ）スーパーファミリーに属し、４個の細胞外Ｉｇ様ド
メインを含む。上記ＬＡＧ３遺伝子は、８個のエキソンを含む。配列データ、エキソン／
イントロン組織化、および染色体位置は全て、ＬＡＧ３とＣＤ４との密接な関係を示す。
ＬＡＧ３はまた、ＣＤ２２３（ＣＤ分類２２３（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ２２３））と称された。

ＬＡＧ−３は、配列番号７に示されるとおりのアミノ酸配列を有し得る。

本発明によれば、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列を有
し得る。非限定的実施形態において、ＬＡＧ−３ポリペプチドは、少なくとも２０個、も
しくは少なくとも３０個、もしくは少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個、およ
び最大５２４個までのアミノ酸の長さである配列番号７の連続部分であるアミノ酸配列を
有し得る。代わりにもしくはさらに、非限定的な種々の実施形態において、ＬＡＧ−３ポ
リペプチドは、配列番号７のアミノ酸１〜５２５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１
５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４
００、４００〜４２０、４２１〜４５０、４５１〜４７１、４７２〜５２５、４２１〜５
２５、４５１〜５２５、もしくは４７２〜５２５のアミノ酸配列を有する。一実施形態に
おいて、上記ＬＡＧ−３ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸４７２〜５２５のアミノ
酸配列を有する。ある種の実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイ
ンは、配列番号７のアミノ酸４７２〜５２５のアミノ酸配列を有するＬＡＧ−３ポリペプ
チドを含む。ある種の実施形態において、上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号７
のアミノ酸４５１〜４７１のアミノ酸配列を有するＬＡＧ−３ポリペプチドを含む。

本発明によれば、「ＬＡＧ−３核酸分子」とは、ＬＡＧ−３ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドをいう。

ナチュラルキラー細胞レセプター２Ｂ４（２Ｂ４）
ナチュラルキラー細胞レセプター２Ｂ４（２Ｂ４）は、ＮＫ細胞およびＴ細胞のサブセッ
トに対する非ＭＨＣ拘束細胞死滅を媒介する。今日まで、２Ｂ４の機能は、未だ調査中で
あるが、２Ｂ４−Ｓアイソフォームは、活性化レセプターであると考えられ、２Ｂ４−Ｌ
アイソフォームは、免疫細胞の負の免疫調節因子であると考えられている。２Ｂ４は、そ
の高アフィニティーリガンドであるＣＤ４８を結合する際に結合状態になる。２Ｂ４は、
チロシンベースのスイッチモチーフ（上記タンパク質を種々のホスファターゼと会合させ
る分子スイッチを含む。２Ｂ４は、ＣＤ２４４（ＣＤ分類２４４）とも称された。

２Ｂ４は、配列番号８に示されるとおりのアミノ酸配列を有し得る。

本発明によれば、２Ｂ４ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列を有し得
る。非限定的実施形態において、２Ｂ４ポリペプチドは、少なくとも２０個、もしくは少
なくとも３０個、もしくは少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個、および最大３
６９個までのアミノ酸の長さである配列番号８の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る
。代わりにもしくはさらに、非限定的な種々の実施形態において、２Ｂ４ポリペプチドは
、配列番号８のアミノ酸１〜３７０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０
〜２１５、２１６〜２２９、２３０〜２５０、２５１〜３７０、２１６〜３７０、２３０
〜３７０、もしくは２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、上記
２Ｂ４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する。
ある種の実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８
のアミノ酸２５１〜３７０のアミノ酸配列を有する２Ｂ４ポリペプチドを含む。ある種の
実施形態において、上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸２３０〜２
５０のアミノ酸配列を有する２Ｂ４ポリペプチドを含む。

本発明によれば、「２Ｂ４核酸分子」とは、２Ｂ４ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドをいう。

Ｂリンパ球およびＴリンパ球減衰因子（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）（ＢＴＬＡ）
Ｂリンパ球およびＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）発現は、Ｔ細胞の活性化の間に誘発さ
れ、ＢＴＬＡは、Ｔｈ１細胞で発現されたままであるが、Ｔｈ２細胞ではそうではない。
ＰＤ１およびＣＴＬＡ４のように、ＢＴＬＡは、Ｂ７ホモログであるＢ７Ｈ４と相互作用
する。しかし、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４とは異なり、ＢＴＬＡは、細胞表面レセプタ
ーのＢ７ファミリーだけでなく、腫瘍壊死ファミリーレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）との相互
作用を介してＴ細胞阻害を示す。ＢＴＬＡは、腫瘍壊死因子（レセプター）スーパーファ
ミリーのリガンドであるメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）（ヘルペスウイルス侵入媒介
因子（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｎｔｒｙｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）として
も公知）である。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。ＢＴＬ
Ａ活性化は、ヒトＣＤ８^＋癌特異的Ｔ細胞の機能を阻害することが示された。ＢＴＬＡは
また、ＣＤ２７２（分化クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎ）２７２）と称された。

ＢＴＬＡは、配列番号９に示されるとおりのアミノ酸配列を有し得る。

本発明によれば、ＢＴＬＡポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％、９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列を有し
得る。非限定的実施形態において、ＢＴＬＡポリペプチドは、少なくとも２０個、もしく
は少なくとも３０個、もしくは少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個、および最
大２８８個までのアミノ酸の長さである配列番号９の連続部分であるアミノ酸配列を有し
得る。代わりにもしくはさらに、非限定的な種々の実施形態において、ＢＴＬＡポリペプ
チドは、配列番号９のアミノ酸１〜２８９、１〜５０、５０〜１００、１００〜１３４、
１３５〜１５７、１５８〜１７８、１７９〜２８９、１３５〜２８９、１５８〜２８９、
もしくは１７９〜２８９のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、上記ＢＴＬＡポ
リペプチドは、配列番号９のアミノ酸１７９〜２８９のアミノ酸配列を有する。ある種の
実施形態において、上記ｉＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９のアミノ
酸１７９〜２８９のアミノ酸配列を有するＢＴＬＡポリペプチドを含む。ある種の実施形
態において、上記ｉＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号９のアミノ酸１５８〜１７８の
アミノ酸配列を有するＢＴＬＡポリペプチドを含む。

本発明によれば、「ＢＴＬＡ核酸分子」とは、ＢＴＬＡポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをいう。

造血細胞系統
哺乳動物造血（血液）細胞は、多様な範囲の生理学的活性を提供する。造血細胞は、リン
パ系統、骨髄系統および赤血球系統へと分かれる。リンパ系統（Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナ
チュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む）は、抗体の生成、細胞性免疫系の調節、血中の外来
因子の検出、宿主にとって外来の細胞の検出などを提供する。用語「Ｔ細胞」とは、本明
細書で使用される場合、胸腺で成熟し、細胞媒介性免疫を主に担うリンパ球をいう。Ｔ細
胞は、適応免疫系に関与する。用語「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」とは、本明細書で
使用される場合、細胞媒介性免疫の一部であり、先天的な免疫応答の間に作用するリンパ
球をいう。それらは、標的細胞に対してそれらの細胞傷害性効果を発揮するために、事前
の活性化を要しない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬもしくはキラーＴ細胞）は、感染した体
細胞もしくは腫瘍細胞の死滅を誘発し得るＴリンパ球のサブセットである。

本発明の方法において使用するための細胞
本発明は、免疫応答細胞を活性化する抗原認識レセプター（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）お
よび阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）の組み合わせを発現する細胞、ならびに増
強された免疫応答を要する疾患の処置のためにこのような細胞を使用するための方法を提
供する。１つのアプローチにおいて、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、記憶、ナ
イーブ、エフェクター、Ｔ−ｒｅｇなどを含む全てのサブセット）、先天性免疫系の細胞
、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞もしくは他の免疫応答細胞は、新生物形成の処置もしくは予防の
ために、非腫瘍組織の抗原と結合するｉＣＡＲを発現させるために使用される。例えば、
ＣＤ１９を認識するキメラ抗原レセプター１９−２８ｚを発現するＴ細胞は、ＣＤ３３を
結合するｉＣＡＲを発現するＴ細胞において共発現される。このような細胞は、血液の癌
（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）の処置もしくは予防のために、必要なヒト
被験体に投与される。別のアプローチにおいて、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞、ＮＫ細胞、
ＣＴＬ細胞は、ウイルス疾患の処置のために使用され得る。上記細胞は、組換えもしくは
内因性の抗原レセプターを発現し得、これらは、ＣＤ１９に対して特異的である１９−２
８ｚ、ＰＳＭＡに対して特異的であるＰ２８ｚ、メソテリンに対して特異的であるＭ２８
ｚ、もしくはＣＤ５６に対して特異的である５６−２８ｚであり得る。

患者自身のＴ細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）といわれる人工Ｔ細胞レセプター
をコードする遺伝子の導入を通じて腫瘍を標的化するように遺伝子改変され得る。ＣＡＲ
は、免疫応答を活性化するＣＡＲおよび免疫応答を抑制するｉＣＡＲを含む。

腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球（およびＮＫ細胞）
本発明の方法において使用され得る腫瘍抗原特異的ヒトリンパ球のタイプとしては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するよ
うに遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ、Ｍ．、ｅｔａｌ．２
００３ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ３：３５−４５）、ａおよびヘテロダイマーを
含む全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞レセプター複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ド
ナーリンパ球（Ｍｏｒｇａｎ、Ｒ．Ａ．、ｅｔａｌ．２００６Ｓｃｉｅｎｃｅ３
１４：１２６−１２９）、腫瘍生検において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から得られたリ
ンパ球培養物（Ｐａｎｅｌｌｉ、Ｍ．Ｃ．、ｅｔａｌ．２０００ＪＩｍｍｕｎｏ
ｌ１６４：４９５−５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ、Ｍ．Ｃ．、ｅｔａｌ．２０００
ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６４：４３８２−４３９２）、および人工抗原提示細胞（ＡＡＰ
Ｃ）もしくはパルスした（ｐｕｌｓｅｄ）樹状細胞を使用する選択的にインビトロで増大
させた抗原特異的末梢血白血球（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｊ．、ｅｔａｌ．２００５Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓ６５：５４１７−５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ、Ｇ．Ａ．、
ｅｔａｌ．２００３Ｂｌｏｏｄ１０２：２４９８−２５０５）。上記Ｔ細胞は、
自己由来の、非自己由来の（例えば、同種異系）もしくはインビトロで操作された前駆細
胞もしくは幹細胞に由来するものであり得る。Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、も
しくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で一般に行われるように大量に（ｉｎｂｏｌｋ）調
製されてもよいし、Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌを使用することによ
って精製されてもよい。

任意の適切な腫瘍抗原（抗原性ペプチド）は、本明細書で記載される腫瘍関連実施形態に
おける使用に適している。免疫応答活性化抗原の供給源としては、癌タンパク質が挙げら
れるが、これらに限定されない。上記抗原は、ペプチドとして、または無傷なタンパク質
もしくはその一部として発現され得る。上記無傷なタンパク質もしくはその一部は、天然
であってもよいし、変異誘発されていてもよい。適切な免疫応答活性化抗原としては、前
立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＣＳＡ）が挙げられる。

ウイルス抗原特異的Ｔリンパ球（およびＮＫ細胞）
病原体感染もしくは他の感染性疾患の処置において、例えば、免疫無防備状態の被験体に
おいて使用するのに適した抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）、およびインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原。

ＣＴＬの未精製供給源は、当該分野で公知のもののいずれかであり得る（例えば、骨髄、
胎児、新生児もしくは成体または他の造血細胞源、例えば、胎児肝臓、末梢血もしくは臍
帯血）。種々の技術が、上記細胞を分離するために使用され得る。例えば、負の選択法は
、非ＣＴＬを最初に取り出し得る。ｍＡｂは、特定の細胞系統および／もしくは正の選択
もしくは負の選択の両方に関する分化のステージと関連するマーカーを同定するために特
に有用である。

最終的に分化した細胞の大きな割合が、比較的粗い分離によって最初に取り出され得る。
例えば、磁性ビーズ分離は、多数の関連性のない細胞を取り出すために最初に使用され得
る。好ましくは、全造血細胞のうちの少なくとも約８０％、通常は少なくとも７０％が、
細胞単離の前に取り出される。

分離手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：密度勾配遠心分離；リ
セット（ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ）；細胞密度を変える粒子への結合；抗体被覆磁性ビーズで
の磁性分離；アフィニティークロマトグラフィー；補体および細胞毒が挙げられるが、こ
れらに限定されない、ｍＡｂに結合したもしくはｍＡｂと関連して使用される細胞傷害性
薬剤；ならびに固体マトリクス（例えば、プレート、チップ）に結合させた抗体でのパニ
ング、傾瀉（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）または任意の他の従来技術。

分離および分析のための技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フ
ローサイトメトリー（これは、種々の程度の精製を有し得る）、例えば、複数のカラーチ
ャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル。

上記細胞は、死細胞と会合する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））を使用する
ことによって、死細胞に対して選択され得る。好ましくは、上記細胞は、２％ウシ胎仔
血清（ＦＣＳ）もしくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む媒体、または任
意の他の適切な、好ましくは無菌の等張性媒体の中に集められる。

よって、本発明は一般に、免疫応答細胞（例えば、第１の抗原と結合し、免疫応答細胞を
活性化するレセプター、および第２の抗原と結合し、免疫応答細胞を阻害するレセプター
を含むウイルス特異的もしくは腫瘍特異的Ｔ細胞）を提供する。

