CN1102409C - 一种鸡用三联活疫苗及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种鸡用三联活疫苗及其生产方法，本发明的三联活疫苗用语预防鸡新城疫，鸡传染性支气管炎，鸡传染性法氏囊病这三种危害养鸡业的主要传染病，不仅简化了免疫程序，节省了劳动力、而且可避免目前生产实际中育雏阶段过于频繁免疫接种因应激因素及多种病毒疫苗前后不同时间接种而发生的免疫干扰现象。在生产上采用同一个鸡胚复制三种制苗病毒，便利生产，保证了疫苗质量。
Description
本发明涉及一种用于预防鸡新城疫，鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三种鸡传染病的联合活疫苗(本发明申请中简称三联苗或ND-IB-IBD三联活疫苗苗)及其生产方法，属于动物用活疫苗及其制造领域。
鸡新城疫(Newcastle disease，ND)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursaldisease，IBD)和鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是危害养鸡业的三种主要传染病，它们分别是由鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)和鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)所引起的。世界各国对这三种传染病的防治均十分重视。所使用的活疫苗一般是按常规方法制造的单一株减毒病毒活疫苗，主要有系列新城疫疫苗，鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗、鸡传染性支气管炎(H52和H120)活疫苗。尽管这些疫苗在三种疫病的防治中发挥了重大作用，但由于三种疫苗在接种时间上比较接近，均需在育雏早期接种。这样在育雏阶段的短时间内要接种三次疫苗，如果进行二次免疫，一只鸡则需接种6次。这在生产实际中，不仅疫苗成本高，在短时间内过于集中的对鸡反复接种，因接种致鸡产生的应激反应及三种疫苗病毒接种生的干扰作用，严重影响三种疫苗的免疫效果。在生产实际中，有的鸡场为避免上述问题，在免疫前，将三种单苗稀释后混合接种，这虽然解决了反复接种问题，但由于三种疫苗病毒混合后的免疫剂量比例不易控制，免疫效果也不理想。因此疫苗使用单位均希望有一种接种简便，效果良好的联合疫苗，只需1～2次接种，可同时预防这三种传染病。
目前对于鸡新城疫的预防采用的疫苗主要是用NDV中等毒力的I系，弱毒力株II系，IV系及克隆30(C30)等弱毒株活疫苗；对于鸡传染性支气管炎的预防，疫苗主要是IBV H120、H52毒株生产的；对于鸡传染性法氏囊病的预防主要是采用IBV B87等中等毒力株疫苗。这些疫苗中除鸡新城疫和鸡传染性支气管炎已制成二联苗外，主要还是应用单一的疫苗。在制造工艺上，除鸡传染性法氏囊病活疫苗可采用鸡胚和细胞培养两种方式繁殖病毒外；鸡新城疫和鸡传染性支气管炎活疫苗均采用鸡胚繁殖病毒，其中鸡新城疫、鸡传染性支气管炎病毒的制苗材料为收获的含病毒尿囊液，鸡传染性法氏囊病疫苗为含病毒胎儿组织。由于病毒在鸡胚中各部位的含量不同，所以，在制造新城疫疫苗和传染性支气管炎疫苗时，仅收获尿囊液而将胎儿废弃；在制造法氏囊疫苗时，仅收获胎儿而将尿囊液废弃。
本发明的目的就是为解决以上两方面的问题，而发明鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三联活疫苗(以下称ND-IB-IBD三联活疫苗、或称鸡三联活疫苗)及其制造技术。
本发明的技术要点在于，要制造出合格的鸡三联活疫苗，在制造工艺上要解决的主要技术难点是确保鸡三联活疫苗中三种病毒的含量必须达到三种单苗规定的质量标准，即NDV每0.1ml含有108以上EID50(半数感染量)、IBV H120含有106以上EID50、IBDV B87含有105以上EID50。
