CN104208669B - 一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗及其制备方法，该二联疫苗由犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的。本发明的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，将犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗进行复配，辅以冻干保护剂和杂菌抑制剂，所得二联疫苗质量稳定，免疫时间长，不良反应少，安全可靠；能同时使犬瘟热病毒、犬细小病毒得到有效的控制，免疫效果显著；使用剂量与单苗相当，其效力优于两单苗的效力；简化了接种程序，减少接种动物应急反应的次数，达到一针两防的目的。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，同时还涉及一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法。
背景技术
犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病。该病发病率高，几乎达到100%，且临床症状多样，容易发生细菌、病毒的混合感染和继发二次感染，死亡率更是高达80%。幼龄动物多为急性、致死性感染，成年动物可呈慢性持续性感染，临诊以双相热型、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫肿胀为主要特征。该病呈世界性分布，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疾病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失惨重。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及师、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物均有CD自然发病的报道，甚至人也有CDV感染的病例，并且CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害也越来越大。
犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病，临床上以急性出血性胃肠炎和心肌炎为特征。犬细小病毒对犬具有高度的接触传染性，各种年龄的犬均可感染，但以刚断乳至90日龄的犬发病较多，病情也较严重。该病发病急，病程短，死亡率高，传染性强，对实验犬、军犬、警犬等犬群以及宠物犬均具有较大的危害性。
目前，现有的犬瘟热和犬细小病毒病的疫苗的生产方法多采用传统转瓶发或鸡胚生产工艺，生产效率较低，生产成本高；并且由于产品质量不稳定，存在免疫时间短、不良反应多等问题，进而影响免疫效果。同时，现有市场上犬瘟热和犬细小病毒病的疫苗多为单苗，需多次接种，程序繁琐且增加了接种动物的应急反应次数，使用不便，不能满足广泛使用的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，解决现有疫苗由于质量不稳定所引起的免疫时间短、不良反应多、免疫效果不理想的问题。
本发明的第二个目的是提供一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，由犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的。
所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经110～120℃灭菌30～40min后，经检测无菌后制成的。
所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联疫苗总体积的10%。
所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。
所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联疫苗中含青霉素100～200单位、含链霉素100～200μg。
本发明的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，包括下列步骤：
1）将犬瘟热病毒弱毒疫苗和犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例进行充分混合，加入冻干保护剂和杂菌抑制剂，过滤、分装、冻干，得冻干疫苗；
2）将步骤1）所得冻干疫苗分装，然后进行真空冻干，即得。
本发明的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，将犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗进行复配，辅以冻干保护剂和杂菌抑制剂，所得二联疫苗质量稳定，免疫时间长，不良反应少，安全可靠；能同时使犬瘟热病毒、犬细小病毒得到有效的控制，免疫效果显著；使用剂量与单苗相当，其效力优于两单苗的效力；简化了接种程序，减少接种动物应急反应的次数，达到一针两防的目的。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，由犬瘟热病毒弱毒疫苗（市售）与犬细小病毒弱毒疫苗（市售）按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的。
所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经110℃灭菌40min后，经检测无菌后制成的。所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联活疫苗总体积的10%。所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联活疫苗中含青霉素100单位、含链霉素200μg。
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，包括下列步骤：
1）将犬瘟热病毒弱毒疫苗和犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例进行充分混合，加入冻干保护剂和杂菌抑制剂，过滤、分装、冻干，得冻干疫苗；
2）将步骤1）所得冻干疫苗分装于三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干，即得。
实施例2
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，由犬瘟热病毒弱毒疫苗（市售）与犬细小病毒弱毒疫苗（市售）按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的。
所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经120℃灭菌30min后，经检测无菌后制成的。所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联活疫苗总体积的10%。所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联活疫苗中含青霉素200单位、含链霉素100μg。
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，包括下列步骤：
1）将犬瘟热病毒弱毒疫苗和犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例进行充分混合，加入冻干保护剂和杂菌抑制剂，过滤、分装、冻干，得冻干疫苗；