ベクター
免疫応答細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、実質的に均一
な細胞組成物を組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物で形質導入することによって達成され
得る。好ましくは、レトロウイルスベクター（γレトロウイルスベクターもしくはレンチ
ウイルスベクターのいずれか）は、上記ＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物を宿主細胞ゲノムの
中に導入するために使用される。例えば、抗原（例えば、腫瘍抗原、またはその改変体も
しくはフラグメント）を結合するレセプターをコードするポリヌクレオチドは、レトロウ
イルスベクターにクローニングされ得、発現は、その内因性プロモーターから、レトロウ
イルス長末端反復から、または選択的内部プロモーター（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｉｎ
ｔｅｒｎａｌｐｒｏｍｏｔｅｒ）から駆動され得る。非ウイルスベクターもしくはＲＮ
Ａも同様に使用され得る。ランダム染色体組み込み、もしくは標的化組み込み（例えば、
ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、ジンクフ
ィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、および／もしくはｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌ
ａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａ
ｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）を使用する）、または導入遺伝子発現（例えば、天然のもしくは
化学改変されたＲＮＡを使用する）が使用され得る。

腫瘍もしくはウイルス抗原特異的細胞を提供する細胞の最初の遺伝子改変のために、レト
ロウイルスベクターは、一般に、形質導入のために使用されるが、任意の他の適切なウイ
ルスベクターもしくは非ウイルス送達システムが使用され得る。上記細胞を遺伝子改変し
て、少なくとも２つの共刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含む細胞を提供するために
、レトロウイルス遺伝子移入（形質導入）は、同様に有効であると判明している。レトロ
ウイルスベクターおよび適切なパッケージング株の組み合わせもまた適切であり、ここで
キャプシドタンパク質は、ヒト細胞に感染させるために機能する。種々の広宿主性ウイル
ス生成細胞株は公知である（ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ、ｅｔａｌ．（１９８５）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ
、ｅｔａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２
９０２）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ、ｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０−６４６４）が挙げられるが
、これらに限定されない）。非広宿主性粒子もまた適切である（例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ
１１４もしくはＧＡＬＶエンベロープおよび当該分野で公知の任意の他のもので偽型化さ
れた粒子）。

考えられる形質導入法はまた、上記細胞とプロデューサー細胞との直接共培養（例えば、
Ｂｒｅｇｎｉ、ｅｔａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８−１４２２の
方法による）、または適切な増殖因子およびポリカチオンありもしくはなしでのウイルス
上清のみもしくは濃縮されたベクターストックとの培養（例えば、Ｘｕ、ｅｔａｌ．
（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３−２３０；およびＨｕｇｈｅｓ、
ｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方
法による）を含む。

形質導入するウイルスベクターは、免疫応答細胞において共刺激リガンドを発現するため
に使用され得る。好ましくは、その選択されたベクターは、高い感染効率、ならびに安定
な組み込みおよび発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅｅｔａｌ．、Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ８：４２３−４３０、１９９７；Ｋｉｄｏｅｔａｌ
．、ＣｕｒｒｅｎｔＥｙｅＲｅｓｅａｒｃｈ１５：８３３−８４４、１９９６；
Ｂｌｏｏｍｅｒｅｔａｌ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ７１：６６
４１−６６４９、１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２
：２６３２６７、１９９６；およびＭｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９、１９９７を参照のこ
と）。使用され得る他のウイルスベクターとしては、以下が挙げられる：例えば、アデノ
ウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのベクター、ワクシニアウイルス
、ウシパピローマウイルス、もしくはヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン・バーウ
イルス）（例えば、ｔｈｅｖｅｃｔｏｒｓｏｆＭｉｌｌｅｒ、ＨｕｍａｎＧｅｎ
ｅＴｈｅｒａｐｙ１５−１４、１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２
４４：１２７５−１２８１、１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓｅｔａｌ．、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ６：６０８−６１４、１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖｅｔａｌ
．、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：５５−
６１、１９９０；Ｓｈａｒｐ、ＴｈｅＬａｎｃｅｔ３３７：１２７７−１２７８、
１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３６：３１１−３２２、１９８
７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６：４０１−４０９、１９８４；Ｍｏ
ｅｎ、ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ１７：４０７−４１６、１９９１；Ｍｉｌｌｅｒｅ
ｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：９８０−９９０、１９８９；ＬｅＧ
ａｌＬａＳａｌｌｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９８８−９９０、１
９９３；およびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃｈｅｓｔ１０７：７７Ｓ− ８３Ｓ、１９９５のベ
クターもまた参照のこと）。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発されており、臨
床状況において使用されてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ３２３：３７０、１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、米国
特許第５，３９９，３４６号）。

非ウイルスアプローチはまた、細胞中でのタンパク質の発現のために使用され得る。例え
ば、核酸分子は、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３、１９８７；Ｏｎｏ
ｅｔａｌ．、ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ１７：２５９、１９９０；
Ｂｒｉｇｈａｍｅｔａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８
、１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ１０１：５１２、１９８３）、アシアロオロソムコイド−ポリリジン結合
体化（Ｗｕｅｔａｌ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ２６３：１４６２１、１９８８；Ｗｕｅｔａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６４：１６９８５、１９８９）の
存在下で核酸を投与することによって、または手術条件下でのマイクロインジェクション
（Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５、１９９０）によって
、細胞に導入され得る。遺伝子移入のための他の非ウイルス手段としては、インビトロで
リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラ
スト融合を使用するトランスフェクションが挙げられる。リポソームはまた、ＤＮＡを細
胞に送達するために潜在的に有益であり得る。被験体の罹患した組織への正常な遺伝子の
移植はまた、正常な核酸を培養可能な細胞タイプ（例えば、自己由来のもしくは異種由来
の初代細胞もしくはその子孫）にエキソビボで移入することによって達成され得、その後
、上記細胞（もしくはその子孫）は、標的とした組織に注射されるか、または全身に注射
される。組換えレセプターはまた、トランスポザーゼもしくは標的化ヌクレアーゼ（例え
ば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、もしくはＴＡＬＥヌクレアーゼ
）を使用して導かれ得るか、または得られ得る。一過性の発現は、ＲＮＡエレクトロポレ
ーションによって得られ得る。

ポリヌクレオチド治療法における使用のためのｅＤＮＡ発現は、任意の適切なプロモータ
ー（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）プロモーター、もしくはメタロチオネインプロモーター）から指向され得、
任意の適切な哺乳動物調節エレメントもしくはイントロン（例えば、伸長因子１αエンハ
ンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節され得る。例えば、望ましい場合
、特定の細胞タイプにおいて遺伝子発現を優先的に指向することが公知のエンハンサーは
、核酸の発現を指向するために使用され得る。使用されるエンハンサーとしては、組織特
異的エンハンサーもしくは細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが挙げられ
得るが、これらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンを治療用構築物として使用す
る場合、調節は、コグネイト調節配列によって、もしくは望ましい場合、異種供給源に由
来する調節配列（上記のプロモーターもしくは調節エレメントのうちのいずれかを含む）
によって、媒介され得る。

得られた細胞は、改変されていない細胞に類似の条件下で増殖させられ得、それによって
、上記改変された細胞が増大させられ得、種々の目的のために使用され得る。

ポリペプチドおよびアナログ
αＣＤ１９、αＰＳＭＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、および１９−
２８ｚポリペプチドまたはこれらの抗新生物活性を増強する（例えば、ヒト化モノクロー
ナル抗体）か、または免疫応答細胞において発現される場合に、細胞傷害性活性を阻害す
る（例えば、ｉＣＡＲ）方法で改変されているそれらのフラグメントもまた、本発明に含
まれる。本発明は、配列の中に変化を生じさせることによって、アミノ酸配列もしくは核
酸配列を最適化するための方法を提供する。このような変化としては、ある種の変異、欠
失、挿入、または翻訳後修飾が挙げられる。本発明はさらに、本発明の任意の天然に存在
するポリペプチドのアナログを含む。アナログは、本発明の天然に存在するポリペプチド
から、アミノ酸配列の差異によって、翻訳後修飾によって、またはその両方によって異な
り得る。本発明のアナログは、一般に、本発明の天然に存在するアミノ酸配列のうちの全
てもしくは一部と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
，９６％，９７％、９８％、９９％もしくはより高い同一性を示す。配列比較の長さは、
少なくとも５個、１０個、１５個もしくは２０個のアミノ酸残基、好ましくは、少なくと
も２５個、５０個、もしくは７５個のアミノ酸残基、およびより好ましくは、１００個よ
り多くのアミノ酸残基である。繰り返すと、同一性の程度を決定する例示的なアプローチ
において、密接に関連した配列を示すｅ^−３〜ｅ^−１００の間の確率スコアでＢＬＡＳＴ
プログラムが使用され得る。改変としては、ポリペプチドのインビボおよびインビトロで
の化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、もしくはグリコシ
ル化が挙げられ；このような改変は、ポリペプチド合成もしくはプロセシングの間に、ま
たは単離された改変酵素での処理の後に、起こり得る。アナログはまた、本発明の天然に
存在するポリペプチドから、一次配列における変化によって異なり得る。これらとしては
、天然および誘発性（例えば、照射もしくはエタンメチルスルフェートへの曝露によるか
、またはＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｄｅｄ．
）、ＣＳＨＰｒｅｓｓ、１９８９、もしくはＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，前出によ
って記載されるとおりの部位特異的変異誘発による、ランダム変異誘発から生じる）の両
方の遺伝子改変体が挙げられる。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸もしく
は天然に存在しないかもしくは合成のアミノ酸（例えば、βアミノ酸もしくはγアミノ酸
）を含む、環化ペプチド、分子、およびアナログもまた、含まれる。

全長ポリペプチドに加えて、本発明はまた、本発明のポリペプチドもしくはペプチドドメ
インのうちのいずれか１つのフラグメントを提供する。本明細書で使用される場合、用語
「フラグメント」とは、少なくとも５個、１０個、１３個、もしくは１５個のアミノ酸を
意味する。他の実施形態において、フラグメントは、少なくとも２０個の連続したアミノ
酸、少なくとも３０個の連続したアミノ酸、もしくは少なくとも５０個の連続したアミノ
酸、および他の実施形態において、少なくとも６０〜８０個、１００個、２００個、３０
０個もしくはより多くの連続したアミノ酸である。本発明のフラグメントは、当業者に公
知の方法によって生成され得るか、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、生物
学的活性にとって必要とされない発生期ポリペプチドからのアミノ酸の除去もしくは選択
的ｍＲＮＡスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の
除去）から生じ得る。

非タンパク質アナログは、本発明のタンパク質の機能的活性を摸倣するように設計された
化学構造を有する。このようなアナログは、本発明の方法に従って投与される。このよう
なアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超え得る。アナログ設計の方法は、当
該分野で周知であり、アナログの合成は、得られるアナログが、免疫応答細胞において発
現される場合にその元のポリペプチドの抗新生物活性を増大させるように化学的構造を改
変することによって、このような方法に従って行われ得る。これら化学的改変としては、
代わりのＲ基に置換すること、および参照ポリペプチドの特定の炭素原子における飽和の
程度を変化させることが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、上記タンパ
ク質アナログは、インビボでの分解に比較的抵抗性であり、投与の際により長期の治療効
果を生じる。機能的活性を測定するためのアッセイとしては、以下の実施例に記載される
ものが挙げられるが、これらに限定されない。

共刺激リガンド
少なくとも１種の共刺激リガンドとの相互作用は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全な
活性化にとって重要な非抗原特異的シグナルを提供する。共刺激リガンドとしては、腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１
５もしくはＩＬ２１）、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが挙
げられるが、これらに限定されない。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、全身炎症に関与するサ
イトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は、免疫細胞の調節にある。腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドは、多くの共通する特徴を共有する。上記リガンドの大部
分は、短い細胞質セグメントおよび比較的長い細胞外領域を含むタイプＩＩ膜貫通型タン
パク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦリガンドとしては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ
１５４、ＣＤＩ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＣＤ１３４Ｌ／
ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３
０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）／リンホトキシンα（ＬＴα）、リンホ
トキシンβ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｉｙｓ／ＴＨＡ
ＮＫ／Ｔａｌｌ−１、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦレセプターリガンド（ＧＩＴＲＬ
）、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳ
Ｆ１４）。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合もしくは接
着プロセスに関与する細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の大きなグループであ
る。これらタンパク質は、免疫グロブリンと構造特徴を共有する。すなわち、それらは、
免疫グロブリンドメイン（折りたたみ）を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリ
ガンドとしては、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＯＳ（ともに、ＣＤ２８のリガンド）が
挙げられるが、これらに限定されない。

投与
本発明の遺伝子改変された免疫応答細胞（例えば、Ｔ細胞、先天性免疫系の細胞、ＮＫ細
胞、ＣＴＬ細胞、もしくはそれらの子孫）を含む組成物は、新生物形成、病原体感染、も
しくは感染性疾患の処置のために、被験体に全身にもしくは直接提供され得る。一実施形
態において、本発明の細胞は、目的の器官（例えば、新生物形成に冒されている器官）へ
と直接注射される。あるいは、遺伝子改変された免疫応答細胞を含む組成物は、上記目的
の器官へと、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、間接的に提供さ
れる。増殖および分化薬剤は、上記細胞の投与の前、その間、もしくはその後に提供され
て、Ｔ細胞、先天性免疫系の細胞、ＮＫ細胞、もしくはＣＴＬ細胞のインビボもしくはイ
ンビトロでの生成を増大し得る。

