DK174167B1 - Vaccine - Google Patents

Description

i DK 174167 B1

Bovin virusdiarrévirus (BVDV) er yderst almindeligt hos kvæg i Storbritannien, det øvrige Vesteuropa, Nordamerika, Australien og Afrika. Infektion med dette virus kan resultere i forskellige syndromer og patologier, der i vid udstrækning påvirkes af dyrets alder, når det in-5 ficeres for første gang. Hos unge, ikke tidligere inficerede kalve forårsager viruset en forbigående infektion. Denne er forbundet med leukopenia og en interrelateret periode med immunsuppression og forøget modtagelighed for infektioner med andre mikroorganismer. BVDV er efter RSV (respiratorisk syncytial virus) sandsynligvis det mest betydningsfulde 10 virus i forbindelse med udbrud af respiratorisk sygdom hos unge, op-staldede kalve, og p.g.a. sin immunsuppressive virkning kan det være involveret i andre infektioner hos kalve, fx. enteritis. Dette virus anses også for at bidrage væsentligt til sygdom hos kalve i USA og Canada, der opfedes på marken ("feedlot"-kalve). Efter restitution udviser dyrene en 15 vis immunitet over for reinfektion. Denne immunitet synes imidlertid ikke at være absolut eller livsvarig.

Mere alvorlige problemer opstår ved infektion af drægtige køer. Resultatet kan være abort, eller alternativt kan der optræde deformiteter i det fuldbårne foster. Disse deformiteter kan stamme fra udsættelse for 20 virus på et tidspunkt, hvor immunkompetens er under udvikling, og kunne være resultatet af en ufuldstændig immunrespons. Infektion af fosteret før udvikling af immunkompetens kan resultere i, at fosteret forbliver viræmisk gennem hele fosterudviklingsperioden, og at kalven efter fødselen bliver ved med at være viræmisk med en ikke-cytopatogen form af vi-25 ruset og specielt immuntolerant over for BVDV gennem hele livet. Sådanne kalve er de dyr, der senere dør af slimhindesygdomme, en hændelse, der udløses af superinfektion med en cytopatogen variant af BVDV.

Det er blevet anslået, at ca. 0,4% af tilsyneladende normale kødkvægkalve i Storbritannien er viræmiske, og på farme er disse dyr en ho-30 vedkilde til infektion.

Traditionelt opdeles virusvacciner i to kategorier: levende vacciner, der indeholder levende viruser, som er blevet behandlet eller dyrket (afsvækket) på en sådan måde, at de bliver mindre patogene, og vacciner, der indeholder dræbte (i nakti verede) viruspartikler. I forbindel-35 se med BVDV kan viruserne selv være cytopatogene eller ikke-cytopatoge-ne. Principielt kunne der således forekomme fire hovedkategorier af BVDV-vaccine, selvom langt de fleste kommercielle vacciner er baseret på det cytopatogene virus. Det er desuden en udbredt opfattelse, at levende DK 174167 B1 2 vacciner er uacceptable, da levende cytopatogene vaccinestammer i permanent viræmiske dyr kan føre til døden p.g.a. slimhindesygdom, og da levende ikke-cytopatogen virusvaccine kan inficere fosteret i drægtige køer og føre til en hvilken som helst af de ovenfor anførte sygdomme.

5 US 3.869.547 beskriver kalvediarrévacciner fremstillet ved at lade kalvediarrévirus opnået fra fæces fra inficerede kalve passere igennem vævskultur fra en til ca. 250 gange. Anvendelsen af Qui1 A (et varemærke) som adjuvans beskrives ikke i dette skrift.

På farme er infektion via åndedrætssystemet sandsynligvis den mest 10 betydningsfulde smittevej for viruset, og beskyttelse mod spredning ad denne vej må forventes at have en overordentiig gavnlig virkning i forbindelse med kontrol af sygdom, der skyldes BVDV.

Parenteral vaccination med inaktiveret BVDV beskyttede mod respiratorisk infektion. I et forsøg var alle 5 vaccinerede kalve resistente 15 over for smitte ad respiratorisk vej, og alle 5 kontroldyr blev inficeret .

