KR20020005675A

KR20020005675A - ＨＩＶ-1 Ｔａｔ 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는항-ＨＩＶ-1 백신

Info

Publication number: KR20020005675A
Application number: KR1020017013031A
Authority: KR
Inventors: 에르완 로레
Original assignee: 조세프 벡세라; 썽트르 나시오날 드 라 르쉐이쉬 씨엉띠피끄(씨.엔.에르.에스.)
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-01-17
Also published as: ES2231178T3; PL197666B1; HK1044463B; CA2370563C; EP1169057A2; FR2792206A1; CA2370563A1; WO2000061067A3; DE60015312D1; MXPA01010482A; NO20014841L; HUP0200841A2; AU775560B2; ATE280586T1; HK1044463A1; FR2792206B1; IL145884A0; NO20014841D0; WO2000061067B1; DE60015312T2

Abstract

본 발명은 Tat HIV-1 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는 항-HIV-1 백신, 및 HIV에 감염된 개체에서 상기 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다. Tat 단백질은 HIV-1 Oyi 변이체의 단백질이다.

Description

ＨＩＶ-1 Ｔａｔ 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는 항-ＨＩＶ-1 백신{Anti-HIV-1 vaccine comprising all or part of the HIV-1 Tat protein}

Tat는 바이러스 유전자의 발현 및 HIV-1 바이러스의 복제에 필수적인 바이러스 단백질이다. Tat 유전자는 분리체에 따라 99 내지 106개 잔기의 단백질을 코딩하는 두 개의 엑손으로 구성된다. 그러나, C-말단의 일부가 결손되어 있는 86개의 잔기를 함유하는 형태의 Tat 활성은 이미 기술되었다. 이와 같은 86개의 잔기를 갖는 Tat 유도체는 천연 상태로는 더 이상 존재하지 않는 실험실적 인공물 또는 선조형(ancestral form)인 것으로 여겨진다. 이러한 단백질은 HIV-1 mRNAs의 5' 말단에 위치해 TAR로 명명되는 뉴클레오타이드 표적물에 부착함으로써 HIV-1 유전자를 활성화시킨다. 이것은 HIV로 감염된 세포에 의해 분비되며 HIV-1의 효과적인 역전사에 필수적이다. 이것은 일단 세포 밖에서 원거리 감염 세포를 활성화시키고 비감염된 T 세포의 면역결핍을 유도할 수 있다. 또한, 이것은 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)과 같은 AIDS-관련 병리학적 증상에 직접 관여한다.

AIDS 백신 개발이 전 세계적으로 강력히 요망되었으나, AIDS 백신 제조는 두가지 주요 문제점을 갖는다. 그 첫 번째는 인벨롭(envelope) 단백질 GP120이 상당히 가변적이라는 것이다. 두 번째 문제점은 항-GP120 항체가 공표된 AIDS를 앓고 있는 환자의 질병을 더욱 악화시키는 것으로 나타났다는 사실에 기인한다. 그러나, 예비 결과는 이전에 오염되지 않았던 사람에게서 항-GP120 항체로 보호 효과가 가능할 수 있음을 시사한다. 항-GP120 백신을 갖는 상 II가 미국 로슈(Roche Company)사에 의해 최초로 시도되었다. 이러한 상 II를 위해 선택된 집단 (cohort)은 의학적인 관점에서 이미 검증되었다. 그러나, 백신이 시판되는 경우 상응하는 의학적 감시를 받는 것은 어려울 것이다.

GP120을 사용하여 HIV-1으로 감염된 환자의 혈액에서 Tat를 검출한다. 바이러스로 감염된 세포를 모두 제거할 의무가 있는 대식세포 및 세포독성 T 림프세포(CTL)의 활동은 Tat에 의해 서서히 봉쇄되고, 따라서 면역억제제로서 작용한다. 항-Tat 항체(또는 Tat 표적 활성 성분)는 CTL 및 대식세포의 활동을 복구시킨다.

따라서, Tat는 항-Tat 항바이러스 개발 및 백신 접근에 있어 모두 유리한 목표물이다.

그러므로, Tat 단백질이 실험 대상이다. 생물학적으로 불활성인 재조합 Tat 단백질(Tat 톡소이드)로 얻은 임상적 시도는, 특히 Tat 톡소이드가 혈청반응음성 환자에게서 항-Tat 항체를 지속적으로 다량 생산하는 것으로 나타났다(참조: Le Buanec et al., 1998). 혈청양성 및 면역결핍 환자에게서는 항-Tat 항체 수준이 정상인의 항-Tat 항체 수준에 비해 상당히 증가한 것으로 관찰되었다(참조: Westendorp et al., 1995).

상기와 같은 Tat 톡소이드는 Tat 시스테인의 카복시메틸화후 생물학적으로 불활성화된 재조합 단백질이다. 발명자들은 또한 카복시메틸화된 Tat(Tat Bru cmC)를 제조하고, 유리된 시스테인을 갖는 동일한 Tat 변이체(Tat Bru fC)가 트랜스액티베이션(transactivation)할 수 있어도, 상기 제조된 Tat는 트랜스액티베이션 활성이 없음을 밝혀냈다. Tat Bru cmC는 Tat Bru fC에 필적할만한 친화성으로 TAR에 결합할 수 있다.

카복시메틸화된 Tat를 백신으로 사용하는데 있어서 주 단점은 발명자들이 원편광 이색성 및 NMR로 확인한 바, 시스테인의 화학적 변형이 구조를 변화시킨다는 것이다. 각종 Tat 변이체중에 구조 변화가 존재하기는 하지만, 시스테인의 카복시메틸화는 Tat의 펩타이드 사슬 폴딩을 주로 변형시키게 되고 그 결과 항-Tat 백신 제조용 후보로는 마땅치 않다.

따라서, 결손이 있지만 작용성 Tat와 유사한 구조적 특징을 갖는 Tat 단백질을 항-HIV-1 백신에 사용하는 것이 권장된다. 이러한 Tat는 천연 Tat에 의해 유도된 것과 유사한 면역 반응을 유도할 수 있지만, 트랜스액티베이션할 수 없는, 즉 상기 언급한 바와 같이 원거리 감염 세포를 활성화시키지 않고 비감염 T 세포의 면역결핍을 유도하지 못하도록, 가능한 천연 Tat 단백질에 근접한 삼차원 구조를 가져야 한다. 이러한 면역결핍을 억제하는 것이 중요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 약제학적으로 허용되는 비히클, 및 경우에 따라 하나이상의 적합한 면역 보조제와 함께, TAR에 결합할 수 있으면서 트랜스액티베이션할 수 없는 적어도 하나의 HIV-1 Tat 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는 항-HIV-1 백신을 제공하는 것이다. 이러한 Tat 단백질은 이 단백질이 투여되는 동물에게서 이러한 단백질의 다른 변이체를 인식할 수 있는 항체를 상기 변이체의 트랜스액티베이션을 억제하기에 충분한 수준으로 생성할 수 있어야 한다.

