CN101531719A - 一种禽流感基因工程多肽抗原 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽流感基因工程多肽抗原及其构建、制备方法。本发明以禽流感病毒较为保守的基质蛋白2的膜外部分(M2e)为抗原主体，并在其两端连接T细胞抗原表位增加抗原性，制备新型禽流感基因工程多肽抗原。人工合成编码禽流感病毒M2e和非特异性T细胞表位肽段基因，结合PCR扩增方法引入特异性T细胞表位，将此基因进行串联并插入融合表达载体，经发酵制备成抗原。该抗原能有效的刺激机体产生体液、细胞免疫反应，抗血清能特异性的与H9N2病毒结合，并且对不同亚型的流感病毒有交叉反应的潜力，为制备“通用型”禽流感疫苗打下基础。

Description

一种禽流感基因工程多肽抗原

一技术领域

本发明涉及一种禽流感基因工程多肽抗原，属于基因工程领域，具体涉及禽流感病毒保护性基因片段的制备、串联、表达，从而制备一种禽流感基因工程多肽抗原。

二背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒引起的一种从呼吸系统到全身性败血症等多种症状的传染性疾病，由H5和H7亚型禽流感病毒引起高致病性禽流感，一旦爆发，往往造成家禽的大量死亡，被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病，在我国被列为一类传染病(Iain Stephenson，Jane Democratis.Influenza：current threat from avian influenza.Published Online May8，2006.)。最近H5N1、H9N2和H7N7禽流感病毒感染人的事件表明家禽是人畜传播潜在的中间宿主。这也使得世界各国对禽流感的关注程度大大提高。因此，从分子水平开展对禽流感病毒的研究，不仅在病毒学、免疫学等学科上有重要的学术意义，而且在公共卫生等方面也具有重大的社会意义。

禽流感病毒基质蛋白2(M2)由97个氨基酸残基组成，其中24个氨基酸(M2e)为胞外区，19个氨基酸为跨膜区及54个氨基酸组成的胞内区(Hull，D.J.，Gilmore，R.，and Lamb，R.A.(1988).Integration of a small integral membrane protein，M2 of influenza virus into the endoplasmicreticulum：analysis of the intemal signal-anchor domain of a protein with an ectoplasmic NH，terminus.J.Cell Biol.706.1489-1498.R.J.SUGRUE，A.J.HAY.Structural Characteristics of the M2 Protein ofInfluenza A Viruses：Evidence That It Forms a Tetrameric Channel.VIROLOGY 180，617-624(1991).)。M2的氨基酸序列很保守，在所检测的毒株中，其同源性高达90％，而且氨基端的前10个氨基酸在人流感和禽流感病毒中几乎完全相同。M2功能是质子通道作用(Chizhmakov，I.V.，Geraghty，F.M.，Ogden，D.C.，Hayhurst，A.，Antoniou，M.，Hay，A.J.，1996.Selective protonpermeability and pH regulation of the influenza virus M2 channel expressed in mouse erythroleukaemiacells.J.Physiol.494，329-336.Chizhmakov，I.V.，Ogden，D.C.，Geraghty，F.M.，Hayhurst，A.，Skinner，A.，Betakova，T.，Hay，A.J.，2003.Differences in conductance of M2 proton channels of two influenza virusesat low and highpH.J.Physiol.546，427-502.Mould，J.A.，Drury，J.E.，Frings，S.M.，Kaupp，U.B.，Pekosz，A.，Lamb，R.A.，Pinto，L.H.，2000.Permeation and activation of the M2 ion channel of influenzaA virus.J.Biol.Chem.275，31038-31050.K.Shimbo，D.L.Brassard，R.A.Lamb，L.H.Pinto，Ion selectivity andactivation of the M2 ion channel of influenza virus，Biophys.J.70(1996)1336-1346.)：在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值，在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外在病毒装配过程中也起作用。研究表明，针对M2氨基端的单克隆抗体可以抑制病毒蚀斑的增大，因此M2e成为研制针对流感病毒具有交叉保护作用亚单位苗的热点。

抗原表位又被称为抗原决定簇是伴随分子生物学和计算机模拟技术迅速发展而产生的。表位疫苗不仅提供了一种更有效的利用病原体中各个抗原成分的方法，而且对于流感病毒这种高度变异的病毒来说，一方面可以通过选择具有交叉保护性的表位来达到预防多个毒株的目的，另一方面可以通过对流行毒株的监测来及时合成表位，实现对变异毒株的控制。A型流感病毒蛋白中较为保守的蛋白为核蛋白(NP)和基质蛋白(M)，含有诱导具有交叉保护性T、B细胞反应的特定多肽，从理论上保证了研究多肽疫苗的可行性。

