CN103193869A

CN103193869A - 一种牛口蹄疫病毒a型合成肽及其制备和应用

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Publication number: CN103193869A
Application number: CN2013101096308A
Authority: CN
Inventors: 张永光; 张中旺; 王永录; 潘丽; 方玉珍; 吕建亮; 周鹏; 刘新生; 蒋守田
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: CN103193869B

Abstract

本发明公开了一种牛口蹄疫病毒A型合成肽，它具有以下氨基酸序列：acetyl-YDLDFEALKPHFKSLGQTITPADKSPPSVYNGTCKYSAPATRRGDLGSLAARLAACLPASFNYGAIRAT–amide。本发明合成的牛口蹄疫病毒A型合成肽，能够做为生产实践中有效的A型口蹄疫新型疫苗使用；同时，本实验的完成为进一步完善口蹄疫A型合成肽疫苗的构建以及口蹄疫其他亚型合成肽疫苗的构建奠定了一定的基础，在合成肽疫苗研究过程中所提出的新思路及其新方法的建立都将为今后进一步完善多抗原肽、多价肽以及联合肽疫苗的开发研究提供理论依据和技术支持。

Description

一种牛口蹄疫病毒A型合成肽及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种合成肽，具体地，涉及一种牛口蹄疫病毒A型合成肽及其制备和应用。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的烈性传染病。该病的暴发流行，给畜牧业生产和进出口贸易造成极大损失，因此，联合国粮农组织和国际兽疫局将其列为头号必须报告的传染病。

自1879年Loeffer发现该病以来，人们为控制该病做了不懈努力。疫苗接种是特异性预防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于存在病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素，以及不能产生交叉保护、无法区别免疫动物和自然感染动物、灭活苗免疫后常出现食欲减退、呕吐、体温升高等不良反应，有的甚至引起死亡等问题，促使人们不断寻求一种更加安全、有效、广谱的FMD疫苗。近年来, 随着生物技术在兽医生物制品领域应用的不断深化和发展，疫苗制造技术和免疫学技术得到迅猛发展，FMD基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。其中表位疫苗就是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路，它是以抗原表位为基础制备的疫苗。一般，免疫系统识别、递呈抗原时仅需要十几个氨基酸，与抗体结合仅需要几个氨基酸，所以利用定位精确、氨基酸序列较短的抗原表位，既能够有效地被免疫系统识别、递呈，又能诱发机体产生特异性体液和细胞免疫应答；同时较短的序列很容易合成，对载体的克隆能力要求较低，易于在载体中插入多个表位构建基因工程多表位疫苗。对于FMDV这样具有高度变异性的病毒，应用的疫苗株可能因与当前的流行株不匹配而不能提供有效的免疫保护，然而基于多表位疫苗含有广谱的表位信息，可以避免因病毒变异而造成的疫苗免疫失败，同时又可以同野毒株区别开来，从而为疾病的进化提供条件。表位疫苗，与弱毒疫苗和灭活疫苗相比，减少了疫苗中与免疫无关的成分，其免疫所产生的抗体针对靶病毒，特异性强，更加安全可靠，而且便于规模化生产，作为一种新型基因工程疫苗，具有广阔的开发前景。

表位疫苗通常包括合成肽疫苗（synthetic peptide vaccine）、重组表位疫苗(recombinant epitope-based vaccine)以及表位核酸疫苗(epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes)等。其中合成肽疫苗，即根据免疫抗原表位的氨基酸序列，用化学合成法人工合成抗原决定簇小肽，辅以适当的载体与佐剂制备而成的一种新型基因工程疫苗。近年来FMD合成肽疫苗的迅猛发展及广泛应用已使其在FMD的防控工作中发挥了重要作用。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究。Doel等分别用A、O、C血清型FMDV VP1序列的141～158和200～213肽段组成的40个氨基酸合成肽，免疫牛和豚鼠，结果每个肽都产生了高水平的特异性中和抗体,在豚鼠中O、A型肽可抗各自病毒的攻击并获得完全保护，C型较差(Doel et al, 1990)。