따라서, Tat 단백질은 본 발명에 따른 백신 제조용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이 단백질의 하나이상 부분만이 본 발명에서 Tat 단백질에 요망되는 기능을 수행할 수 있다. 상기 언급된 백신은 또한 각종 Tat 단백질의 배합체 또는 각종 Tat 단백질의 일부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 대상은 HIV-1 Tat 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는 항-HIV-1 백신, 수개의 Tat 변이체를 인식할 수 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조방법 및 생물학적 샘플에서 Tat를 검출하는 방법이다.

본 발명의 목적은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 백신으로서 사용하기 위한 인간 면역결핍 바이러스의 조절 단백질, 즉 Tat 단백질의 용도 및 HIV로 감염된 개체에서 상기 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 여러 Tat 단백질을 비교하여 나타낸 것이다.

Tat 단백질을 도 1a에 굵은 글씨 및 도 1b에 밑줄로 언급된 6개의 구조 그룹으로 분류하였다.

도 1a: Tat 단백질의 아미노산 서열

바이러스의 선조 균주에 근접한 HIV-1 분리체로부터 TatZ2를 수득하였다(참조: Zhu et al., 1998). 중앙 아프리카의 이성애 HIV 감염자에게서 80s로 분리된 HIV-1 균주로부터 Tat Mal 및 Tat Eli를 수득하였다(참조: Alizon et al., 1986). Tat Br은 실험실에서 가장 널리 사용되는 서열을 포함하며 프랑스에서 분리된 HIV-1 균주로부터 수득하였고(참조: Barre-Sinoussi et al., 1983), Tat Jr은 미국 HIV-1 분리체로부터 수득하였다(참조: O'Brien et al., 1990). Tat Oyi는 Tat Jr과 밀접한 관련이 있으며, Tat Bru but는 가봉의 건강한 환자에게서 동정된 HIV 균주로부터 수득하였다.

도 1b: Tat 단백질을 그의 크기와 MULTALIN 프로그램용으로 그들을 포함하는 돌연변이 함수로서 분류(Corpet, 1989).

도 2: HIV-Oyi 변이체의 Tat 단백질 서열(Huet 등에 의해 기술, 1989).

도 3: 280 nm에서 C8 그라프트 칼럼을 사용한 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 6개의 Tat 변이체 정제(실험과정의 물질 및 방법 참조).

각 프레임에 있어서, 하부 트레이싱은 정제전 펩타이드 합성 결과를 나타내고, 상부 트레이싱은 최종 정제 단계후 합성 결과를 나타낸다. TFA를 사용하여 수지로부터 Tat Bru (A), Tat Jr (B), TatZ2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) 및 Tat Eli (F)를 분리하였다. 부틸 메틸 에테르로 정제후, 단백질을 TFA 완충액에 0.1%로 용해시켰다(각 프레임의 하부 트레이싱). 각 단백질에 대해, 정제를 Hybar Merck C8 칼럼(4.5×125 ㎜, 유속 0.8 ㎖/분)상에서 반분취용 HPLC로 2회 연속 수행한 후, 순수 분획을 분석하고(각 프레임의 상부 트레이싱), 질량 스펙트럼및 아미노산 분석으로 확인하였다(데이터는 나타나 있지 않다). 각 경우, 주요 HPLC 피크는 완전한 서열을 나타내는 것으로 관찰되었다. 10 내지 15 분사이의 피크는 50개 잔기의 유도체를 나타내는 반면, 주 분획에 근접한 피크는 N-말단으로부터 1 내지 15개가 결손된 유도체이었다. 매우 소수성인 분획은 아마도 불완전하게 비보호된 측쇄로 인해 고분자량을 갖는 유도체이다.

도 4: 전기영동에 의해 뉴클레오타이드 표적 TAR용 합성 Tat의 친화성 상수 측정(참조: 물질 및 방법하에서의 전기영동 이동 시프트 시험)

단백질 농도(ng/㎕)는 각 겔 밴드의 상부에 표시하였다. 유리 또는 복합 RNA를 각각f(유리) 및c로 나타내었다. 동일한 RNA 제제를 6개의 단백질로 적정하는데 사용하였다. 카복시메틸화된 시스테인을 갖는 Tat Bru 유도체(Bru cmC)를 또한 시험하였다. 평형 해리상수(Kd)가 전기영동 이동 시프트 시험으로부터 직접 측정되었다. Kd 값은 Tat Eli 및 Tat Mal에 대해 약 50 nM 내지 Tat Oyi 및 Tat Jr에 대해 약 140 nM로 다양하다. 또한, 발명자들은 Kd 값이 다양하다는 것 이외에도 각종 단백질에 대한 결합 특성이 다소 상이함을 알아냈다. 예를 들어, 저농도의 Tat Bru는 잘 분리된 단일 복합체를 제공하며, 다소 높은 농도(>4.5 ng/㎕)로는 형태를 응집시켜 아크릴아미드 겔을 통과할 수 없었다. 이와 대조적으로, 다중결합된 복합체는 심지어 저농도에서도 Tat Eli로 용이하게 동정되었다. Tat Eli로 3개 까지의 지연(retarded) 밴드 및 Tat Jr로는 이보다 적은 정도를 확인하는 것이 가능하다. 이러한 효과는, 예를 들어 Tat Bru 및 Tat Mal과 같은 더 짧은 단백질 및 더 긴 단백질인 Tat Oyi로는 관찰되지 않는다.

도 5: HeLa 세포상에서 합성 Tat 단백질의 트랜스액티베이션 시험.