三发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种禽流感基因工程多肽抗原及其制备方法，提出以禽流感病毒基质蛋白和核蛋白上的抗原表位进行串联表达，以表达的融合蛋白制备作为免疫原及其制备方法。

技术方案：

一种禽流感基因工程多肽抗原，其特征在于，以禽流感病毒表面保守的基质蛋白2即M2膜外部分的N端24个氨基酸肽段(M2e)作为主要抗原，在其C端连接特异性的T细胞抗原表位，或分别在其C、N端连接特异性和非特异性的T细胞抗原表位，构成融合蛋白，其中特异性T细胞表位为禽流感病毒核蛋白NP上具有抗原性的氨基酸肽段，非特异性T细胞表位为乙肝表面抗原HBs和破伤风毒素TT具有抗原性的氨基酸肽段，在多肽连接处以柔性氨基酸作为接头连接。

其M2膜外部分的N端24个氨基酸肽段M2e串联成三拷贝3M2e形式，特异性T细胞表位是禽流感病毒核蛋白NP366-374位氨基酸肽段和NP383-391位氨基酸肽段，其非特异T细胞表位是乙肝表面抗原HBs19-33氨基酸肽段和破伤风毒素TT580-599位氨基酸肽段。

抗原多肽连接处采用如下串联结构：3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA或者HBs_19-33AA-X-TT_580-599AA-Y-3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA；其中“X”为GGGGS接头，“Y”为GLPSGG接头。

上述多肽疫苗，其具有抗原性的氨基酸多肽序列为SEQ ID NO.2，或SEQ IDNO.4。

有益效果：

为了满足多肽抗原对多种亚型禽流感病毒具有交叉保护能力的效果，在设计该融合蛋白时主要选取了禽流感病毒中较为保守的蛋白。M2蛋白是流感病毒表面一种囊膜蛋白，主要保护性抗原决定簇在其N端的1～24个氨基酸(M2e)，在所检测的毒株中，其同源性高达90％，而且N端的前10个氨基酸在人流感和禽流感病毒中几乎完全相同。以A/Chicken/GuangDong/191/04(H5N1)和A/Chicken/Henan/62/00(H9N2)两个毒株的M2e序列位参考，对比其它以报道的M2e序列，对24肽中个别氨基酸进行调整，实施例中序列为SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD。在禽流感病毒蛋白中NP蛋白同属较为保守的蛋白，其中含有大量的辅助性和杀伤性的T细胞表位，参照上述方法比较禽流感病毒NP蛋白序列，并综合考虑各个表位的抗原性，选取NP_366-374、NP_383-391位两个T细胞表位串联在M2e的C端。并对NP_366-374、NP_383-391位肽段中的氨基酸做个别调整，实施例中序列为ASNESMETM和SRYWAIRTR。为了提高融合蛋白的抗原性，本发明中将氨基酸序列相对较短、抗原性较弱的M2e24肽重复至3拷贝形式(3M2e)，也可采用其它形式(如6拷贝或12拷贝)，以构成抗原的主体部分。由于该序列所含的多为B细胞表位，在C端连接两个特异性T细胞表位的基础上在其N端再连接两个非特异性的T细胞表位从而进一步提高融合蛋白的抗原性。乙肝表面抗原和破伤风毒素蛋白上含有广谱的T细胞表位，它突破了MHC限制，能够提高融合蛋白的抗原性。将乙肝表面抗原(HBs)19-33和破伤风毒素(TT)580-599位氨基酸肽段连接在M2e的N端。由于该氨基酸肽段至于融合蛋白的C端将主要产生针对它的抗体，所以非特性和特异性T细胞表位相对3M2e的位置是不可调换的，而两类T细胞表位内部的两个位点在不影响抗原性的情况下顺序是可以调换的。具有抗原性的氨基酸肽段在连接时，在肽段连接处加入适当的氨基酸多肽作为接头，接头中的氨基酸数目和种类根据需要进行调整，其原则是不影响整形成融合蛋白后表现足够的抗原性。