由于表位多肽分子量小，易被细胞内的蛋白酶降解，通常为克服这些抗原表位肽单独存在时免疫原性较低的现象，针对不同的疫苗设计和使用目的可以选择适合的表位传递系统来增强其免疫原性：（1）将多个表位串联起来表达形成多表位线性肽。例如将包含一个、两个、四个VP1（137～162）的肽段与β-半乳糖苷酶N-端相连时，后两者可在豚鼠体内诱导产生保护水平的抗体。Broekhuijsen M.P等用FMDV VP1的141～160位氨基酸合成双联体、四联体及八联体的合成肽，实验表明，用0.8-4微克的单剂量四联体或八联体肽免疫豚鼠就能产生足以保护病毒攻击的中和抗体反应，而20微克剂量的双联体合成肽才能产生相同水平的抗体(Broekhuijsen et al, 1987)。（2）以赖氨酸残基作为核心基质，将若干条抗原表位相同或不同的单体肽偶联于分枝状的多聚赖氨酸骨架上，形成一种具有独特三维空间结构的合成肽，即多抗原肽(Multiple antigen peptide，MAP)。这种设计使疫苗的一个分子中包含多种特异性表位，较单体肽具有明显的优越性，可诱导更好的保护力，已用于FMD分子疫苗的设计。（3）将其与载体蛋白如牛血清白蛋白（BSA）或匙孔血蓝蛋白（KLH）(Francis et a1, 1985)或霍乱毒素等相偶连以提高其免疫原性。Bittle等根据O1型FMDV VP1氨基酸序列，化学合成140～160位氨基酸肽与载体蛋白偶联，免疫豚鼠后能诱导产生中和抗体，对同型毒株具有保护作用（Bittle et a1, 1982）。Clarke等利用乙型肝炎病毒核心蛋白能自我包装成类病毒粒子，将FMDV的Ｂ细胞和Ｔ细胞抗原表位的合成肽连接到其蛋白的Ｎ-末端，并在痘病毒中表达，其表达的融合蛋白在豚鼠和猪体内都可诱导高水平的中和抗体（Clarke et al，1987）。（4）用具有佐剂活性的脂质分子共价连接于多肽链制成脂肽。除此之外，还可选择受体连接的多肽传递系统、靶向多肽类以及糖肽、免疫刺激复合物等多种形式。

与传统疫苗相比，FMD合成肽疫苗的设计研发直接锁定FMDV不同血清型病毒株抗原表位氨基酸序列的自身特点。其主要具备以下优势：既可以随时根据流行毒株的变化情况对抗原肽进行调整，可使用一些保守序列或多种不同保护性抗原序列进行抗原肽的合成，从而使合成肽疫苗所诱导产生的免疫应答更具有特异性以及广谱性，除传统免疫途径外，合成肽疫苗还可通过鼻内、口腔和皮肤等途径。合成肽疫苗在FMD的预防和控制方面具有很大的优势和潜力，多种方式接种再配以适当佐剂使机体产生更为有效的免疫应答，利用非疫苗用抗原肽建立的诊断方法可对疫苗免疫和自然感染动物进行有效区分。合成肽疫苗安全可靠、便于长期贮存、质量可控、能有效避免不良反应的发生，且投入少、成本低、更适宜规模生产。FMD合成肽疫苗弥补了目前传统FMD疫苗所存在的诸多不足，成为FMD疫苗发展的主要趋势之一

虽然合成肽疫苗领域的研究已经取得了重大进展，但在实际应用上仍存在许多问题有待解决：1.应用到FMD合成肽疫苗研究中的抗原表位太过局限，大多集中在结构蛋白 VP1的第140～160和200～213位氨基酸，可供选择的抗原表位贫乏。2.合成肽的免疫原性较低，这就要求选定的抗原表位自身须具备较强的免疫原性。3.抗原肽的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致，但目前应用的预测及模拟等各种方法都还无法掌握其自然的组成，现有合成技术也只能合成直链肽段，其三维空间结构与天然分子不尽相同。4.对于所选用的载体和佐剂与抗原肽及机体的作用机理还不够清楚。影响载体和佐剂功效的充分发挥，无法更确实的提高合成肽疫苗的免疫效力和保护作用。5.多肽合成和纯化技术的局限性以及各种佐剂的应用在不同程度上使合成肽疫苗的毒副作用增大等。