上記改変された細胞は、任意の生理学的に受容可能なビヒクル中で、通常は静脈内に投与
され得るが、それらはまた、骨もしくは他の都合の良い部位に導入され得、ここで上記細
胞は、再生および分化に適切な部位を見出し得る（例えば、胸腺）。通常、少なくとも１
×１０^５細胞が投与され、最終的には、１×１０^１０以上に達する。本発明の遺伝子改変
された免疫応答細胞は、精製された細胞集団を含み得る。当業者は、種々の周知の方法（
例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））を使用して、集団中の遺伝子改変さ
れた免疫応答細胞のパーセンテージを容易に決定し得る。遺伝子改変された免疫応答細胞
を含む集団中の純度の好ましい範囲は、約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、および約
６５〜約７０％である。より好ましくは、上記純度は、約７０〜約７５％、約７５〜約８
０％、約８０〜約８５％であり；そしてさらにより好ましくは、上記純度は、約８５〜約
９０％、約９０〜約９５％、および約９５〜約１００％である。投与量は、当業者によっ
て容易に調節され得る（例えば、純度の低下は、投与量の増大を要し得る）。上記細胞は
、注射、カテーテルなどによって導入され得る。望ましい場合、インターロイキン（例え
ば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ６、ＩＬ−１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１
、ならびに他のオンターロイキン）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳ
ＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、およびエ
リスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されない因子もまた、含まれ得る。

本発明の組成物は、遺伝子改変された免疫応答細胞もしくはそれらの子孫および薬学的に
受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を包含する。投与は、自己由来のもしくは異種由
来であり得る。例えば、免疫応答細胞、もしくは子孫は、ある被験体から得られ得、同じ
被験体もしくは異なる適合性の被験体に投与され得る。本発明の末梢血由来免疫応答細胞
もしくはそれらの子孫（例えば、インビボ、エキソビボもしくはインビトロ由来の）は、
カテーテル投与、全身投与、局所注射、静脈内注射、もしくは非経口投与を含め、局所注
射を介して投与され得る。本発明の治療的組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答細
胞を含む薬学的組成物）を投与する場合、それは一般に、単位投与注射形態（液剤、懸濁
物、エマルジョン）中に製剤化される。

製剤
遺伝子改変された免疫応答細胞を含む本発明の組成物は、選択されたｐＨに緩衝化され得
る滅菌液体調製物（例えば、等張性水性溶液、懸濁物、エマルジョン、分散物、もしくは
粘性組成物）として、都合の良いように提供され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘
性組成物、および固体組成物より調製しやすい。さらに、液体組成物は、投与する（特に
注射による）には、幾分より都合がよい。粘性組成物は、他方で、特定の組織とのより長
い接触期間を提供するために適切な粘性範囲内で製剤化され得る。液体もしくは粘性の組
成物は、溶媒もしくは分散媒（例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ポリ
オール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールな
ど）、およびこれらの適切な混合物を含む）であり得るキャリアを含み得る。

滅菌注射用溶液は、必要量の適切な溶媒の中に、望ましい場合には種々の量の他の成分と
ともに、本発明を実施するにあたって利用される遺伝子改変された免疫応答細胞を組み込
むことによって調製され得る。このような組成物は、適切なキャリア、希釈剤、もしくは
賦形剤（例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなど）と混合した状
態にあり得る。上記組成物はまた、凍結乾燥され得る。上記組成物は、投与経路および所
望の調製物に依存して、補助物質（例えば、湿潤剤、分散剤、もしくは乳化剤（例えば、
メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化剤もしくは粘性増強添加剤、保存剤、矯味矯
臭剤、着色剤など）を含み得る。標準テキスト、例えば、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰ
ＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ」、１７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５
（本明細書に参考として援用される）が、過度の実験なく適切な調製物を調製するために
調べられ得る。

上記組成物の安定性および滅菌性を増強する種々の添加剤（抗菌性保存剤、抗酸化剤、キ
レート化剤、および緩衝化剤が挙げられる）が、添加され得る。微生物活動の防止は、種
々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビ
ン酸などによって保証され得る。薬学的な注射用形態の長期の吸収は、球腫を遅らせる薬
剤、例えば、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、イヌリン（ｉｎｕｒｎ）モノステアレー
トおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本発明によれば、使用される
任意のビヒクル、希釈剤もしくは添加剤が、遺伝子改変された免疫応答細胞もしくはそれ
らの子孫と適合性でなければならない。

上記組成物は等張性であり得る。すなわち、それらは、血液もしくは涙液と同じ浸透圧を
有し得る。本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、もしくは他の薬学的に受
容可能な薬剤（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、ポリエチレングリ
コールまたは他の無機溶質もしくは有機溶質）を使用して達成され得る。塩化ナトリウム
は、特にナトリウムイオンを含む緩衝液にとって好ましい。

上記組成物の粘性は、望ましい場合、薬学的に受容可能な濃化剤を使用して選択したレベ
ルで維持され得る。メチルセルロースは、容易にかつ経済的に入手可能であり、扱いやす
いことから好ましい。他の適切な濃化剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシ
メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。上記
濃化剤の好ましい濃度は、選択される薬剤に依存する。重要な点は、選択された粘性を達
成する量を使用することである。明らかに、適切なキャリアおよび他の添加剤の選択は、
正確な投与経路および特定の投与形態（例えば、液体投与形態（例えば、上記組成物が溶
液、懸濁物、ゲルもしくは別の液体形態（例えば、徐放性形態もしくは液体充填形態（ｌ
ｉｑｕｉｄ−ｆｉｌｌｅｄｆｏｒｍ）へと製剤化される予定か否か）の性質に依存する
。

当業者は、上記組成物の成分が化学的に不活性であり、本発明に記載されるとおりの遺伝
子改変された免疫応答細胞の生存性もしくは効力に影響を与えないように選択されるべき
であることを認識する。これは、化学および薬学の原理に熟練した者にとって何ら問題を
提示せず、または問題は、標準テキストを参照することによって、もしくは単純な実験（
過度な実験を要しない）によって、本開示および本明細書で引用される文書から容易に回
避され得る。

本発明の遺伝子改変された免疫応答細胞の治療的使用に関する１つの懸念は、最適な効果
を達成するために必要な細胞の量である。投与される予定の細胞の量は、処置されている
被験体によって変動する。一実施形態において、１０^４〜１０^１０の間、１０^５〜１０^９
の間もしくは１０^６〜１０^８の間の本発明の遺伝子改変された免疫応答細胞が、ヒト被験
体に投与される。より有効な細胞が、さらに小数で投与されてもよい。いくつかの実施形
態において、少なくとも約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、および５
×１０^８の本発明の遺伝子改変された免疫応答細胞は、ヒト被験体に投与される。何が有
効用量であるかの正確な決定は、各被験体に特有の因子（それらの大きさ、年齢、性別、
体重、および特定の被験体の状態が挙げられる）に基づき得る。投与量は、本開示および
当該分野の知識から、当業者によって容易に確認され得る。

当業者は、本発明の組成物中の、および本発明の方法において投与される予定の細胞およ
び選択肢的な添加剤、ビヒクル、および／もしくはキャリアの量を容易に決定し得る。代
表的には、任意の添加剤（活性な細胞および／もしくは薬剤に加えて）は、リン酸緩衝化
生理食塩水中に０．００１〜５０％（重量）溶液の量で存在し、上記活性成分は、マイク
ログラムもしくはミリグラム程度（例えば、約０．０００１〜約５重量％、好ましくは、
約０．０００１〜約１重量％、さらにより好ましくは、約０．０００１〜約０．０５重量
％もしくは約０．００１〜約２０重量％、好ましくは、約０．０１〜約１０重量％、およ
びさらにより好ましくは、約０．０５〜約５重量％）で存在する。当然のことながら、動
物もしくはヒトに投与される予定の任意の組成物に関して、および任意の特定の投与方法
に関して、そのために：毒性（例えば、適切な動物モデル（例えば、マウスのような齧歯
類）において致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定する）；ならびに上記組成物の投与
量、その中の成分の濃度および上記組成物を投与するタイミング（これは、適切な応答を
誘発する）を決定することは、好ましい。このような決定は、当業者の知識、本開示およ
び本明細書で引用される文書から過度な実験を要しない。そして逐次的な投与の時間は、
過度な実験なしに確認され得る。

処置方法
本明細書で提供されるのは、被験体において新生物形成を処置するための方法である。被
験体（例えば、免疫無防備状態のヒト被験体）において病原体感染もしくは他の感染性疾
患を処置するための方法もまた、本明細書で企図される。上記方法は、本発明のＴ細胞、
先天性免疫系の細胞、ＮＫ細胞、もしくはＣＴＬ細胞を、望ましい効果、既存の状態の緩
和もしくは再発の防止を達成するために有効な量で投与する工程を包含する。処置に関し
て、投与される量は、望ましい効果を生じるにあたって有効な量である。有効量は、１回
の投与もしくは一連の投与の中で提供され得る。有効量は、ボーラスでもしくは連続灌流
によって提供され得る。

「有効量」（もしくは「治療上有効な量」）は、処置の際に有益なもしくは所望の臨床的
結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１以上の用量で被験体に投与され得る
。処置に関して、有効量は、上記疾患の進行を和らげる、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔ
ｅ）、安定化する、改善する（ｒｅｖｅｒｓｅ）もしくは遅らせるか、またはさもなけれ
ば上記疾患の病理学的転帰を軽減するために十分な量である。上記有効量は、一般には、
症例毎を基本に医師によって決定され、当業者の技術範囲内である。有効量を達成するた
めに適切な投与量を決定する場合に、いくつかの要因が代表的には考慮される。これら要
因としては、被験体の年齢、性別および体重、処置されている疾患の状態、上記状態の重
症度ならびに投与される抗原結合フラグメントの形態および有効濃度が挙げられる。

抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法のために、１０^６〜１０^１０の範囲（例えば、
１０^９）の細胞用量が、代表的には注入される。上記遺伝子改変された細胞を上記宿主に
投与し、その後分化した際に、上記特定の抗原に対して特異的に指向されるＴ細胞が誘発
される。Ｔ細胞の「誘発」は、例えば、欠失もしくはアネルギーによる、抗原特異的Ｔ細
胞の不活性化を含み得る。不活性化は、自己免疫障害におけるように寛容性を確立もしく
は再確立するために特に有用である。上記改変された細胞は、当該分野で公知の任意の方
法によって投与され得る（静脈内、皮下、節内、腫瘍内、鞘内、胸腔内、腹腔内および胸
腺に直接、が挙げられるが、これらに限定されない）。

治療法
本発明は、必要な被験体において免疫応答を増大させるための方法を提供する。一実施形
態において、本発明は、被験体において新生物形成を処置もしくは予防するための方法を
提供する。本発明は、従来の治療介入に反応しない血液の癌（例えば、白血病、リンパ腫
、および骨髄腫）または卵巣癌を有する被験体の処置のために特に有用な治療を提供する
。治療に適切なヒト被験体は、代表的には、臨床基準によって区別され得る２つの処置群
を含む。「進行した疾患」もしくは「高腫瘍量」を有する被験体は、臨床的に測定可能な
腫瘍を有する被験体である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍の塊に基づいて（例えば、
触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラムもしくはＸ線によって；それら自体に
ある陽性の生化学的もしくは組織病理学的マーカーは、この集団を同定するためには不十
分である）検出され得るものである。本発明において具現化される薬学的組成物は、それ
ら状態を和らげる目的で、抗腫瘍応答を誘発するためにこれら被験体に投与される。理想
的には、結果として腫瘍塊の縮小が起こるが、任意の臨床的改善は利益を与える。臨床的
改善としては、進行のリスクもしくは速度の低下、または上記腫瘍の病理学的転帰の低減
が挙げられる。

適切な被験体の第２の群は、当該分野で「補助群」として公知である。これらは、新生物
形成の履歴を有したことがあるが、別の治療態様に応答性であった個体である。以前の治
療としては、外科的切除、放射線療法、および古典的な化学療法受けたことがあり得るが
、これらに限定されない。結果として、これら個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有しな
い。しかし、彼らは、元の腫瘍部位付近でもしくは転移によってのいずれかであっても、
上記疾患の進行のリスクがあると疑われる。この群は、高リスク個体および低リスク個体
へとさらに下位分類され得る。この下位分類は、最初の処置の前後に認められた特徴に基
づいて行われる。これら特徴は、臨床分やで公知であり、各異なる新生物形成に関して適
切に定義される。高リスク亜群に代表的な特徴は、腫瘍が隣接する組織に侵襲してしまっ
たか、またはリンパ節への侵襲を示すものである。

別の群は、新生物形成の遺伝的素因を有するが、新生物形成の臨床徴候をこれまで明示し
たことがない。例えば、乳癌と関連する遺伝的変異に関して試験陽性であるが、未だ妊娠
可能な年齢である女性は、予防的手術を行うのが適切になるまでに、新生物形成の発生を
予防的に妨げる処置において本明細書で記載される抗原結合フラグメントのうちの１種以
上を受けようとし得る。

