JPH06508623A - 抗ウィルス剤としてのインフルエンザウィルスのｍ−蛋白質ペプチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗ウィルス剤としてのインフルエンザウィルスのＭ−蛋白質ペプチド発肌幻宵景 発肌ｑ技丑分野 本発明は、ペプチドに基づく抗ウィルス剤およびその使用に関するものである。

より詳細には本発明は、配列においてインフルエンザマトリックス蛋白質の領域 に実質的に対応するペプチドに基づいた抗ウィルス剤に関するものである。

従来技五〇賑盟 インフルエンザウィルス、すなわち一本１ｊＲＮＡウイルスの種類は、世界中で 重大な呼吸病を発生させ続けている。Ａ型インフルエンザウィルスは、特に長両 にて肺炎および死亡をもたらす、Ｂ型インフルエンザウィルスはＡ型よりも弱年 層に感染する傾向を有し、レイ症候群と関連する。抗原ドリフトによりＢ型イン フルエンザウィルスは全ゆる年齢層にて病気を発生させつる。インフルエンザの 経済的コストは相当なものである：米国にてインフルエンザに基づく病気の年間 経費は４６億ドル〜１００億ドルであると推定される。

インフルエンザは些細な病気でない。典型的なインフルエンザの場合は発熱、喉 啜れおよび数日間の倦怠感に続く平穏な回復に限られるが、より重大な肺病、− 次的ウィルス性肺炎または二次的細菌性肺炎も生しうる〔アトバイザリ−・コミ ティ・オン　イミュニゼーション・プラクチス、ＭＭＷＲ１第３５Ｓ、第３１７ 〜３３１頁（１９８６））、長両者または心肺病もしくは他の慢性肺病に罹１色 した患者は特に危険である。

インフルエンザに対する唯一の有効な抗ウイルス薬剤はアマンタジンまたはその 近緑のリマンタジンである。これら薬剤はインフルエンザに対し極めて有効であ るが、Ａ型インフルエンザウィルスによって発生した病気にしか有効でなく、極 めて高い罹１色率および死亡率の危険にある群の個人、すなわち長両者において は充分に耐えられない。低い腎クリアランスを有する個人の場合、薬剤が蓄積し て痙ｔを引起こすこともある。他のＣＮＳ作用はふらつき、眩量および集中性に おける問題である〔同上；並びにドリノおよびヘントレイ、「インフルエンザの 管理に関する諸選択」、ケンダおよびバトリアル力（編）、アランＲ，リス・イ ンコーポレーシッン社、ニューヨーク（１９８６Ｌ第３１７〜３２６頁〕、さら に、この薬剤は予防剤として最も効果的に作用し、したがってインフルエンザに よる実際の感染がなければ副作用の危険を伴う。米国における過去１０例のイン フルエンザ流行のうち４例にて主たる流行病の原因であったＢ型インフルエンザ では相当な罹患率および死亡率も生ずる（ＭＭＷＲ１第３５巻、第４７０〜４７ ９頁（１９８６））。

本発明は、ウィルス転写を標的として機能する抗ウィルス剤を提供する。これう 薬剤はインフルエンザウィルスに対し特異性であるだけでなく、インフルエンザ ウィルスの表面抗原、すなわちヘマグルチニンおよびニューラミニダーゼに関連 した抗原シフトおよびドリフトも存在しない、したがって、これら抗ウィルス剤 はＡ型およびＢ型インフルエンザウィルスの転写を抑制すると共に、人間および 動物の病気の原因となるパラミクソウィルスおよびラブドウィルス群を包含する 他の陰性ストランドウィルスのＲＮＡポリメラーゼにも拡大しうる広範なスペク トルを存する。

Ｍ、（「マトリックス蛋白質」）はインフルエンザとりオンの主たる構造成分で あって、全ウィルス蛋白質の約３０％を構成すると共にエンベロブも表面糖蛋白 質とりポヌクレオ蛋白質複合体との間の重要位置を占める〔パイロロジー、第４ ２巻、第８９０〜９０４頁（１９７９））、Ｍ、はりボソームまたは平面パイレ ーヤー脂質膜のいずれかとしてパイレーヤー中に混入する（Ｄ、Ｊ、ブハー等、 ｊ、パイロロジー、第３６巻、第５８６〜５９０頁（１９８０）；Ｄ、Ｊ、ブハ ー等、インターパイロロジー、第１４巻、第６９〜７７頁（１９８Ｂ）、および Ｍ、　Ｗ、カーノ等、Ｊ、クリニカル・マイクロバイオロジー、第１６巻、第１ １５〜１２２頁（１９８２））。

Ｍｌはインフルエンザウィルス転写を抑制することが示されており、この活性は １５ｋｄアミノ末端断片に位置することが示されている〔ザボナルイエフおよび ゲーンドン、Ｊ、パイロロジー、第３３巻、第５８３〜５８６頁（１９８０）； およびＺ、イエ等、Ｊ、パイロロジー、第６１巻、第２３９〜２４６頁（１９８ ７））、この作用はモノクローナル抗体によって逆転することができるＣＲ。

Ｗ、ハンキンス等、ウィルス・ジーン、第３巻、第１１１〜１２６頁（１９８６ ））、Ｚ、イエ等（Ｊ、パイロロジー、第６３巻、第３５８６〜３５９４頁（１ ９８９））は転写抑制を検討すると共に、抗−表現型抗体と合成ペプチドとを用 いてＲＮＡ結合ドメインを決定した。背景として本出願人等はモノクローナル抗 体（ＭＡｂ）を用いてＭｌの免疫蛍光分析を行ない、複製サイクルおよび細胞質 におけるＭｌとアクチンフィラメントとの結合に際し核へのＭ、の移動を観察し たＣＤ、ブハー等、Ｊ、パイロロジー、第６３巻、第３６２２〜３６３３頁（１ ９８９））、Ｍ、は、極めて変化しやすい表面抗原へマグルチニンおよびニュー ラミニダーゼとは異なり高度に保持される。インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３ ４およびインフルエンザ株Ａ／ウドーン／７２からのＭ、におけるアミノ酸配列 の比較は、３８年間にわたって変化した７種のみのアミノ酸を示す〔ウィンター およびフィールズ、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第８巻、第１９６５〜 １９７４頁（１９８０）、並びにラムおよびライ、パイロロジー、第１１２巻、 第７４６〜７５１頁（１９８１））、さらに、これら変化はたとえば１ｉｅ−＋ Ａ１ａおよびＡｒｇ→Ｌｙｓのような変化を含み保存性である。ヘマグルチニン における抗原ドリフトは、Ａ／ＮＴ／６０／６８対Ａ／パンコック７７９株につ き見られるように、サブタイプ内でアミノ酸の０．９〜１％／１年の割合で生ず る〔ハトレストンおよびブラウンリー、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第 １Ｏ巻、第１０２９〜１０３８頁（１９８２））、Ａ型とＢ型とのＭ１間におけ る全体的配列ホモロジーは５４％であると判明した。しかしながら、成る領域に おいては７０％より高いホモロジーが存在する。したがって、広範な活性スペク トルを有する抗ウイルス性ペプチド（Ａ型およびＢ型の両者）は、ウィルス転写 抑制活性を有するＭ１中に存在する保持配列を組込めば生ずると思われる。

Ｍ、蛋白質に関する他の研究は、Ｍ、が脂質パイレーヤーリポソームまたは平面 膜に組込まれることを示している〔ブハー（１９８０）、上記〕、インフルエン ザワクチンを接種した或いは野生型の循環性ウィルスを感染させた臨床患者にお けるＭ１成分に対する抗体反応につき研究されている（Ｍ、　Ｗ、カーフ等、Ｊ 、クリニカル・マイクロバイオロジー、第１１．１１８１３頁（１９８２））。

Ｍｌは臨床試料におけるＡ型インフルエンザウィルスの一般的検出のための有効 な目標となりうることか示されている（Ｄ、Ｊ、プハー等、Ｊ、イミュノロジカ ル・メリンス、第９６巻、第７７〜８５頁（１９８７））、Ｍｌの数個の抗原部 位に対するモノクローナル抗体のパネルが開発されて、ウィルス検出に用いられ ている〔同上；およびり、プハー等、第ｖ１１回ウィルス学国際会議、エドモン トン、カナダ、要約Ｒ２３２８］、本出願人等は、合成ペプチドを用いてＭ、０ ３種の免疫反応性セグメントを位置決定した〔ブハー（１９８９Ｌ上記；および 米国特許第４，９８１，７８２号〕。

これら初期の研究は免疫化を介するインフルエンザ感染のメカニズムおよび潜在 的予防につき貴重な洞察を与えているが、直接的な抗ウィルス作用により病気に 介入する薬剤につき重要なニーズが残されている０本発明が解決しようとするの はこのニーズである。

■桝 以下の引例は本発明者等が集めたものであって、インフルエンザ、インフルエン ザウィルス、ペプチドの抗ウィルス活性など一般的な主題に関するものである、 これら引例の多くを本明細書の全体にわたって引用する。

１、　ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス、新たなワクチン開発、優先 権の確立、第１巻、米国における重大な病気、ワシントンＤ、　Ｃ，、ナショナ ル・アカデミ−・プレス社、付録Ｋ、インフルエンザうイルスＡおよび已に対す る免疫化の展望（１９８５）。

２、７ドバイザリー・コミティー・オン・イミュニゼーシゴン・プラクティス（ ＡＣＩＰ）、インフルエンザの予防および管理、ＭＭＷＲ，第３５巻、第３１７ 〜３３１頁（１９８６）。

３、Ｒ，ドリフおよびり、　Ｗ、ベントレイ、アマンタジンおよびリマンタジン ：成人におけるインフルエンザＡの予防および治療、「インフルエンザの管理に 関する選択Ｊ、Ａ、Ｐ、センタおよびＰ、　Ａ、バトリアルカ（編）、アランＲ 、リス・インコーポレーシッン社、二ニーヨーク（１９８６Ｌ第３１７〜３２６ 頁。