国内，上海复旦大学曾将编码FMD病毒VP1结构蛋白中第141～160及200～213位氨基酸的DNA片段与编码大肠杆菌的一个大分子蛋白的基因相结合，通过大肠杆菌成功表达了对FMD病毒有免疫原性的融合蛋白，用其研制出了猪O型FMD基因工程疫苗，并于2005年获国家一类新兽药证书，但可能由于田间免疫效果不甚理想，迄今未成功推向市场。中牧股份有限公司与申联生物医药(上海)有限公司联合，研制成功了猪口蹄疫O型合成肽疫苗，于2004年获国家一类新兽药注册证书，并用于我国猪O型FMD防控实践。由于其副反应小、免疫抗体滴度高且稳定，一直深受青睐。但该疫苗的有效肽段仅来源于某一历史毒株，抗原谱覆盖面较窄。自2009年以来，随着猪O型FMD病毒变异株的出现，该疫苗免疫猪不能很好抵御流行毒的侵袭，因此其应用受到了极大限制。除此之外，目前我国牛羊FMDV O－Asia1型二价合成肽疫苗的研制工作也已进入到申请临床试验阶段。但是，对于牛口蹄疫A型合成肽疫苗的研究目前还很少。

鉴于 2009 年以后我国部分地区 A 型口蹄疫大肆流行的严峻形势，构建具有良好免疫保护效果的牛口蹄疫A型合成肽疫苗具有重要的科研和生产意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种牛口蹄疫病毒A型合成肽及其制备和应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的牛口蹄疫病毒A型合成肽，具有以下氨基酸序列：

acetyl-YDLDF EALKP HFKSL GQTIT PADKS PPS VYNGT CKYSA PATRR GDLGS LAARL AACLP ASFNY GAIRA T–amide。

本发明的牛口蹄疫病毒A型合成肽（简称PB），通过以下方法制备完成：

（1）选择FMDV A/HB/WH09株VP1结构蛋白上129～169位氨基酸作为B细胞表位、非结构蛋白3D上346～370位氨基酸作为T细胞表位，两表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（简写为PPS）间隔序列按T-B表位顺序连接；

（2）将B细胞表位即VP1结构蛋白上129～169位氨基酸中的134位氨基酸S换成半胱氨酸C，将156位氨基酸Q也换成半胱氨酸C；

（3）采用固相多肽合成技术将设计好的氨基酸序列用多肽合成仪合成，合成过程中使两个替换的半胱氨酸形成二硫键从而达到环肽的效果，并进行N端乙酰化，末端酰胺化修饰；

（4）将合成好的多肽以PBS溶解，与等体积油佐剂均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，得到牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗。其中，油佐剂为MONTANIDE ISA 206油佐剂，购于法国Seppic公司。

本发明的牛口蹄疫病毒A型合成肽在制备牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗中的应用。

实验部分：

分别选择A型口蹄疫病毒结构蛋白上的抗原位点序列VP1：129～169位氨基酸、非结构蛋白上的抗原位点序列3A：21～35位氨基酸、3D：346～370位氨基酸为基础材料，具体序列分别参考GenBank上的A/HuBWH/CHA/2009 (JF792355)， A/VN/11/2009（ACX54403）的相关序列。

将这三个表位进行排列组合，对不同组合多肽进行生物信息学的验证分析，确保目的片段具有较高亲水性、抗原指数性和表面可能性；通过氨基酸替换、二硫键形成，模拟口蹄疫病毒VP1结构蛋白上G-H环的自然构象；各表位间以linker脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列连接，确保不会干扰表位的独立性。采用固相多肽合成技术，在体外人工合成优化后的口蹄疫病毒主要B、 T抗原表位组合，共设计并化学合成出三种不同肽链：PA、PB和PC，与免疫佐剂乳化后分别接种豚鼠和牛，通过ELISA试验检测血清抗体，微量细胞中和试验检测中和抗体，攻毒试验检测对豚鼠和牛的保护效果，最终筛选出免疫保护效力最好的一组牛口蹄疫A型合成肽疫苗，即PB组：3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169)，当其剂量为100μg/头时，免疫一次即可使牛达到良好的保护效果。