以下の新生物形成のうちのいずれか：神経膠芽腫、黒色腫、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、
軟組織肉腫、および種々の癌腫（前立腺癌および小細胞肺癌が挙げられる）を有するヒト
新生物形成被験体は、特に適切な被験体である。適切な癌腫としては、腫瘍学分野で公知
のいずれかのものがさらに挙げられる（星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏
突起神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原
性肉腫、膵管腺癌、小細胞肺癌および大細胞肺癌（ｓｍａｌｌａｎｄｌａｒｇｅｃ
ｅｌｌｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、扁平上皮癌、細気管支肺胞癌（ｂｒｏｎｃｈｏ
ａｌｖｅｏｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮性腺癌、およびこれらの肝転移、リンパ管
肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）
、肝癌、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、
汗腺癌、乳頭状癌、脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、
胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫
、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網
膜芽腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、および
Ｈ鎖病、乳房腫瘍（例えば、管癌および小葉癌）、子宮頸部の扁平上皮癌および腺癌、子
宮および卵巣の上皮癌、前立腺癌、膀胱の移行扁平上皮癌、Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫
（リンパ節型およびびまん型）形質細胞腫、急性および慢性の白血病、悪性黒色腫、軟組
織肉腫および平滑筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない）。

上記被験体は、進行した疾患形態を有し得、その場合、処置目的は、疾患進行の緩和もし
くは改善、および／または副作用の改善を含み得る。上記被験体は、上記状態の履歴を有
し得、そのために、彼らは既に処置されており、その場合、治療目的は、代表的には、再
発のリスクの低下もしくは遅延を含む。

よって、本発明は、被験体において新生物形成を処置もしくは予防するための方法を提供
し、上記方法は、腫瘍抗原と結合し、免疫応答細胞を活性化するレセプター（例えば、Ｔ
ＣＲ、ＣＡＲ）および標的抗原と結合し、上記免疫応答細胞を抑制する阻害性キメラ抗原
レセプター（ｉＣＡＲ）をコードするベクターを含む、有効量の免疫応答細胞を投与する
工程を包含する。腫瘍抗原と結合し、上記免疫応答細胞を活性化するレセプター（例えば
、ＴＣＲ、ＣＡＲ）および標的抗原と結合し、上記免疫応答細胞を抑制する阻害性キメラ
抗原レセプター（ｉＣＡＲ）をコードするベクターの細胞表面発現の結果として、養子移
入されたヒトＴ細胞もしくはＮＫ細胞は、選択的細胞傷害性活性が与えられる。

一実施形態において、上記新生物形成は、血液の癌（例えば、白血病、リンパ腫、および
骨髄腫）、卵巣癌、肉腫、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、前立腺癌、乳癌、膀胱癌
、脳の癌、結腸癌、腸の癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、神経膠芽
腫、および咽頭癌からなる群より選択される。別の実施形態において、上記腫瘍抗原は、
以下のうちの１以上である：炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３
、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、
細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ
−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、レセプターチロシンプロテインキナーゼｅ
ｒｂ-Ｂ２，３，４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児型アセチルコリンレセプター
（ＡＣｈＲ）、葉酸レセプター−ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ
３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写
酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３レセプターサブユニットα−２（ＩＬ−１
３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼインサートドメインレセプター（ＫＤＲ）、ルイスＹ（
ＬｅＹ）、Ｌｌ細胞接着分子（ＬｌＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ−Ａ
Ｉ）、ムチン１６（Ｍｕｃ−１６）、ムチン１（Ｍｕｃ−１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）
、ＮＫＧ２Ｄリガンド、癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺
幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２
（ＴＡＧ−７２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ-Ｒ２）、もしくはウィルムス腫瘍
タンパク質（ＷＴ−１）。

他の実施形態において、本発明は、病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌
感染、寄生生物感染、もしくは原生動物感染）を有する患者を処置するための方法を提供
する。本発明は、免疫無防備状態の被験体において免疫応答を増強するために特に有用で
ある。本発明の方法を使用する処置に反応しやすい例示的なウイルス感染としては、サイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）、およびインフルエンザウイルスの感染が挙げられるが、これらに限定
されない。よって、本発明は、被験体において病原体感染を処置もしくは予防するための
方法を提供し、上記方法は、有効量の、本明細書で記載されるとおりの免疫応答細胞を投
与する工程を包含する。

キット
本発明は、新生物形成、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植の処置もしくは予防
のためのキットを提供する。一実施形態において、上記キットは、活性化抗原レセプター
および阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を含む免疫応答細胞の有効量を単位投与
形態で含む治療用もしくは予防用の組成物を含む。いくつかの実施形態において、上記キ
ットは、治療用もしくは予防用のワクチンを含む滅菌容器を含み；このような容器は、ボ
ックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、
もしくは当該分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチ
ック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、もしくは医薬を保持するために適した他の材
料から作製され得る。

望ましい場合、上記免疫応答細胞は、新生物形成、病原体感染、免疫障害もしくは同種異
系移植を有するかまたは発生させるリスクのある被験体に、上記細胞を投与するための説
明書と一緒に提供される。上記説明書は、一般に、新生物形成、病原体感染、免疫障害も
しくは同種異系移植の処置もしくは予防のための組成物の使用についての情報を含む。他
の実施形態において、上記説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明
；投与スケジュールおよび新生物形成、病原体感染、免疫障害もしくは同種異系移植また
はこれらの症状の処置もしくは予防のための投与；予防措置；警告；適応症；禁忌（ｃｏ
ｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）；過剰投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究
；および／または参考文献。上記説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷され得るか
、あるいは容器に貼付されるラベルとしてもしくは別個のシート、パンフレット、カード
または上記容器の中にもしくは容器と一緒に供給されるフォルダとして印刷され得る。

本発明の実施は、別段示されなければ、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、
細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術（これらは、当業者の十分に技術範囲内であ
る）を使用する。このような技術は、文献（例えば、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ」（Ｇａｉｔ、１９８４）；「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」
（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）；「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」
「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（
Ｗｅｉｒ、Ｉ９９６）；「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒ
ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒａｎｄＣａｌｏｓ、１９８７）
；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）；「ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１））
の中で十分に説明されている。これら技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの生成に適用可能であり、よって、本発明の作製および実施にあたって考慮され得る
。特定の実施形態のために特に有用な技術は、以下の節において考察される。

以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法をどのよう
に作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために示され、本発明者らが
彼らの発明として解釈するものの範囲を限定するとは意図されない。

実施例１．阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）はオフターゲット応答を回避する。

概要
Ｔ細胞療法は、いくつかの癌の処置に関する長期の効力および根治の可能性を示した。し
かし、それらの使用は、ドナーリンパ球注入後の移植片対宿主病において認められるよう
に、バイスタンダー組織への損傷、またはいくらかの操作されたＴ細胞療法において被る
「オンターゲット、オフ腫瘍」毒性によって制限される。非特異的免疫抑制および可逆性
のＴ細胞除去は、このような有害な応答を制御するための現在唯一の手段であるが、治療
利益を捨てるまたは二次的な合併症を引き起こすという犠牲を払っている。免疫阻害性レ
セプターの生理学的パラダイムに基づいて、抗原特異的阻害性キメラ抗原レセプター（ｉ
ＣＡＲ）を、Ｔ細胞応答を先制的に抑えるように設計した。その結果は以下に示されると
おり、ＣＴＬＡ−４ベースのもしくはＰＤ−１ベースのｉＣＡＲが、サイトカイン分泌、
細胞傷害性、および内因性Ｔ細胞レセプターもしくは活性化キメラレセプターを通じて誘
発される増殖を選択的に制限し得ることを示す。上記ｉＣＡＲの最初の効果は一時的であ
るので、Ｔ細胞がそれらの活性化レセプターによって認識される抗原とその後遭遇する際
に機能することを可能にする。このようにして、ｉＣＡＲは、不適切なＴ細胞特異性の転
帰を処置するというよりむしろ予防するためのダイナミックな自己調節性安全スイッチを
提供する。

導入
Ｔ細胞療法は、骨髄および臓器移植、癌免疫療法、ウイルス感染、ならびに自己免疫疾患
において臨床効力を示した（１−６）。不運なことに、Ｔ細胞は、有害な副作用にも関わ
り得る。「オンターゲットであるがオフ腫瘍」の有害事象は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ
）操作したＴ細胞およびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）操作したＴ細胞の両方を使用す
る癌免疫療法臨床試験において報告された。これらとしては、抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現
するＴ細胞で処置した慢性リンパ性白血病患者におけるＢ細胞形成不全（７−９）、肺上
皮に対する交叉反応性から生じると考えられる抗ＥＲＢＢ２ＣＡＲＴ細胞注入後の胎
児急性呼吸窮迫症候群（１０）、および癌精巣抗原を認識するＴＣＲで処置した患者が被
った心筋壊死もしくは神経毒性に由来するＴＣＲ誘発性の死亡（１１−１３）が挙げられ
る。同様に、同種異系の骨髄移植におけるドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）の治癒力の獲得
は、急性および慢性両方の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および骨髄形成不全の誘発によっ
て妨げられる（１４）。移植片対腫瘍（ＧＶＴ）の有益な効果をＧＶＨＤから区別するス
トラテジーは、今日まで成功が制限されている（１５）。

Ｔ細胞媒介性毒性を抑制する現在のアプローチは、Ｔ細胞に対して細胞増殖抑制性効果も
しくは細胞傷害性効果を発揮して、免疫応答を抑制する免疫抑制レジメン（例えば、高用
量コルチコステロイド治療）の使用に依拠している（１６）。有効ではあるものの、この
アプローチは、有益なＴ細胞機能と有害なＴ細胞機能との間を識別できない。さらに、免
疫抑制薬は、実質的な二次的副作用（例えば、易感染性、ならびに心臓、腎臓、および神
経の損傷）を引き起こす（１４）。自殺遺伝子操作ストラテジー（これは、毒性因子（例
えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（１７）もしくは誘発性カスパーゼ−９（
１８））の選択的酵素メタボライザーを使用し得る）、またはＴ細胞へと操作された異所
性エピトープを標的とする抗体媒介性除去ストラテジー（１９，２０）はまた、それらの
治療効力からも見境なく、Ｔ細胞を除去する。さらに、これらアプローチは、それらが有
害な副作用を観察した後に実施されるので反作用的（ｒｅａｃｔｉｖｅ）である。望まし
くないＴ細胞反応性を防止するストラテジーは、よって、非常に望まれる。

Ｔ細胞活性化の生理学的調節は、免疫阻害性レセプターを含むいくつかの機構（これらは
、Ｔ細胞応答を弱らせるかもしくは終わらせるにあたって中心的な役割を果たす）によっ
て達成される（２１，２２）。阻害性レセプターは、免疫応答を次第に減らすためにＴ細
胞刺激の間にアップレギュレートされ得るか、または活性化閾値を調節するために基礎発
現され得る。従って、阻害性レセプターＣＴＬＡ−４を欠損するマウスは、広範囲に及ぶ
Ｔ細胞活性化および増殖を示し、最終的には、活性化Ｔ細胞の浸潤を伴う重症の全身性自
己免疫疾患で死に至る（２３）。同様に、ＰＤ−１（活性化Ｔ細胞上で特異的に発現され
る別の阻害性レセプター）の喪失は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおおいて進行性の関節炎お
よび糸球体腎炎を、ならびに非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて加速した膵島炎を
引き起こす（２４，２５）。これらレセプターの調節およびそれらの下流のシグナル伝達
経路は、Ｔ細胞機能に対して実質的な影響を有する。Ｔ細胞刺激の間のＣＴＬＡ−４もし
くはＰＤ−１のインビトロでのライゲーションは、活性化、サイトカイン放出、および増
殖をブロックする（２６）。顕著なことには、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体
は、黒色腫、肺癌および腎癌を有するいくらかの患者において抗Ｔ細胞応答を抑制解除ス
ルことによって臨床上の有望性を示した（２２，２７，２８）。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ
−１両方のブロックはまた、慢性Ｂ型肝炎およびＨＩＶ感染における免疫機能不全および
ウイルス持続性を改善するために活発に調査されている最中である（２９，３０）。しか
し、非特異的免疫抑制と同様に、抗体媒介性阻害性レセプターチェックポイントブロック
は、抗原特異的ではないので、有益なＴ細胞集団と有害なＴ細胞集団との間を識別しない
。

遺伝子操作ストラテジーは、天然のＴ細胞阻害生理学を制御・利用し、抗原選択的様式で
Ｔ細胞応答を調節するために使用された。表面抗原認識ドメインと強力な急性阻害性シグ
ナル伝達ドメインとを併せ持って、活性化レセプターの同時の結合にも拘わらずＴ細胞応
答性を制限する阻害性キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ（ｉＣＡＲ））を設計した（図１Ａ
）。以下で示したように、ヒト初代Ｔ細胞において、ＰＤ−１ベースのおよびＣＴＬＡ−
４ベースのｉＣＡＲは、重要なＴＣＲもしくは活性化ＣＡＲ機能を可逆的に制限し、従っ
て、インビトロおよびインビボで、標的細胞とオフターゲット細胞との間の識別を可能に
する。