De dræbte BVDV-antigener, der testedes, bevirkede produktion af høje titere af neutraliserende antistoffer. Det blev påvist, at de steg fra mindre end 50 før vaccination til 2.000-10.000 enheder eller mere 20 efter vaccination.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en vaccine omfattende et dræbt, ikke-cytopatogent virus, hvor viruset er dyrket på en cellelinie stammende fra bovine celler såsom MDBK-cellelinien (Madin Darby Bovine Kidney, Madin & Darby (1958), der kan fås hos ECACC, Salisbury, Wilt-25 shire, UK), og tilsat Quil A som adjuvans. MDBK-celler kan fås fra mange laboratorier verden over. Andre bovine cellelinier, der kan anvendes ved udøvelsen af opfindelsen, omfatter EBL-celler, NM5-celler, LWC874-celler og CTe-celler.

MDBK-cellelinien anvendes fortrinsvis ved passageniveau 147-187, 30 mere foretrukket ved passageniveau 147 til 157, og mest foretrukket ved passageniveau 147. Podevirus fremstilles fortrinsvis ved tilsætning af ca. 106 TCDj.q BVDV (ikke-cytopatogen stamme) til konfluente kulturer af kalvetestikelceller. Kalvetestikelceller foretrækkes til dyrkning af podekulturen, fordi virusudbytter er højere i disse celler, hvorimod anti-35 genudbytter er større i MDBK-celler. Cellerne kan dyrkes i rulleflasker med Eagle's MEM-medium tilsat 7,5% kalvefosterserum, 0,11% natriumbicar-bonat og 0,25% lactalbuminhydrolysat. Efter tilsætning af viruset kan kulturerne vedligeholdes med 50 ml medium, Eagle's BME tilsat 2% kalve- DK 174167 B1 3 fosterserum, 0,17% natriumbicarbonat, 0,25% lactalbuminhydrolysat og 0,6% magnesiumchloridhexahydrat. Kulturen kan inkuberes ved ca. 36°C i 5 til 9 dage, fortrinsvis i 7 dage, og dernæst underkastes en enkelt ned-frysnings-/optøningscyklus. Suspensionen kan centrifugeres ved ca. 500 g 5 i 4 til 6 minutter, fortrinsvis i 5 minutter, til fjernelse af grove affaldspartikler, og supernatantfluidet kan i brugsklar tilstand opbevares ved ca. -70°C i små volumener. Titeren af det opbevarede podevirus kan bestemmes ved analyse i kulturer af kalvetesti kel celler.

Virusantigen fremstilles ved tilsætning af ca. 1 ml podevirus inde-10 holdende ca. 106 TCD^q BVDV, til kulturer af MDBK-celler. Disse celler kan dyrkes i rulleflasker med Eagle's MEM, 10% kalvefosterserum og 0,11% natriumbicarbonat og anvendes efter ca. 4 dages vækst, når kulturerne har en konfluens på ca. 75%. Efter tilsætning af viruset kan kulturen vedligeholdes med 125 ml BME-medium (se ovenfor). Syv dage senere, når 15 kulturen indeholder ca. 108 celler og en virustiter på ca. 108,5 TCD5Q, tilsættes /1-propiolacton til en koncentration på 1 til 500, og flasken rulles i 3 timer ved 36°C til inaktivering af viruset. Fuldstændig inaktivering af antigenpræparatet kontrolleres ved at lade prøver passere gennem kulturer af kalvetestikelceller. Antigenet opbevares ved -20°C.

20 Før cellekulturer anvendes til fremstilling af podevirus og virusantigen, kontrolleres de for tilstedeværelsen af tilfældigt forekommende BVDV. Kalvefosterserum kontrolleres for fravær af virus og BVDV-anti-stof.

En dosis af vaccinen fremstilles ved blanding af 1 mg "Quil A" (et 25 varemærke; Superfos A/S, Danmark) i form af 50 β] forrådspræparat (20 mg/ml i vand) og 4 ml beta-propiolacton-i naktiveret virus. Denne blanding injiceres subkutant bag skulderen i ca. 3 måneder gamle kalve, der påviseligt var fri for BVDV-antistof, både for antistof stammende fra moderdyret og for antistof produceret som følge af infektion.

30 Vaccinerede kalve udviste antistofrespons (tabel 1), bestemt ved ELISA-testen (Howard, Clarke & Brownlie, 1985), der påvistes 6 uger efter den første vaccination. Disse dyr og uvaccinerede kontroldyr smittedes med en stamme af BVDV (11249nc), der blev valgt pga. sin tropisme for åndedrætssystemet og sin stabile naso-faryngale afgivelsesrate. Kal -35 ve inficeredes intranasalt i ottende uge. Virusafgivelse bestemtes ved undersøgelse af naso-faryngale tamponprøver (blod blev også testet) i op til 10 dage efter smitning, og prøverne analyseredes i kalvetesti kel cel -lekulturer. BVDV blev udvundet fra kontroldyrene (tabellerne 2, 3), men DK 174167 B1 4 ikke fra den vaccinerede gruppe. Forholdet for de enkelte dyr mellem antistofniveauer på smittetidspunktet og modtageligheden over for infektion er vist i tabel 3. I intet af kontroldyrene kunne der påvises antistof på smitningstidspunktet, og de blev alle inficeret og serokonverte-5 ret (tabel 1).