本发明的技术方案流程如图4所示。

1、毒株与氨基酸序列

FMDV A/HB/WH09毒株由国家口蹄疫参考实验室提供， A型FMDV VP1、3D、3A具体序列分别参考GenBank上的A/HuBWH/CHA/2009 (JF792355)， A/VN/11/2009（ACX54403）的相关序列。

2、主要试剂、实验动物

四甲基联苯胺(TMB)为Sigma公司产品，HRP标记的羊抗豚鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂均为进口分析纯；健康豚鼠（约250g）由中国农业科学院兰州兽医研究所试验动物场提供。品种、来源相同的健康8个月大小抗FMDV抗体阴性幼牛来自甘肃省定西市的一个规模化养牛场。

3、方法

3.1免疫原的制备：选择FMDV A/HB/WH09株VP1结构蛋白上129～169位氨基酸、非结构蛋白3A上21～35位氨基酸、非结构蛋白3D上346～370位氨基酸，组合成3种肽链，表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列连接，其中替换的半胱氨酸（C）用来合成环状结构，以模拟口蹄疫病毒VP1结构蛋白上G-H环的自然构象。送invitrogene公司合成。具体序列如下：

PA：

3A(21～35)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169) 非结构蛋白3A上21～35位氨基酸作为T细胞表位， VP1结构蛋白上129～169位氨基酸作为B细胞表位、两表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列按T-B表位顺序连接，并将B细胞表位即VP1结构蛋白上129～169位氨基酸中的134位氨基酸S换成半胱氨酸C，将156位氨基酸Q换成半胱氨酸C。并进行N端乙酰化，末端酰胺化修饰。

acetyl-AAIEF FEGMV HDSIK PPS VYNGT CKYSA PATRR GDLGS LAARL AACLP AS FNY GAIRA T-amide

PB：（本发明所合成的牛口蹄疫病毒A型合成肽）

3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169) 非结构蛋白3D上346～370位氨基酸作为T细胞表位， VP1结构蛋白上129～169位氨基酸作为B细胞表位、两表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列按T-B表位顺序连接，并将B细胞表位即VP1结构蛋白上129～169位氨基酸中的134位氨基酸S换成半胱氨酸C，将156位氨基酸Q换成半胱氨酸C。并进行N端乙酰化，末端酰胺化修饰。

acetyl-YDLDF EALKP HFKSL GQTIT PADKS PPS VYNGT CKYSA PATRR GDLGS LAARL AACLP ASFNY GAIRA T–amide

PC：

3A(21～35)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169)-PPS-3D(346～370) 非结构蛋白3A上21～35位氨基酸和3D上346～370位氨基酸作为两个T细胞表位， VP1结构蛋白上129～169位氨基酸作为B细胞表位、各表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列按T-B-T表位顺序连接，并将B细胞表位即VP1结构蛋白上129～169位氨基酸中的134位氨基酸S换成半胱氨酸C，将156位氨基酸Q换成半胱氨酸C。并进行N端乙酰化，末端酰胺化修饰。

acetyl-AAIEF FEGMV HDSIK PPS VYNGT CKYSA PATRR GDLGS LAARL AACLP ASFNY GAIRA T PPS YDLDF EALKP HFKSL GQTIT PADKS–amide

3.2 豚鼠免疫效力试验

3.2.1 动物免疫

将合成的多肽以0.04M的PBS溶解，使之浓度为500μg/ml，与等体积油佐剂(MONTANIDE ISA 206油佐剂，LOT：11111，Seppic，France)均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，使其终浓度为250μg/ml。将体重在250g左右的 30 只豚鼠随机分成5组（6只/组），每只豚鼠于后肢内侧进行肌肉注射，第一组豚鼠注射等量 PBS油乳剂作为阴性对照；第二组豚鼠注射商品化A型FMDV灭活疫苗（购自中农威特生物科技股份有限公司）作为阳性对照（0.3 mL/只）；第三组豚鼠注射PA抗原0.3mL，即75μg/只；第四组豚鼠注射PB抗原0.3 mL，即75μg/只；第五组豚鼠注射PC抗原0.3 mL，即75μg/只。第一次免疫后21 d 对各组动物进行第二次同等剂量免疫。所有豚鼠于无FMDV的隔离环境中饲养。