如果按照传统的疫苗制造方法，将三种病毒分别接种鸡胚繁殖病毒，将收获的病毒液简单混合，由于三种病毒液的相互稀释作用，使单位体积中的病毒含量只有原液的三分之一，达不到三种病毒单苗规定的质量标准。另外采用单独接种有一半的尿囊液和胎儿组织得不到利用，使疫苗生产成本增加。如采用病毒浓缩办法，则由于污染及设备因素也难于实行。
为此，本发明设计了一种同胚同时接种三种病毒的生产工艺，同胚繁殖三种病毒不仅解决了病毒液相互稀释的难题，也使尿囊液和鸡胚胎儿得到了充分利用。并制造出了合格的鸡三联活疫苗。
采用同胚同时接种三种病毒生产鸡三联活疫苗，其技术关键是确定三种病毒的接种比例和接种时间，由于IBV对鸡胚的毒力较强，单独接种时鸡胚死亡时间为30～36小时(h)，而新城疫病毒繁殖高峰期在36～72h，法氏囊病毒繁殖高峰期在48～120h。因此采用三种病毒同胚同时接种必须确定合理的接种比例，使得三种病毒都能充分繁殖，并将鸡胚的死亡时间控制在72～120h，以获得最高的产量。为达到此目的，本发明通过对9种不同比例的接种配方进行比较，最终确定了最佳的接种配比，即同胚接种104EID50的NDV IV系病毒，103EID50IBVH120病毒，103EID50IBDV B87病毒，可获得最佳的病毒繁殖效果。经试验，用该配方接种9～10日龄SPF鸡胚，制造出的三联疫苗、新城疫IV系的EID50可达到8.5～9.5；H120 EID50可达到6.1～7.5；B87 EID50可达到5.0～6.7，均达到了三种病毒单苗规定的质量标准。
本发明的具体实施步骤为，按照三种疫苗单苗制造规程(中华人民共和国农业部颁.中华人民共和国兽用生物制品规程，以下可称《规程》)要求制备三种生产用种子病毒(或称种毒)、检验合格后，将三种种毒稀释成每0.1ml含有104 EID50的NDV IV系病毒，103EID50 IBV H120病毒；103EID IBDV 87 B87病毒。尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。接种后密封针孔。37℃孵育至120h。收取30～120h的死胚和活胚。4℃冷冻4～24h后，分别以无菌方式收取鸡胚尿囊液和胎儿及尿囊膜。将收获的胎儿和尿囊膜制成组织匀浆。经200目铜纱过滤或以5000r/min离心20分(min)，收取滤过液或上清，与收取的尿囊液混合，加入等体积冻干保护剂冷冻干燥即为冻干鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三联活疫苗。
采用本发明的鸡三联活疫苗在田间试验中对7～10日龄雏鸡点眼滴鼻进行初次免疫(以下称初免或首免)，25日龄点眼滴鼻第二次免疫(以下称二免)，二免后25天即初免后50天，分别用三种强毒(NDV、IBV、IBDV)进行攻击，保护率均可达到100％。
在实验室试验中对于无特定病原(SPF)鸡免疫后一年，对新城疫强毒攻击仍可达到100％保护。
为了确定三种同胚繁殖的病毒在同时免疫鸡后，是否会有相互干扰作用，将三联苗用三种病毒的阳性血清中和成单价，并与未中和的三联苗及单独制备的三种单苗以相同免疫剂量免疫SPF鸡，免疫后30d采血测定抗体效价，结果表明三种病毒同时免疫鸡后，三种病毒之间基本无干扰作用。
ND-IB-IBD三联活疫苗的研制成功，在生产上不仅简化了免疫程序，节省了劳动力、而且可避免目前生产实际中育雏阶段过于频繁免疫接种因应激因素及多种病毒疫苗前后不同时间接种而发生的免疫干扰现象。对于预防新城疫，鸡传染性支气管炎，鸡传染性法氏囊病这三种危害养鸡业的主要传染病有良好的应用价值。
实施例及实验