４、　センター・フォー・ディシーズ・コントール（ＣＤＣ）、インフルエンザ −米国、１９８５〜１９８６期間、ＭＭＷＲ１第３５巻、第４７０〜４７９頁（ １９８６）。

５、１．Ｔ、ンユルッ、インフルエンザウィルスの構造、■、ピリオンのポリペ プチド、パイロロジー、第４２巻、第８９０〜９０４頁（１９７９）。

６、Ｄ、Ｊ、ブハー、ｒ、ｃ、　カーリトネンコフ、Ｊ、　Ａ、ザコミルジン、 Ｖ、Ｂ、　ダレゴリエフ、Ｓ、　Ｍ、クリメンコおよびＪ、Ｆ、デービス、リポ ソーム中へのインフルエンザウィルス膜蛋白質の組込み、Ｊ、パイロロジー、第 ３６巻、第５８６〜５９０頁＜１９８０）。

７、Ｄ、Ｊ、ブハー、１．Ｇ、　ｈ−’Ｊ　ト、ｔ７：＋７、Ｄ、Ｋ、　ルホフ 、Ｔ、■、ピシンおよびＨ，Ｍ、リー、ヒトおよび鳥類から分離されたインフル エンザウィルスＨ２（アジア）へマグルチニンの比較研究、インターパイロロジ ー、第１４巻、第６９〜７７頁（１９８Ｂ）。

８、Ｍ、Ｗ、カーフ、Ｍ、ガラガー、Ｄ、プハー、ｃ、ｐ、セリー二およびＥ、 Ｄ、キルボーン、酵素結合の免疫吸着分析によるインフルエンザウィルスのニュ ーラミーダーゼ−特異性抗体の検出、Ｊ、クリニカル・マイクロバイオロジー、 第１６巻、第１１５〜１２２頁（１９８２）。

９、Ａ、Ｙ、ザボナルイエフおよびＹ、Ｚ、ゲーンドン、インビトロにおけるイ ンフルエンザＡウィルスピリオン転写活性およびリマンタジンに対するその感受 性に対する膜（Ｍ）蛋白質の影響、Ｊ６　バイオロジー、第３３巻、第５８３〜 ５８６頁（１９８０）。

１０、　Ｚ、４ｘ、Ｒ，ハＪＬ／、Ｊ、　Ｗ、　フｔ　ｙ’）　スオヨヒＲ，Ｒ ，”）フナ−、インフルエンザウィルスのマトリックス（Ｍ）ＩＦ白質の機能性 および抗原性ドメイン、Ｊ、パイロロジー、第６１巻、第２３９〜２４６頁（１ ９８７）。

１１、　Ｒ，Ｗ、ハンキンス、Ｋ、ナガタ、Ｄ、Ｊ、ブハー、Ｓ、ボプルおよび Ａ、イシハマ、転写抑制に関与するインフルエンザウィルスマトリックス蛋白質 エピトープのモノクローナル抗体分析、ウィルス・ジーン、第３巻、第１１１〜 １２６頁（１９８９）。

１２、　Ｚ、イエ、Ｎ、　Ｗ、ヘイシーおよびＲ，Ｒ，ワグナ−２抗遺伝子型抗 体および合成ペプチドでマツピングしたインフルエンザＡウィルスマトリックス 蛋白質の転写−抑制およびＲＮＡ結合性ドメイン、Ｊ、パイロロジー、第６３巻 、第３５８６〜３５９４頁（１９８９）。

１３、　Ｄ、ブハー、Ｓ、ポプル、Ｍ、ハエル、Ａ、ミハイル、Ｙ、Ｆ、　ゴン グ、Ｃ，ホワイトカー、Ｅ、パオレンチおよびＡ、シュド、インフルエンザウィ ルスのＭ蛋白ｆ（Ｍｌ）：モノクローナル抗体による抗原分析および細胞内位置 決定、Ｊ、パイロロジー、第６３巻、第３６２２〜３６３３頁（１９８９）。

１４、　Ｇ、ウィンターおよびＳ、フィールズ、Ｍｌ中へのインフルエンザＤＮ Ａのクローン化、Ａ／ＰＲ／８／３４マトリックス蛋白質をコードするＲＮＡセ グメントの配列、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ、第８１１、第１９６５〜 １９７４頁（１９８０）。

１５、　Ｒ，Ａ、ラムおよびＣ，Ｊ、ライ、ＨＩＮＩおよびＨ３Ｎ３株における インフルエンザウィルス膜蛋白ｔ（ＭＬ）アミノ酸配列の保持および第２蛋白質 （Ｍ２）をコードするＲＮＡセグメント７の開放読枠、パイロロジー、第１１２ 巻、第７４６〜７５１頁（１９８１）。

１６、　Ｊ、Ａ、ハトレストンおよびＧ、Ｇ、　ブラウンリー、ヒトインフルエ ンザＡウィルス株Ａ／ＮＴ／６０／６８の核蛋白質遺伝子の配列、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ、第１Ｏ巻、第１０２９〜１０３８頁（１９８２）。

１７、　Ｄ、Ｊ、ブハー、インフルエンザウィルスの主ポリペプチドのクロマト グラフ分離、ザ・ネガティブ・ストランド・ウィルス、Ｂ、　Ｗ、Ｊ、マーヒー およびＲｏＤ、バリー（編）、第１巻、アカデミツク・プレス社（１９７５）、 第１３３〜１４３頁。

１Ｂ、　Ｄ、Ｊ、ブハー、Ｓ、Ｓ、Ｌ、リ−１Ｊ、　Ｍ、ケホーおよびＥ、Ｄ。

キルボーン、インフルエンザウィルスワクチンからのへマグルチニンポリペプチ ドのクロマトグラフ分離およびそのアミノ末端配列の決定、プロシーディング・ ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７３巻、第２３８〜２４２頁 （１９７６）。

１９、　Ｄ、Ｊ、ブハー、親和性クロマトグラフィーによるインフルエンザウィ ルスからのニューラミニダーゼの精製、ハイオヒミカ・ハイオフィジカ・アクタ 、第４８３巻、第３９３〜３９９頁（１９７７）。

２０、Ｍ、ガラガー、Ｄ、Ｊ、ブハー、Ｒ，ドールマスキン、Ｊ、Ｆ、デービス 、Ｇ、ロゼン及びＥ、　Ｄ、キルボーン、遺伝子手法と生化学手法との組合せに よるヒトインフルエンザウィルスの免疫原二エーラミニダーゼの分離、Ｊ、クリ ニカル・マイクロバイオロジー、第２０巻、第８９〜９３頁（１９８４）。

２１、Ｍ、Ｗ、カー７、Ｄ、Ｊ、プハー、Ａ、Ｋ、　コウル、Ｇ、カリンシュお よびＥ、　Ｄ、キルボーン、酵素結合免疫吸着分析によるインフルエンザウィル スＭ蛋白質に対する抗体の検出、Ｊ、クリニカル・マイクロバイオロジー、第１ ６巻、第８１３頁（１９Ｂ２）。

２２、　Ｄ、Ｊ、　ブハー、Ｉ、Ｇ、　カリトネンコフ、Ｍ、Ｗ、カー７、Ａ、 バロ、Ｄ、ハロウェイおよびＡ、ミカイル、Ｍ−蛋白質抗原の選択的吸着および 検出によるインフルエンザウィルスの検出、Ｊ、イミュノロジカル、メソツズ、 第９６巻、第７７〜８５頁（１９８７）。

２３、　Ｄ、プハー、Ａ、ミカイル、Ｓ、ポプル、Ｍ、バエルおよびＣ，ホワイ タカー、Ｍ−蛋白質に対するモノクローナル抗体でのインフルエンザウィルスの 迅速検出、第Ｖ１１回ウィルス学国際会議、エドモントン、カナダ、要約Ｒ２３ ２８゜ ２４、Ａ、に、ショト、Ｄ、Ｊ、ブハーおよびＳ、Ｗ、ポプル、インフルエンザ ウィルス感染の診断および予防のための合成ペプチド、並びにその使用、米国特 許第４，９８１．７８２号、１９９１年１月１日。

２５、Ｂ、Ｗ、エリクソンおよびＲ，Ｂ、メリフィールド、固相ペプチド合成、 プロティン、第１Ｉｔ＝、Ｈ，ニューラス（［）　、アカデツミ、クス・プレス ・インコーボレーシゴン社、ニューヨーク、第２５５〜５２７頁（１９７６）。

２６、　Ｄ、Ｊ、　ブハー、１．Ｇ、カリトネンコフ、Ｊ、　Ａ、ザコミルジン 、Ｖ、Ｂ、グレゴリエフ、Ｓ０Ｍ、クリメンコおよびＪ、Ｆ、デービス、リポソ ーム中へのインフルエンザウィルスＭ蛋白質の組込み、Ｊ、パイロロジー、第３ ６巻、第５８６〜５９０頁（１９８０）。

２７、０．Ｍ、ロコバンスキー、インフルエンザウィルスから分離されたリボ核 蛋白質−ポリメラーゼ複合体によるＲＮＡ合成、パイロロジー、第７３巻、第２ ７６〜３３８頁（１９７６）。

２Ｂ、Ｊ、Ｊ、ブロッナ、Ｍ、バラロイ、■、ラウルンおよびＲ，Ｍ、クルージ 、独特なキャップ（Ｍ’ＧｉｐｐＸｍ）依存性インフルエンザピリオンエンドヌ クレアーゼはキャンブトＲＮＡを開裂して、ウィルス転写を開始させるプライマ ーを発生する、セル、第２３巻、第８４７〜８５８頁（１９８１）。