상기 세포를 LacZ 리포터(reporter) 유전자가 결합된 HIV-1 LTR로 형질감염시켰다. 생성된 β-gal 단백질 수준은 각종 합성 Tat의 트랜스액티베이션 용량에 비례하였다. LTR은 HIV를 전사하는데 필요한 하향 및 상향 DNA 서열을 함유하며, TAR은 mRNA의 개시부에 존재한다(참조: Claven 및 Charneau, 1994). HIV를 트랜스액티베이션시키는데 필요한 세포 보조인자는 HeLa 세포내에 존재한다. Tat가 없는 경우, 대조용(C)으로 표시된 β-gal의 기본 발현만이 있다. 다음 막대그래프는 상이한 Tat 변이체를 두 농도(1 μM(밝은 회색 박스) 및 5 μM(어두은 회색 박스))로 사용하여 수득한 트랜스액티베이션을 나타낸다. 각 경우, Tat를 세포 완충액에 첨가하였는데, 대조군보다 높은 β-gal의 발현은 합성 Tat가 핵 및 세포질막을 교차할 수 있고, TAR에 결합할 수 있으며, 세포 보조인자와 상호작용할 수 있음을 의미한다. 이 실험에서 Tat Bru cmC(데이터는 나타나 있지 않음) 및 Tat Oyi 만이 결여되어 있으나, 이들은 TAR에 결합하였다(도 1 참조). Tat Mal 및 Tat Eli는 Tat Bru 보다 3 내지 4배 높은 수준의 트랜스액티베이션을 나타내었다. 선조 Tat 단백질에 가장 가까운 Tat Z2는 낮은 수준의 트랜스액티베이션을 나타내었으며, 진화하게 되면 HIV-1 분리체에 더 효과적인 Tat를 제공할 수 있다. 리포터 유전자로서 루시페라제를 사용한 다른 형질감염 시험으로 유사한 결과가 얻어졌으며, 1 μM 농도의 Tat Mal 및 Tat Eli는 트랜스액티베이션된 Tat-pCMV로 수득한 수준에 필적하는 정도로 LTR을 트랜스액티베이션시켰다(데이터는 나타나 있지 않다). 각종 실험에 사용된 농도 범위는 0.1 내지 10 μM이다(데이터는 나타나 있지 않다). 0.1 μM에서, Tat Eli 만이 기본 수준에서 상당히 높은 트랜스액티베이션 수준을 나타내었다. 10 μM에서, 6개의 Tat가 상기와 같은 높은 트랜스액티베이션을 나타내었으며, 포화로 인해 이들간의 차이를 밝히는 것은 불가능하다.

도 6: Tat Z2(흰 삼각형), Tat Oyi(검은 삼각형) Tat Bru(흰 원), Tat Bru cmC(부호 없음), Tat Jr(검은 원), Tat Mal(흰 네모) 및 Tat Eli(검은 네모)의 이색성 스펙트럼

스펙트럼을 포스페이트 완충액(20 mM, pH 4.5)에서 측정하였다; 이들은 260 내지 178 nm에서 50 ㎛의 광로 길이로 기록되었다. CD 스펙트럼에서 관찰된 차이는 크기에 관계없이 Tat 변이체간에 구조적 불균질성을 나타낸다. CD 스펙트럼을 짧은 Tat(백색 부호) 및 긴 Tat(흑색 부호)로 구성된 두 범주로 조합하는 것은 가능하지 않다. CD 스펙트럼은 미조직 구조에 대표적인 200 nm에 근접한 네거티브 밴드를 특징으로 한다. Tat Bru cmC로 관찰된 200 nm 밴드의 강한 크기는 시스테인의 변형이 다른 Tat에 비해 주 구조적 변화를 일으키는 원인임을 나타낸다.

도 7: 변성 조건하에서 Tat 단백질의 7개 변이체에 대해 세 개의 토끼 폴리클로날 혈청(항-Tat Bru cmC, 항-Tat Oyi 및 항-Tat Eli) 희석물을 사용하여 수행한 Elisa 시험

도 8: 항-Tat Eli, 항-Tat Oyi 및 항-Tat Bru cmC 혈청을 사용한 Tat Eli에 의한 트랜스액티베이션의 억제.

본 발명은 상기 설명으로 제한되지 않는다. 본 발명은 이후 설명만을 목적으로 언급되는 실시예에 비추어 더욱 명백해질 것이다.

실시예

1) 도 3 내지 6에 해당하는 물질 및 방법

단백질 합성, 정제 및 특정화

펩타이드를 Barany 및 Merrifield 방법(1980)에 따라 자동 합성기(ABI 433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) 상에서 4-하이드록시메틸-페녹시메틸-코폴리스티렌 디비닐벤젠(Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA)이 1%(HMP)(0.5 내지 0.65 밀리몰)로 예비충전된 수지상에 조립하였다. 결손을 나타내는 유도체가 수득되는 것을 방지하기 위하여, Fmoc가 없는 N-말단부를 4.75%의 아세트산 무수물(Merck), 6.25%의 DIEA (2.0M), 1.5%의 1-하이드록시벤조트리아졸 1M(HOBt)(Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB) 및 87.5%의 N-메틸피롤리돈(Perkin Elmer, Forster City, CA)을 함유하는 혼합물로 처리한 후 아세틸 그룹으로 보호하였다. 각 탈보호 단계를 전도 장치로 조절하였다. 펩타이드를 탈보호시키고, 10% 메틸 페닐 설파이드(Merck) 및 5% 에탄 디티올(Merck)이 보충된 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 수지로부터 제거하였다. 정제는 Beckman 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치 및 Merck C8 역상 칼럼(10×250 ㎜)을 사용하여 수행하였다. 완충액 A는 물과 0.1%의 TFA로 구성되고, 완충액 B는 아세토니트릴과 0.1%의 TFA로 구성된다. 구배는 20 내지 40%의 완충액 B를 2 ㎖/분의 유속으로 40 분간에 걸쳐 사용하는 것으로 구성된다. 전기분무 질량 분광분석은 Perkin Elmer PE-SCIEX API 150ex simple quad로 수행하였다. 아미노산 분석은 Beckman, model 6300 분석기로 수행하였다.

전기영동 이동 시프트 시험

필수 피리미딘 UUU 벌지(bulge)를 함유하는 TAR RNA의 뉴클레오타이드 59개 를 RNA 폴리머라제 T3에 의한 전사로 시험관내에서 제조하였다. 결합 반응 혼합물(20 ㎕)은 0.2 나노몰의 방사표지된 TAR RNA, TK 완충액(50 mM 트리스, pH 7.4, 20 mM KCl, 0.1%의 트리톤 X-100)중의 0-100 ng의 Tat를 함유한다. 0.1%의 트리톤 X-100을 함유하는 8% 변성화 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동에 의해 비결합 RNA로부터 복합체를 분리하였다. 샘플(25 ㎕)을 로딩하기전에 겔을 30분동안 예비주행시켰다. 전기영동을 약 200V에서 90분동안 연속수행하였다. 유리 및/또는 결합된 RNA의 상대량을 인 이미지화에 의해 측정하였다.

원편광 이색성(CD)

원편광 이색성 스펙트럼을 Jobin-Yvon CD UV 분광광도계(Long-Jumeau, FRANCE)(Mark VI)를 사용하여 260 내지 178 nm에서 50 ㎛ 광로 길이로 측정하였다. 장비를 (+)-10-캄포설폰산으로 캘리브레이션하였다. 290.5 nm의 포지티브 CD 밴드와 192.5 nm의 네거티브 밴드 사이에 2.1 비가 관찰되었다. 데이터를 분당 1 nm의 스캐닝 비율로 0.5 nm 간격으로 수집하였다. CD 스펙트럼을 아미드에 대한 Δε의 형태로 플롯팅하였다. 샘플을 20 mM 포스페이트 완충액(pH 4.5)중에서 제조하였다. 단백질 농도는 0.5 내지 1 ㎎/㎖이었다.