材料および方法
研究設計
本研究の目的は、抗原依存性かつ可逆性の様式で標的細胞に対するＴ細胞毒性を制限し得
る合成レセプターを作ることであった。ＣＴＬＡ−４もしくはＰＤ−１の細胞内テールお
よびｓｃＦｖ標的化ドメイン（ＰＳＭＡに対する）を使用する２つのこのようなレセプタ
ーを設計し、それらが（ｉ）ＴＣＲ駆動Ｔ細胞機能性もしくは（ｉｉ）ＣＡＲ駆動Ｔ細胞
機能性を、インビトロおよびインビボでブロックし得るか否かを分析した。インビトロで
は、（ｉ）細胞傷害性、（ｉｉ）サイトカイン分泌、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞増殖を分析
することに焦点を当てた。インビボ実験では、ｉＣＡＲがライブイメージングおよびエン
ドポイント分析（マウスの未処置群によって示される）を使用して細胞標的を保護する統
合能力を分析した。実験手順は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅ
ａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ−Ｋｅｔ
ｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）によって承認を受けた。上記
実験の全般的設計は、Ｔ細胞（ｉＣＡＲもしくはコントロールＰｄｅｌレセプターを発現
する）を標的細胞（ＰＳＭＡを発現するかもしくは欠いている）に曝し、常に内部コント
ロールの存在下でｉＣＡＲ機能をインターロゲートしようとする群を比較することであっ
た。ｉＣＡＲを欠いているＴ細胞は、Ｔ細胞をｉＣＡＲもしくはｉＣＡＲ／ＣＡＲ二重陽
性（レポーター遺伝子を使用する）であるようにソートすることによって、結果に混合を
引き起こすことから制限された。各実験を、種々のドナーＴ細胞を使用して複数回行った
（Ｔ細胞は決してプールしなかった）。大部分の場合、代表的実験（サンプル複製は３よ
り大きい）を使用するデータを、形質導入効率およびソーティング効率、ドナー関連変動
性、ならびにＥ／Ｔ比に起因する差異のような混乱させる変数を回避するために示した。

阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）設計
各阻害性キメラ抗原レセプター（ｉＣＡＲ）を、２つのアプローチを使用するＵｎｉＰｒ
ｏｔ配列註釈とともに設計した。第１に、商業的遺伝子合成もしくはｃＤＮＡを使用して
、各レセプターの細胞内ドメインを、以前に記載されたＰｚ１レセプター（Ｓｔｅｐｈａ
ｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７．１３（１２）：１
４４０−９）のＣＤ２８／ＣＤ３ζドメインの代わりにクローニングし、従って、ＣＤ８
膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを利用した。ＣＤ８ポリペプチドは、以下に示され
るとおりのアミノ酸配列を有し得る：

上記ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを、配列番号１１のアミノ酸１３７〜２
０９のアミノ酸配列を有し得る。代わりにもしくはさらに、ＣＤ４膜貫通ドメインおよび
ヒンジドメインも使用し得、そして試験した。ｉＣＡＲ構築物の核酸配列およびアミノ酸
配列を、付録Ａに提供する。あるいは、上記膜貫通ドメインおよび最大で上記第１の註釈
をつけた細胞外位相的ドメイン（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｄｏｍａｉｎ）までのアミノ
酸（ＰＤ−１に関してはアミノ酸１４５〜２８８：ＣＴＬＡ４に関してはアミノ酸１６１
〜２２３）を、各レセプターの内因性ヒンジ領域を利用するように含めた。これら構築物
を、ＰＳＭＡｓｃＦｖの後ろにＰ２８ｚベクターにクローニングした。上記２つのアプ
ローチによって生じたレセプターの間で、有意な機能的差異は認められなかった。さらに
、いかなる標的化ドメインをも欠いているが、各レセプターの膜貫通部分および細胞内部
分を保持する、各ｉＣＡＲのバージョンを作った。コントロールＰｄｅｌレセプターを、
Ｐ−２８ｚのＣＤ２８／ＣＤ３ζドメインを削除することによって設計した（３４）。ｉ
ＣＡＲは、ＣＡＲ（これらの全ては、ｉＣＡＲとは全く対照的に、Ｔ細胞活性化を誘発す
る）から明確に区別されるべきである。ＰＳＭＡｓｃＦｖの核酸配列は、以下に提供さ
れる：

ＰＳＭＡｓｃＦｖのアミノ酸配列は、以下に提供される：

レセプター（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、２Ｂ４、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ−４
）をまた、ＣＤ１９標的ｓｃＦＶで試験した。ＣＤ１９ｓｃＦＶの核酸配列は、以下に
提供される：

ＣＤ１９ｓｃＦＶのアミノ酸配列は、以下に提供される：

上記ＰＳＭＡ標的ｓｃＦＶおよび上記ＣＤ１９標的ｓｃＦＶは、適切な構造的考察が認め
られる限りにおいて、ｉＣＡＲのモジュラー性質に起因して交換され得る。

結合体化アッセイ、ウェスタンブロットおよびＧＡＭ染色

各ｉＣＡＲの細胞表面発現を、以前に記載されたヤギ抗マウス染色プロトコル（Ｍａｒｋ
ｌｅｙｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１０．１１５（１７）：３５０８−１９）
を使用して分析した。細胞結合体化アッセイを、以前に記載されたように行った（Ｂｕｒ
ｓｈｔｙｎａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅａｓｓａｙｕｓｉｎｇｔｗｏ−ｃｏｌｏｒｆｌｏｗｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０
．６１２：８９−９６）。簡潔には、ＥＬ４細胞もしくはＥＬ４−ＰＳＭＡ細胞を、
親油性ＤｉＤ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、１：１比でＴ細胞とＦＡＣＳチュ
ーブ中で混合し、３７℃において５分間インキュベートし、フローサイトメトリーで分析
した。ウェスタンブロット分析を、標準プロトコルを使用してＢｉｏ−ｒａｄＭｉｎｉ
−ＰＲＯＴＥＡＮＴｅｔｒａシステムで行った。ＣＴＬＡ−４の細胞内テールを、ＣＴ
ＬＡ−４末端を認識するポリクローナル抗体Ｃ−１９（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して検出した。

レトロウイルスベクターおよびウイルス生成
ＳＦＧオンコレトロウイルスベクターをコードするプラスミドを、標準的分子生物学技術
を使用して調製した。１９−２８ｚ−ＩＲＥＳ−ＬＮＧＦＲ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＧＦ
Ｐ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびコメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬ）ベクターの合成が記載
されている（Ｍａｒｋｌｅｙｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１０．１１５（１７）
：３５０８−１９；Ｓｔｅｐｈａｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ、２００７．１３（１２）：１４４０−９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓｅｔａｌ．
、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、２００７．１３（１８：１）：５４２６−
３５）。レトロウイルスプロデューサーを、プラスミドでトランスフェクトしたＨ２９細
胞上清から調製した（Ｓｔｅｐｈａｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ
、２００７．１３（１２）：１４４０−９）。

細胞株
ＥＬ４−ＣＤ１９、ＥＬ４−ＰＳＭＡならびに人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）ＮＩＨ３
Ｔ３−ＣＤ１９およびＮＩＨ３Ｔ３−ＰＳＭＡが記載されている（Ｇａｄｅ（２００５
）；Ｓｔｅｐｈａｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７．
１３（１２）：１４４０−９；Ｍａｈｅｒｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２．２０（１）：７０−７５；Ｍａｒｋｌｅｙｅｔ
ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１０．１１５（１７）：３５０８−１９；Ｂｒｅｎｔ
ｊｅｎｓｅｔａｌ．、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、２００７．１３（１
８：１）：５４２６−３５）。ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ１９−ＰＳＭＡ、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｃ
Ｄ１９−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ１９−ＧＦＰ、およびＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ
１９−ＣＢＬならびにＮＡＬＭ／６−ＣＢＬおよびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ−ＣＢＬは、
Ｈ２９プロデューサー細胞のそれぞれのレトロウイルス上清での形質導入後に得た。細胞
株の全ての比較群を、ＭｏＦｌｏソーターを使用して、ＣＤ１９、ＧＦＰ、もしくはｍＣ
ｈｅｒｒｙの同等の発現についてソートした。

末梢血白血球（ＰＢＬ）回収およびレトロウイルス形質導入
末梢血を、ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ−ＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎ
ｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）治験審査委員会によって承認されたプロトコルの下で、インフォー
ムド・コンセントの後に健康ドナーから得た。ＰＢＬを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを使
用して単離し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で４８時間活性化した。活性化Ｔ細胞を
、レトロネクチン被覆（Ｔａｋａｒａ）レトロウイルスベクター結合プレート中での遠心
分離によって３連続日目に形質導入した。細胞に、３日毎に、２０ＵのＩＬ−２を補充し
たＲＰＭＩ培地を供給した。形質導入の１０日後に、増強されたＧＦＰ（ｉＣＡＲをマー
クする）およびＬＮＧＦＲ（１９−２８ｚをマークする）に基づくＦＡＣＳ選択を使用し
て、ＭｏＦｌｏソーターで陽性細胞を単離した。ソート後分析を行って、両方のレポータ
ーの同等の発現を確保した。

ｉＰＳ由来線維芽細胞の生成
末梢血リンパ球をＰＨＡで活性化し、レトロウイルス上清（ｆ−ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｐ２Ａ
−Ｍｙｃ−Ｅ２Ａ−Ｓｏｘ２およびｆ−ｖｅｘＧＦＰ−Ｐ２Ａ−Ｏｋｔ４−Ｔ２Ａ-Ｋｌ
ｆ４）で形質導入し、２４時間後にＭＥＦフィーダー細胞上にプレートした（Ｔｈｅｍｅ
ｌｉ（２０１３））。培地を、形質導入後５日目に、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（
８ｎｇ／ｍｌ）を含むヒトＥＳ培地に交換し、その後、半分の培地を毎日交換した。Ｔ−
ｉＰＳコロニーは、形質導入の約２２〜２５日後に出現した。皮下異種移植片奇形腫アッ
セイを、Ｔ−ｉＰＳ−１．１０細胞株を使用して行った。３ヶ月間で、奇形腫を取り出し
、１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２Ｕ／ｍｌのディスパ
ーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３７℃で２時間処理して、単一の細胞懸濁物を得た。上
記細胞を、ＨＬＡ−ＡＢＣ陽性細胞に関してソートし、１％Ｌ−グルタミン、１％ペ
ニシリン、１％ストレプトアビジンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した
ＲＰＭＩ中での培養の１週間後、それらは、ｉＰＳ−ｆｉｂを再現性高く自発的に生じた
。

フローサイトメトリー
全てのフローサイトメトリー分析を、ＬＳＲＩＩサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア，Ｖｅｒ．９．６（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で
分析した。抗ヒトＬＮＧＦＲ、ＣＤ４５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、Ｈ
ＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ６２Ｌを、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
から得た；抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ９０、および４′，６−ジア
ミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；抗ヒ
トＰＳＭＡを、Ｍｅｄｉｃａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
から得た；抗ヒトＣＣＲ７をＲ＆Ｄから得た；抗ヒトＦｏｘｐ３（２３６Ａ／Ｅ７）、お
よびＦｏｘｐ３アイソタイプをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。

インビトロＴ細胞アッセイ
増殖、エフェクターサイトカイン生成アッセイ、および細胞傷害性アッセイに関して一般
には、ソートした精製Ｔ細胞の連続希釈物を、９６ウェル平底プレート（プレートの外側
ウェルは、エバポレーションの効果を最小限にするために培地のみを含む）中に、それぞ
れのＡＡＰＣ（４０〜５０Ｇｙで照射し、３×１０^４／ウェルで２４時間前に播種した）
に播種した。ｉＰＳ−線維芽細胞は、標的として使用した場合には照射しなかった。新鮮
な培地を３〜４日ごとにまたは培地の色が変化したときに添加した。サイトカイン生成を
、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
およびＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかによって、製造業者
の説明書に従ってテキスト中で述べられているとおりに定量した。Ｔ細胞数を、全ウェル
を集めることによって、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）上の生存細胞数（Ｄ
ＡＰＩ）およびＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して計算
した。全てのインビトロ培養実験を、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン、１％
ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で行った。明確に述べら
れなければ、いかなるときも外因性サイトカインを投与しなかった。

ルシフェラーゼＣＴＬアッセイ
読み取り値としてバイオルミネッセンスを使用する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッ
セイを、以前に記載されるように行った（Ｆｕｅｔａｌ．、ＰｌｏＳｏｎｅ、２０
１０．５（７）：ｅ１１８６７）。簡潔には、全てのインビトロルシフェラーゼアッ
セイを、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）および９６ウェルＯｐｔｉｃａｌＢｏｔｔｏｍＢｌａｃｋＭｉｃｒ
ｏｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）で行い、製造業者のプロトコルに従って僅かに調節して行っ
た。全ての標的細胞を、ＣＢＬとＧＦＰレポーターを発現するように操作して、同等の発
現レベルを確保した。培養培地を、１ウェルあたり５０μｌまで除去し、調製したルシフ
ェラーゼ試薬のうちの５０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、そのプレート
を５分間インキュベートして、上記細胞を完全に溶解させた。ＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ１００Ｓｅｒｉｅｓ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で測定を行った。Ｌｉｖｉｎ
ｇＩｍａｇｅソフトウェアバージョン２．６（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、光子放出
強度を定量した。

ＣＴＬの微速度顕微鏡検査および蛍光顕微鏡検査
全ての顕微鏡撮影法を、ライブイメージングシステムを装備したＺｅｉｓｓＡｘｉｏＶ
ｅｒｔ２００Ｍを使用して行った。微速度撮影動画を獲得し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフ
トウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）のＭｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａ
ｌＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを使用して編集した。ＣＴＬ実験に関しては、ｍＣｈｅｒｒ
ｙ陽性ＡＡＰＣのシグナルを、ＭｅｔａＭｏｒｐｈの中のＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＭｏｒ
ｐｈｏｍｅｔｒｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ機能を使用して定量した。