实施例制苗毒株 新城疫采用鸡新城疫病毒(NDV)LaSota病毒株。鸡传染性支气管炎采用鸡鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120病毒株。传染性鸡传染性法氏囊病病采用鸡传染性鸡传染性法氏囊病病病毒(IBDV)B87病毒株。3种病毒的种子病毒(本发明专利文献中毒均由中国兽药监察所提供，并按照现有的三种单苗生产和检验《规程》制备生产用种子、本发明所引用的《规程》为中华人民共和国农业部颁，中华人民共和国兽用生物制品规程)。
按照三种疫苗单苗制造《规程》要求制备三种生产用种毒、检验合格后，将三种种毒稀释成每0.1ml含有104EID50的NDV IV系病毒，103EID50IBV；103EID50IBDV，尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。接种后密封针孔。37℃孵育至120h。收取30～120h的死胚和活胚。4℃冷冻4～24h后，分别以无菌方式收取鸡胚尿囊液和胎儿及尿囊膜。将收获的胎儿和尿囊膜制成组织匀浆。经200目铜纱过滤或以5000r/min离心20min，收取滤过液或上清，与收取的尿囊液混合，加入等体积冻干保护剂冷冻干燥即为冻干鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三联活疫苗。
本发明中采用9～11日龄SPF鸡胚作为制苗用；有关试验采用SPF鸡及普通养鸡场的蛋鸡。实验1制苗工艺研究
采用NDV LaSota、IBV H120及IBDV B87三种弱毒株制备三联疫苗，如采用同胚同时接利，其技术关键是确定三种病毒的接种比例，经反复试验，共对九种不同比例的配方进行了试验，要求采用的配方接利鸡胚后，鸡胚不得过早死亡，才能保证三种病毒充分繁殖，经对九种配方的比较试验，其中只有A配方、即每胚同时接种ND LaSota株104EID50、IBV H120103EID50IBDV B87 103EID50，在接种后，鸡胚死亡高峰期为72～96h，收获的尿囊液ND血凝价(HA价)可达到1∶1024。ND EID50可达到8.5。IBV H120达到6.5、IBDV B87达到5.5。均达到了三种单苗规程规定的标准。采用该配方。试制备了3批实验室疫苗，5批扩大试验疫苗。经实验室试验和田间试验，从试验结果来看，均可达到三种单苗规程的质量标准。1最佳接种种毒配方筛选将三种生产用种毒根据毒价，以不同比例的配比配制成联合毒液，接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育。收获接种后30～120h的死胚和活胚。以无菌方式分别收取胚液和胎儿及尿囊膜；将尿囊膜和胎儿制成组织匀浆，经200目铜钞网过滤或5 000r/min离心后，取滤过液或上清液与收取的尿囊液混合，即为三联抗原。
为了确定最佳接种配方。将各组尿囊液首先测定ND HA价，初步筛选合理配方，在此基础上，将HA价达到1∶512以上的配方组制成三联抗原，并取样用NDV、IBV、IBDV阳性血清分别中和后接种鸡胚测定三种病毒的EID50，确定最佳的接种配方。2 制苗工艺研究 在制苗工艺研究中对9种种毒配方进行了试验，首先以新城疫病毒HA作为标准对9种种毒配比接种鸡胚后收获的尿囊液测定HA，对9种配方进行初选。对于HA价达到1∶512以上的配方组，再分别用3种阳性血清中和后分别测定三联抗原中，NDV LaSota、IBV H120、IBDV B87的EID50。并以此指标作为最终标准筛选最佳的接种配方，试验结果见表1。
表1九种接种配方的试验结果
| 配方号 | 配方含毒量(EID50) | 收获胚液中三种病毒的浓度 | |||
| NDV(HA) | NDV(EID50) | IBV(EID50) | IBDV(EID50) | ||
| A | NDV 104、IBV 103、IBDV 103 | 1024 | 8.5 | 6.5 | 5.5 |
| B | NDV 103、1BV 103、IBDV 103 | 512 | 7.5 | 6.5 | 5.5 |
| C | NDV 102、IBV 103、IBDV 103 | 32 | - | - | - |