HIV LTR로 형질감염된 세포에 의한 트랜스액티베이션

합성 Tat에 의한 작용적 트랜스액티베이션을 P4세포를 사용하여 결정하였다. 이들 CD4-HeLa 세포는 HIV LTR 조절하에 박테리아 lacZ 유전자를 가지며, β-갈락토시다제의 세포질 축적은 엄밀히 Tat의 존재에 따라 달라진다. 12-웰 플레이트상에 플레이팅된 융합(confluent) 세포의 80%를 5% CO₂의 존재하에 37 ℃에서 24 시간동안 0.1% BSA가 보충된 DMEM 배지에 함유된 Tat 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션후, 세포를 포스페이트-완충 염수로 세척하여 단백질을 추출하고, β-갈락토시다제에 대한 항원(ELISA)에 결합된 효소를 사용한 상업적 면역흡수 시험(Boehringer Mannheim, FRANCE)을 제조자 지시에 따라 수행하여 β-갈락토시다제에 대해 분석하였다. 이 값을 Bradford 방법에 의해 결정된 상이한 세포 용해물의 총 단백질 농도를 이용하여 정규화하였다.

트랜스액티베이션 억제

배양배지에 항-Tat Eli 혈청, 항-Tat Oyi 혈청 또는 항-Tat Bru 혈청중 어느 하나를 첨가하는 것을 제외하고 상기 HIV LTR로 형질감염된 세포에 의한 트랜스액티베이션 실험을 재현하였다. Tat 단백질은 그의 일부분의 경우 Eli 변이체로부터 수득되었다.

발명자들은 특히 항체를 포함하지 않는 대조 배지와 비교해 볼 때 항-Tat Oyi 항체에 의해 Tat Eli 단백질의 트랜스액티베이션이 불활성화됨을 발견하였다.

2) 도 7에 해당하는 물질 및 방법

면역화 조건은 완전 프로인트 보조제 0.5 ㎖와 100 mM 포스페이트 완충액(pH 4.5) 0.5 ㎖중의 정제된 Tat 단백질 100 ㎍을 피내 주사하는 것이다(0 일). 제 1 부스터(booster)를 불완전 프로인트 보조제(0.5 ㎖)를 제외하고 나머지는 동일한조건하에서 D21에 수행하였다. 제 2 부스터를 D41과 동일한 D42에 수행하였다. FST 튜브중의 D53에서 혈액을 채취하고, 2,000 회전/분으로 원심분리한 후 혈청을 수득하였다. 혈청을 1/1,000으로 희석하였다.

Elisa: 시험을 Maxisorp U96 플레이트(Polylabo)상에서 수행하였다. 포스페이트 완충액(pH 4.5)중의 단백질을 4 ℃, 플레이트상에서 밤새 인큐베이션하였다. MPBS 완충액(8 g/ℓ NaCl, 0.2 g/ℓ KCl, 1.44 g/ℓ Na₂HPO₄, 0.24 g/ℓKH₂PO₄, 5% 탈크림 우유(HCl로 pH를 7.4로 조정))중에 포화시킨 후, 단백질을 토끼의 제 1 항체와 1 시간동안 인큐베이션하였다. 그후, 토끼 Fc 단편(Cappel)에 특이적인 퍼옥시다제에 커플링된 염소 항체와 1 시간동안 인큐베이션하였다. 가시화(revealing)를 H₂O₂, 100 mM 시트르산, 50 mM NaOH 및 0.2 ㎎/㎖ ABTS (Boehringer)의 존재하에서 수행하였다. 흡광도를 405 nm에서 읽었다.

희석없이, 항-Tat Eli 혈청은 모든 Tat 변이체 또는 유도체를 인식할 수 있다.

3) 웨스턴 블롯용 물질 및 방법

웨스턴 블롯: 단백질을 우선 3M 트리스-HCl, pH 8.8, 5% β-머캅토에탄올, 2% SDS, 10% 글리세롤 및 브로모페놀 블루의 존재하에서 변성시켰다. 이를 15% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 그후, 단백질을 면역검출에 의해 노출되도록 하기 위해 니트로셀룰로스막으로 옮겼다. 특이적 부위를 5% 탈크림 우유를 함유하는 PBS 용액(8 g/ℓ NaCl, 0.2 g/ℓ KCl, 1.44 g/ℓNa₂HPO₄, 0.24 g/ℓKH₂PO₄, HCl로 pH를 7.4로 조정)으로 봉쇄시켰다. 니트로셀룰로스막을 토끼의 제 1 항체와 1 시간동안 인큐베이션하였다. 그후, 토끼 Fc 단편(Sigma)에 특이적인 퍼옥시다제에 커플링된 염소 항체와 인큐베이션하였다. 가시화를 H₂CO₂, PBS 및 디아미노벤즈아미딘의 존재하에서 수행하였다(본 발명에서는 겔 사진이 나타나 있지 않다).

4) 도 8에 해당하는 물질 및 방법

도 5에 대해 기술된 프로토콜에 따라 β-갈락토시다제 단백질(LacZ)용 리포터 유전자 및 HIV-1 LTR로 형질감염된 인간 HeLa 세포를 사용하여 트랜스액티베이션을 측정하였다.

도 7에 대해 기술된 프로토콜에 따라 토끼로부터 혈청을 수득하였다.

100 ㎕의 세 항-Tat 혈청, 즉 항-Tat Eli, 항-Tat Oyi 및 항-Tat Bru cmC를 희석 비율을 증가시키면서 세포 배양배지에 첨가하고, 이어서 Tat Eli 변이체 100 ㎕를 1 또는 5 μM로 첨가하였다. 따라서, β-갈락토시다제의 세포질 축적은 Tat의 존재여부에 따라 달라진다.

무엇보다도 먼저, 동등하게 희석시켰을 때, 항-Tat Eli 혈청이 가장 효과적이었다. 이것은 혈청이 트랜스액티베이션 활성이 중화되어야 하는 것과 동일한 변이체에 대해 제조된 항체를 함유하기 때문에 합리적이다. 그러나, Tat Oyi가 Tat Eli의 트랜스액티베이션을 상당히 중화시키는 항체를 생성할 수 있음이 강조되어야 한다. 이러한 억제는 실제로 항-Tat Bru cmC 혈청을 특히 1/10 희석하여 사용하였을 때 관찰된 것보다 크다. 이와 같은 결과는 항-Tat Oyi 항체가 다른 Tat 변이체보다 유리함을 입증한다.