２９、　Ａ、カド−１Ｋ、ミズモトおよびＡ、イシハマ、インフルエンザウィル スからのＲＮＡポリメラーゼ−ＲＮＡ複合体の精製および酵素特性、ウィルス・ リサーチ、第３巻、第１１５〜１２７頁（１９８５）。

３０、Ｒ，Ｇ、アルムキスト、Ｗ、　Ｒ，チャオ、Ａ、に、シュド、Ｃ，ミトマ 、Ｄ、Ｊ、ロッジ、Ｒ，Ｅ、パナセビツチおよびＲ，Ｊ、マシュース、蛇毒アン ギオテンシン変換性酵素抑制剤のケトメチレン含有モノペプチド同族体の合成お よび生物学的活性、ｊ、メジカル・ケミストリー、第３１巻、第５６１頁（１９ ８Ｂ）。

３１、　Ｊ、Ｍ、スチュワードおよびＪ、Ｄ、ヤング、固相ペプチド合成、Ｊ、 Ｍ、スチュワードおよびＪ、　Ｄ、ヤング（編）、ピアス・ケミカル・カンパニ ー社（１，９８４Ｌ第８３頁。

３２、　Ｓ、Ｌ、ハーベソンおよびり、　Ｈ，リッチ、ケトメチレンおよびヒド ロキシエチレンアミド結合置換を有するペプチドによるアミノペプチダーゼの抑 制、Ｊ、メジカル・ケミストリー、第３２巻、第１３７８〜１３９２頁（１９８ ９）。

３３、Ｍ、Ｔ、ガルシアーロペ・人Ｒ，ゴンザレスームニツおよびＪ、　Ｒ。

ハルト、Ｃ−末端のケトメチレンジペプチド含有塩基性アミノ酸同族体の合成、 テトラヘドロン、第４４巻、第５１３１〜５１３８頁（１９８Ｂ）。

３４、Ｍ、Ｔ、ガルシア〜ロベツ、Ｒ，ゴンザレスームニツおよびＪ、Ｒ。

ハルト、ケトメチレンジペプチド同族体への簡単かつ有能な経路、テトラヘドロ ン、第２９巻、第１５７７〜１５８０頁（１９８Ｂ）。

３５、　Ｒ，Ｌ、ジぢンソンおよびＲ，Ｂ、ミラー、ペプチドのケトメチレン同 族体の合成におけるトリフェニルメチル（トリチル）アミノ保護基の使用、イン ターナシボナル・ジャーナル・ペプチド・プロティンリサーチ、第２３巻、第５ ８１〜５９０頁（１９８４）。

３６、　Ｊ、Ｖ、Ｎ、Ｖ、プラサドおよびり、Ｈ，リッチ、α−アミノアルデヒ ドに対するアリル金属の付加、スタチン、ケトメチレンおよびヒドロエチレンジ ペプチドジエステルの合成に対する応用、テトラヘドロン・レタース、第３１巻 、第１８０３〜１８０６頁（１９９０）。

３７、　Ｂ、Ｅ、エバンス、Ｋ、　Ｅ、リトル、Ｃ，Ｆ、ホムニ、り、Ｊ、Ｐ。

スブリンガー、Ｊ、ヒルシフイールドおよびり、Ｆ、　ビバー、新規なキラルア ミノアルキルエポキシドおよびｒ−（アミノアルキル）Ｔ−ラクトンを用いるヒ ドロキシエチレンジペプチドイソステルスの立体制御合成、Ｊ、オーガニック・ ケミストリー、第５０巻、第４６１５〜４６２５頁（１９８５）。

３８、　Ａ、Ｈ，フレイ、Ｒ，Ｌ、ケイおよびＥ、Ｆ、　タラインマン、２Ｒ１ ４Ｓ、５Ｓヒドロキシエチレンジベブチドアイソステルスに対するラクトン先駆 体の短い立体選択合成、Ｊ、オーガニック・ケミストリー、第５１ｔ＝、第４８ ２８〜４８３３頁（１９８６）。

３９、　Ｋ、プレス、Ｓ、シルト、Ｋ、Ｈ，ワイスミュラー、Ｇ２　ユングおよ びＨｏＧ、　ラメンシー、ウィルス特異性の細胞毒性Ｔリンパ球の合成リボペプ チドワクチンでのインビボブライミング、ネイチャー、第３４２巻、第５６１〜 ５６４頁（１９８９）。

４０、［、）ス、Ｒ，Ａ、ヒュース、Ｍ、Ｒ，マンディ、Ｐ、マスカグニおよび Ｗ、　Ａ、ギポンス、弱く吸着したペプチドおよび薬物の新規なオリゴペプチド 放出システム、第１１回アメリカ・ペプチド・シンポジウムのプロシーディング 、Ｊ、Ｅ、リビエルおよびＧ、　Ｒ，マーシャル（編）、ＥＳＣＯＭ、ライデン 、第１０７８〜１０７９頁（１９９０）。

４１、Ｙ、　サンチェズ、■、イオネスクーマチウ、Ｇ、Ｒ，ドリースマン、Ｗ 、クランプ、Ｈ，Ｒ，シックス、Ｆ、Ｂ、ホリンガーおよびＪ、Ｊ、メルニツク 、Ｂ型肝炎ウィルス由来の抗原に対する体液および細胞の免疫性：フロインド完 成アジュバントとアラムとリポソームとの比較活性、インフエクシャス・イミュ ノロジー、第３０巻、第７２８〜７３３頁（１９８０）。

４２、　Ｇ、Ｗ、ボスおよびＧ、Ｍ、エア、インフルエンザウィルスにおけるマ トリックス孟白質のＮ−末Ｒｓ　Ｔｒｉ域をコードするヌクレオチド配列、ヨー ロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第９６巻、第３６３〜３７２頁（ １９７０）。

４３、Ｂ、Ｅ、ヨハンソン、Ｄ、Ｊ、プハーおよびＥ、Ｄ、キルボーン、精製さ れたインフルエンザウィルスへマグルチニンおよびニューラミニダーゼは抗体反 応の刺激において均等であるが対称的種類の感染に対する免疫性を誘発する、Ｊ 、パイロロジー、第６３巻、第１２３９〜１２４６頁（１９８９）。

４４、Ａ、ブレボリアデス、感染細胞の核および細胞質におけるインフルエンザ ウィルス誘発蛋白質、パイロロジー、第７９巻、第４４９〜４５４頁（１９７７ ）。

発皿Ω説所 今回、本発明者等は、インフルエンザＡマトリックス蛋白質（Ｍ、）の１４８〜 １６６ＳＪＩ域に実質的に対応する合成ペプチドがマトリックス蛋白質自身によ り示されるよりも顕著に高いインフルエンザ転写抑制剤としての活性を示すこと を突き止めた。−面において本発明は、これら活性ペプチド自身およびその同族 体を提供する。他面において本発明は、これらペプチドを含む抗ウイルス組成物 およびこれら組成物を用いる抗ウイルス療法を提供する。

旧厘匁囚単文説所 添付図面を参照して本発明を説明する。

第１図は抑制活性につき提案したメカニズムを示す本発明によるペプチドの略図 であり、 第２図はＭ、のポリメラーゼ抑制活性を本発明によるペプチドの活性と比較する グラフである。

本明細書においては、一般的なしアミノ酸およびアキラルグリシンにつき次の１ 文字記号を用いて説明する： ヱ亙Ｚ伐　土文字記ユ アラニン　Ａ アルギニン　Ｒ アスパラギン酸　Ｄ アスパラギンもしくはアスパラギン酸Ｂグルタミン酸　Ｅ グルタミンもしくはグルタミン酸　Ｚ 大して一般的でないアミノ酸については３文字コードで示す：Ｄ−アラニンにつ きＤ−Ａｌａ、Ｎ−メチルアラニンにつきＮＭｅ−Ａｌａ、Ｄ−アルギニンにつ きＤ−ＡｒｇおよびＮ−メチルアルギニンにつきＮＭｅ−Ａｒｇ、これらペプチ ドは、そのアミノ末端を左側かつ酸末端を右側にした配列で示す。

「アシル」はアルキル含有カルボニル基、たとえばＲ−Ｃ（−０）−を示し、こ こでＲは１〜８個の炭素原子を有するアルキル基は、たとえばメチル、エチル、 ｎ−プロピル、イソプロピル、ヘキシル、オクチルなどである。本発明で一般に 好適なアシル基はアセチルである。アシル基は、ポリペプチドの末端アミノ基を 封鎖するために使用される。

「インフルエンザ」は、インフルエンザウィルスの感染によりもたらされる病的 状態を意味する。インフルエンザウィルスにはＡ型およびＢ型ウィルスが存在す る。これらＡ型およびＢ型は当業界で認識されている。これらの多数が同定され ており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに存在して入手するこ とができる。これら代表的な材料は「アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション・カタログ・オプ・ストレインＩＩ、第４版Ｊ　（１９８３）、Ｒ，ヘイ 等、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーラン ドの第２７２〜２７６頁（参考のためここに引用する）に記載されている。

「結合体」とはキャリヤに化学結合した抗原もしくはハブテンを意味し、結合体 は他の基をも含有することができる。

「対応する」もしくは「実質的に対応する」とは、互いに同一であり或いは約４ もしくは５アミノ酸単位以下だけ互いに相違する２種のアミノ酸配列の性質を意 味する。これら配列は、所定位置に異なるアミノ酸を有することにより或いは余 分のアミノ酸を育することにより或いはアミノ酸を欠失することにより相違する ことができる。好ましくは、これら配列は最高１〜４つの相違点を有する。この 意味での規定に関する説明は次の通りである。

「低級アルキル」とは１〜４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖の飽和炭 化水素基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル 、イソブチル、５ｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルを意味する。

「マトリックス蛋白質」もしくは「Ｍ蛋白質」または「Ｍｌ」とは、インフルエ ンザおよび関連ウィルスの蛋白質成分を意味する。これについては背景の説明に て詳細に記載されている。