3.2.2 血清抗体动态监测

分别在免疫前（0d）、免疫后14d、21d、35d、42d 对豚鼠进行心脏采血，分离血清用于抗体测定。将A型FMDV灭活抗原用ELISA包被液进行1:8 稀释后包被ELISA反应板，按文献报道的方法应用间接ELISA法测定血清中抗FMDV抗体。

3.2.3中和抗体效价测定

在96孔细胞培养板上测定并用Karber法计算FMDV A/HB/WH09毒株对BHK-21细胞的半数细胞感染量 (TCID₅₀/100μL)。通过微量中和试验对动物免疫前（0d）和免疫后42d采集血清中的中和抗体效价进行测定。将待检血清56℃灭活30min后，在96孔细胞培养板中，用DMEM/High Glucose培养基从1:2开始对待检血清作一系列倍比稀释，每孔含量50μL，每个稀释度重复4孔，然后每孔中加入含有200TCID₅₀/100μL 的病毒液50μL，37℃、5％CO₂细胞培养箱中作用1h后每孔加入浓度为1×10⁶个/mL的BHK-21细胞悬液50μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。48h后在镜下作初步判断，72 h后终判。按照Karber法计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的最高血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

3.2.4 动物保护性试验

首先测定FMDV A/HB/WH09豚鼠适应病毒的ID₅₀。试验豚鼠在第二次免疫后第21天用测知ID₅₀的FMDV A/HB/WH09豚鼠适应病毒进行攻毒。各组的6只豚鼠左后跖部皮内和皮下接种100倍ID₅₀剂量的病毒液。连续观察7天，判定豚鼠发病情况。

3.3、合成肽PB疫苗最小有效免疫剂量的测定

3.3.1动物免疫

PB组合成肽疫苗以不同剂量免疫豚鼠：将合成的PB多肽以0.04M的PBS溶解，与等体积油佐剂（206）均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，使其终浓度分别为500μg/ml、200μg/ml、100μg/m和50μg/ml。将体重在250g左右的 30 只豚鼠随机分成6组（5只/组），每只豚鼠于后肢内侧进行肌肉注射，第一组豚鼠注射等量 PBS油乳剂作为阴性对照；第二组豚鼠注射商品化A型FMDV灭活疫苗（购自中农威特生物科技股份有限公司）作为阳性对照（1mL/只）；第三组豚鼠注射500μg/ml PB疫苗0.5ml，即250μg/只；第四组豚鼠注射200μg/ml PB疫苗0.5ml，即100μg/只；第五组豚鼠注射100μg/ml PB疫苗0.5ml，即50μg/只；第六组豚鼠注射50μg/ml PB疫苗0.5ml，即25μg/只。第一次免疫后21d 对各组动物进行第二次同等剂量免疫。所有豚鼠于无FMDV的隔离环境中饲养。

3.3.2中和抗体效价测定

通过微量中和试验分别对豚鼠免疫前（0d）、免疫后21d和免疫后42d采集的血清进行中和抗体效价测定。方法同3.2.3

3.3.3豚鼠攻毒保护试验

试验豚鼠在第二次免疫后第21天用测知ID₅₀的FMDV A/HB/WH09豚鼠适应病毒进行攻毒。各组的5只豚鼠左后跖部皮内和皮下接种100倍ID₅₀剂量的病毒液。连续观察7天，判定豚鼠发病情况。

3.4 牛免疫效力试验：

3.4.1实验牛免疫及采血：

取待免疫的合成肽抗原以PBS溶解，使PA、PC和PB1组浓度为200μg/mL，PB2组浓度为100μg/mL。PBS溶解的抗原蛋白与等体积油佐剂(206)均匀混合。取来源相同、品种相同的28头健康8个月大小抗FMDV抗体阴性的幼牛，分为6组，阴性对照组3头，其他各组均5头。臀部肌肉注射的方式免疫合成肽疫苗，PA、PC和PB1组免疫合成肽的剂量为100μg/mL/头；PB2组免疫合成肽的剂量为50μg/mL/头。牛注射商品化A型FMDV灭活疫苗（购自中农威特生物科技股份有限公司）作阳性对照。未注射疫苗牛做阴性对照。在0天免疫1次。于0d、21d颈静脉采血。采集的血液置于37°C放置15min，4°C放置2h，充分析出血清；4 000 r/min离心10 min，11000r/min离心4min，小心吸出血清，－70°C保存。

