CN1106700A - 防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗及 其制备方法，其含有鸡新城疫病毒、传染性支气管炎 病毒和传染性法氏囊炎病毒，三种病毒由同胚培养法 获得，其方法是用同胚培养取替单独培养，一次接种 使三种病毒在同一鸡胚中培养，经孵化、冷却、消毒等 工序从鸡胚中收取胚液，对经无菌、毒价检测合格的 鸡胚胚液，通过制备水相和油相，按比例混合乳化制 得成品，疫苗为白色油乳型，其优点省工、省时、节约 原材料，方便使用，一针预防三种鸡病。

Description

本发明涉及防治禽类疾病的疫苗及其制备，特别是防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗及其制备方法。

目前，使用的防治鸡新城疫（ND）、传染性支气法氏囊炎（IBD）三联油乳剂灭活苗，国内外均采用病毒培养、提取、浓缩的方法制备，一般是采用将每一种鸡病的病毒进行单独培养的方法，在鸡胚或细胞中进行，然后按一定比例提取浓缩制备成疫苗，在使用时单独使用或按一定比例混合使用，缺点是制备工艺复杂、浪费原材料，给使用者带来不便。

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足进行改进，提出防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗及其制备方法。

本发明的技术解决方案是，采用含有鸡新城疫病毒（Newcastle    Dlsease    Vlrcrs，简称NDV），传染性支气管炎病毒（Infectlons    Bronchltls    Vlrus，简称IDV）、传染性法氏囊炎病毒（Infectlons    Bursal    Dlsease    Vlrus，简称IBDV）三种病毒抗原体疫苗，疫苗系灭活疫苗，其特征在于，疫苗是采用同一鸡胚中培养提取的含有鸡新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊炎病毒（IBDV）的三种疫苗病毒抗原的混合液，该混合液经灭合处理制备而成。

灭活疫苗的成品为白色油乳剂。

防治鸡病的三病油乳剂灭活疫苗的制备方法，采用鸡新城疫病毒毒株，传染性支气管炎病毒毒株和传染性法氏囊炎病毒毒株作毒种种源，选用符合制备疫苗病毒抗原用的未经鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊炎三种疫苗免疫的健康鸡群所产的受精蛋作制备用毒的培养体，其特征在于，采用同胚培养法取替单独培养法，将取自各毒种种源的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒采用一次接种于培养体中，使它们在同一鸡胚中培养，经孵化、冷却、消毒多道工序，从鸡胚中收取胚液，经无菌检测合格，再作毒价检测，随即将毒价检测合格的鸡胚液进行灭活处理，用作疫苗抗原剂，再分别进行水相和油相制备，将油相和水相按比例搅拌混合均匀制得灭活疫苗成品。

毒种接种的具体步骤是，先将鸡新城疫苗毒毒株种毒以100倍、传染性法氏囊炎病毒毒株种毒以10倍稀释，传染性支气管炎病毒毒株种毒以10^-3-10^-5的浓度稀释，然后各取1ml，加入100ml生理盐水中配成混合毒液，将混合毒液接种于孵育9-10日发育良好的鸡胚尿囊中，每胚按0.1ml混合毒液接种，接种孔用蜡封好。

接种后，培养基置于37℃-39℃条件下继续孵化到96小时，经照蛋，弃去死胚，活胚经冷却无菌操作，从中收获胚液。

三种毒的毒价检测的合格指标，其鸡胚半数感染量EID₅₀≥10⁶/0.1ml。

将经过毒价检测合格的鸡胚液按先计量后加入终浓度0.1%甲醛溶液方式进行病毒抗原灭活处理。

油相制备是取94%10号白油加6%司本80混合后再加入2%的硬脂酸铝，边加热边搅拌至透明止，高压消毒备用。

水相制备是将灭活处理后的鸡胚液置于容器中，加入4%吐温80，用力摇动使吐温80充分混匀于鸡胚液中。

油包水灭活疫苗的制备是，取3份油相放入胶磨或乳剂缸内，开动电机慢速搅拌，同时加入1份水相，加完后，再以10000转/分钟搅拌2分钟，制成油乳剂灭活疫苗的成品。

本发明的优点是，采用同胚混合培养，使得鸡胚尿囊液中三种病毒滴度同时达到高峰，按此方法培养的混合毒不需浓缩即可制备油乳剂灭活疫苗，其效果可以达到单一培养后再按比例混合制得的三联油乳剂灭活苗，工艺上省时省工、节约原材料，降低了生产成本，给使用者带来了方便，一针可以防治三种鸡病。