实施例(一)中，以融合蛋白3M2eAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA为抗原制备禽流感多肽抗原pET-MN。SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小与预计的一致，见(图1(a))。在条带“3、5”可见与预计分子量大小相符的融合蛋白，并且该蛋白以可溶性形式表达。Western-blotting检测该融合蛋白具有很强的抗原性，能跟标准抗体发生特异性抗体反应(见图1(b))。用该抗原免疫鸡，ELISA检测抗体水平，以H9、H5两个亚型的M2e24肽包被检测出的抗体水平无明显差异。文中只给出以H9亚型24肽包被检测结果。结果证明该抗原能刺激机体产生针对M2e的抗体(见图2)。流式细胞术检测鸡外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞数量在免疫后随时间的变化(见图3)，结果证明该疫苗能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。

实施例(二)中，以融合蛋白HBsAA-TTAA-3MeAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA为抗原制备禽流感多肽抗原pET-HTMN。SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小与预计的一致，见(图4(a))。在条带“3、4、5”可见与预计分子量大小相符的融合蛋白，该蛋白大部分为包涵体少量蛋白为可溶性形式表达。Western-blotting检测该融合蛋白具有很强的抗原性，能跟标准抗体发生特异性抗体反应(见图4(b))。用该抗原免疫鸡，ELISA检测抗体水平，以H9、H5两个亚型的M2e24肽包被检测出的抗体水平无明显差异。文中只给出以H9亚型24肽包被检测结果。结果证明该抗原能刺激机体产生针对M2e的抗体(见图5)。分离抗血清与H9N2禽流感病毒感染的MDCK细胞能特异性结合(见图6)。流式细胞术检测鸡外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞数量在免疫后随时间的变化(见图7)，结果证明该抗原能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。文中给出该抗原免疫后流式检测图片(见图8)。

设计该融合蛋白来制备新型免疫原用于预防不同亚型的禽流感，交叉免疫力是其主要特征，但是考虑到疫苗发挥最大的免疫效力，我们认为：由于不同亚型的禽流感病毒M2e的氨基酸序列存在细微差别，以H5亚型禽流感病毒序列为依据构建的抗原最适合用于H5亚型禽流感的预防；以H9亚型禽流感病毒序列为依据构建的抗原最适合用于H9亚型禽流感的预防。

附图说明：

1.图1和图10中图1(a)为多肽抗原pET-MN的SDS-PAGE电泳图示，图1(b)为多肽抗原pET-MN的Western-blotting检测图示。

2.图2和图11为多肽抗原pET-MN免疫鸡后ELISA检测抗M2e抗体图示。

3.图3和图12为多肽抗原pET-MN免疫鸡后流式细胞术检测淋巴细胞图示。

4.图4和图13中图4(a)为多肽抗原pET-HTMN的SDS-PAGE电泳图示，图4(b)为多肽抗原pET-HTMN的Western-blotting检测图示。

5.图5和图14为多肽抗原pET-HTMN免疫鸡后ELISA检测抗M2e抗体图示。

6.图6和图15为pET-HTMN免疫鸡抗血清与H9N2流感病毒感染的MDCK细胞免疫荧光。

7.图7和图16为多肽抗原pET-HTMN免疫鸡后流式细胞术检测淋巴细胞图示。

8.图8和图17为多肽抗原pET-HTMN免疫鸡后流式细胞术检测淋巴细胞图片。

9.图9和图18为抗原多肽结构结构示意图。

具体实施方式：

以下叙述本发明的具体实施例，应该说明的是本实施例只对本发明有说明作用，而没有限制作用。在实施例中详细描述了抗原基因的串联、克隆、表达，但并不意味着抗原基因的克隆表达仅限于实施例中的叙述，任何以其它基因工程方法克隆表达权利要求书中所述序列都应包括在本发明所要要求的权利范围之内。

实施例中将禽流感病毒3M2e、NP抗原多肽进行串联，并在其N端连接非特异性T细胞表位，构成融合蛋白。抗原采用3拷贝的M2e肽段和NP蛋白366-374、383-391位氨基酸肽段，以及适当选取乙肝表面抗原和破伤风毒素抗原表位，并将其组成3M2eAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA和HBs_19-33AA-TT_580-599AA-3M2eAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA的串联结构，并在多肽连接处加入适当的氨基酸接头，采用3M2eAA-GGGGS(“X”)-NP_366-374AA-NP_383-391AA和HBs_19-33AA-GLPSGG(“Y”)-TT_580-599AA-GGGGS(“X”)-3MeAA-GGGGS(“X”)-NP_366-374AA-NP_383-391AA的抗原多肽结构，其结构示意图如图7。