3.4.2牛血清抗体效价测定：

分别用LBP-ELISA试剂盒（购自中国农业科学院兰州兽医研究所）和细胞中和试验方法检测牛血清抗体效价。

3.4.2牛体功毒实验

在免疫后21天进行攻毒，舌面皮内分两点注射牛体适应毒FMDV A/HB/WH09 10⁴ID₅₀/0.2ml。观察10天，详细记录发病情况。攻毒牛凡除舌面以外，牙龈、口腔及四蹄等任何一部位出现水疱，均判为发病；对照牛应至少三个蹄出现水疱判为试验成立。

4 结果

4.1 豚鼠免疫效力试验结果

4.1.1血清抗体的测定

将所合成的多肽PA、PB和PC乳化制备成疫苗以后免疫豚鼠，应用间接ELISA方法测定血清抗体。结果表明，三组合成多肽免疫豚鼠后14d、21d 均检测不到显著的抗FMDV特异性抗体，直到二免后抗体水平开始显著增高。PC组动物的抗体水平在免疫后35d达到最高值，超过PA组和PB组动物的抗体水平，随后开始下降。PA组和PB组抗体水平则呈稳定增高的态势，但PA组的抗体水平明显低于PB和PC组。商品化灭活疫苗免疫组豚鼠在免疫以后迅速产生抗FMDV的特异性抗体，免疫21d后就能达到很高的抗体水平，第二次免疫对该组豚鼠抗体水平未见显著影响。作为阴性对照的应用PBS油乳剂免疫的豚鼠，在整个实验过程中始终检测不到抗FMDV的特异性抗体（图1）。

4.1.2血清中和抗体效价的测定

用微量细胞中和试验对各实验组豚鼠在免疫前（0d）及攻毒前（42d）所采集血清中FMDV的中和抗体效价进行测定。结果显示，42d时，三组合成肽免疫豚鼠的血清中均能检测到较高效价的中和抗体，且都超过了灭活疫苗免疫组动物的中和抗体水平。其中以PA和PB组中和抗体效价最高。(图 2)。

4.1.3 豚鼠攻毒试验

用上述测定了ID₅₀的FMDV A/HB/WH09病毒株对所有免疫豚鼠进行攻击，结果发现用PB合成肽免疫的6只豚鼠与用商品化灭活疫苗免疫的豚鼠结果一致，所有豚鼠都未出现继发性水疱，而作为对照组的用PBS油乳剂免疫的豚鼠则四只脚全部发病（表1）。表明PB合成肽免疫豚鼠后能够给豚鼠提供一定的保护力，使得动物能够在一定程度上抵御FMDV 感染。

4.2 合成肽PB疫苗最小有效免疫剂量的测定结果

4.2.1豚鼠血清中和抗体效价的测定

用微量细胞中和试验对各实验组豚鼠在免疫前（0d）、二免前（21d）和攻毒前（42d）所采集血清中FMDV的中和抗体效价进行测定。结果显示，21d时，中和抗体效价与免疫剂量成正比，250μg组最高，其次是100μg组，并且都高于灭活疫苗阳性对照组，而50μg组和25μg组则没有检测到中和抗体。42d时，各试验组免疫豚鼠的血清中均能检测到较高效价的中和抗体，除25μg组外，其他三组均高于灭活疫苗组，其中以100μg组中和抗体效价最好，达2.4（即1:256）。而阴性对照PBS组一直未测到口蹄疫中和抗体。(图 3)。