참조문헌

본 발명의 유리한 구체예에 따라, Tat 단백질이 그의 완전한 상태로 사용되는 경우, 이것은 바람직하게는 99 내지 106개의 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 101개의 아미노산을 포함한다.

"Tat 단백질 부분"이라는 표현은 항체를 생산하기에 충분히 면역원성인 것으로서 동일한 변이체에 속하거나 그렇지 않은 하나이상의 Tat 단백질의 단편 또는 이들 단편의 배합체를 의미한다. 바람직하기로, 상기 단편은 15 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 18 내지 25개의 아미노산을 포함한다. 이러한 정의는 본 출원에서 상기 표현이 사용될 때마다 유효하다.

따라서, 본 발명에 따른 백신에 사용될 수 있는 Tat 단백질은 TAR과 결합하는 동안 트랜스액티베이션할 수 없도록, "천연"으로 명명되는 작용성 Tat 단백질, 즉 천연 상태로 존재하는 각종 HIV-1 균주로부터 추출된 단백질과 상이하여야 한다. 이것이 바로 본 발명에 따른 백신에 사용되는 Tat가 작용성 Tat의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가져야 하는 이유이다. 일반적으로 점(point) 돌연변이인 이러한 돌연변이는, 예를 들어 하나이상의 아미노산을 억제, 부가 또는 치환시킬 수 있다.

상기 연구에서, 발명자들은 무엇보다도 먼저 Bru 분리체(86개의 잔기)에 상응하는 Tat 변이체를 조사한 후, 각각 이 단백질에 의해 관찰되는 구조적 다양성을 나타내는 다섯 개의 다른 변이체를 합성하였다(참조: Gregoire et Loret, 1996): Tat Z2(86개의 잔기), Tat Mal(87개의 잔기), Tat Eli(99개의 잔기), Tat Oyi(101개의 잔기) 및 Tat Jr(101개의 잔기). 이에 따라, 모든 HIV-1 분리체중에서 6개의 구조 그룹이 단백질 크기 및 이들의 돌연변이 특성에 따라 결정되었다. 이들 변이체는 아마도 카복시메틸화된 시스테인(Tat Bru cmC) 및 이어서 유리된 시스테인(Tat Bru fC)으로 모두 2회 합성된 Tat Bru와 유사한 약물학적 활성을 가질 것이다. 사용된 화학은 HBTU 활성제를 사용한 fastFmoc 타입이다. 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제하였다. 이들 합성 단백질은 모두 TAR에 결합할 수 있으나, HeLa 세포의 트랜스액티베이션 시험에서 상당히 불일치하는 것으로 밝혀졌다. 가장 놀라운 결과는 Tat Oyi 변이체에서 트랜스액티베이션이 존재하지 않는 것으로 밝혀진 것이다. 또한, 카복시메틸화된 시스테인을 갖는 Tat Bru 유도체에서도 트랜스액티베이션이 관찰되지 않았다. 이들 합성 단백질을 수성상 원편광 이색성(CD)으로 조사한 바로는 Tat Bru cmC의 변형이 Tat Bru의 구조를 상당히 변형시키는 것으로 나타났다. 한편, Tat Oyi는 그의 CD 스펙트럼으로 입증된 바와 같이 다른 것과 유사한 구조를 갖는다.

HIV-1 Oyi 균주가 1988년 가봉인 환자(더욱 엄밀히 말해 임신 여성)에게서 동정되었다(참조: Huet et al., 1989). 이 환자는 수시간동안 혈청반응 양성이었음에도 아주 건강하였다. 명백히, 이러한 HIV-1 균주에 결손 Tat 단백질이 존재한다는 사실이 상기 환자에게서 AIDS의 진행을 억제하고 AIDS 바이러스에 대해 면역을 제공한다. 실제로, 당분야에서 수행한 역학적 조사에 따르면 HIV-1 Oyi로 감염된 환자는 장기간 비진행자인 것으로 나타났다.

HIV Oyi 균주는 유럽 및 북아메리카에 가장 널리 퍼져있는 HIV-1 균주에 상응하는 서브타입 B에 속한다. HIV Oyi 균주가 확인된 가봉 여성은 가봉 남동부 Haut Ogooue의 시골지방에 위치한 31명의 사람 그룹에 속하였다. 이 그룹은 1986년 가봉 전역에서 감염된 약 2,000명에 대해 혈청역학 분석을 수행하는 동안 확인되었다. 이 Haut Ogooue 그룹은 감염된 사람의 건강이 양호할 뿐만 아니라 또한 완전히 비정형적인 웨스턴 블롯 프로파일을 나타냄으로써 주의를 끌었다. 실제로, 이러한 사람들에게서 항-gp120, 항-gp160 및 항-gp41 항체의 존재를 검출하는 것은 불가능하였던 반면, 항-gag및 항-pol항체가 동정되었다(참조: Huet et al., 1989).

동일한 Haut Ogooue 지방중에서 선택된 750명의 임산한 여성 그룹을 조사하고, 이중 25명(즉 3.3%)이 ELISA 시험에 의해 HIV 양성인 것으로 확인되었다. 이들 25명의 여성중에서, 23명이 지역의 비정형적인 웨스턴 블롯 특성을 가졌다(상기 참조). HIV-1 Oyi 균주를 갖는 사람을 포함하여 약 10여명의 여성을 2년동안 추적하였다.

이 기간동안, 항-gp120 항체를 형성할 시간을 허여하지 않는 새로운 감염의 가능성을 제외하고 비정형적인 혈청학적 프로파일은 일정하였다. HIV-2gag에 대한 반응이 없고 HIV-2 감염중 두 케이스만이 연안 지역에 위치한 가봉에서 보고되었기 때문에 HIV-2 감염 존재는 배제되었다. 조사된 환자는 모두 조사기간 2 년동안 건강이 양호하였고, 체중감소 또는 기회감염균 질병이 없었다(참조: Huet et al., 1989).

Oyi가 동정된 여성은 시골 출신으로 건강이 양호하고 HTLV-1 및 HIV-2에 대해 혈청음성이었다. PPMC에 의해 이 여성의 림프세포를 공동배양하였더니 15일 이후에나 RT 활성이 나타났으며, 이는 매우 보기드문 현상이다. 바이러스는 또한 거의 검출할 수 없는 세포변성 활성을 나타내었다. 배양 상등액이 PBMC의 감염을 허용한다 하더라도, 실질적으로 H-9 및 CEM 또는 U-937 단핵세포와 같은 정상 림프세포주에서 복제는 가능하지 않다. 이러한 분석을 확인시키는 것으로, 동일 지역의 다른 17명의 환자에게서 유사한 결과가 관찰되었으며, 이는 모든 경우 항-gp120 항체가 없음을 입증한다. 정상적인 HIV-1 공여자 혈청이 HIV-1 Oyigp120을 인식할 수 있음을 주목하는 것은 흥미롭다(참조: Huet et al., 1989). 따라서, HIV-1 Oyi 바이러스가 클로닝되었다; 서열화는Tat유전자를 제외하고 결손이 없음을 나타내었다(참조: Huet et al., 1989).