「ペプチド」もしくは「ポリペプチド」という用語は、加水分解に際し２種もし くはそれ以上のアミノ酸を生成する比較的低分子量の化合物を意味する。

「医薬上許容しうる塩」および「塩」とは、原ポリペプチドの所望の抗ウィルス 活性を保持する塩を意味する。「医薬上許容しうる塩」とは、摂取もしくは非経 口投与などに適し、何ら望ましくない毒物学的作用を与えない塩を意味する。

この種の塩および医薬上許容しうる塩の例は（ａ）無機酸、たとえば塩酸、臭化 水素酸、硫酸、燐酸、硝酸などで生成される酸付加塩；および有機酸、たとえば 酢酸、修酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸 、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、アルギン酸、ポリグルタ ミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクチュロン 酸などで生成される塩；　（ｂ）−価および多価金属陽イオン、たとえばナトリ ウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、 銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとの塩；またはＮ、Ｎ’−ジベンジル エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから生成される有機陽イオンとの塩 ヨ並びに（Ｃ）たとえばタンニン酸亜鉛塩などの上記（ａ）と（ｂ）との組合せ を包含する。

「保持的１換」とは、ペプチドの抗ウィルス活性もしくは抑制活性を阻害もしく は減少させないペプチドにおけるアミノ酸置換を意味すべく使用される。

ニプチ上 本発明のペプチドは、インフルエンザＡマトリックス蛋白質の１４８〜１６６領 域に実質的に対応する。原材料におけるこの領域は次の配列；Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ４ −Ｑ−Ｉ−Ａ−Ｄ−３−Ｑ−Ｈ−Ｒ−３−１’１−Ｒ−Ｑ−１’ｌ−Ｖを有する 。

ペプチドは、次の特徴を存するならば、この領域に「実質的に対応する」と規定 される： １個もしくは２個のアミノ酸残基により離間した原１４８および１５１Ｃ残基に 対応する第１および第２Ｃ残基と、１個もしくは２個のアミノ酸残基により離間 した原１５９および１６２Ｈ残基に対応する第１および第２Ｈ残基とを有し、４ 〜７個の残基が第２Ｃ残基と第１Ｈ残基との間に位置し、さらに第２Ｈ残基を越 えて少なくとも約１〜７個までのアミノ酸残基を含み、さらに全部で１２〜２０ 個のアミノ酸を有し、その少なくとも７５％が原材料に存在する同し配列（欠失 及び付加を許容する）における原材料のアミノ酸である。

これら基準を用い、アミノ酸は次のように規定することができる：ＡＡａ　１− ＡＡａ２−　ＡＡａ３−ＣＩ　−ＡＡｂｌ−ＡＡｂ２−Ｃ２−ＡＡｃｌ　−ＡＡ ｃ２−　ＡＡｃ３−ＡＡｃ４−ＡＡｃ５−ＡＡｃ６−ＡＡｃ７−Ｈｌ−ＡＡｄｌ −＾Ａｄ２−Ｈ２−ＡＡｅｌ−ＡＡｅ２−＾Ａｅ３−ＡＡｅ４−ＡＡｅ５−ＡＡ ｅ６式中： ＡＡａｌは欠失するか或いはＧまたはＧに関する保持的置換、たとえばＡもしく はＬであり； ＡＡａ２は欠失するか或いはＬまたはＬにつき保持的置換、たとえば■もしくは ■であり； ＡＡａ３は欠失するか或いはＶまたは■につき保持的置換、たとえばＩ、Ｌもし くはＡである。

好ましくはＡＡａｌ、２および３の全てが欠失し、この場合は必要に応じＣにて 遊離したＮＨよ基はアシル化することができる。

ＡＡｂｌは欠失するか或いはＡまたはＡにつき保持的置換、たとえばＤ−ａｌａ もしくはＮＭｅ−ａｌａであり； ＡＡｂ２は欠失するか或いはＴまたはＴにつき保持的置換、たとえばＳである好 ましくはＡＡｂｌおよびＡＡｂ２の少な（とも一方、より好ましくは両者が存在 し、それぞれＡおよびＴの原型で存在する。

ＡＡｃｌはＥであるか或いは欠失し、または已につき保持的置換、たとえばＤで あり； ＡＡｃ２はＱであるか或いは欠失し、またはＱにつき保持的置換、たとえばＮで あり； ＡＡｃ３は■であるか或いは欠失し、またはＩにつき保持的置換、たとえばＬも しくはＶであり； ＡＡｃ４はＡであるか或いは欠失し、またはＡにつき保持的置換、たとえばＬで あり； ＡＡｃ５はＤであるか或いは欠失し、またはＤにつき保持的置換、たとえばＥで あり； ＡＡｃ６はＳであるか或いは欠失し、またはＳにつき保持的置換、たとえばＡも しくはＴであり； ＡＡｃ７はＱであるか或いは欠失し、またはＱにつき保持的置換、たとえばＡも しくはＮである。

好ましくは、これらＡＡｃ隣接アミノ酸の０〜４個は省略され或いはこのＡＡＣ 配列における最高１個もしくは２個のアミノ酸が置換される：ＡＡｄｌはＲであ るか或いは欠失し、またはＲにつき保持的置換、たとえばＡもしくはＫであり； ＡＡｄ２はＳであるか或いは欠失し、またはＳにつき保持的置換、たとえばＡも しくはＴである。

好ましくはＡＡｄｌおよびＡＡｄ２の少なくとも一方がその原型で存在する。

より好ましくは、両者がその原形に存在する。

ＡＡｅｌはＲであるか或いは欠失し、またはＲにつき保持的置換、たとえばＤ− ａｒｇもしくはＫであり； ＡＡｅ２はＱであるか或いは欠失し、またはＱにつき保持的置換、たとえばＡも しくはＮであり； ＡＡｅ３はＭであるか或いは欠失し、またばＭにつき保持的置換、たとえばＡで あり； ＡＡｅ４はＶであるか或いは欠失し、または■につき保持的置換、たとえば■、 ＬもしくはＡであり； ＡＡｅ５はＴであるか或いは欠失し、またはＴにつき保持的置換、たとえばＳで あり； ＡＡｅ６はＴであるか或いは欠失し、またはＴにつき保持的置換、たとえばＳで ある。

少なくとも１個、好ましくは４個のＡＡｅアミノ酸が存在すれば好適である。

これらペプチド配列自身の他に、ケトメチレン−およびヒドロキシエチレン−含 有ペプチドも使用することができ、同様にこれら化合物の医薬上許容しつる塩も 可能である。

１群の好適配列を第１表に示す。

：Ｉ：Ｉ：Ｉ　ゴ　：Ｉ　：！　ッ　：Ｉ　ス　コ　ッ　ゴ　ッ　ゴｏｏｏｏｏ ａｏｏｏｏａａａ＜ 匡　匡　匡　工　匡　匡　【　筐　匡　ζ　に　匡　く　ｃＩエエエエ＝工＝＝ エエ＝：Ｉ ＣｎｖＪｔｎ　の　の　の　の　ψ　の　の　く１　の　の匡　ａ：　匡　Ｃ！ ：　匡　ご　匡　；：；〈　匡　Ｃ区エエエエエ＝エエエエエエエＩ ｏｏｏａｏ＜ｏｏｏｏａｏｏ。

ｔｕ　ｗ　ｕｕ　ｗ　＜　ｔｕ　ｗ　ｔｕ　１１１　１ＪＪ　ｔｕ　ｗ　ｕｓ　 ｗＯ口Ｃ）Ｃ）Ｃ）０００口ＱＣ）ＯＯＣ））−１−←４Ｊ←←μ←←←←ト← ← （＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜（（ ＞　４＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞ ＜　２：！コニ！：！：Ｉ：！：Ｉ：！ココゴコッ０　０００００００００００ ００２！ ０：　ａ：ｃ　−ソ　匡　匡　匡　匡　匡　に　匡　に　匡　Ｃ工　工＝＝＝　 エエーエエエエ＝工工 ％０　の　ψ　ψ　ψ　勢　ψ′　の　ψ　ψ　の　の　φ　←ｌ　ψＣ匡　Ａ 　−ソ　−　匡　＝　【　匡　Ｃに　；【【エ　エエ＝＝工＝＝＝＝　工＝：＝ 工 舊（＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜ 派　−−−−−−−−Ｊ）−１−−−−−ｏ　（７０００００２１００００００ ０ｗＬＬＩＬＬＪｕＪｕｊｕＪＣ４ｕＪｕＪｕＪ　１）１）１）１）田Ｑ口０（ ＪＯＯＣ）Ｃ）ＱＣ）Ｃ）Ｃ）ＯＣ）０←←トトト帽トＩ−トトト←←←ト く ＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜ ｊ　−）　）　＞　＞　＞　＞　）　）　）　＞：Ｉスコツココ２ツツｘ２＠ Ｃ１、Ｃ２、Ｈ及びＨ２アミノ酸残基を含むこれらペプチドが極めて活性である 理由の一つの説明は、亜鉛と結合して亜鉛フィンガーと呼ばれるフィンガーを構 成し、次いでＲＮＡに結合することである。第１図は、Ｍｌの環１４８〜１６６ 領域におけるペプチド（ペプチド６）のこの亜鉛フィンガーの配列を示す。