2）将步骤1）所得冻干疫苗分装于三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干，即得。
实施例3
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，由犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的。
所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经115℃灭菌35min后，经检测无菌后制成的。所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联活疫苗总体积的10%。所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联活疫苗中含青霉素150单位、含链霉素150μg。
所述犬瘟热病毒弱毒疫苗，为犬瘟热病毒核衣壳蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗是通过反向遗传操作技术在新城疫LaSota弱毒疫苗中表达犬瘟热病毒核衣壳蛋白。
上述犬瘟热病毒弱毒疫苗是由以下方法制备的：
1）Covac-N基因的获取和序列分析：
从GenBank获得CDV弱毒疫苗株Covac基因组N基因的序列，并扩增、重组以获得重组病毒基因组cDNA；
2）表达N基因的重组病毒基因组全长cDNA的构建：
质粒PBS-CDV-N经Pme I酶切处理后，回收CDV-N片段，并与经Pme I酶切去磷酸化的NDV感染性克隆质粒连接，构建表达为Covac-N的重组基因；
3）重组病毒的拯救：
在细胞密度为80%以上的BHK-21细胞上，按0.1的病毒量接种表达T7聚合物的重组痘病毒，预感染细胞2h后，共转染；将检测为阳性的接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔中，拯救出重组病毒。
在经RT-PCR鉴定，WesternBlot表达，检测到Covac-N的特异产物，表明犬瘟热病毒N蛋白在重组新城病毒感染细胞中获得了正确表达。
所述犬细小病毒弱毒疫苗是由以下方法制备的：
用含有质量分数为10%的小牛血清的199培养基的营养液，37℃培养F81细胞2天，使其细胞密度达到80%以上，将犬细小病毒弱毒疫苗株CPV-2以1%的量，37℃感作1h，加入3%的维持液（含有质量分数为3%的小牛血清的199培养基）37℃培养5天，待70%以上细胞发生病变时，将细胞置于-20℃条件下反复冻融3次，收集上清液得到犬细小病毒液，即为犬细小病毒弱毒疫苗，保存备用。
本实施例的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，包括下列步骤：
1）将犬瘟热病毒弱毒疫苗和犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例进行充分混合，加入冻干保护剂和杂菌抑制剂，过滤、分装、冻干，得冻干疫苗；
2）将步骤1）所得冻干疫苗分装于三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干，即得。
Claims (10)
1.一种犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，其特征在于：由犬瘟热病毒弱毒疫苗与犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例混合后，再加入冻干保护剂和杂菌抑制剂制成的；
所述犬瘟热病毒弱毒疫苗，为犬瘟热病毒核衣壳蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗是通过反向遗传操作技术在新城疫LaSota弱毒疫苗中表达犬瘟热病毒核衣壳蛋白；
上述犬瘟热病毒弱毒疫苗是由以下方法制备的：
1）Covac-N基因的获取和序列分析：
从GenBank获得CDV弱毒疫苗株Covac基因组N基因的序列，并扩增、重组以获得重组病毒基因组cDNA；
2）表达N基因的重组病毒基因组全长cDNA的构建：
质粒PBS-CDV-N经Pme I酶切处理后，回收CDV-N片段，并与经Pme
I酶切去磷酸化的NDV感染性克隆质粒连接，构建表达为Covac-N的重组基因；
3）重组病毒的拯救：
在细胞密度为80%以上的BHK-21细胞上，按0.1的病毒量接种表达T7聚合物的重组痘病毒，预感染细胞2h后，共转染；将检测为阳性的接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔中，拯救出重组病毒；
所述犬细小病毒弱毒疫苗是由以下方法制备的：
用含有质量分数为10%的小牛血清的199培养基的营养液，37℃培养F81细胞2天，使其细胞密度达到80%以上，将犬细小病毒弱毒疫苗株CPV-2以1%的量，37℃感作1h，加入3%的维持液37℃培养5天，待70%以上细胞发生病变时，将细胞置于-20℃条件下反复冻融3次，收集上清液得到犬细小病毒液，即为犬细小病毒弱毒疫苗，保存备用；
其中，3%的维持液为含有质量分数为3%的小牛血清的199培养基。
2.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，其特征在于：所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经110～120℃灭菌30～40min后，经检测无菌后制成的。
3.根据权利要求1或2所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，其特征在于：所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联疫苗总体积的10%。
4.根据权利要求1所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，其特征在于：所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。
5.根据权利要求1或4所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗，其特征在于：所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联疫苗中含青霉素100～200单位、含链霉素100～200μg。
6.一种如权利要求1所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
1）将犬瘟热病毒弱毒疫苗和犬细小病毒弱毒疫苗按体积比为1:1的比例进行充分混合，加入冻干保护剂和杂菌抑制剂，过滤、分装、冻干，得冻干疫苗；
2）将步骤1）所得冻干疫苗分装，然后进行真空冻干，即得。
7.根据权利要求6所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂是将蔗糖、脱脂乳混合，经110～120℃灭菌30～40min后，经检测无菌后制成的。
8.根据权利要求6或7所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂的加入量是使其占所述二联疫苗总体积的10%。
9.根据权利要求6所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，其特征在于：所述杂菌抑制剂为青霉素和链霉素。
10.根据权利要求6或9所述的犬瘟热、犬细小病毒病二联疫苗的制备方法，其特征在于：所述杂菌抑制剂的加入量为：每毫升二联疫苗中含青霉素100～200单位、含链霉素100～200μg。
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