| D | NDV 104、IBV 104、IBDV 103 | 256 | - | - | - |
| E | NDV 104、IBV 103、IBDV 103 | 512 | 8.5 | 6.0 | 4.5 |
| F | NDV 104、IBV 102、IBDV 103 | 1024 | 8.5 | 5.0 | 4.5 |
| G | NDV 104、IBV 104、IBDV 104 | 128 | - | - | - |
| H | NDV 104、IBV 104、IBDV 103 | 256 | - | - | - |
| I | NDV 104、IBV 104、IBDV 102 | 512 | 8.0 | 6.5 | 4.0 |
根据表1的试验结果，决定采用A配方作为最终接种种毒配方。3 疫苗的半成品检验 将制备好的三联毒液按常规进行无菌检验。
在病毒含量测定时，将毒液用生理盐水做10-3稀释，分别用ND、IB、IBD中和血清中和成单价毒液。并测定3种病毒的EID50，要求每0.1ml含NDV在108以上EID50；IBV 106以上EID50；IBDV 105以上EID50。4成品检验 将冻干疫苗用生理盐水做10-3稀释，用NDV、IBV、IBDV中和血清分组进行中和。使成单价疫苗，再按三种单苗规程的要求进行成品检验，即NDV每0.1ml含108以上EID50；IBV含106以上EID50；IBDV含105以上EID50。三批实验室疫苗的抗原含量测定 将三批疫苗用三种病毒阳性血清分别中和后，分别测定三种病毒的EID50，结果见表2。
表2三批实验室疫苗的抗原含量测定结果
| 疫苗批号 | EID50/0.1ml | ||
| NDV | IBV | IBDV | |
| 9701 | 9.10 | 6.90 | 6.70 |
| 9702 | 9.50 | 6.50 | 5.50 |
| 9703 | 8.71 | 7.10 | 5.70 |
按照确定的A配方，连续制备了3批疫苗并对其进行了相关试验。实验2 3批疫苗的效力试验
将3批疫苗采用点眼、滴鼻方式免疫10日龄SPF鸡，免疫后30天采血，测定抗体效价。其中NDV测HI抗体价、IBDV测定琼脂扩散沉淀试验(AGP)阳性率、IBV在免疫后测血清中和抗体价，并进行强毒攻击结果见表3。
表3 三批疫苗的效力试验结果
实验3 免疫期试验
| 疫苗批号 | NDV(HI价) | IBV(血清中和价) | IBDV(AGP) | 攻毒保护 | ||
| NDV | IBV | IBDV | ||||
| 9701 | 1∶32 | 1∶13 | 83.3％ | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| 9702 | 1∶32 | 1∶18 | 100％ | 5/5 | 4/5 | 5/5 |
| 9703 | 1∶32 | 1∶13 | 62.5％ | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| 对照 | - | - | - | 0/5 | 2/5 | 0/5 |
将9701、9702、9703三批疫苗点眼滴鼻免疫SPF鸡，另外将9701批疫苗采用饮水免疫方式免疫SPF鸡，免疫后30、90、120天采血测定抗体效价。其中NDV测HI抗体价。IBDV测定AGP阳性率，IBV在免疫后30天测血清中和抗体价。结果见表4、表5、表6。
表4 三批疫苗点眼滴鼻免疫后的免疫期
| 疫苗批号 | NDV(HI价) | IBDV(AGP) | IBV(中和价)30d | ||||
| 30d | 90d | 120d | 30d | 90d | 120d | ||
| 97019702 | 1∶321∶32 | 1∶81∶8 | 1∶81∶8 | 83.3％100％ | 33％33％ | 33％- | 1∶131∶18 |
| 9703 1∶32 | 1∶8 | 1∶8 | 62.5％ | 33％ | - | 1∶13 | |