ペプチドの人　および ペプチドは、ベックマンモデル９９０Ｃ型自動化ペプチド合成装置または多重ペ プチド合成装置（アムリット・シュド、Ｐ、Ｉ、ＳＲＩインターナショナル社に より設計、１６ペプチドを同時に合成する能力を存する）にてポリスチレン樹脂 に結合した市販のｔ−ＢＯＣアミノ酸と、次の側鎖保護基：ＡｓｐおよびＣＩＵ につき０−ベンジルエステル；ＴｈｒおよびＳｅｒにつきＯ−ベンジルエーテル ；Ａｒｇにつきトシル；ＨｉｓにつきＤＮＰ；Ｃｙｓにつきｐ−メトキシ−ベン ジル；Ｌｙｓにつき０−クロルベンジルオキシ−カルボニル；およびＴｙｒにつ き２，６−ジクロルベンジルを有するｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸とを用い固相技術 〔エリクソンおよびメリフィールド、ザ・プロティン、第１Ｉ巻、Ｈ２ニューラ ス編、アカデミツク・プレス・インコーボレーシゴン社、ＮＹ、第２５５〜５２ ７頁（１９７６））によって合成することができる。カップリングは全て、樹脂 上のアミノ酸のミリ当量数よりも３モル過剰のｔ−ＢＯＣアミノ酸とジシクロへ キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とを用いて行うことができる。ＡｓｎおよびＧ ｉｎの場合は、３モル過剰のｔ−ＢＯＣアミノ酸とＤＣＣとヒドロキシベンゾト リアゾール（ＨＯＢＴ）とを使用すべきである。掃去剤として０．１％インドー ルおよび１０％アニソールを含有するＴＦＡ−ＣＨ，ＣＩ□　（４０％）を、Ｂ ＯＣ保護解除に用いることができる０合成サイクルの詳細を第２表に示す。

第２表 ２上でペプチドを　上し゛る工　のス　ジニール、ＩＪ　濱遁□□□拭圭　侍間 Ａ髭虹 １、　ＣＨ２Ｃｌ□Ｘ３　１．　５ ２、４０％ＴＦＡ／ＣＨ，ＣＩ！予備洗浄　５３、４０％Ｔ　Ｆ　Ａ　／　ＣＨ ｚ　Ｃｌ　ｚ　３０４、　ＣＨｔ　Ｃｌｚ　ｘ５　１．　５５、８０％イソプロ パツール／ＣＩ（ｚ　Ｃ１２Ｘ３　１．　５６、　ＣＨ１ＣＩ□×３１・　５ ７、５％ジイソプロピルエチルアミン／　ＣＨｚ　Ｃｌｘ　ｘ２　１０８、　Ｃ Ｈｔ　Ｃ１，ｘ３　１．５ ９、カップリング；３倍過剰のｔ−ＢＯＣアミノ酸、　１２０ＣＨ２ＣＩ２　： 　ＤＭＦ　（９：　ｌ　；　ｖ／ｖ）ＤＣＣ／ＣＨ，ｃｌ。

１０、　ＣＨｔ　Ｃ１，ｘ３　１．５ １１、　８０％イソプロパツール／ＣＨ！　ＣＩ、Ｘ３　１．５合成を完了した 後、ペプチドは掃去剤としての１０％アニソールおよび１％エタンジチオールの 存在下に４°Ｃにて１時間にわたり無水弗化水素を用いて樹脂から離脱させるこ とができる。

ＨｉｓのＤＮＰ基は、２０倍過剰のチオフェノールでの処理によるＨＦ開裂の前 に除去される〔スチュワードおよびヤング、固相ペプチド合成（１９８４）、第 ８３頁〕、各種の有機副生物は、エーテルでの抽出によりペプチドから分離する と共に５０％酢酸での抽出により樹脂から単離し、水で約５％まで希釈して凍結 乾燥することができる。粗製ペプチドは、バイダック１５〜２０ｕｍｃ＋＠を充 填した６０ｃｍ／２０ｍｍＩＪ４製用カラムを用いるＨＰＬＣにより精製するこ とができる。

ケトメチレン−およびヒドロキシエチレン−Ａ　ペプチド　のムケトメチレンー 含有ペプチドを作成するには多くの合成手段がある。全ての場合、最初の工程は 適する側鎖保護基とアミノ末端保護基とを有するケトメチレン含有ジペプチド単 位の合成を特徴とする特定のケトメチレン−含有ジペプチドを作成するため選択 される方法は、置換につき選択されるジペプチドの側鎖の性質に依存する。この 種の合成につき一般に用いられる方法は文献〔ハーベソンおよびリッチ、Ｊ、メ ジカル・ケミストリー、第３２巻、第１３７Ｂ〜１３９２頁（１９８９）；ガル シアロペツ等、テトラヘドロン、第４４巻、第５１３１〜５１３８頁（１９８８ ）および第２９Ｓ、第１５７７〜１５８０頁（１９８８）；ジョンソンおよびミ ラー、インターナショナル・ジャーナル・ペプチド・プロティン・リサーチ、第 ２３巻、第５８１〜５９０頁（１９８４）およびジェニングスーホワイトおよび アルムキット、テトラヘドロン・レタース、第２３巻、第２５３３〜２５３４頁 （１９８２））に記載されている。より大型のペプチドに対するケトメチレン含 有ジペプチドの組込みは、アミノ末端のＢＯＣ保護を用いる固相合成により行わ れる。この方法はロナルド・アルムキスト博士によりＳＦ？Ｉインターナショナ ル社で開発され、同じペプチドにおけると同数の２個のケトメチレン結合を有す るペプチド類似体を作成することに成功している（ＲｌＧ、アルムキスト等、Ｊ 、メジカル・ケミストリー、第３１巻、第５６１頁（１９８８）〕。

ヒドロキシエチレン結合は、硼水素化ナトリウムでの簡単な還元によりケトメチ レン含有ペプチドから合成することができる。所望ならばケトメチレン〔ハーベ ソンおよびリッチ（１９８２）、上記〕およびヒドロキシエチレン含有ジペプチ ド〔プラサドおよびリッチ、テトラヘドロン・レタースミ第３１巻、第１８０３ 〜１８０６頁（１９９０））の両者を製造すべく立体選択的方法を用いることが できる。

ジペプチド類似体の合成は、ＳＡＲ試験に基づき到達する最も活性なペプチドの ケトメチレン含有同族体を与えるよう行うことができる１反応式１は、ジペプチ ド類似体を作成すべく使用しうるＡｒｇ−５ｅｒケトメチレンの合成を示してい る。

同様な合成ルートを用いてＺｓ　Ａｒ　ｇ−ＫｍＮ　ｌ　ｅを合成すると共に、 これを、インプロパツール、ブタノール、アセトン、ジオキサンもしくはテトラ ヒドロ固相合成によりペプチド中に組込む本発明者等の実験が示したところでは 、ケト基に隣接する光学中心はＨＦ開裂に際しセラミ化し、次いでＣｌ８−ＨＰ ＬＣ精製に際し水性ＴＦＡを加える。セリンの光学中心もラセミ型である為、ア ルギニンケトメチレンジペプチドを含有するペプチドで４種のジアステレオマー が得られる。これら４種のジアステレオマーの全てを分離することができる。Ｌ ｙｓもしくは他の残基によるＡｒｇの置換はこの望ましくないラセミ化を防止す る。

ケトメチレン含をペプチドからヒドロキシエチレン誘導体への変換は、ＮａＢＨ ４での精製ケトメチレン含有ペプチドの処理によって達成される。

塩形成 遊離塩基型のペプチドは、化学量論的に過剰の適する有機もしくは無機酸、たと えば燐酸、ピルビン酸、塩酸もしくは硫酸などでの処理により酸付加塩まで変換 することができる。典型的には、遊離塩基をたとえばエタノールもしくはメタノ ールのような極性有機溶剤に溶解し、酸をこれに添加する。温度を約２０〜１０ ０゛Ｃの範囲に維持する。得られた酸付加塩は自然に沈殿し、或いは極性の低い 溶剤で溶液から分離させることができる。

本発明によるペプチドの他の医薬上許容しうる無毒性の塩誘導体は、遊離酸を適 量の医薬上許容しつる塩基で処理して製造される０代表的な医薬上許容しうる塩 基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム 、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化 銅、水酸化第一マンガン、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、水酸化第二マン ガン、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルア ミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール 、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイ ン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコ サミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、 Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などである０反応は水中で単独に或いは 不活性な水混和性の有機溶剤と組合せて約０〜約１００°Ｃの温度、好ましくは 室温で行われる。典型的な不活性の水混和性有機溶剤はメタノール、エタノール フランを包含する０本発明のペプチドと用いる塩基とのモル比は、特定の塩につ き所望される比を与えるよう選択される。たとえばカルシウム塩もしくはマグネ シウム塩を製造するには、遊離酸の出発物質を少なくとも半モル当量の医薬上許 容しうる塩基で処理して中性塩を生成させることができる０本発明のペプチドの アルミニウム塩を製造する場合は、中性塩生成物が望ましければ、少なくとも１ ／３モル当量の医薬上許容しうる塩基を用いる。

本発明によるペプチドの塩誘導体は、その各遊離酸まで前記塩を酸（好ましくは 無機酸、たとえば塩酸、硫酸など）により約０〜約５０°Ｃの温度（好ましくは 室温）で酸性化して再変換することができる。

ユ爽づ１土工□□□金底 小型ペプチドの薬理上効果的な細胞内濃度は、しばしば浸透性向上を用いて達成 される。たとえば、しばしばペプチドを改変して膜浸透性を向上させることが有 利である。これを達成するには、次の２つの手段のいずれかを用いることができ る。（１）トリパルミイルー３−グリセリルシスティン（ＰｓＣ３Ｓ）をプレス 等の手順〔ネイチャー、第３４２巻、第５６１〜５６４頁（１９８９））にした がって組込むことができる。この改変は親油性ペプチドを生成させる。この種の ペプチドは、細胞膜への付着および細胞質中への浸入を媒介することが報告され ている（同上）。（２）親油性ｎ−アルキルアミノ酸オリゴマーをＮ−もしくは Ｃ−末端にて付加することにより、ペプチド候補を誘導化させることもできる、 これら誘導体は、ペプチドの細胞吸収を増大させると報告されているＣ１．トス 等、第１１回アメリカン・ペプチド・シンポジウムのプロシーディング（１９９ ０）］。