串联结构的融合蛋白其基因序列是：SEQ ID NO.1，编码的抗原多肽氨基酸序列是SEQ ID NO.2；串联结构的融合蛋白其基因序列是：SEQ ID NO.3，编码的抗原多肽氨基酸序列是SEQ ID NO.4。其结构特征如下：

编码融合蛋白3M2eAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA的基因大小为306bp，融合蛋白的大小为11.2kDa，加上表达载体pET-32α(+)自身蛋白20kDa，整个融合蛋白为31.2kDa；

编码融合蛋白HBsAA-TTAA-3MeAA-NP_366-374AA-NP_383-391AA的基因大小为466bp，融合蛋白的大小为16.2kDa，加上表达载体pET-32α(+)自身蛋白20kDa，整个融合蛋白为36.2kDa。

实施例(一)：以禽流感多肽抗原pET-MN为例具体描述本发明。

比较GenBank中公布的禽流感M2e序列SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD，根据密码子的偏嗜性和简并性原则人工合成连续的三拷贝M2e基因(3M2e)，并在全基因的5’端加入EcoRI，3’端加入BamHI酶切位点终止密码子及SalI酶切位点，送上海Invitrogen公司合成并连接到pMD-18T载体中，命名为pMD18T-3M2e。以该质粒为模板，在下游引物非配对部分引入NP表位，第一次扩增引入表位NP366-374，第二次扩增引入表位NP383-391，经两次PCR扩增，得到片段3M2e-NP366-374-NP383-391(SEQ ID NO.1)，将该片段与表达载体pET-32α经限制性内切酶双酶切，回收酶切产物，在T4ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌BL21-DE3菌株感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，经双酶切鉴定、DNA测序分析，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因片段与设计相符，将此克隆命名为pET-MN。

将pET-MN以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度200rmp通气培养2h，加入IPTG诱导后，30℃搅拌速度150rmp继续培养6小时后收集菌体。将菌体配成油乳剂后，即可获得一种新型禽流感基因工程多肽抗原，其具有抗原性的氨基酸多肽序列为SEQ ID NO.2。

其结果如下：

SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小与预计的一致，见(图1(a))。图中“1”为蛋白质分子量Marker；“2、3、4、5”分别是空质粒pET-32α转化受体菌BL21-DE3、重组质粒pET-MN转化BL21-DE3、重组质粒pET-MN转化BL21-DE3后超声波裂解沉淀和重组质粒pET-MN转化BL21-DE3后超声波裂解上清蛋白表达条带。在条带“3、5”可见与预计分子量大小相符的融合蛋白，并且该蛋白以可溶性形式表达。Western-blotting检测该融合蛋白具有很强的抗原性，能跟标准抗体发生特异性抗体反应(见图1(b))。

用该多肽抗原免疫鸡，ELISA检测抗体水平，结果证明该抗原能刺激机体产生针对M2e的抗体(见图2)。图中横坐标表示时间间隔，纵坐标表示抗体滴度，由图可见抗体滴度随时间变化的消涨。流式细胞术检测鸡外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞数量在免疫后随时间的变化(见图3)，结果证明该抗原能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。图中横坐标表示免疫后时间间隔，纵坐标表示淋巴细胞数量，由图可见淋巴细胞数量在免疫后不同时间间隔的变化。

实施例(二)：以禽流感多肽抗原pET-HTMN为例具体描述本发明。

人工合成编码HBs-TT以及柔性氨基酸接头的基因片段(序列见SEQ ID NO.3中1-150位)，将片段3M2e-NP_366-374-NP_383-391与其串联，获得融合基因HBs-TT-3Me-NP_366-374-NP_383-391(SEQ ID NO.3)，将该片段与表达载体pET-32α经限制性内切酶双酶切，回收酶切产物，在T4ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌BL21-DE3菌株感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，经双酶切鉴定、DNA测序分析，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因片段与设计相符，将此克隆命名为pET-HTMN。

将pET-HTMN以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度200rmp通气培养2h，加入IPTG诱导6小时后收集菌体。将菌体重悬于裂解液中，超声破破碎15min，超声后8000rmp离心20min收集包涵体。以8M尿素溶解包涵体，经Ni柱纯化复性包涵体。最后纯化后的融合蛋白配成油乳剂后，即可获得一种新型禽流感基因工程多肽抗原，其具有抗原性的氨基酸多肽序列为SEQ ID NO.4。