ｍｏＤＣおよび刺激
単球由来樹状細胞を、Ｔ−ｉＰＳ細胞と同じドナーからＭｏ−ＤＣＧｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎＴｏｏｌＢｏｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して生成した。上記ｍｏＤＣに、未成
熟ステージ（５〜６日目）において、６回の凍結融解サイクルを通じて生成したｉＰＳ−
Ｆｉｂ由来の溶解物を２４時間添加した。上記ＤＣの成熟を、ＣＤ８０、ＣＤ８６および
ＨＬＡ−ＤＲのフローサイトメトリーによって確認した。以前に記載されるように刺激を
行った（Ｙｕａｎｅｔａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０
０５．１７４（２）：７５８−６６）。簡潔には、第１回の刺激を、１：３０Ｔ細
胞／ｍｏＤＣ比を使用して、第２回を、１：１０〜１：３０比を使用して行った。１％
Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１０％ヒトＡＢ血清
（ＣｅｌｌＧｒｏ）および５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−１５（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を
補充したＲＰＭＩを、使用した。３日目に、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。

プロテオームプロファイラーアレイ
Ｔ細胞を、Ｅ／Ｔ比４：１において６０分間、ＡＡＰＣに曝し、洗浄し、溶解させ、ヒ
トホスホイムノレセプターアレイ上で（１００μｇ）を、製造業者（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ
ｓ）のプロトコルに従ってインキュベートした。全てのブロットを、露出レベルを標準化
するために同じｘ線フィルム上でのケミルミネッセンスを使用して検出した。スキャンし
たｘ線フィルム画像を、画像分析ソフトウェアで分析した。全てのピクセル密度を、内部
ｐＹコントロールで各アレイに対して正規化した。

マウスモデルおよび定量的バイオルミネッセンス
ＮＡＬＭ／６研究のために、６〜１２週齢の雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウス（Ｊａ
ｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、５×１０^５腫瘍細胞（単一の腫瘍もしくは腫瘍
混合型の実験に関して同じ用量）を静脈内接種した。ＮＡＬＭ／６細胞を、ＣＢＬとＧＦ
Ｐレポーターを発現するように操作した。４日後、３×１０^５のソートしたＴ細胞を静脈
内に注入した；細胞用量は、ソート後分析によって確認されるとおり、％ＧＦＰ^＋１９
−２８ｚ^＋に基づいた。２１日間でマウスを屠殺した（Ｔ細胞コントロールは、後肢麻痺
を示さない）。ｉＰＳ−ｆｉｂ研究のために、６〜１２週齢の雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ
_ｃ（ヌル）マウスに、氷冷ＲＰＭＩおよびＭａｔｒｉｇｅｌ混合物（ＢＤＢｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）の１：１混合物中に調製した１×１０^６細胞を腹腔内接種した。８日後に、
５×１０^５の２回ｍｏＤＣで刺激したＧＦＰソートＴ細胞を、腹腔内に注入した；細胞用
量は、ソート後分析によって確認されるとおり、パーセントＧＦＰ^＋に基づいた。さらに
、インビトロルシフェラーゼＣＴＬアッセイを行って、標的としてｉＰＳ−Ｆｉｂを使用
して、全ての群において同等の同種異系反応性を確立した。両方のモデルにおいて、Ｄ−
ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ，腹腔内に１５０ｍｇ／ｋｇ）を、コメツキムシルシフェ
ラーゼの基質として使用し、バイオルミネッセンス画像を、ＩＶＩＳ１００Ｉｍａｇ
ｉｎｇＳｙｓｔｅｍで集めた。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアバージョン２．
６を使用して、以前に記載された（Ｍａｒｋｌｅｙｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１
０．１１５（１７）：３５０８−１９）ように、バイオルミネッセンス画像化データ
セットを獲得および定量した。マウスを、ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒ
ｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）の組織ガイドラインに従ってケアし
た。

統計法
データを、本文中で述べられるように、平均±標準偏差／平均の標準誤差として提示する
。結果を、本文中で述べられるように、不対のスチューデントｔ検定（両側）によって、
もしくはＡＮＯＶＡによって分析した。統計的有意性をｐ＜０．０５として定義した。ペ
アワイズ多重比較を、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で多重比較のために較正した多重ｔ検定を
使用して行った。全ての正確なＰ値を提供する。全ての統計分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウ
ェアバージョン６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。

結果
１．ｉＣＡＲは、初代ヒトＴ細胞の細胞表面でよく発現される
特定の理論に拘束されないが、膜貫通領域を通じて免疫阻害性レセプター（ＣＴＬＡ−４
、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、もしくはＢＴＬＡ）のシグナル伝達ドメインに融合し
た抗原に対して特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）もしくはＦａｂは、抗原認識
に際して特異的にＴ細胞機能を阻害すると仮定した。これらレセプターは、免疫細胞阻害
能力を有するのでｉＣＡＲといわれ、特定の抗原と結合し、ＣＡＲ（免疫細胞活性化能力
を有するレセプターを記載するために使用される用語）とは異なるキメラレセプターであ
る。

ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して特異的なｓｃＦｖを、モデル表面抗原とし
て使用した（３１）。このｓｃＦｖは、広く研究されており、前立腺癌の免疫療法に関し
てフェーズ１治験で調査中である（３２）。ＰＳＭＡは、転移性前立腺癌において過剰発
現されているが、正常な腎臓、肝臓、結腸、および脳星状細胞においても見出される（３
３）。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、およびＢＴＬＡ細胞内ドメインを
それぞれ有する、ＰＳＭＡに対して特異的な５種の異なるｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ−Ｐといわ
れる）を、生成した。コントロールレセプター、Ｐｄｅｌを生成した。これは、標的化ｓ
ｃＦｖおよび膜貫通ドメインのみを有するが、細胞質ドメインを欠いていた（図（１Ｂ）
。各ｉＣＡＲを、バイシストロン性レトロウイルスベクターへと、ＩＲＥＳ−ＧＦＰレセ
プターモジュールとともにクローニングした（図１Ｂ）。末梢血単核細胞からのヒト初代
Ｔ細胞の形質導入の際に、上記ＣＴＬＡ４−ｉＣＡＲは、細胞表面で十分に発現されてお
り、ＰＤ−１−ｉＣＡＲ−ＰおよびＰｄｅｌは、Ｐ２８ｚレセプター（３４）（臨床試験
で現在使用されているＣＤ２８／ＣＤ３ζベースの二重シグナル伝達ＰＳＭＡ特異的レセ
プター）に類似のレベルで細胞表面で発現された（図１Ｃおよび図１Ｄ）。ホスホアレイ
を使用して、上記ＰＤ１−ｉＣＡＲがレセプター結合の際にシグナルを伝達しているか否
かを調べた。リン酸化の状態を、３Ｔ３−Ｓ標的に対して３ｔ３−Ｄ標的への曝露の際に
、ＲｎＤヒトホスホイムノレセプターアレイを使用して分析した。１９−２８ｚ−Ｐ−Ｐ
Ｄ１細胞を、３Ｔ３ＷＴ、３Ｔ３−Ｓ、もしくは３Ｔ３−Ｄ細胞のいずれかとともにイ
ンキュベートした。レセプター結合を２時間行い、次いで、ホスホ状態の細胞溶解物を分
析した。３Ｔ３−Ｄに曝露した細胞は、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、および２Ｂ４（全てＰ
Ｄ１シグナル伝達の下流の標的）のリン酸化に有意な増大を有し、重要なことには、３ｔ
３−Ｓへの曝露の場合には、全３種が、シグナル強度の低下を示した（図１８）。ＣＴＬ
Ａ４−ｉＣＡＲの場合には、ウェスタンブロットおよび細胞内フローサイトメトリーによ
って強い細胞内発現が認められたが、細胞表面発現は制限されていた（図１Ｃ、図１Ｄお
よび図９Ａ〜Ｃ）。表面発現を、Ｙ１６５Ｇ変異ＣＴＬＡ４−テール（細胞表面移動に重
要な残基）を使用して回復させて、ｍｕｔＣＴＬＡ４−ｉＣＡＲを構築した（図１Ｃ、図
１Ｄおよび図９Ａ〜Ｃ）。この知見は、休止Ｔ細胞において構成的にインターナライズさ
れ、エンドサイトーシスアダプター複合体ＡＰ−２との、そのチロシンモチーフＹＶＫＭ
（３５）を介する活性化を通じて分解されるＣＴＬＡ−４の生理学的移動と一致する。実
際に、Ｔ細胞活性化後の細胞表面への上記ＣＴＬＡ−４−ｉＣＡＲ−Ｐのアップレギュレ
ーションが見出され（図９Ｃ）、チロシンモチーフＹ１６５Ｇ変異を使用して構成的表面
発現を回復させて、ｍｕｔＣＴＬＡ−４−ｉＣＡＲ−Ｐを構築した。これは、休止細胞に
おいて細胞表面発現を示した（図１Ｃ）。ｉＣＡＲによるＰＳＭＡ認識は、細胞結合体化
アッセイを使用して示された。ここでｉＣＡＲ発現Ｔ細胞はＰＳＭＡを発現するマウス胸
腺腫ＥＬ４細胞を結合した（図１０Ａ）。

２．ｉＣＡＲは、抗原拘束様式でＴＣＲ応答を制限する
自己標的化Ｔ細胞に対するそれらの使用に加えて、ｉＣＡＲは、移植後ドナーリンパ球注
入においてＧＶＨＤの予防のために潜在的有用性を有する。従って、ｉＣＡＲの効力を、
アロ反応性（移植片拒絶、ＧＶＨＤおよび治療上の移植片対腫瘍（ＧＶＴ）応答の根底に
ある強力な免疫応答）の状況において、形質転換されていない代理の正常組織を保護する
ことにおいて評価した。さらに、内因性ＴＣＲ駆動初代ヒトＴ細胞応答に対するｉＣＡＲ
の効果を研究するために、標的としての樹状細胞（ＤＣ）に同系の抗原提示細胞および線
維芽細胞を刺激する場合に同種異系ＤＣを使用するアロ反応性モデル（図１１Ａ）を、確
立した（図１１Ａ）。このモデルにおいて、上記ｉＣＡＲ操作したＴ細胞もしくはＰｄｅ
ｌ操作したＴ細胞を、内因性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の極めて強力な刺激因子である
単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）で刺激し。次いで、線維芽細胞がＰＳＭＡ抗原を発現する
か否かに対して評価した。反復の皮膚生検を必要とせずに上記ＤＣに対して同系の再補充
可能な線維芽細胞を得るために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を確立した；安定な線維
芽細胞株（ｉＰＳ−ｆｉｂといわれる）を、ｉＰＳＣから得た（図１１Ｂ〜Ｄ）。上記ｉ
ＰＳ−ｆｉｂは、複製的な老化および接触阻害を示し、容易に形質導入、継代、およびＮ
ＯＤ／重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）／γ_ｃ ⁻マウスにおいて移植でき、上記マウスの中
でそれらは、腫瘍を形成することなく、数週間残った。ｉＰＳ−ｆｉｂに対して内因性Ｔ
ＣＲ特異性を有する強力なアロ反応性Ｔ細胞を獲得するために、ｍｏＤＣに上記同系ｉＰ
Ｓ−ｆｉｂに由来する溶解物を適用した。この刺激培養系は、いくつかのＴ細胞ドナーか
ら強い細胞傷害性およびＣＤ４駆動応答およびＣＤ８駆動応答の両方を生じるサイトカイ
ン分泌を刺激した（図１２Ａ〜Ｃ）。

上記ｉＣＡＲがＰＳＭＡ^＋細胞に対するアロ反応性を制限する能力を調べるために、２回
の適用したｍｏＤＣで刺激したｉＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくはＰｄｅｌ発現Ｔ細胞を、ソー
トし、次いで、ｉＰＳ−ｆｉｂもしくはＰＳＭＡを発現するｉＰＳ−ｆｉｂとともに同時
インキュベートした（図１３Ａ）（３６）。Ｔ細胞の全ての群は、効率的にｉＰＳ−ｆｉ
ｂを死滅させた。これは、同種異系の細胞傷害性（図２Ａおよび２Ｂ）を示すが、上記ｉ
ＣＡＲ陽性Ｔ細胞は、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ^＋細胞を死滅させるそれらの能力を有意
に阻害した（図２Ｃ）。ＰＤ−１ベースのｉＣＡＲを発現するＴ細胞による細胞傷害性は
、低いエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）比において最大で９５％までの程度低下した。
細胞傷害性が迅速に起こり、他のＴ細胞応答と比較して低い活性か閾値を有するので、サ
イトカイン分泌もまた分析した。上記ＰＤ−１ｉＣＡＲは、サイトカイン分泌のより強
い阻害を生じた（７９〜８８％低下）のに対して、上記ｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲは
、５５〜７１％低下を誘発した（図２Ｄ〜Ｆ）。これら結果は、ｉＣＡＲが、抗原依存性
様式で反応性を制限し得ることを示唆した。