ボソーム　へのペプチドの　・ 本発明のペプチドは、リポソーム中へ包封して細胞中へのペプチドの浸入を誘発 させることもできる。大型マルチラメラリポソームはジパルミトイルホスファチ ジル−コリンとコレステロールとジパルミトイルホスファチジン酸との２．０： １．５：０．２のモル比における混合物からそれぞれ製造される（Ｙ、サンチェ ズ等、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ＋＋ｎｕｎ、、第３０巻、第７２８〜７３３頁（１９ ８０））。

生籾ヱ的試験 実施例に示すように、ペプチド６として同定されたペプチドはウィルス転写の抑 制剤として予想外の高活性を示した０次の方法により、他のペプチド候補の活性 を決定することができる。

生惣ヱ敗評価 本発明によるペプチドおよびペプチド同族体の実験的評価は、明確な亜型を示す Ａ型インフルエンザ主株およびＢ型インフルエンザに対する抗ウィルス活性を持 った化合物を得るための必要性に基づいている。抗ウィルス活性は、（ａ）転写 を抑制し、（ｂ）ＲＮＡに結合し、（Ｃ）プラク形成を抑制し、さらに（ｄ）プ ラク寸法を減少させるペプチドもしくはペプチド同族体の能力によって評価され る。さらに、ペプチド候補を各ペプチド候補の皮下投与もしくは鼻孔内点薬およ びウィルス複製に対するその作用の測定によりマウスにて生体内試験する。これ ら生物学的分析の詳細につき下記する。

ウィルスの　および　１ インフルエンザウィルス（Ａ／ＰＲ８／３４）は、１０日齢の胎生卵にて増殖さ せることができる（Ｍ、ガラガー等、Ｊ、クリニカル・マイクロバイオロジー、 第２０巻、第８９〜９３頁（１９８４））、１０００個の卵は１００ｍｇのウィ ルス蛋白質をもたらすと推定される。感染部からアラントイン液を集めると共に 低速度で遠心分離して残骸を除去した後、アラントイン液調製物を２０，０００ ｒｐｍで１時間にわたり遠心分離してウィルスをペレット化させる。ウィルスを さらに３０／６０％蔗糖濃度勾配の界面上に遠心分離して精製する。Ｂ型インフ ルエンザウィルス（Ｂ／リーフ４０）を増殖させ、同様に精製する。

琶り少精裂 Ｍ、は、従来開発されているＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）ゲルクロマト グラフ技術〔ブハー等、上記：およびり、Ｊ、ブハー等、プロシーディング・ナ ンゴナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７３巻、第２３８〜２４２Ｎ（ １９７’６））にしたがって精製される。精製されたベレット化つィルスをｌＯ ％ＳＤＳにより音波処理および５６°Ｃでの１５分間にわたる加熱によって破壊 させ、次いでセファロース６Ｂ−ＣＬカラムに施す、ヘマグルチニンのジスルフ ィド結合を維持するには還元剤を添加しない、非還元性条件下で、Ｍｌは２５， ０００の分子量を有するクロマトグラフで分離される唯一のウィルス成分である 。カラムフラクションをＳＤＳゲル電気泳動によりＭｌにつき分析し、純粋フラ クションを集める。不純物を伴うＭｌを含有するフラクションを循環して純度を 向上させる。各アマンタジンを、ＰＭ−１０膜を装着したアミコン限外濾過セル で濃縮する。数日間の透析と複数回の蒸留水（４℃）の交換によってＳＤＳを除 去する。この技術を用いてＡ型およびＢ型の両インフルエンザウィルスがらＭｌ を精ＲＮＡ−）ランスクリブターゼコアをＯ，Ｍ、　ロチッパンスキー、パイロ ロジー、第７３巻、第３２７〜３３８頁（１９７６）の方法（Ｊ、Ｊ、プロッチ 等、セル、第２３ｔｉ、第８４７〜８５８頁（１９８１）により改変〕にしたが って作成する。ペレット化したインフルエンザウィルスを、０．１ＭのＫＣＩと ５ｍｍのＭｇＣ＋、と１．５ｍＭのＤＴＴと５％グリセリンと１．５％トリトン Ｎ−１０１と１％リソレクチンとを含有する１ｍｌの緩衝液、すなわちＯ，ＬＭ トリスＨＣＩ　（ｐＨ７，８）にて３１℃で２５分間培養することにより破壊さ せる。この混合物を０．０５Ｍ）リスＨＣ１（ｐＨ７，８）および０．１５Ｍ　 ＮａＣ１における３０％〜６０％（ｗ　／　ｖ　）のグリセリン濃度勾配にて５ ９，０００ｒｐｍで３時間にわたり４℃にてＷ３６５０−ターで遠心分離する。

１ｍｌの７０％グリセリン平衡剤はグリセリン濃度勾配の基礎となる。精製され たウィルスコアは、３０％〜６０％のグリセリン濃度勾配のほぼ中間に沈降する 。この実験室における手順を用いて、下記に分析するようにポリメラーゼの比活 性が２１．３倍増大したコア調製物を得た。

トランスクリプターゼ抑制につき一層鋭敏な分析は、Ａ、カド−等によりウィル ス・リサーチ、第３ｔ＝、第１１５〜１２７頁（１９８５））に記載されたよう に作成した一層高度に精製したコアで得られる。これら著者の報告によれば、ホ スホセルロースクロマトグラフィーによるポリメラーゼ複合体がらのＭ、の完全 除去はトランスクリプターゼ活性の６０倍の増加をもたらした。この手順は、５ Ｗ２７０−夕における２２．００Ｏｒｐｍでの１２時間にわたるウィルス溶解物 の遠心分離に続＜Ｃ５ＴＦＡ１度勾配からのコアの精製を必要とする。ホスホセ ルロースクロマトグラフィーは、２０％グリセリンと１ｍＭ　ＤＴＴとを含有す る１０ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，８）で予備平衡化されたカラムにより２ ０ｍ１の比容積を用いて行われる。トランスクリプターゼ活性を有する各アマン タジンを０〜ＩＭの直線ＮａＣ１濃度勾配で溶出させる。２％ＮＰ４０を含有す るカラム緩衝液で平衡化された第二ホスホセルロースカラムでの再クロマトグラ フィーおよび０〜ＩＭのＮＡＣ＋直線濃度勾配による溶出は、出発ウィルス調製 物よりも比活性が３０００倍高いトランスクリプターゼ活性を有する精製ＲＮＡ ポリメラーゼＲＮＡ複合体を与える。

八り旦処理Ｒ）Ａボリメー−ゼゞ　およびその　に　るトランスクリブターゼ活 性をカド−（上記）により記載されたように分析する、分析は、０．１ｍｌの最 終容積にて３０°Ｃで３０分間行なう０反応混合物は５０ｍＭのトリスＭＣＩ　 （２５℃にてｐＨ７，８）と１ｍＭのＭｇＣ１，と１００ｍＭのＮａＣｌと５ｍ ＭのＤＴＴとを含有すると共にＡｐＧ　（２５０μＭ）　、２００μＭ　（Ｈ” 　）ＡＴＰ　（約３．ＯＸＩＯＳｄｐｍ／ｎＭ）および２００　ｕＭのそれぞれ ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰを添加する０反応を等容積の１０％冷ＴＣＡ溶液の 添加によって停止させる。ＴＣＡ不溶性放射能をＧＦ／Ｃガラスフィルタ（ワッ トマン）上に集め、液体シンチレーションによって計数する。精製されたＭｌは 「比較」抑制剤として役立つ０反応の特異性は、抑制を逆転させるＭｌに対し特 異性のモノクローナル抗体を用いて証明することができる〔ハンキンス（１９８ ９Ｌ上記およびプハー等（１９８９）、上記〕。

Ｍ　およびペプチドのＲＮＡ　人゛ 精製されたＭ、並びに合成ペプチドおよびペプチド同族体を、イエ等（１９８９ 、上記）により記載されたようにＲＮＡ結合活性につき試験する。インフルエン ザウィルスをＭＤＣＫ細胞モ細胞モル−イヤー、１を含有する燐酸塩フリーの最 小必須培地の存在下に増殖させて、ウィルスＲＮＡをＰ３！で標識する。ＲＮＡ をボスおよびエアーの方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、 第９６巻、第３６３〜３７２頁（１９７０））の方法により抽出し、この方法は ＳＤＳおよびプロテナーゼにと共に培養し、次いでフェノールおよびクロロホル ムで抽出することを含む、ペプチドまたはＭｌをスロット−プロット装置により ニトロセルロース上にプロットし、ＢＳＡとフィコールとＥＤＴＡとＮａＣ１と ポリビニルピロリドンとを含有する検査用トリス緩衝液で洗浄し、次いで１：４ ０００の比にてＰ３″標識ウィルスＲＮＡをキャリヤ酵母ｔＲＮＡと共に含有す る検査用緩衝液で洗浄する（同上）０次いで各シートを検査用緩衝液で数回洗浄 し、乾燥させ、次いで放射能写真技術にかける。プロットをヘーファー密度計で の走査によって定量する。

亡り　に　る ペプチドおよびペプチド同族体を、プラク形成を抑制し或いはＭＤＣＫ細胞モ細 胞モル−イヤーるインフルエンザウィルスのプラク寸法減少をもたらす能力につ き評価する。３０〜１００個のプラグを生成するのに充分なウィルス接種量を用 いて、６０ｍｍプレートにおけるモルイヤーに感染させる。最小必須培地におけ る４ｍｌの０．　５％寒天上層を加える。さらにペプチドにはトリプシン感受性 部位が存在しないと仮定して、トリプシン（２Ｍｇ／ｍｌ）を寒天に添加する、 ペプチドおよびペプチド同族体を寒天上層に種々異なる希釈率で添加する。プレ ートを５％ＣＯ！の下で３５℃にて２〜３日間にわたり培養し、プラク抑制また はプラグ寸法の減少をクリスタルバイオレットでのプレートの染色後に評価する 。