Cys 22에서 Ser로의 돌연변이가 트랜스액티베이션의 손실 이유인 것으로 나타났으며, 이러한 돌연변이를 복귀시키게 되면 Tat 활성을 복원시킬 수 있다.

또한, Tat 부재하에 바이러스의 재생산이 가능하지만, 그 수준은 아주 낮은 것으로 관찰되었다. 따라서, HIV의 독성과 Tat 트랜스액티베이션 효율 간에는 밀접한 관계가 있다. 이러한 역학적 조사는 다시 한 번 상기 질병에 의한 사망율과 HIV 복제율간에 밀접한 관계가 있음을 시사한다. 따라서, Tat는 HIV가 이러한 바이러스 감염을 치명적인 질병으로 변화되도록 하는 복제율에 다다를 수 있게 하는 것으로 나타났다.

또한, Haut Ogooue 지역의 비정형적인 환자를 상기한 바와 같이 조사한 바에 따르면, 결손이 있는 HIV 균주가 정상적인 HIV 균주와 비교할 때 제공할 것으로 보이는 보호를 나타낸다. 실제로, 수 명의 비정형적인 환자로부터 새로이 수집한 림프세포를 PCR 분석하면 정상적인 HIV 균주의 존재를 나타낼 것으로 생각된다. 보호 메카니즘은 항-gp120 항체를 포함하지 않으며, 후자는 이들 환자에게 존재하지 않는다. 세포독성 T 림프세포의 작용은 바이러스를 근절시키는 메카니즘일 수 있다.

가봉에서 실시한 비교적 최근의 역학적 조사(참조: Delaporte et al., 1996)는 기타 아프리카 국가와 비교하여 볼 때 HIV로 감염된 환자가 낮은 퍼센트(2 내지 3%)임을 나타내었다. Oyi 서브타입이 주민에게서 완전히 사라진 것으로 나타났으며, HIV-1 Oyi 균주가 채취된 가봉 여성은 1995년에 아주 건강하였고 모두 혈청음성인 3명의 아이를 출산하였다. 이 여성에게서 HIV-1 Oyi 바이러스는 더 이상 검출되지 않았다.

따라서, HIV-1 Oyi 변이체의 Tat 단백질이 항-HIV-1 백신의 조성물에 최적의 후보인 것으로 나타났다. 그러나, 불활성화된 Tat가 반드시 면역원성일 필요는 없다. 현재, 백신의 온전한 이점은 항체, 더욱이 본 경우에 있어 다른 Tat 변이체에 대해 활성인 항체를 생성한다는 것이다. 놀랍게도, 발명자들은 이를 입증할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 특히 유리한 구체예에 따라 HIV-1 Oyi 변이체의 전부 또는 일부로서 Tat를 포함한다.

항-Tat 백신의 장점은 심지어 여러 수준으로 직시될 수 있다. 무증후성 환자에게서 면역결핍을 제한함으로써 AIDS 진행을 지연시키는 것이 가능할 수 있다. 이러한 백신은 환자에게 바이러스에 대한 유효한 면역을 보유시켜 감염 시초의 경우처럼 보여지도록 한다. 특히, HIV에 의해 감염되지 않았으나 그의 활성이 Tat에 의해 억제되는 대식세포 및 세포독성 T 림프세포(CTL)의 활성을 복구시키면 환자를 비진행자로 만들 수 있는 결과를 얻을 수 있다.

공표된 AIDS를 갖는 환자에게서 항-Tat 백신은 HIV-감염 세포에 의한 그의 분비후 Tat 단백질의 직접적인 작용과 연결되어 있는 것처럼 보이는 카포시 육종 또는 신경병학적 증후와 같은 특정 병리학적 증상 범위를 제한시킬 수 있다.

본 발명에서 HIV-1 Oyi 변이체의 이점은 또한 웨스턴 블롯 실험(본 출원에는 나타나 있지 않은 겔 사진)에 의해 확인되며, 상이한 Tat 변이체간에 상호 인식이 있었는지를 결정하기 위하여 발명자들에 의해 Elisa 시험이 실시되었다.

실제로, 이들 두 타입의 실험에서, 7개의 Tat 변이체에 대해 세 개의 상이한 항-Tat 혈청이 시험되었다.

발명자들은 토끼를 프로인트(Freund) 보조제의 존재하에서 통상적인 면역화 프로토콜에 따라 Tat Oyi, Tat Bru cmC 및 Tat Eli로 면역화시켰다. 53일후 수득한 폴리클로날 혈청을 웨스턴 블롯팅 및 Elisa 시험으로 분석하였다. 얻은 적정가는 항-Oyi, 항-Bru cmC 및 항-Eli 항체에 대해 각각 700, 11 및 660 pM 이었다.

변성 조건하에서, 웨스턴 블롯 실험은 항-Tat Bru cmC 혈청의 경우와 마찬가지로 항-Tat Oyi 혈청 및 항-Tat Eli 혈청이 모든 변이체에 대해 상호 면역원성을 나타낼 수 없는 것으로 나타났다.

Tat Bru cmC는 시스테인이 카복시메틸화된 변이체이다. 시스테인의 이러한 화학적 변형은 트랜스액티베이션 활성을 상실시킬 뿐만 아니라(참조: Peloponese et al., 1999), 이 변이체의 3D 구조를 상실시켜 불규칙 코일로 전환시킨다(비공개된 결과). 따라서, 항-Tat Bru cmC 혈청이 변성될 때 모든 변이체를 인식할 수 있다는 것을 발견한 것은 놀라운 일이 아니다.

비변성 조건하에서, Elisa 시험(도 7 참조)은 항-Tat Oyi 혈청이 항-Tat Bru cmC 혈청과 마찬가지로 모든 변이체를 인식할 수 있는 것으로 나타났다. 한편, 항-Tat Eli 혈청은 여전히 모든 변이체를 인식할 수 없었다. 따라서, 보존된 3D 에피토프는 다수의 Tat 변이체로 존재하는 것으로 여겨진다. 그러나, Tat Oyi의 특이적 면역원성 특성만이 이들 항체를 다량으로 생성할 수 있다. 따라서, 현재까지 과소평가된 환자에게서 Tat의 존재 가망성이 높다. 세 혈청의 희석비는1/1,000이다. 동일하지만 희석없이 실시한 실험에서, 항-Tat Eli 혈청은 또한 모든 다른 Tat 변이체를 인식할 수 있었다. Tat Bru(Tat Bru K50)의 라이신 50을 아세틸화시키면 항-Tat Eli 혈청에 의한 인식이 저농도로 이루어질 수 있음을 주목하는 것이 유리하다.