BVDV-antigen kan anvendes sammen med andre mikroorganismer (fortrinsvis inaktiverede) til dannelse af en multivalent vaccine. Egnede organismer omfatter respiratorisk syncytial virus, parainfluenza 3 virus og Mycoplasma bovis.

10 I stedet for at anvende helt virus kan det være fordelagtigt at ad skille antigenerne fra viruset og anvende dem sammen med Quil A, eventuelt sammen med egnede bærere o.lign. Dette kan opnås på kendte måder.

15 Tabel 1

Antistofresponser ved ELISA-testning1 i kalve vaccineret med stamme

Kyl203nc 20 Gruppe Antal Ugez kalve 03 6 8 10 12

Uvaccineret 5 1,4 ND ND 1,4 2,09 2,50 +0,60 +0,12 25 Vaccine- standarddosis 5 1,4 1,4 3,07 3,52 4,38 4,09 +0,30 +0,13 +0,25 +0,29

30 1 gennemsnitligt antal enheder antistof (10n) + SD

z kalve vaccineret i uge 0, 3 og 6; smittet intranasalt i uge 8 med stamme 11249nc DK 174167 B1 5

Tabel 2

Virkning af vaccination med stamme Kyl203nc på infektion med BVDV 5

Gruppe Antal Antal inficerede kalve1 kalve på den anførte dag O 4 6 8 10 10 Uvaccineret 501510

Vaccine- standarddosis 500000 15 1 I sol ater fra nasofaryngale tamponprøver DK 174167 B1 6

Tabel 3

Forhold mellem antistof på smitningstidspunkt og modtagelighed for infektion i individuelle dyr 5

Dyr Vaccine1 Antistof2 Virus- % Leucopenia4

Kode nr. isolat3

Nasof. prøve Blod 10 X502 S 3,71 - - 5 A21 S 3,57 - - 0 X694 S 3,51 - - 0 X657 S 3,42 - - 0 X684 S 3,38 - - 5 15 A10 - 1,4 + - 46 A407 - 1,4 + + 48 X192 - 1,4 + + 53 X658 - 1,4 + + 52 X659 - 1,4 + + 54 20 _________________________ 1 Dyr, der fik standarddosis (S) eller ingen vaccine (-) 2 Enheder af antistof (10n) ifølge ELISA-testning på dagen for smitte, dyr anført i faldende orden 3 Isolater fra nasofaryngal tamponprøve som i tabel 2, isolater fra 25 blod på dag 6 4 Procent reduktion i celletælling, sammenlignet med gennemsnittet af 3 præinokulationsværdier MDBK (Madin-Darby bovin nyre) cellelinien har i ca. 25 år kunnet 30 fås fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA som ATCC CCL 22 . Siden 1982 har denne linie været BVD-fri. Ligesom MDBK fra en anden kilde har samme cellelinie også kunnet fås fra European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, UK under løbenummeret ECACC 85102401. En prøve af sidstnævnte depot blev 35 d. 2. august 1989 deponeret hos ECACC i overensstemmelse med Budapest-traktatens bestemmelser under løbenummeret 89080201.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine omfattende følgende trin: (a) dyrkning af ikke-cytopatogent bovin virusdiarrévirus 5 (BVDV) i en cellelinie stammende fra bovine celler, (b) inaktivering af virus fra trin (a), og (c) blanding af virusafledt materiale fra trin (b) med Quil A.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor cellelinien omfatter MDBK,

10 EBL, NM5, LWC874 eller CTe celler.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor cellelinien omfatter MDBK-celler.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor cellelinien indledningsvis inokuleres med BVDV dyrket i kalvetesti kel cel1 er.

5. Fremgangsmåde ifølge til et hvilket som helst af de foregående 20 krav, hvor det virusafledte materiale omfatter hele viruser. 1 ' i Vaccine, der er virksom over for bovin virusdiarrévirus (BVDV) infektion, omfattende inaktiveret ikke-cytopatogent BVDV og Quil A som adjuvans derfor. 25