4.2.2 豚鼠攻毒试验

用前期试验测定了ID₅₀的FMDV A/HB/WH09病毒株对所有免疫豚鼠进行攻击，结果发现25μg以上剂量的PB合成肽免疫的豚鼠与用商品化灭活疫苗免疫的豚鼠保护率一致，所有豚鼠都未出现继发性水疱，而且100μg以上剂量的两组40%未出现原发性水疱。作为对照组的用PBS油乳剂免疫的豚鼠则四只脚全部发病（表2）。表明PB合成肽以50μg的剂量免疫豚鼠即能够给豚鼠提供完全的保护力，使得豚鼠能够抵御同型FMDV 的感染。

4.3 牛免疫效力试验结果

免疫后21天牛体攻毒结果显示，灭活疫苗阳性对照组细胞中和抗体滴度对数值均高于2.1，即大于1:128。其他试验组除PC组的36号、PB1组的36、49号牛的细胞中和抗体滴度对数值高于1.2（即1:16）外，其他试验动物的细胞中和抗体滴度对数值均低于0.9，即当1:8稀释血清时，仍不能中和相应口蹄疫病毒。液相阻断ELISA法检测牛血清抗体效价结果也是以灭活疫苗阳性对照组最高，其次为PB1（100ug/头）组，其他试验组均未检测到明显的口蹄疫A型抗体。攻毒保护试验结果也以灭活疫苗阳性对照组最高，达80%，PB1组次之，达60%，然后是PA和PC组，为40%，PB2（50ug/头）组则完全没有达到保护效果，且一头牛在攻毒后第六天死亡。阴性对照组3头牛均有3个蹄子以上发病。说明在所设计合成的三组疫苗中，PB组在剂量为100ug/头时，免疫一次即可使牛达到明显的免疫保护效果（如表3所示）。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述一种牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗及制备方法，其有益效果在于：所设计合成的三种不同组合的肽疫苗均表现出一定的免疫原性，其中以PB组，即3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169)免疫保护效力最高，50μg/只的剂量免疫两次后即可保护豚鼠100%的抵抗同型病毒的攻击。牛体免疫效力试验结果，在灭活疫苗保护率为80%的情况下，当PB组剂量为100μg/头时，免疫一次保护率即可达到60%的良好效果，为三组合成肽中保护效力最好的一组。因此PB合成肽，即3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(S→C)～156(Q→C)～169)能够作为生产实践中有效的A型口蹄疫新型疫苗使用。同时，本实验的完成为进一步完善口蹄疫A型合成肽疫苗的构建以及口蹄疫其他亚型合成肽疫苗的构建奠定了一定的基础。在合成肽疫苗研究过程中所提出的新思路及其新方法的建立都将为今后进一步完善多抗原肽、多价肽以及联合肽疫苗的开发研究提供理论依据和技术支持。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 间接ELISA法检测免疫豚鼠抗体水平

图2 细胞中和试验检测免疫豚鼠的血清FMDV中和抗体效价

图3 细胞中和试验检测PB合成肽不同剂量免疫豚鼠的血清FMDV中和抗体效价

图4 本发明的技术方案流程图。

具体实施方式

牛口蹄疫病毒A型合成肽，具有以下氨基酸序列：

牛口蹄疫病毒A型合成肽，通过以下方法制备完成：

（1）选择FMDV A/HB/WH09株VP1结构蛋白上129～169位氨基酸作为B细胞表位、非结构蛋白3D上346～370位氨基酸作为T细胞表位，两表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸间隔序列按T-B表位顺序连接；

（3）采用固相多肽合成技术将设计好的氨基酸序列用多肽合成仪合成，合成过程中使两个替换的半胱氨酸形成二硫键从而达到环肽的效果，并进行N端乙酰化，末端酰胺化修饰，得到牛口蹄疫病毒A型合成肽；

（4）将合成好的多肽以PBS溶解，与等体积油佐剂均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，得到牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗；

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种牛口蹄疫病毒A型合成肽，其特征在于，具有以下氨基酸序列：

2.权利要求1所述的牛口蹄疫病毒A型合成肽的制备方法，包括以下步骤：

（4）将合成好的多肽以PBS溶解，与等体积油佐剂均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，得到牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗。

3.权利要求1所述的牛口蹄疫病毒A型合成肽在制备牛口蹄疫病毒A型合成肽疫苗中的应用。