其结果如下：

SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小与预计的一致，见(图4(a))。图中“1”为蛋白质分子量Marker；“2、3、4、5”分别是空质粒pET-32α转化受体菌BL21-DE3、重组质粒pET-HTMN转化BL21-DE3、重组质粒pET-MN转化BL21-DE3后超声波裂解沉淀和重组质粒pET-HTMN转化BL21-DE3后超声波裂解上清蛋白表达条带。在条带“3、4、5”可见与预计分子量大小相符的融合蛋白，该蛋白大部分为包涵体少量蛋白为可溶性形式表达。Western-blotting检测该融合蛋白具有很强的抗原性，能跟标准抗体发生特异性抗体反应(见图4(b))。

用该抗原免疫鸡，ELISA检测抗体水平，结果证明该抗原能刺激机体产生针对M2e的抗体(见图5)。图中横坐标表示时间间隔，纵坐标表示抗体滴度，由图可见抗体滴度随时间变化的消涨。抗体能够与病毒表达在感染细胞表面的M2结合，用免疫的血清1:100稀释与感染病毒的MDCK细胞孵育，加荧光二抗在荧光显微镜下观察结果表明，在感染细胞的表面能够观察到荧光(图6(A))，而阴性血清对照细胞表面没有荧光(图6(B))。从而证明了表达的融合蛋白刺激机体产生的抗血清能够与流感病毒结合。流式细胞术检测鸡外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞数量在免疫后随时间的变化(见图7)，结果证明该抗原能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。图中横坐标表示免疫后时间间隔，纵坐标表示淋巴细胞数量，由图可见淋巴细胞数量在免疫后不同时间间隔的变化。通过免疫学实验可以看出构建的抗原具有较的免疫原性，可以用于疫苗的制备。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>一种禽流感基因工程多肽抗原

<130>说明书

<140>00

<141>2008-05-09

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>297

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>融合蛋白基因1

<222>(1)..(297)

<223>

<400>1

<210>2

<211>98

<212>PRT

<213>融合蛋白

<220>

<221>融合蛋白1

<222>(1)..(98)

<223>

<400>2

<210>3

<211>441

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>融合蛋白基因2

<222>(1)..(441)

<223>

<400>3

<210>4

<211>146

<212>PRT

<213>融合蛋白

<220>

<221>融合蛋白2

<222>(1)..(146)

<223>

<400>4

Claims (9)

1、一种禽流感基因工程多肽抗原，其特征在于，以禽流感病毒表面保守的基质蛋白2即M2膜外部分的N端24个氨基酸肽段即M2e作为主要抗原，在其C端连接特异性的T细胞抗原表位，或在其C、N端分别连接特异性和非特异性的T细胞抗原表位，构成融合蛋白，其中特异性T细胞表位为禽流感病毒核蛋白NP上具有抗原性的氨基酸肽段，非特异性T细胞表位为乙肝表面抗原HBs和破伤风毒素TT具有抗原性的氨基酸肽段，在多肽连接处以柔性氨基酸作为接头连接。

2、根据权利要求1所述的多肽抗原，其中M2的N端24个氨基酸肽段即M2e串联成三拷贝即3M2e形式。

3、根据权利要求1或2所述的多肽抗原，其特异性T细胞抗原表位是禽流感病毒核蛋白NP366-374位氨基酸肽段和NP383-391位氨基酸肽段。

4、根据权利要求1或2所述的多肽抗原，其非特异T细胞表位是乙肝表面抗原HBs19-33位氨基酸肽段和破伤风毒素TT580-599位氨基酸肽段。

5、根据权利要求3所述的多肽抗原，其非特异T细胞表位是乙肝表面抗原HBs19-33位氨基酸肽段和破伤风毒素TT580-599位氨基酸肽段。

6、根据权利要求1或2所述的多肽抗原，其特征在于，

多肽连接处采用如下串联结构：3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA或者HBs_19-33AA-X-TT_580-599AA-Y-3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA；其中“X”为GGGGS接头，“Y”为GLPSGG接头。

7、根据权利要求3所述的多肽抗原，其特征在于，

多肽连接处采用如下串联结构：3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA或者HBs_19-33AA-Y-TT_580-599AA-X-3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA；其中“X”为GGGGS接头，“Y”为GLPSGG接头。

8、根据权利要求4所述的多肽抗原，其特征在于，

多肽连接处采用如下串联结构：3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA或者HBs_19-33AA-X-TT_580-599AA-Y-3M2eAA-X-NP_366-374AA-NP_383-391AA；其中“X”为GGGGS接头，“Y”为GLPSGG接头。

9、根据权利要求1所述的多肽抗原，其具有抗原性的氨基酸多肽序列为SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4。

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