表5 9701批疫苗饮水免疫后的免疫期
| 免疫天数 | NDV(HI价) | IBDV(AGP) | IBV(中和价) |
| 19 | 1∶64 | 75％ | - |
| 30 | 1∶32 | 100％ | 1∶13 |
| 55 | 1∶16 | 61.9％ | - |
| 63 | 1∶16 | 53.1％ | - |
| 162 | 1∶16 | 20％ | - |
表6三批疫苗免疫后一年对新城疫病毒的攻毒保护
实验4 最小免疫剂量测定
| 疫苗批号 | 鸡数 | 免疫时间 | NDV攻毒保护 |
| 9701 | 10 | 12个月 | 9/10 |
| 9702 | 7 | 12个月 | 6/7 |
| 9703 | 2 | 12个月 | 2/2 |
| 9701(饮水) | 15 | 14个月 | 14/15 |
| 对照 | 3 | 12个月 | 0/3 |
将9803批三联苗按照，一个剂量，1/10剂量。1/100剂量分别免疫一周龄SPF鸡，免疫后26天采血测定抗体效价。30天分别用三种强毒进行攻击。确定最小免疫剂量。结果见表7。
表7 三联苗免疫剂量测定结果
实验5三联苗中三种病毒的相互干扰试验
| 免疫剂量 | NDV(HI价) | IBV(HI价) | IBDV(AGP) | 攻毒保护 | ||
| NDV | IBV | IBDV | ||||
| 一个剂量 | 1∶256 | 1∶9.2 | 80％ | 9/9 | 9/9 | 9/9 |
| 1/10剂量 | 1∶128 | 1∶28.5 | 100％ | 9/9 | 9/10 | 9/9 |
| 1/100剂量 | 1∶73.4 | 1∶35.9 | 80％ | 9/9 | 9/10 | 9/9 |
| 对照 | - | - | - | 0/5 | 0/8 | 0/5 |
将9805批三联苗用NDV、IBV、IBDV中和血清中和成单苗与未中和三联苗以及抗原含量相同的ND、IB、IBD单苗分别免疫7日龄SPF鸡。测定三联苗中三种种毒的相互干扰作用、结果见表8。
从结果来看除H120抗体效价稍低于单价疫苗外，ND、IBD抗体效价未见降低，说明三种同胚繁殖的病毒在同时免疫鸡后，基本无相互干扰作用。实验6三联苗的扩大试验
用连续制备的五批疫苗，批号分别为9801、9802、9803、9804、9805并进行了以下试验。1批扩大试验疫苗的效力及安全试验 在安全试验中，将五批疫苗按10个使用剂量接种7日龄SPF鸡，观察10天未见不良反应。
效力试验采用EID50测定方法，测定结果见表9。
表8三联苗中三种种毒干扰试验结果
| 组别 | 抗体效价 | ||
| NDV(HI) | IBV(中和价) | IBDV(AGP) | |
| 三联苗 | 1∶32 | 1∶24 | 100％ |
| 三联苗中和后NDV | 1∶24.25 | - | - |
| 三联苗中和后IBV | - | 1∶27 | - |
| 三联苗中和后IBDV | - | - | 100％ |
| ND单苗 | 1∶24 | - | - |
| IB单苗 | - | 1∶32 | - |
| IBD单苗 | - | - | 80％ |
表9五批扩大试验三联苗的效力测定结果
2 三联苗的田间试验 将9801、9802、9803三批三联苗在北京西郊农场正发畜禽公司进行田间试验，共免疫12000羽蛋鸡以确定生产用免疫程序，并试验其免疫效果。
| 疫苗批号 | 效 检(EID50) | ||
| NDV | IBV | IBDV | |
| 9801 | 9.1 | 6.1 | 5.9 |
| 9802 | 9.5 | 7.5 | 5.5 |
| 9803 | 9.5 | 7.3 | 5.1 |
| 9804 | 9.5 | 7.25 | 6.0 |
| 9805 | 9.0 | 7.1 | 6.1 |