따라서, 상기 세 개의 토끼 폴리클로날 혈청으로 실시한 실험은 백신으로서 Tat Oyi의 이점을 입증한다. 또한, 항-Tat Oyi 혈청은 Tat Bru 또는 Tat Eli를 갖는 HeLa 세포상에서 트랜스액티베이션을 억제할 수 있다. 대조군으로 사용된 항-Tat Eli 혈청은 심지어 활성 변이체로부터 항체의 생산이 Tat Oyi로 관찰된 모든 Tat 변이체의 상호 인식을 입증시키지 않음을 보여준다. 긴 변이체(101개의 잔기)인 Tat Oyi는 짧은 변이체(86개의 잔기)인 Tat Bru cmC와 비교할 때 Tat 변이체를 더 잘 인식시키도록 한다. 짧은 Tat 변이체를 갖는 HIV-1 균주는 실질적으로 사라지고 실험실적 인공물인 것이 나타났다(참조: Jeang et al., 1999). 또한, 항-Tat Oyi 혈청은 Tat 변이체의 변성 형태(또는 선형 에피토프)를 더 이상 인식하지 않기 때문에 높은 특이성을 나타낸다. 반대로, Tat Bru cmC 혈청은 구조적으로 매우 다양하기 때문에 항-Tat Bru cmC 혈청은 인간에게서 자가면역 항체를 생성할 위험이 매우 크다. 발명자들은 인간 알부민을 인식할 수 있는 항체가 항-Tat Bru cmC 혈청에 존재함을 발견하였다(데이터는 나타내지 않았다).

따라서, 적어도 하나의 Tat 에피토프의 삼차원 구조 보존이 항-Tat 3D 항체에 의한 다른 Tat 변이체의 인식에 있어 필수적이다.

또한, 본 발명자들은 항-Tat Oyi 항체가 Tat Eli 단백질의 트랜스액티베이션을 억제할 수 있음을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명의 목적은 수개의 Tat 변이체를 인식할 수 있는 항-Tat 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 실제로, 이러한 항체들이 HIV로 감염될 수 있는 개체에서 변이체에 상관없이 이들 혈액중의 Tat 단백질 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있음이 강조되어야 한다.

따라서, 본 발명은

- 면역 반응 보조제와 배합된 Tat 단백질 또는 이 Tat 단백질의 일부를 주입하여 동물을 면역화시키고,

- 면역화된 동물의 혈청에 함유된 특이 항체를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 수개의 Tat 변이체를 인식할 수 있는 항-Tat 폴리클로날 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

동물의 면역화는 주사, 흡입, 경구 투여, 피하, 피내, 복강내, 정맥내 또는 근육내와 같이 Tat 단백질 또는 이 Tat 단백질의 일부를 동물에 도입시킬 수 있는 어떤 모드에 의해 수행될 수 있다.

동물의 면역화는 또한 당업자들에게 잘 알려진 기술에 따라 Tat 단백질 서열의 전부 또는 일부를 가질 뿐만 아니라 또한 Tat 단백질의 발현에 필요한 모든 시스템을 갖는 벡터의 생체내(in vivo) 또는 원위치(in situ) 발현 수단으로 수행될 수 있다.

면역화된 동물의 혈청에 함유된 특이 항체의 정제는, 예를 들어 항원으로서 제공되는 단백질 또는 단백질의 일부가 이미 부착되어 있는 친화성 칼럼상에서 수행될 수 있다.

본 발명의 유리한 구체예에 따라, 상기 언급된 방법의 면역화 단계에 사용된 Tat 단백질 또는 Tat 단백질의 일부는 Oyi 변이체 또는 Bru cmC 변이체에 상응한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 상기 언급된 단백질은 화학적으로 합성된 단백질이다.

모든 Tat 변이체중에서 7개의 시스테인 잔기 위치(영역 22-37)가 고도로 보존되었으며, 트랜스액티베이션을 위해 이들 시스테인 잔기중 6개의 중요성이 문헌에 기술되었다(참조: Jeang, 1996).

결과적으로, 상기 변이체가 본 발명에서 목적하는 성질을 가지면서 트랜스액티베이션시키지 못하도록 하기 위해 상기 시스테인중 적어도 하나에서 Tat 변이체를 돌연변이시키는 것이 전적으로 가능하다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 세린 또는 알라닌과 같은 다른 아미노산을 시스테인으로 치환시키는 것으로 구성된다.

발명자들은 이핵 2D NMR에 의해 Tat Bru의 3D 구조를 결정하고 Tat 변이체에 보존되어 있는 것이 확실한 표적 영역을 동정하였다. 이 표적은 부분적으로 Tat 서열의 N-말단 영역 및 염기성(basic) 영역으로 구성된다.

Tat Bru 변이체의 3D 구조는 시스테인이 풍부한 영역이 N-말단 영역 및 염기성 영역의 삼차원 공간에 근접해 있음을 보여준다. 이것은 시스테인의 카복시메틸화가 아마도 상기 표적의 구조를 변형시키며, 변형된 Tat는 항-HIV 백신 제조를 위해 가능한 후보로 고려될 수 없음을 나타낸다.

또한, 발명자들은 다양한 Tat 단백질의 고체상 화학적 합성을 수행하였다.

당분야의 현 지식 수준에서, 상기와 같은 합성 모드로 제공되는 이점은 분자생물학에 의해 제조된 Tat에 비해 생산비용이 저렴하고, 수율이 뛰어나며, 오염이 없다는 것이다.

따라서, 유리하게도 본 발명에 따른 백신에 사용된 Tat는 화학적 합성 및 더욱 특히는 FMOC, 및 바람직하게는 fastFMOC 타입의 합성과 같은 고체상 화학적 합성에 의해 제조된다. 이러한 타입의 보호 그룹을 사용한 합성방법이 또한 본 발명의 대상이다.

그러나, 본 발명에 따른 백신에 사용된 Tat는 또한 그밖의 다른 방식, 예를 들어 당업자들에게 잘 알려져 있는 재조합 기술 수단으로 합성될 수 있다. 이러한 기술에 사용된 클로닝 및 발현 시스템은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces)와 같은 미생물 및 또한 효모, 곤충 및 포유동물 세포로부터 유래될 수 있다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 또한 고려될 수 있다. 아주 명백히, Tat 단백질 서열의 전부 또는 일부를 갖는 벡터는 당업자들에 잘 알려진 기술에 따라 이를 위해 필요한 모든 발현 시스템을 포함할 것이다.

