CN116925194A - 一种猪δ冠状病毒S1蛋白的中和抗原表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位及其应用，其中猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明针对PDCoV免疫显性结构域S1‑CTD区域，利用细胞融合以及亚克隆筛选，成功获得了一株针对PDCoV S1‑CTD蛋白的单克隆抗体4E‑3，并利用肽扫描技术鉴定出单克隆抗体4E‑3识别的抗原表位为²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸，为PDCoV疫苗设计、抗病毒药物及抗体检测试剂盒的研发提供重要的理论及物质基础。

Description

一种猪δ冠状病毒S1蛋白的中和抗原表位及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位及其应用。

背景技术

根据系统发育关系和基因组结构，可将冠状病毒分为四个属：α、β、γ和δ属。猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)属于δ属，其临床症状与其它三种猪α冠状病毒相似，包括：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)，均可导致哺乳仔猪严重腹泻、呕吐、脱水和死亡。PDCoV具有广泛的宿主嗜性，可感染犊牛、鸡、火鸡和老鼠，更重要的是，Lednicky J A等人最近报道了三例海地儿童感染PDCoV的病例。这些发现表明了该病毒具有在种间传播的潜力，可能对人类健康造成威胁。因此，迫切需要研制安全有效的疫苗及抗病毒药物，以帮助控制PDCoV的流行。

PDCoV基因组长度约为25kb，编码的蛋白质包括：ORF1a/b、纤突蛋白(spikeprotein，S)、小膜蛋白(small membrane protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)、非结构蛋白6(nonstructural protein 6，NS6)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、非结构蛋白7(nonstructural protein 7，NS7)和非结构蛋白7a(nonstructural protein 7a，NS7a)。S蛋白是冠状病毒表面的三聚体1型糖蛋白。在感染过程中，宿主蛋白酶将S蛋白裂解成Sl和S2亚基。S1蛋白参与受体的识别和结合，包含C端和N端结构域(分别为S1-CTD和S1-NTD)。S2亚基介导病毒与细胞膜的融合。研究发现疫苗诱导的中和抗体强弱与冠状病毒感染易感动物后的病毒载量高低之间有很强的相关性。冠状病毒S蛋白是主要诱导宿主机体产生中和抗体的结构蛋白，因此S蛋白常作为冠状病毒疫苗研究的一个关键靶蛋白。PDCoVS蛋白中S1-NTD(aa50 -286)、S1-CTD(aa278 -616)和S2(aa601 -1087)三个区域已被证实均可以诱导机体产生中和抗体，其中S1-CTD是主要的免疫显性结构域，可诱导产生较其它两个区域更强的中和抗体，因此S1-CTD区域是PDCoV疫苗开发的一个关键靶点。

预防性疫苗的本质是通过人为引入病毒抗原，利用自身免疫系统，对靶抗原的表位进行识别、免疫放大及记忆，进而产生持久且特异的体液及细胞免疫。因此，一种理想的疫苗是能够有效唤起免疫系统的体液和细胞免疫。然而，研制CoVs疫苗的一个重要安全问题是抗体依耐增强效应(antibody-dependent enhancement，ADE)。病毒入侵后，机体会产生特异性中和抗体，抑制病毒感染细胞，但在特定情况下，病毒与非中和抗体或亚中和抗体结合，反而促进病毒感染细胞，这种现象被称为ADE。目前大量研究表明当机体产生过多的非中和抗体，或者体内中和抗体水平较低时，病毒的再次感染就有可能会引起ADE效应。因此，诱导高效中和抗体产生，减轻ADE的不良影响，是冠状病毒疫苗研究的一个重要方向。为了避免ADE效应，基于表位的疫苗或强中和性单克隆抗体是很好的选择，但目前还缺乏基于PDCoV的S1-CTD区域表位的研究，以获得安全高效的疫苗或抗病毒药物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。

本发明还提供了一种前述表位肽在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。

本发明还提供了一种预防猪δ冠状病毒的疫苗，它是以前述的表位肽为抗原，加上药学上可接受的载体制备而成的疫苗。

进一步地，所述载体为具有免疫原性的蛋白载体；所述蛋白载体包括钥孔血蓝蛋白。

本发明还提供了一种前述疫苗的制备方法，它包括如下步骤：取前述的表位肽，与钥孔血蓝蛋白偶联，即得。

本发明还提供了一种单克隆抗体，它是经猪δ冠状病毒S1-CTD蛋白激活后的B细胞，与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生并分泌的抗体。

进一步地，所述抗体识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S^280-288；所述表位S^280-288的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。

本发明还提供了一种制备前述单克隆抗体的方法，它包括如下步骤：

取杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔，5～8d抽取腹水，离心，取上清液采用硫酸铵盐析法提取，提取液用Protein G亲和层析柱纯化，即得；

所述杂交瘤细胞是猪δ冠状病毒S1-CTD蛋白激活后的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的能产生并分泌识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S^280-288的细胞；所述S^280-288表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。