下面根据本发明的技术解决方案详细描述本发明的实施例。

1、选择NDV Lasota弱毒株，IBV M₄₁毒株，由中国兽药监察所保管、鉴定、供应。

制备疫苗用的IBDV HB₉₁系进口毒株经鸡胚适应3代获得，由湖北省畜牧兽医研究所分离和保存。

NDV Lasota、IBV M₄₁毒株的性能标准、保存、继代、无菌检验等均按《部颁规程》中有关上述三种毒保存、检验规程进行。

IBDV HB₉₁3代适应株，其含毒滴度为10^6-7EID₅₀/0.1ml，湿毒（50%甘油保护剂）-25℃可保存12个月。

2、同胚培养NDV、IBV、IBDV三种毒。

选择符合制备疫苗要求用的未经鸡新城疫（ND）、传染性支气管炎（IB）和传染性法氏囊炎（IBD）三种疫苗免疫鸡群所产的新鲜受精鸡蛋作为培养基，清除受精蛋表面的污物，用消毒药擦拭干净，然后置于38-39℃的孵化箱内孵化，相对湿度保持在60-70%。

进行一次毒种接种，接种的具体步骤是，先将NDV，Lasotca株以100倍，IBDV HB₉₁以10倍稀释，IBV M₄₁以10^-3-10^-5的浓度稀释，然后各取1ml加入100ml无菌生理盐水中，制成混合毒液，再将混合毒液接种于作为培养基的已孵育了9-10日发育良好的鸡胚尿囊内，每胚按0.1ml接种，接种后将蛋壳上的接种孔用蜡封好，将其置于37℃的条件下继续孵化96小时，照蛋、弃去死胎，在4℃冷却24小时。

鸡胚液的提取，将冷却的鸡胚取出，放入空气干燥室内，以避免过多凝结水造成对培养基基体的污染，将蛋壳的气室部位用碘酊消毒后，以无菌手术剥去气室部位的蛋壳，将蛋壳膜，用尖头小摄子将绒毛尿囊膜及羊膜撕破，抽取收集胚液，注意每个鸡胚提取鸡胚液之前均应检查，凡胎儿腐败者，胚液混浊及有任何污染可疑的鸡胚，都应弃去。

3、进行检测

对收集的鸡胚液，作无菌检测，按《部颁规程》进行，观察3天应无菌生长。

对经无菌检验后合格的鸡胚液再进行毒价检测。鸡胚液混合毒价检测均用无ND、IB、IBD抗体的鸡胚，测定鸡胚半数感染量（EID50），用抗NDV、IBV和IBDV特异性高免血清封闭相应病毒。具体操作如下，将含毒胚液用生理盐水稀释10^-3分别放入三支无菌管中，每管1ml，第一管加入IB和IBD高免血清各0.5ml，第二管加入ND和IBD高免血清各0.5ml，第三管加入ND和IB高免血清各0.5ml，在25℃下中和1小时后，将每管稀释为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、五个组，每组接种9-10日龄鸡胚5-6个，每种毒同时设6个正常的鸡胚对照在37-39℃培养箱中孵化。

NDV毒价判定，第一排管测NDV毒价，将10^-5-10^-8每组接种5-6胚，每胚0.1ml，48小时前死亡的鸡胚不计，随时取出48-96小时死亡的鸡胚。收获鸡胚液，同组等量混合至96小时，取出活胎，逐个收获胚液，分别测定红细胞凝集价，1∶80上为感染，计算其半数感染量（EID₅₀）EID₅₀≥10⁷/0.1ml判定为合格。

IBV毒价判定，第二排管测IBV毒价，将10^-4-10^-8五个组，每组接种9-10日龄鸡胚5-6个，每胚尿囊接种0.1ml，观察6天，接种胚应在2-6天死亡或至6天时，有活的鸡胚中部分出现胎儿无水，蜷缩、发育小（接种胎儿比对照中未接种中最轻胎儿重量低2克以上），根据死胎儿数和胎儿出现特异性病痕数测定其EID₅₀，EID₅₀应≥10⁶/0.1ml以上判定合格。

IBDV毒价的判定，第三排管测IBDV毒价，在10^-4-10^-8五组中各接种8-9日龄鸡胚5-6个，每胚尿囊膜（CAM）接种0.1ml，观察4天24小时死胚弃出，48小时死亡胎及96小时活胎逐个检查，观察鸡胚IBD特异病变，腿胸肌条状，点状出血、斑驳样肝脏和蒸熟样心脏，根据特异性病变胎儿数计算其EID₅₀，EID₅₀≥10⁶/0.1ml应判定合格。