３．ｉＣＡＲは、化学量論的様式で機能する
上記ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐが、その発現のレベルもしくは上記標的抗原の発現レベルに
依存して、差次的阻害レベルを提供し得るか否かを、調べた。ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐも
しくはＰｄｅｌの高レベルもしくは低レベルの発現に関して、刺激したＴ細胞をソートし
、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡに曝した（図１４Ａ）。Ｔ細胞死滅、サイトカイン放出、お
よび発現されたｉＣＡＲのレベルの間に、化学量論的関係性を見出した。上記ＰＤ−１
ｉＣＡＲ−Ｐの発現の低レベルに関してソートしたＴ細胞は、最大でＥ／Ｔ比１：１まで
で５０％阻害を提供し得るに過ぎなかったが、ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐ発現の高レベルは
、最大でＥ／Ｔ比８：１までで８０％阻害を可能にし、１６：１においてさらに５０％阻
害を可能にした（図３Ａおよび図３Ｂ）。上記ｉＣＡＲ抗原発現レベルの影響を調べるた
めに、ｉＰＳ−ｆｉｂを、高いもしくは低いＰＳＭＡ発現に関してソートし、ソートした
ＰＤ−１ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞に曝した（図１４Ｂ）。高ＰＳＭＡ発現を有するｉＰＳ
−ｆｉｂは、ある範囲のＥ／Ｔ比（１：１〜４：１）にわたって、ＰＤ−１ｉＣＡＲ−
ＰＴ細胞の死滅およびサイトカイン分泌のうちの少なくとも８０％を阻害したのに対し
て、低ＰＳＭＡ発現を有するｉＰＳ−ｆｉｂは、同レベルの阻害を提供しなかった（図３
Ｃおよび図３Ｄ）。

４．ｉＣＡＲは、インビボで同種異系応答を制限する
ｉＣＡＲが、インビボでＴ細胞媒介性の除去から組織を保護し得るか否かを調べるために
、ｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭＡ^＋細胞（これはまた、ＣＢＬを発現した）を、ＮＯＤ／ＳＣ
ＩＤ／γｃ⁻マウスに腹腔内注射した（図１４Ｂ）。上記細胞は、バイオルミネッセンス
画像化（ＢＬＩ）によってモニターされ得る小結節を樹立した。１×１０^６ｉＰＳ−ｆ
ｉｂ−ＰＳＭＡ^＋細胞を注射して５日後に、上記マウスを、５×１０^５ｍｏＤＣ刺激し
たＰｄｅｌ発現Ｔ細胞もしくはＰＤ−１−ｉＣＡＲ−Ｐ発現Ｔ細胞で処置した。上記Ｐｄ
ｅｌ群は、ＢＬＩシグナルの有意な減少（７〜２２倍）とともにｉＰＳ−ｆｉｂ−ＰＳＭ
Ａ^＋細胞を排除したのに対して、上記ＰＤ−１−ｉＣＡＲ−Ｐ群は、Ｔ細胞で処置しなか
ったコントロールマウスに類似して、ＢＬＩで小結節を一掃できなかった（図４Ａおよび
図４Ｂ）。これら結果は、ｉＣＡＲが、インビボでＴＣＲ駆動応答を抗原特異的様式で制
限し得るという証拠を提供する。

５．ｉＣＡＲは、活性化キメラ抗原レセプターを阻害し得る
活性化ＣＡＲの調節に対するｉＣＡＲの効果を研究するために、１９−２８ｚ（広範囲に
特徴付けられた、臨床試験で現在使用されている第２世代ＣＡＲ）を使用した；１９−２
８ｚは、ＣＤ１９抗原に応答して活性化およびＣＤ２８共刺激を提供する（９，３４）。
初代Ｔ細胞を、１９−２８ｚＣＡＲおよび上記ｉＣＡＲ−Ｐレセプターで形質導入し、
二重発現に関してソートし、それぞれ、以前に報告された、標的組織およびオフターゲッ
ト組織をまねて、ＣＤ１９もしくはＣＤ１９とＰＳＭＡの両方を発現する人工抗原提示細
胞（ＡＡＰＣ）に播種した（図１３Ｂおよび図１５Ａ）。上記１９−２８ｚキメラ抗原レ
セプター（ＣＡＲ）（広く特徴付けられた、現在臨床試験中の第２世代ＣＡＲ）を利用し
て、ＣＤ１９抗原に応じて活性化および共刺激シグナルを提供した（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ
ｅｔａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１１．１１８（１８）：４８１７−２８；Ｍａ
ｈｅｒｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２．２０
（１）：７０−７５）。Ａｌｔｈｏｕｇｈコントロール群由来のＴ細胞（１９−２８
ｚ単独もしくは１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌ）は、両方のＡＡＰＣに対して類似のサイトカイ
ン分泌を示したが、上記ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞は、オンターゲット細胞と比較して、オフタ
ーゲット細胞に曝した場合に、サイトカイン分泌の顕著な低下を示した（図５Ａおよび図
１５Ｂ）。ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐは、サイトカインレベルの最も強い低下を生じた（７
１〜８９％）のに対して、ｍｕｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲ−Ｐは、より小さな低下を誘発
し（４８〜６７％）、ＬＡＧ−３−、ＢＴＬＡ−、および２Ｂ４ｉＣＡＲ−Ｐは、３０
％阻害を誘発した。

１９−２８ｚは、ＣＤ１９発現ＡＡＰＣによって誘発される、強力な増殖シグナルを提供
する。１９−２８ｚ／ＰｄｅｌＴ細胞は、いずれのＡＡＰＣに対しても同様に増殖した
が、ｍｕｔＣＴＬＡ−４もしくはＰＤ−１ｉＣＡＲを発現するＴ細胞は、オフターゲッ
トＡＡＰＣの存在下で低下した蓄積を示し、上記ＰＤ−１ｉＣＡＲ−Ｐは、第２のＡＡ
ＰＣ刺激後のＴ細胞蓄積において蓄積９０％低下を引き起こした（図５Ｂ、図５Ｃおよび
図１５Ｃ）。上記ｉＣＡＲがＴ細胞サイトカイン分泌および増殖をブロックする能力を示
したので、ｉＣＡＲを、細胞傷害性に対するそれらの効果について評価したところ、それ
は、迅速に起こり、他のＴ細胞機能より低い活性化閾値を有する。この共培養系において
、ｍＣｈｅｒｒｙをさらに発現するように改変したこれらＡＡＰＣの運命の定量的顕微鏡
検査を行った（図５Ｄ）。３８時間以内に、１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−Ｐおよびコントロ
ール二重陽性Ｔ細胞の全ての群が、標的細胞を溶解した（図５Ｅ）。ＣＤ１９^＋ＰＳＭＡ
^＋オフターゲット細胞に曝された場合、上記ｍｕｔＣＴＬＡ−４ベースのおよびＰＤ−
１ベースのｉＣＡＲは、それぞれ、細胞傷害性において６７％および９１％の低下を引き
起こした（図５Ｆ）。ＰＤ−１の場合には、ＡＡＰＣは、５日間残ったのに対して、ｍｕ
ｔＣＴＬＡ−４ｉＣＡＲの効果は、より制限されていた（図５Ｄ）。従って、上記ＰＤ
−１ベースのｉＣＡＲを、さらにインビボで評価するために選択した。

インビボでのＰＤ−１ｉＣＡＲの機能を評価するために、ＮＡＬＭ／６、ＣＤ１９^＋
Ｂ細胞白血病細胞株（ＰＳＭＡあり）を評価し、治療的Ｔ細胞応答を、以前に確立された
異種移植片ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ ⁻マウスモデル（Ｍａｒｋｌｅｙｅｔａｌ．、Ｂ
ｌｏｏｄ、２０１０．１１５（１７）：３５０８−１９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓｅ
ｔａｌ．、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、２００７．１３（１８：１）：
５４２６−３５）において、ＮＡＬＭ／６およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ細胞に対して比
較した（図１５Ｄ）。全身腫瘍注入の５日後に、上記マウスを、単一用量の３×１０^５
１９−２８ｚ／ＰＤ−１−ｉＣＡＲＰソートした二重陽性Ｔ細胞で処置した。腫瘍量のバ
イオルミネッセント画像化（ＢＬＩ）は、ＮＡＬＭ／６（オンターゲット）とは対照的に
、ＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ（オフターゲット）の根絶において有意差（３倍〜１０倍減少
）を示した（図６Ａおよび図６Ｂ）。最初に骨髄に制限されたが、ＮＡＬＭ／６白血病は
、最終的には脾臓に侵襲し、その重量は、疾患負荷の後期指数を提供する。１９−２８ｚ
／ＰＤ−１−ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞での処置後に、ＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡマウスは、上
記コントロール「Ｔ細胞なし」群の脾臓重量において有意差を示さなかったが、ＮＡＬＭ
／６を有するマウスの脾臓重量は、１／２．６であった（図６Ｃ）。フローサイトメトリ
ー分析から、ＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ群とは対照的に、脾臓および骨髄中のＮＡＬＭ／６
細胞数の低下が確認された（図６Ｄおよび図６Ｅ）。並行して、Ｔ細胞のより多くの残留
が、ＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ群よりＮＡＬＭ／６群において認められた（図６Ｄおよび図
６Ｆ）。これら知見は、ＰＤ−１ベースのｉＣＡＲが、「オフターゲット」ＮＡＬＭ／６
−ＰＳＭＡ細胞のインビボでの排除を選択的に妨げると同時に、「オンターゲット」ＮＡ
ＬＭ／６細胞に対する治療応答を進めさせることを確立した。

６．ｉＣＡＲは、一時的かつ可逆的様式で機能する
ｉＣＡＲの臨床的有用性に関する魅力的な局面は、機能的可逆性、すなわち、阻害性オフ
ターゲット組織と以前接触した後のＴ細胞機能性の再出現である。ｉＣＡＲによる有効な
ＰＳＭＡ認識は、ｉＣＡＲ発現Ｔ細胞とＰＳＭＡを発現するＥＬ４細胞との結合退形成に
よって示されたが、野生型ＥＬ４細胞では示されなかった（図１６ＦＡ）。ｉＣＡＲの構
成的発現は、コントロールＴ細胞と比較してＴ細胞の増殖能（ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズも
しくはＤＣ活性化後）、サイトカイン分泌、もしくは表面マーカー発現を損なわなかった
（図１６Ａ〜Ｅおよび図１６Ｇ−Ｉ）。ｉＣＡＲ媒介性阻害の一時的特徴を評価するため
に、標的細胞およびオフターゲット細胞による逐次的Ｔ細胞刺激を、４種の異なるシーケ
ンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）で死滅、サイトカイン分泌、および増殖の能力を分析するた
めに設定した。１９−２８ｚ／ＰｄｅｌＴ細胞もしくは１９−２８ｚ／ＰＤ−１−ｉＣ
ＡＲ−ＰＴ細胞を、第１の刺激として、標的（ＣＤ１９^＋）もしくはオフターゲット（
ＣＤ１９^＋ＰＳＭＡ^＋）ＡＡＰＣのいずれかに曝し、続いて、第２の刺激でいずれかのＡ
ＡＰＣに曝した（図７Ａ）。上記第２の刺激の際に、両方のＴ細胞群は、上記第１の刺激
標的とは無関係に等しく標的細胞を死滅させた（図７Ｂ）。このことは、上記第１の刺激
においてオフターゲット細胞に曝した上記１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞が、標的
細胞を死滅させ、上記第２の刺激の間に両方の刺激において標的細胞に曝されたＴ細胞を
増殖させたことを裏付ける。１９−２８ｚ／Ｐｄｅｌを発現するコントロールＴ細胞は、
同じ条件下で低下した機能性を示さなかった。さらに、上記第１の刺激に対して活性化し
たＴ細胞は、上記第２の刺激に対して上記オフターゲットＡＡＰＣによって提示されたｉ
ＣＡＲリガンドに曝された際になお阻害され得た。このことは、ｉＣＡＲが、活性化Ｔ細
胞を調節し得たことを示唆する。両方の刺激に対してオフターゲット細胞に曝されたＴ細
胞は、上記第２の曝露に対してそれらの死滅能力のより大きな阻害を有することもまた観
察された（図７Ｃおよび７Ｄ）。

これら機能の知見を確証したので、本発明者らは、上記ＰＤ−１ｉＣＡＲ、１９−２８
ｚ／Ｐｄｅｌ、および１９−２８ｚ／ＰＤ−１−ｉＣＡＲ−Ｐの二重陽性Ｔ細胞が、調節
性ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２ホスファターゼを差次的にリン酸化することを見出した（
図１７Ａ〜Ｃ）。ＣＤ１９^＋標的ＡＡＰＣへの曝露は、脱リン酸化および結果として生じ
る、Ｔ細胞活性化の際のＳＨＰ−１／２の抑制効果のブロックを示す以前の研究（３９，
４０）と一致して、ＣＤ１９を欠いているＡＡＰＣへの曝露後に認められる、規定レベル
と比較してより低いＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２のリン酸化レベルを示した。対照的に、
ＣＤ１９およびＰＳＭＡを発現するオフターゲットＡＡＰＣへの曝露後に、ＳＨＰ−１お
よびＳＨＰ−２は、増大したリン酸化レベルを示した。これは、上記ＰＤ−１ｉＣＡＲ
が、上記内因性ＰＤ−１分子と同じ生化学的経路を増員することを裏付ける。

７．ｉＣＡＲおよびＣＡＲ二重発現Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボで標的を識別す
る
上記ＰＤ−１ベースのｉＣＡＲを発現するＴ細胞が、同じ生物内の標的細胞の存在下で、
オフターゲット細胞を防御することによって、インビトロで、および特にインビボで、標
的細胞間を識別し得るか否かを、評価した。この筋書きは、ＧＦＰ^＋ＣＤ１９^＋標的ＡＡ
ＰＣおよびｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＣＤ１９^＋ＰＳＭＡ^＋オフターゲットＡＡＰＣを１：１比
で混合するインビトロ共培養系において最初に扱った。微速度顕微鏡検査法を、１９−２
８ｚ／ＰｄｅｌＴ細胞もしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞の効果を分析する
ために行った。上記標的細胞および上記オフターゲット細胞の両方が、１９−２８ｚ／Ｐ
ｄｅｌＴ細胞によって類似の速度で排除されたが、上記１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−Ｐ
Ｔ細胞は、上記標的細胞を優先的に排除すると同時に、オフターゲット細胞を残した（図
８Ａ）。上記ＡＡＰＣのコメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬ）形質導入バージョンでの
三目並べ方式の実験を使用して、この選択性を定量した。３８時間で、上記１９−２８ｚ
／ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞は、上記標的ＡＡＰＣのうちの大部分（８５％）を排除したが、
上記オフターゲット細胞はそのうちの僅か（１０％）しか排除されず、微速度顕微鏡検査
法の結果を確証した（図８Ｂ）。