マウスにおしるペプチドおよびペプチドロ　の　ウィルス・ペプチドおよびペプ チド同族体を、２つのルート（すなわち皮下投与または鼻孔内点薬）のいずれか によりマウスにおける抗ウィルス活性につき試験する。マウス群に軽いエーテル 麻酔の下でＡ／ＰＲ／８／３４の１００回の５０％マウス感染投与量を鼻腔内感 染させるＣＢ、　Ｅ、　ヨハンソン等、Ｊ、パイロロジー、第６３巻、第１２３ ９〜１２４６頁（１９８９））。最初の手順と同様に、化合物（またはブラセボ ）を種々異なる投与レベルにてウィルス感染の数時間前、感染の６時間後、およ びその後の２日間それぞれで投与する。アマンタジンを陽性比較として用いる。

感染の３日間後、マウスを殺し、ホモゲナイズした肺懸濁物の１０−２スクリー ニング希釈物を１０日齢の雛胎芽に注射する。ウィルス陽性の肺を、集めた肺液 におけるヘマグルチニン化によって同定する。抗ウィルス活性をブラセボ処理比 較に対するヘマグルチニン化活性における減少に基づいて評価する。

マウス対Ａ／Ｐｒ／８／３４にて活性であると判明した化合物の抗ウィルス活性 を、過去１０年間を代表する他のＡ型インフルエンザウィルス株（ＨＩ　Ｎ　１ およびＨ３Ｎ２）並びにＢ型インフルエンザ株につき試験する。

ペプチドおよびペプチドｄ　の　および　の４　゛（＋ｔＳで標識したペプチド およびペプチド同族体を用いて、ＭＤＣＫｍ胞モルイヤーによる吸収程度および 細胞内の位置を決定することができる。標識した化合物を細胞媒体に添加すると 共に、ＭＤＣＫ細胞モルイヤー上に上層として載せる。細胞モルイヤーを３７゛ Ｃにて０時間、２時間、６時間および２４時間にわたり培養する。細胞を冷凍さ せ、ＥＤＴＡ／）リプシンで処理し、次いで洗浄する。細胞の１部を、全細胞数 を計数するため貯蔵する。細胞をダウンス・ホモゲナイザでホモゲナイズして細 胞質抽出液を得る（Ａ、ダレボリアデス、パイロロジー、第７９巻、第４４９〜 ４５４頁（１９７７））、ＮＰ−４０を用いかつ上記したように蔗１１＄１衝剤 に沈降させて核を作成する。■＋２５のカウント数を全細胞にて個々に測定し、 さらに核抽出物および細胞質抽出物にて測定する。Ｉ目５の化学形態については ＨＰＬＣにより評価して、細胞による代謝程度を決定する。先ず最初に細胞抽出 物をＨＰＬＣにより分析して、ペプチドが完全であるか或いは代謝されているか どうかを決定する０次いで細胞質および核の抽出物を分析して、ペプチドの位置 を決定する。

蛋史１分Ｍ試駁 （ａ）マウス　ホモ゛　イズ 新たなマウス呼吸器官を生理食塩水でホモゲナイズする。ペプチドをホモゲナイ ズ物と混合し、次いで３７°Ｃの浴内で振とうする１分解をＨＰＬＣにより監視 する。

（ｂ）マウス　ホモ゛　イズ 釈たなマウスの胃を生理食塩水でホモゲナイズする。ペプチドを０．ＩＮのＮａ ＯＨに溶解させ、水中の０．２５％のメチルセロソルブと混合する。この溶液を ０．１Ｎ　ＨＣＩで部分中和する。この溶液をマウスの胃ホモゲナイズ物と混合 し、３７°Ｃで培養する０分解を）ＩＰＬＣにより監視する。

（ｃ）マウス　ホモ゛　イズ マウスの小腸をマウスを殺した直後に副出し、クレブス・リンガ−溶液で細裁す る。ペプチド試料をホモゲナイズ物と混合し、次いで３７°Ｃの浴中で振とうす る０分解をＨＰＬＣにより監視する。

大剋繊衣惣 本発明のペプチド、その塩、並びにそのリポソームおよび脂質などとのアダクト などは抗ウィルス活性を示し、したがって抗ウイルス薬物としての用途を有する 。

これら物質は非経口（注射、皮下、筋肉内もしくは静脈内）、経口、吸入または 鼻孔内の投与、または他の浸透性投与ルートに適する乾燥型に処方することがで きる。

目的とする投与方式に応し使用する組成物は固体、半固体または液体投与形態物 、たとえば錠剤、座薬、丸薬、カプセル、粉末、液体、懸濁液などとすることが でき、好ましくは正確な投与量における１回の投与に適した単位投与形態物とす ることができる。

非経口投与は一般に皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とする。注射液は液 体溶液として或いは懸濁液、注射する前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに適 した固体型または乳液として慣用の形態で作成することができる。適する賦形薬 はたとえば水、塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどである。

さらに、所望ならば投与すべき医薬組成物は少量の無毒性の補助物質、たとえば 湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨｔｌ衝刑など、たとえば酢酸ナトリウム、ソルビタ ンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどをも含有することがで きる。

固体組成物については、慣用の無毒性固体キャリヤはたとえば医薬縁のマニトー ル、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、 セルロース、グルコース、蔗糖、炭酸マグネシウムなどを包含する。上記したよ うな活性化合物は、たとえばポリアルキレングリコール（たとえばプロビレ・ン グリコール）をキャリヤとして用い座薬として処方することができる。液体の医 薬投与しうる組成物は、たとえば上記活性化合物と適宜の医薬アジエバントとを たとえば水、塩水、デキストロース水溶液、グリセリン、エタノールなどのキャ リヤに溶解もしくは分散させて摂取もしくは注射に適する溶液もしくは懸濁液を 形成させて作成することにより調製することができる。所望ならば、投与すべき 医薬組成物はさらに少量の無毒性補助物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、Ｐ Ｈ￥Ｉｋ衝剤など、たとえば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリ エタノールアミン、酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエートなどをも 含有することができる。この種の投与形態物を作成する実際の方法は公知であり 、或いは当業者には明らかである〔たとえばレミントン・ファーマスーチカル・ サイエンス、マツグ・パブリッシング・カンパニー社、イーストン、ペンシルバ ニア、最新版、参照〕、投与すべき組成物はいずれにせよ処置すべき患者の徴候 を軽減するのに有効な量の活性化合物を含有する。

経口投与については、しばしばたとえばケトメチレン基を有するようなペプチド 誘導体を用いて胃腸管におけるペプチドの安定性を向上させると共にウィルス自 身に対するペプチドの供給を増大させることが好ましい。

本発明の１つの特徴はその化合物の高活性である。したがって、比較的低レベル の化合物を用いることができ、たとえば患者の体重１ｋｇ当り約１μｇ〜約５ｍ ｇの範囲の投与量で用いられる。それより多量もしくは少量も所望に応し使用す ることができる。

これら薬剤形態物は典型的には、完全な投与方式が１〜２０回の連続投与を含み うるよう経時的に複数回の投与として投与される。いずれにせよ有効な投与量お よびパターン（すなわち抗ウイルス効果を有するのに充分な方式）を用いるべき である。

実施別 叉施拠よ ニブ土工■金底 本発明によらないペプチド１〜５および本発明によるペプチド６（全てＭｌに存 在し、かつ全て第３表に示す）を作成して比較した。これらは、メリーフィール ド固相技術［エリクソンおよびメリフィールド、ザ・プロテインス、第＋ｒ巻、 Ｈ，ニューラス編、アカデミンク・プレス・インコーポレーシゴン社、ＮＹ、第 ２５５〜５２７頁（１９７６））を用いベックマン・モデル９９０Ｃ型の自動化 ペプチド合成装置で合成した。粗製ペプチドをセファデックスＬＨ−２０により 或いは製造用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ’ＬＣ）により逆相バイダック ＣＩ＠カラム（１５〜２０μｍ）を用いて精製した。ペプチドの純度を分析用Ｈ ＰＬＣおよびアミノ酸分析によって検査した。ペプチドは全て少なくとも９９％ の純度であった。

免疫学的試験のため、ペプチドをアクタおよび共同研究者により記載された方法 ＣＭ、Ｚ、アクタ等、バイオヒミク・バイオフィジーク・アクタ、第６７０巻、 第３００〜３０２頁（１９８１））によりキャリヤ蛋白質キーホールリンベント ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）　、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはチログロブリ ンに結合させた。

第３表 ペプチドのアミノ １、　ＬＴＶＰＳＥＲＧＬＱＲＲＲ ２、ＡＬＮＧＮＧＤＰＮＮＭＤＫＡＶＫＬＹ３、　ＫＲＥＩＴＦＩＩＧＡＫＥＩ ＳＬＳ４、　ＥＱ　ＩＡＤＳＱ）ＩＲ５ＨＲＱＭＶ５、　ＧＴＨＰＳＳＳＡＧＬ ｌ［ＮＤＬＬＥＮ６、　ＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＩＩＲＱＭＶィルス　Ｍ 　および「コア　の （ａ）インフルエンザウィルスの　および　ＩＡ／ＰＲ／８／３４株のインフル エンザウィルスを１０日齢の胎生卵で増殖させたＣＭ、ガラガー等、Ｊ、クリニ カル・マイクロバイオロジー、第２０巻、第８９〜９３頁（１９８４））。