免疫程序为，9日龄滴鼻点眼首免，25日龄饮水二免。第一次免疫(首免)后9d、18d，第二次免疫(二免)后10天、25天采血测定NDV、IBDV抗体效价，二免后25天取部分鸡在实验室分别用三种强毒进行攻击。三联苗的田间试验 将9801、9802、9803三批三联苗在北京西郊农场正发畜禽公司进行田间试验，共免疫鸡12000羽，免疫程序为9日龄滴鼻点眼首免，25日龄滴鼻点眼二免，免疫后不同时间采血测定抗体效价，并于二免后25天取部分鸡进行强毒攻击。结果见表10。
表10 三批扩大试验三联苗的田间试验结果
| 疫苗批号 | 鸡数 | 首免后9天 | 首免后18天 | 二免后10天 | 二免后25天 | 攻毒保护 | ||||||
| NDV(HI) | IBDV(AGP) | NDV(HI) | IBDV(AGP) | NDV(HI) | IBDV(AGP) | NDV(HI) | IBDV(AGP) | NDV | IBV | IBDV | ||
| 9801 | 4000 | 1∶64 | - | 1∶57 | 50％ | 1∶154 | 100％ | 1∶60 | 100％ | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| 9802 | 4000 | 1∶60 | - | 1∶48 | 50％ | 1∶164.7 | 100％ | 1∶104 | 100％ | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| 9803 | 4000 | 1∶54 | - | 1∶45.3 | 50％ | 1∶186.8 | 100％ | 1∶119 | 100％ | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
实验7三联苗的6个月保存期试验
将在2～8℃和-20℃保存6个月的9801、9802、9803批三联疫苗分别用NDV、IBV、IBDV中和血清中和后测定三种病毒的EID50结果见表11。
表11 三批扩大试验三联苗的6个月保存期试验
| 疫苗批号 | 病毒 | 原EID50 | 2-8℃保存6个月EID50 | -20℃保存6个月EID50 |
| 9801 | NDV | 9.1 | 9.1 | 9.1 |
| IBV | 6.1 | 6.0 | 6.0 | |
| IBDV | 5.9 | 5.8 | 5.7 | |
| 9802 | NDV | 9.5 | 9.5 | 9.5 |
| IBV | 6.1 | 6.1 | 6.0 | |
| IBDV | 5.7 | 5.5 | 5.7 | |
| 9803 | NDV | 9.0 | 9.0 | 9.0 |
| IBV | 7.1 | 7.1 | 7.1 | |
| IBDV | 6.1 | 6.1 | 5.5 |
从保存期测定结果看，在2-8℃保存6个月三种病毒的毒价未见明显下降。
Claims (1)
1.一种鸡用三联活疫苗，其特征在于该活疫苗是用鸡新城疫病毒IV系、鸡传染性支气管炎病毒H120株、鸡传染性法氏囊病病毒B87株同时接种到同一枚9～10日龄的SPF鸡胚尿囊腔内，37℃孵育至120h；收取30～120h的死胚和活胚，4℃冷冻4～24h后，分别以无菌方式收取鸡胚尿囊液和胎儿及尿囊膜，将收获的胎儿和尿囊膜制成组织匀浆，经200目铜纱过滤或以5000r/min离心20min，收取滤过液或上清，与收取的尿囊液混合，加入等体积冻干保护剂冷冻干燥即为冻干鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三联活疫苗；该活三联疫苗中病毒含量分别为鸡新城疫病毒IV系的EID50可达到8.5～9.5、鸡传染性支气管炎病毒H120 EID50可达到6.1～7.5、鸡传染性法氏囊病病毒B87 EID50可达到5.0～6.7。
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