同じ選択性がインビボで達成され得るか否かを分析するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ_ｃ
⁻マウスに、ＮＡＬＭ／６腫瘍細胞およびＮＡＬＭ／６−ＰＳＭＡ腫瘍細胞の混合物を注
射し、これら動物を、１９−２８ｚ形質導入Ｔ細胞もしくは１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−Ｐ
形質導入Ｔ細胞で処置した。屠殺した際に、１９−２８ｚＴ細胞で処置したマウスは、
１９−２８ｚ／ｉＣＡＲ−ＰＴ細胞で処置したマウスと比較して、脾臓および骨髄中の
ＰＳＭＡ＋細胞数の３倍減少を示した（図８Ｃおよび８Ｄ）。よって、上記ｉＣＡＲ処置
群は、脾臓重量において３．３倍の増大および全体的な腫瘍量の増大を有した（図８Ｅ）
。これら実験は、標的細胞およびオフターゲット細胞の混合物の存在下で、ｉＣＡＲは、
インビボおよびインビトロの両方で、標的細胞の拒絶を止めることなく、オフターゲット
細胞を選択的に防御し得ることを示す。

考察
この実施例において、Ｔ細胞の特異性を制限するために遺伝的アプローチがとられたとこ
ろ、Ｔ細胞は、腫瘍特異的免疫療法を送達するための内因性の標的化機構を有するように
操作され得ることが示された。抗原認識ドメインを免疫阻害性レセプターＣＴＬＡ−４お
よびＰＤ−１のシグナル伝達ドメインと成功裡に組み合わせて、Ｔ細胞細胞傷害性の抗原
特異的抑制、サイトカイン放出、および増殖を達成した。この概念実証研究は、Ｔ細胞機
能をオフターゲット部位では制限し、従って、免疫応答を意図しない標的組織から反らす
ストラテジーとしてのｉＣＡＲの能力を示す。

上記ｉＣＡＲストラテジーの難題は、３つの重大な特性に依拠する。その第１は、ｉＣＡ
Ｒの基礎発現が、抗原の非存在下でＴ細胞機能を阻害しないことである。内因性ＣＴＬＡ
−４もしくはＰＤ−１シグナル伝達は、それらの効果を発揮するためにそれぞれのリガン
ドの存在を要する。同様に、本明細書で記載されるｉＣＡＲの発現は、基本的なＴ細胞機
能に影響を及ぼすとは見出されなかった。Ｔ細胞サブセットに制限される他の阻害性レセ
プターは、Ｔ細胞応答の調節を微細に調整するために協力して作用し得る（２１，２２）
。ＬＡＧ−３、２Ｂ４、およびＢＴＬＡのようなレセプター、ならびにこれらの組み合わ
せ（例えば、複数の組み合わされた細胞質ドメインを有する単一の第２世代ｉＣＡＲとし
て）は、さらなる調査を正当化する。

第２の重要な特性は、ｉＣＡＲの事前の結合にも拘わらず、Ｔ細胞機能性の維持である。
ｉＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、阻害性抗原への事前の曝露後に、標的抗原に対する応答をな
お高め得ることが見出された。この可逆性は、ナチュラルキラー細胞の挙動を思わせ、こ
こでは転写の変化ではなくシグナル伝達分子のリン酸化状態が、迅速な機能的応答（例え
ば、細胞傷害性）を制御する（４１）。抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｔ
細胞応答を一時的に調節する能力を繰り返し議論するが、アネルギー化したかもしくは疲
弊したＴ細胞の損なわれた機能を改善し得る（２２）。さらに、ＴＣＲ複合体に対するＰ
Ｄ−１およびＣＴＬＡ−４効果の生化学的分析は、リン酸化状態、下流のキナーゼ、およ
びアポトーシスではなく運動性に依存する（４０，４２−４４）。インビトロおよびイン
ビボ両方での結果は、オフターゲット細胞に応じた阻害と持続した治療的機能性を示すが
、上記細胞のうちのいくらかが、時間を経てアネルギー状態になり得る可能性はそれでも
ある（４２）。最終的には、いくつかのＴ細胞がそれらの標的に即座に遭遇して、それを
排除するのに対して、他のＴ細胞は、阻害精細胞に最初に遭遇すると推測されるのがＴ細
胞注入である。オフターゲット細胞に反復して遭遇するＴ細胞は増殖しない（治療応答を
進めさせると同時に、正常組織に対する免疫による攻撃を減らすことを目的とするｉＣＡ
Ｒストラテジーの満足いく結果）が考えられる。上記注入したＴ細胞集団の全体的な増殖
は、あるＴ細胞は増殖を受ける一方で、他方は抑制されて、恐らく、時間を経て全ての注
入されたＴ細胞の消失を生じる、クローンレベルで起こるこれら種々の経路を統合する。
実験条件下では、十分なＴ細胞が、３週間にわたって残って、標的とした腫瘍を排除した
。このような環境下では、第２のもしくは第３のＴ細胞注入物が、必要であれば、注入さ
れ得る。これは、他のところで考察されるように臨床的には有利であり得る（９）。オフ
ターゲット組織を保護すると同時に、腫瘍排除を進めさせる手段としての、アネルギーお
よびクローン性排除の結果としての誘発は、有害な反応がそれ自体、Ｔ細胞排除が誘発さ
れる前に発現されなければならず、治療応答の終結も生じる自殺遺伝子ストラテジーとは
対照的であるはずである。

上記ｉＣＡＲ媒介性免疫応答は、癌および慢性感染の処置のためのドナーリンパ球注入後
に、移植片対宿主病を制御するために有用である（特に、制限された毒性とともに、ＤＬ
Ｉの有益な特性を可能にする）。さらに、ｉＣＡＲは、癌および慢性感染の処置のための
操作された養子Ｔ細胞に由来する組織毒性からのターゲットオフの制御に有用である。こ
れは、養子Ｔ細胞療法後の意図しない心臓もしくは肺の認識のような受容できない毒性プ
ロフィールを有する有望な治療剤を復活させる可能性を高める。従って、ｉＣＡＲは、自
己由来および同種異系両方の状況での安全かつ効果的なＴ細胞両方を確立する新規なスト
ラテジーを提供する。

第３に、上記ｉＣＡＲアプローチは、抗原特異的であるので、腫瘍に存在しないかもしく
はダウンレギュレートされるが、オフターゲット組織によって発現される組織特異的標的
抗原を同定する能力を要する。この問題は、腫瘍抗原に関する研究として未だ広く調査さ
れていないが、ＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓデータベースのような活動は、全てのヒト組
織の「サーフェソーム（ｓｕｒｆａｃｅｏｍｅ）」を特徴付けている最中である（４５）
。１つのストラテジーは、腫瘍細胞でダウンレギュレートされる表面抗原の広いクラスを
使用することである。一例は、実質的に全ての細胞タイプで見出されるが、腫瘍がＴ細胞
免疫応答から逃れる機構として、腫瘍でダウンレギュレートされるヒト白血球抗原（ＨＬ
Ａ）分子によって表される（４６）。従って、腫瘍でダウンレギュレートされる宿主ＨＬ
Ａ分子に対するｉＣＡＲを発現する同種異系のＴ細胞は、ＧＶＴ効果を選択的に促進し得
る。上記ｉＣＡＲアプローチは、ＧＶＴ応答を損なうことなく、ＧＶＨＤ標的組織を防御
する手段として、ＤＬＩの状況で非常に重要であり得る。類似のストラテジーに使いやす
い（−ａｍｉａｂｌｅ）抗原の別のクラスは、細胞表面腫瘍サプレッサー抗原（例えば、
ＯＰＣＭＬ、ＨＹＡＬ２、ＤＣＣ、およびＳＭＡＲ１（４７−４９））を含む。ＯＰＣＭ
Ｌ−ｖ１は、例えば、全ての正常成体組織および胎児組織において広く発現されるが、リ
ンパ腫ならびに乳癌および前立腺癌においてダウンレギュレートされる。細胞表面炭水化
物、脂質、および翻訳後修飾（例えば、ムチンタイプＯ−グリカン（コア３Ｏ−グリカ
ン）はまた、腫瘍によってダウンレギュレートされることが見出された（５０）。別の候
補となる標的は、Ｅ−カドヘリンであり、これは、正常皮膚、肝臓、および消化管で高度
に発現され、ＧＶＨＤの主な標的（５１）であるが、上皮間葉転移を受けて、腫瘍進行お
よび転移を示す腫瘍細胞によってダウンレギュレートされる（５２）。

この研究の主な制限は、強い臨床的に関連性のあるヒト「正常組織」モデル、特に、ヒト
細胞、ヒト抗原、ならびにヒトＴＣＲ、ＣＡＲおよびｉＣＡＲの利用を可能にするモデル
の利用可能性がないことである。ヒトＴ細胞、ヒト標的抗原、およびヒトｉＣＡＲを使用
してアロ反応性反応を駆動するために、同じドナーに由来するＤＣと合わせたｉＰＳ細胞
を樹立することによって、このギャップを埋めようと試みられてきた。単に、ＨＬＡミス
マッチ同種異系Ｔ細胞と、ｉＰＳもしくはｉＰＳ−ｆｉｂ細胞とを共インキュベートする
ことでは、アロ反応性は生じなかった。同系ＤＣの使用は、強力なアロ反応性を生じるた
めに重要であった。このアロ反応性の性質は、定義されなかったので、ブロックされた応
答がＧＶＨＤに関与する機構に無関係であることは考えられる。

上記ｉＣＡＲの発現レベルが重要であることは示された。活性化レセプターもしくは抗原
の高い発現レベルおよび／またはｉＣＡＲもしくはｉＣＡＲ標的化抗原の低い発現の状況
において、十分なブロックは達成できなかった。分析の大部分において、上記ｉＣＡＲは
、Ｔ細胞機能を低下させたが、これを排除しなかった（希に、何らかのアッセイにおいて
９０％阻害を超えることはあった）。上記ｉＣＡＲストラテジーを臨床状況で適用するに
あたって、あらゆるｉＣＡＲの機能性は、レセプターアフィニティー、レセプター発現レ
ベル（すなわち、プロモーター強度）、および一部はそれらの発現レベルに基づく適切な
標的抗原の選択に基づいて、最適化される必要がある。これらはまた、オフターゲット部
位での阻害を達成するために活性化レセプターに対して釣り合いをとる必要がある。ＣＡ
Ｒ標的化治療の場合、最適化されたＣＡＲ／ｉＣＡＲ比は、注意深いベクター設計を通じ
て達成され得る。

結論として、抗原特異的阻害性レセプターが、特定の細胞表面抗原に結合した際にＴ細胞
増殖、サイトカイン分泌、および細胞傷害性を成功裡に再指向し得、従って、Ｔ細胞毒性
をある組織から反らすと同時に、その同じ抗原を発現する別の組織に対する重大なエフェ
クター機能を保持するという概念実証が提供された。これは、ＴＣＲもしくはＣＡＲのい
ずれかによって媒介される応答で示された。このアプローチは、意図しない標的組織への
損傷を防止、もしくは少なくとも低下させるので、受容できない毒性が発生した後に、治
療的Ｔ細胞を不可逆的に排除する必要性を未然に防ぐ。それは、Ｔ細胞をガイドおよび教
育して、有益な機能のみを発揮する合成レセプターを使用することによって、薬物として
細胞の多面的な機能性を利用するパラダイムシフトアプローチである。この動的な安全性
スイッチは、自己由来Ｔ細胞および同種異系Ｔ細胞の治療の範囲において有用な適用を見
出し得る。

参考文献

本発明の実施形態

前述の説明から、本明細書で記載される発明を種々の使用法および条件に適合させるため
に、バリエーションおよび改変が、本明細書で記載される発明に対して行われ得ることは
、明らかである。このような実施形態はまた、以下の請求項の範囲内である。

本明細書中の変数の任意の定義の中の要素の列挙の記載は、任意の単数形の要素もしくは
列挙された要素の組み合わせ（もしくは部分組み合わせ）としてのその変数の定義を含む
。本明細書中の実施形態の記載は、その実施形態を、任意の単一の実施形態としてまたは
任意の他の実施形態もしくはその一部との組み合わせにおいて含む。

本願の主題のうちのいくつかは、米国特許出願第１２／５９３，７５１号（３５Ｕ．Ｓ
．Ｃ． §３７１に従って、米国仮特許出願第６０／９２１，１４４号（２００７年３月
３０日出願）の利益を主張する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４２５１（
２０１０年３月８日出願）の米国の国内段階の出願である）に関連し得る。それらの開示
は、それら全体において本明細書に参考として援用される。

本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、各独立した特許および刊行物が、援用
されることが具体的かつ個々に示されるのと同程度、本明細書に参考として援用される。

Claims

本明細書に記載の発明。