（ｂ）ＭユΩ精Ｉ Ｍｌを非還元性条件下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルクロマトグラフ ィーにより精製したＣＤ、Ｊ、ブハー等、Ｊ、パイロロジー、第３６巻、第５８ ６〜５９０頁（１９８０））、ＳＤＳゲル電気泳動により純度を測定した〔ガラ ガー、上記）、ＳＤＳを多量の蒸留水に対する徹底的な透析によって除去したＲ ＮＡポリメラーゼ−ＲＮＡ複合体をロチラバンスキーの方法（０，Ｍ、　ロチョ バンスキー、パイロロジー、第７３巻、第３２７〜３３８頁（１９７６））の方 法〔ブロッナおよび共同研究者により改変、Ｊ、Ｊ、ブロッナ等、セル、第２３ 巻、第８４７〜８５８頁（１９８１））にしたがって精製した。この手ｌ＠によ り、２１．３倍の比活性の増加を伴うコア調製物を得た。

ヨ’７−２Ａ１１３に−１た近 トランスクリブクーゼ活性をカド−および共同研究者の方法（Ａ、カド−等、ウ ィルス・リサーチ、第３巻、第１１５〜１２７頁（１９８５））にしたがって分 析した。

結果殻夷び検討 ペプチド１は５０ｎＭｆｉ度にて３５％の抑制を示したのに対しペプチド４は５ ０ｎ、Ｍにて３８％の抑制を示した（第４表）０Ｍ−蛋白質の抑制活性を第２図 および第５表に示す、ペプチド２．３および５はポリメラーゼ活性の増大を示し た（第４表）、従来の試験ＣＭ、ブハー等、（１９８９）、上記］におけるこれ らペプチドは、免疫優性領域であると同定された（同上）。

完全な亜鉛フィンガーモチーフを含有するペプチド６は、Ｍ、蛋白質自身よりも ずっと活性であることが判明した０ＭＩ蛋白質の場合の５０％抑制は１ＭＭ〜０ 、　１ＭＭの範囲であったのに対し、ペプチドの場合はピコモル範囲であった（ 第６表、第２図）。

こ詐ら結果が示すように、インフルエンザウィルスのリボ核蛋白質の転写を完全 に抑制しうるＭＩ配列からの断片が同定され、この転写抑制は投与量依存性であ る。したがって、このペプチドはインフルエンザ用の抗ウイルス薬剤の開発に極 めて有力である。さらに、ペプチドは示した陰性ストランドウィルスに対しても 抗ウィルス活性を有する。

ベプチ゛モル′　０ （μ　ｇ／１００　μ　ｌ）　（μＭ）　ベノチＦ　１　ペプチド　２　ベブチ Ｆ　３　ベブチＦ　４　ベブチＦ　５１０　５０　３５　−１３＠　−３０＠　 ３２　−３０”１　５　９　−２０＠　−９’　２３　１０．１　０．５　２　 −１０”　８　２２　１４０．０１　０．０５　３　−３７’　９　３８　１６ 増大％ 第５表 Ｍ−白　によるポリメーーゼの 一二狡」肛Ｅ［−到ＬＵＩに　−押胴Δ−（μｇ７１００μ］）　（μＭ） ２．５　１　６４ ０．２５　０．１　１９ ０、　０２５　０．　０１　２２ ０．００２５　０．００１　２１ 第６表 ペプチド６１４８〜１６６　によるボ１メー−ゼのモル濃度　抑制％ Ｍ　Ｍ−ペプチド６１４８〜１６６ １００　ＮＤ　８１ １０　９５　９Ｂ １　６４　＞ｔｏ。

実施斑ｌ ペプチド６を、１ｍｌ当たり１００μｇのペプチド６を注射用塩水に溶解して注 射液薬剤型に処方した。この溶液を注射用の注射器に充填した。

実施斑主 ペプチド６をリポソームに混入した。ジパルミトイルホスファチジルコリンとコ レステロールとホスファチジン酸〔シグマ・ケミカル・カンパニー社、セントル イス、ＭＯ）とから、それぞれ１　：１．５　：ｏ、２のモル比にてマルチラメ ラリポソームを作成した８次いで、この脂質混合物の乾燥フィルムを形成させ、 ペプチド６の溶液で膨潤させた。比較として、これをリポソーム物質に補捉され たペプチドの量を決定するためＣＩ’標識のペプチド６を用いて反復した。この 物質を反復洗浄し、１８．００Ｏｒｐｍで遠心分離して、捕獲されない物質を除 去した。

この物質を次いで注射用塩水に懸濁して、１０〜１０００μｍ範囲における有効 投与量の蛋白質６を供給した。この形態にて、リポソームはウィルス粒子中への ペプチドの通過を促進した。

実施用土 ペプチド６を長アルキル側鎖を有するα−アミノ酸（いわゆる脂肪族アミノ酸） と縮合させた。これら物質を、ペプチドのＮもしくはＣ末端を介し簡単なアミド もしくはエステル結合によりカップリングさせた。用いた脂肪族アミノ酸はα− アミノ（Ｃ９〜Ｃ１９）線状アルキル酸またはアミド結合を介し互いに結合した 各アルキルペプチド中に９〜１９個の炭素原子を有する生物分解性のオリゴアル キルペプチドである〔トス等、第１１回アメリカ・ペプチド・シンポジウム、上 記参照〕。

これら縮合は複数の異なる蛋白質６をもたらし、そのそれぞれはウィルス粒子中 へのペプチドの移動を促進するのに適した線状アルキル基を有した。したがって 、物質を注射用薬剤に処方する場合（１０〜１，０００μｇ／ｋｇ投与レベル） 、これは益々効果的になる。

実施斑五 １６２〜１６６におけるアミノ酸の代わりにケトメチレン基を挿入してペプチド ６を合成した。これは胃腸管安定性の増大した物質を生成した。これを次のよう に経口投与形態物に処方した： ペプチド　３０ｍｇ コーンスターチ　１１５ｍｇ 乳糖　１５０ｍｇ ステアリン酸マグネシウム　５ｍｇ これら物質を混合すると共に経口投与のための錠剤までプレスした。

２施撚隻 第１表に含まれる他のペプチド並びに保持性置換および欠失を伴って作成した同 族体を、リポソームおよび／または「脂肪族アミノ酸」改変を伴い或いは伴わず に作成して薬荊形態物に処方した０次いで、これら物質を上記手順にしたがい第 １図 濃度（ＩＭ） 第２図 国際調査報告 ＋ｅ＋＋＋ｒ＋＋＋＋ｉｅＩ１ｍ＋ａＩ＊ｌ１ｃａｌｌａ＊Ｎａ　ｐｃ↑／ＵＳ 　９２１０５１８６国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＣＡ、ＪＰ （７２）発明者　ブツチャー、トリス・ジエイアメリカ合衆国ニューヨーク州　 １０１２８、カント・ストリート１２９

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．インフルエンザ転写を抑制する能力によりインフルエンザウィスルに対し抗 ウィルス活性を有するペプチドにおいて、インフルエンザＡマトリックス蛋白質 の１４８〜１６６領域に実質的に対応する配列を有することを特徴とするペプチ ド。
2. ２．前記蛋白質が１４８および１５１　Ｃｓと１５９および１６２　Ｈｓと１６ ３　Ｒ、１６４　Ｑ、１６５　Ｍおよび１６６　Ｎから選択される残基の少なく とも１つとを含む配列を有する請求の範囲第１項に記載のペプチド。
3. ３．実質的に１４８ＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶ１６６に対応する 請求の範囲第２項に記載のペプチド。
4. ４．実質的に１４８ＣＡＴＣＥＱＩＡＤＳＱＨＲＳＨＲＱＭＶ１６６よりなる請 求項第３項に記載のペプチド。
5. ５．１６３　Ｒ、１６４　Ｑ、１６５　Ｍおよび１６６　Ｎ残基のうち少なくと も２つを有する請求の範囲第２項に記載のペプチド。
6. ６．１６３　Ｒ、１６４　Ｑ、１６５　Ｍおよび１６６　Ｎ残基のうち３つを有 する請求の範囲第２項に記載のペプチド。
7. ７．１６３　Ｒ、１６４　Ｑ、１６５　Ｍおよび１６６　Ｎ残基の４つ全てを有 する請求の範囲第２項に記載のペプチド。
8. ８．リボソーム内に包封された請求の範囲第１項に記載のペプチドからなる組成 物。
9. ９．リボソーム内に包封された請求の範囲第２項に記載のペプチドからなる組成 物。
10. １０．脂質に結合した請求の範囲第１項に記載のペプチドからなるリポペプチド 。
11. １１．脂質に結合した請求の範囲第２項に記載のペプチドからなるリポペプチド 。
12. １２．少なくとも１個のケトメチレン置換基を有する請求の範囲第１項に記載の ペプチドからなるケトメチレンペプチド誘導体。
13. １３．少なくとも１個のヒドロキシエチレン置換基を有する請求の範囲第１項に 記載のペプチドからなるヒドロキシエチレンペプチド誘導体。
14. １４．請求の範囲第１項に記載のペプチドを医薬上許容しうるキャリヤ中に含む 抗ウィルス医薬組成物。
15. １５．請求の範囲第２項に記載のペプチドを医薬上許容しうるキャリや中に含む 抗ウィルス医薬組成物。
16. １６．請求の範囲第３項に記載のペプチドを医薬上許容しうるキャリヤ中に含む 抗ウィルス医薬組成物。
17. １７．請求の範囲第８項に記載の組成物を医薬上許容しうるキャリヤ中に含む抗 ウィルス医薬組成物。
18. １８．請求の範囲第９項に記載の組成物を医薬上許容しうるキャリヤ中に含む抗 ウィルス医薬組成物。
19. １９．請求の範囲第１０項に記載のリポペプチドを医薬上許容しうるキャリヤ中 に含む抗ウィルス医薬組成物。
20. ２０．請求の範囲第１１項に記載のリポペプチドを医薬上許容しうるキャリヤ中 に含む抗ウィルス医薬組成物。
21. ２１．ウィルス感染した患者に、抗ウィルス上有効な投与処方の請求の範囲第１ ４項に記載の組成物を投与することを特徴とする抗ウィルス治療法。