4、疫苗制备

病毒抗原灭活。将测毒价合格的鸡胚液倒入玻璃瓶内，计量后加入终浓度0.1%甲醛溶液，随加随摇再倾斜倒入另一瓶中，以避免瓶口壁附近粘附的病毒未能接触到灭活剂，然后放37℃，灭活16-20小时，从瓶内温度达37℃开始计时，在灭活期间摇荡3-4次，至时取出，4℃左右保存备用。

油相制备，取94份10号白油和6份司本80混合后，再加入2份硬脂酸铝，随加随搅拌，至透明为止，高压消毒备用。

水相制备，将经灭活处理的鸡胚液装入在玻璃瓶中，加入4%吐温80，用力摇动，使吐温80充分溶解于鸡胚液中。

油包水（W/O）灭活疫苗的制备，取3份油相放入胶体磨或者乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，加入1份水相，加完后再以10000转/分钟，搅拌2分钟，并加入1/万硫酸柳汞溶液，制成油乳剂灭活疫苗。

将孵化好的疫苗分装，贴上标签，标签应标明制品的名称、批号、装量、用法、保存方法，制造日期、制造单位。

该灭活疫苗的成品为白色乳剂、油乳型，有较好的稳定性。

根据上述制备方法制备的三联油乳剂灭活疫苗，含有鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊炎三种病毒的抗原成份，疫苗系灭活疫苗，该三联疫苗中的三种病毒抗原是采用同一鸡胚中培养提取的含有鸡新城疫病毒NDV、传染性支气管炎病毒IBV、传染性法氏囊炎病毒IBDV的三种毒后经毒价测定灭活处理制备的病毒抗原。其系混合毒液，一针可以防治三种鸡病，进行防治鸡病的免疫十分方便。

Claims (10)

1、防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊炎病毒抗原，疫苗系灭活疫苗，其特征在于，疫苗中的三种病毒抗原是同一鸡胚中培养提取的含有鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒的三种疫苗病毒抗原的混合液，该混合液经灭活处理制备而成。

2、根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗，其特征在于，灭活疫苗的成品为白色油乳剂。

3、一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，采用鸡新城疫病毒毒株，传染性支气管炎病毒毒株和传染性法氏病毒毒株作毒种种源，选用符合制备疫苗病毒抗原用的未经鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊炎三种疫苗免疫的健康鸡群所产的受精蛋作制备用毒的培养体，其特征在于，采用同胚培养法取替单独培养法，将取自各毒种种源的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊炎病毒采用一次接种于培养体中，使它们在同一鸡胚中培养，经孵化、冷却、消毒多道工序，从鸡胚中收取胚液，经无菌检测合格，再作毒价检测，随即将毒价检测合格的鸡胚液进行灭活处理，用作疫苗抗原剂，再分别进行水相和油相制备，将油相与水相按比例搅拌混合、均匀，制得灭活疫苗成品。

4、根据权利要求3所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，毒种接种的具体步骤是，先将鸡新城疫病毒毒株种毒以100倍，传染性法氏囊炎病毒毒株种毒以10倍稀释，传染性支气管炎病毒毒株种毒以10³-10⁵的浓度稀释，后各取1ml加入100ml无菌生理盐水，配成混合毒液，将混合毒液接种于孵育9-10日的培养基中发育良好的鸡胚尿囊中，每胚按0.1ml混合毒液接种，接种孔用蜡封好。

5、根据权利要求4所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，接种后，培养基置于37℃-39℃条件下继续孵化到96小时，经照蛋、弃去死胚，活胚经冷却、无菌操作，从中收获胚液。

6、根据权利要求3所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂活性疫苗的制备方法，其特征在于，三种毒的毒价检测的合格指标，其鸡胚半数感染量EID₅₀≥10⁶/0.1ml。

7、根据权利要求3所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，将经过毒价检测合格的鸡胚液按先计量后加入终浓度0.1%甲醛溶液方式进行病毒抗原灭活处理。

8、根据权利要求3所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，油相制备是取94%10号白油加6%司本80，混合后再加入2%的硬脂酸铝，边加热边搅拌至透明止，高压消毒备用。

9、根据权利要求3所述的一种根据权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，水相制备是将灭活处理后的鸡胚液置于容器中，加入4%吐温80，用力摇动使吐温80充分混匀于鸡胚液中。

10、根据权利要求3所述的一种权利要求1所述的防治鸡病的三联油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，油包水灭活疫苗的制备是，取3份油相放入胶磨或乳剂缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时加入1份水相，加完后再以10000转/分钟，搅拌2分钟，制成油乳剂灭活疫苗的成品。