또한, Tat 단백질, 특히 Tat Oyi가 막속으로 통과하기 때문에 나타날 수 있는 어떤 잠재되어 있는 독성의 위험을 피하기 위하여, 모든 Tat 변이체 서열의 C-말단에 존재하는 서열 Arg-Gly-Asp를 변형시키는 것이 필요할 것이다. 이러한 서열은 세포 표면에서 막 수용체를 인식하기 때문에 막 통과에 필수적이다(참조:Jeang, 1996). 더욱 특히, 이러한 변형은 상기 서열이 구조에 영향을 주지않는 서열 Lys-Ala-Glu, 또는 아마도 서열 Ala-Ala-Ala로 치환되는 것으로 구성될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, HIV로 감염된 다수의 사람들은, 예를 들어 그들의 혈액에서 Tat 단백질의 존재를 검출하는데 실패하였기 때문에, 현재까지 과소평가되어 왔던 것 같다. 본 발명의 이점은 한정된 수의 항체 수단으로 가장 많은 가능한 수의 Tat 변이체를 검출하는 수단을 제공한다는 것이다.

따라서, 본 발명의 대상은 또한

- 생물학적 샘플을 수개의 Tat 변이체와 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 항-Tat 항체와 접촉시키고,

- 항원-항체 복합체의 존재여부를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 샘플에서 Tat 단백질 또는 Tat 단백질 일부의 존재를 검출하는 방법이다.

"항-Tat 항체"라는 표현은 본 발명에서 목적하는 역할을 수행할 수 있는 것으로서, 즉 Tat 단백질의 전부 또는 일부를 인식할 수 있는 완전 항체뿐 아니라 항체 단편 또는 화학적 항체를 의미한다.

항원-항체 복합체의 존재여부 결정은 당업자들에 공지된 방법으로 수행한다. 특히, 이들 복합체를 검출하기 위한 시약은 마커(marker)를 가질 수 있거나, 더욱 특히 사용된 항체가 표지되지 않은 경우에 표지 시약에 의해 인식될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 생물학적 샘플을 항-Tat 항체와 접촉시키는 것은 항-Tat 혈청을 이용하여 수행할 수 있다.

《생물학적 샘플》이란 표현은 환자로부터 수집된 것으로 적절한 항체(들)의 존재하에서 항원-항체 복합체를 제공할 수 있는 항원을 함유할 것으로 여겨지는 어떤 액체, 세포 또는 조직 샘플을 의미한다. 바람직하게, 이러한 생물학적 샘플은 혈액이다.

마지막으로, 본 발명의 대상은 또한

- 면역학적 반응에 적합한 매질 제조용 시약,

- 면역학적 반응에 의해 생성된 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약,

- 임의로, 항원을 갖지 않는 대조용 생물학적 샘플(음성 대조군),

- 임의로, 소정량의 항원을 함유하는 대조용 생물학적 샘플(양성 대조군)을 포함하며, 생물학적 샘플에서 Tat 단백질 또는 Tat 단백질의 일부의 존재여부를 결정하여 HIV 감염을 진단하는 키트이다.

본 발명의 유리한 구체예에 따라, 면역학적 반응에 적합한 매질 제조용 시약은 수개의 Tat 변이체와 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 항-Tat 항체를 포함하며, 바람직하게는 항-Tat Oyi 또는 항-Tat Bru cmM 항체 또는 이들 둘의 배합체를 포함한다.

Claims

약제학적으로 허용되는 비히클, 및 경우에 따라 하나이상의 적합한 면역 보조제와 함께, TAR에 결합할 수 있으며 트랜스액티베이션(transactivation)할 수 없는 적어도 하나의 HIV-1 Tat 단백질의 전부 또는 일부를 함유하는 항-HIV-1 백신
제 1 항에 있어서, Tat 단백질이 99 내지 106개의 아미노산을 함유함을 특징으로 하는 백신
제 1 항 또는 2 항에 있어서, Tat의 뉴클레오타이드 서열이 작용성 (functional) Tat의 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 가짐을 특징으로 하는 백신.
제 3 항에 있어서, 돌연변이가 Tat 단백질의 적어도 하나의 시스테인에 영향을 미치는 백신.
제 1 항 내지 4 항중 어느 한항에 있어서, HIV-1 Oyi 변이체의 Tat 또는 이 Tat의 일부분임을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 있어서, 화학적으로 합성된 Tat임을 특징으로 하는 백신.
제 6 항에 있어서, Tat가 고체상으로 합성됨을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 있어서, 재조합 Tat임을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 있어서, Tat 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부 및 그의 발현을 위해 필요한 요소를 포함하는 발현벡터를 함유함을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 9 항중 어느 한항에 있어서, Tat 서열의 적어도 N-말단 영역 및/또는 염기성(basic) 영역을 포함함을 특징으로 하는 백신.
제 1 항 내지 7 항중 어느 한항에 있어서, Tat의 C-말단에 위치한 Arg-Gly-Asp 영역이 변형됨을 특징으로 하는 백신.
- 면역 반응 보조제와 배합된 Tat 단백질 또는 이 Tat 단백질의 일부를 주입하여 동물을 면역화시키고,

- 면역화된 동물의 혈청에 함유된 특이 항체를 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하여 수개의 Tat 변이체를 인식할 수 있는 항-Tat 폴리클로날 항체를 제조하는 방법.
제 12 항에 있어서, 면역화 단계에 사용된 Tat 단백질 또는 그의 일부가 Oyi 또는 Bru cmC 변형체에 상응함을 특징으로 하는 백신.
제 12 항 또는 13 항에 있어서, 면역화 단계에 사용된 Tat 단백질 또는 그의 일부가 제 6 항에 정의된 것임을 특징으로 하는 백신.
- 생물학적 샘플을 수개의 Tat 변이체와 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 항-Tat 항체와 접촉시키고,

- 항원-항체 복합체의 존재여부를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 샘플에서 Tat 단백질 또는 Tat 단백질 일부의 존재를 검출하는 방법.
- 면역학적 반응에 적합한 매질 제조용 시약,

- 면역학적 반응에 의해 생성된 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약,

- 임의로, 항원을 갖지 않는 대조용 생물학적 샘플(음성 대조군),

- 임의로, 소정량의 항원을 함유하는 대조용 생물학적 샘플(양성 대조군)을 포함하며, 생물학적 샘플에서 Tat 단백질 또는 Tat 단백질 일부의 존재여부를 결정하여 HIV 감염을 진단하기 위한 키트.
제 16 항에 있어서, 면역학적 반응에 적합한 매질 제조용 시약이 제 15 항에 정의된 항체를 포함함을 특징으로 하는 키트.
FMOC 타입, 바람직하게는 fastFMOC 타입의 보호그룹을 사용함을 특징으로 하여 제 1 항 내지 5 항, 10 항 및 11 항중 어느 하나에 정의된 Tat 변이체를 합성하는 방법.