进一步地，所述小鼠为BALB/c小鼠。

本发明还提供了一种前述单克隆抗体在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。

本发明最后提供了一种预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物，它是以前述的单克隆抗体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明所述“猪δ冠状病毒S1-CTD蛋白”是猪δ冠状病毒S蛋白S1亚单位的C端结构域，一般认为S1-CTD结合蛋白类受体。

本发明针对PDCoV免疫显性结构域S1-CTD区域，利用细胞融合以及亚克隆筛选，成功获得了一株针对PDCoV S1-CTD蛋白的单克隆抗体4E-3，经病毒中和试验及噬斑减少中和试验证明，该单克隆抗体能够在体外中和PDCoV，其IC50分别为3.612μg/mL与3.155μg/mL。此外，利用肽扫描技术鉴定出单克隆抗体4E-3识别的抗原表位为²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸。序列比对显示，该表位在PDCoV毒株中高度保守，但与其他猪冠状病毒(PEDV、TGEV、猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)、SADS–CoV、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)序列相似性较低，具有作为PDCoV诊断靶点的潜力。重要的是，与KLH偶联的S^280-088表位(²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸)可以在小鼠体内诱导出强效的PDCoV特异性中和抗体，并且KLH-S^280-288免疫也可以诱导高效的中和抗体，减少仔猪在PDCoV挑战后的粪便病毒脱落。单克隆抗体4E-3的制备及其抗原表位的鉴定，为PDCoV疫苗设计、抗病毒药物及抗体检测试剂盒的研发提供重要的理论及物质基础。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1PDCoV S1-CTD蛋白的表达、纯化及western blot验证(A：PDCoV S1-CTD蛋白的表达、纯化；M：蛋白Marker；1：pET32a(+)空载；2：pET32a-S1-CTD未诱导；3：诱导后超声破碎后全菌；4：超声破碎后上清液；5：超声破碎后包涵体；6：纯化后包涵体；B：PDCoV S1-CTD蛋白的western blot验证。M：蛋白Marker；1：pET32a(+)空载；2：纯化后包涵体)；

图2单克隆抗体4E-3间接免疫荧光分析；

图3中和试验结果(A：采用基于ELISA的病毒中和试验；B:PRNT法检测单克隆抗体4E-3的中和活性)

图4杂交瘤细胞株稳定性和单抗亚型测定结果(A：阳性杂交瘤细胞株4E-3分泌单抗稳定性的测定；B：单抗亚型鉴定)

图5单克隆抗体4E-3抗原表位的初步鉴定(A：PDCoV S1-CTD蛋白截短表达示意图，绿色部分为单克隆抗体4E-3可识别蛋白；B：PDCoV S1-CTD截短表达蛋白SDS-PAGE分析及western blot检测；M，Maker；1-6，CTD-1、CTD-2、CTD-3、CTD-4、CTD-5和CTD-6；C和D：Western blot及dot blot检测单克隆抗体所识别的PDCoV S1-CTD截短表达蛋白；1-6，CTD-1、CTD-2、CTD-3、CTD-4、CTD-5和CTD-6；E和G：PDCoV S1-CTD截短表达蛋白：His-S^50-290、His-S^315-422及His-S^50-327的SDS-PAGE分析及western blot检测。M，Maker；1-3，His-S^50-290、His-S^315-422及His-S^50-327；F：Western blot检测单克隆抗体4E-3所识别的PDCoV S1-CTD截短表达蛋白；1-3，His-S^50-290、His-S^315-422及His-S^50-327)；

图6单克隆抗体4E-3识别表位及其关键氨基酸的鉴定(A：单克隆抗体4E-3表位识别合成多肽示意图；B：丙氨酸突变扫描多肽合成示意图；C：Dot blot验证单克隆抗体4E-3所识别的表位；D和E：Dot blot及间接ELISA验证单克隆抗体4E-3识别表位的关键氨基酸)；

图7抗原表位S^280-288序列在PDCoV毒株、δ-CoVs及猪源CoVs中的保守性分析(A，抗原表位S^280-288序列在PDCoV毒株中的保守性分析；B，抗原表位S^280-288序列在δ-CoVs中的保守性分析；C，抗原表位S^280-288序列在猪源CoVs中的保守性分析)

图8PDCoV S^280-288表位肽在小鼠体内的主动免疫效果评价(A：实验时间示意图，在第0周、第2周和第4周注射等量的KLH-S^280-288，并于每周收集血清；B：KLH-S^280-288免疫小鼠后PDCoV的特异IgG抗体及中和抗体产生的动力学研究；C，PDCoV特异的IgG抗体与中和抗体的相关性分析；D，噬斑减少中和试验测定小鼠二免后2周血清中和抗体水平；E，根据图D中噬斑的数量进行曲线拟合，计算中和抗体效价)；

图9免疫KLH-aa^280-288后猪的体液免疫和IFN-γ应答(A：实验时间示意图，仔猪在第0周和第2周注射等量的KLH-S^280-288，于第4周挑战PDCoV。B：KLH-aa^280-288免疫组和对照组PDCoV特异IgG抗体水平；C：噬斑减少中和试验测定测定PDCoV中和抗体滴度；D：ELISpot法检测IFN-γ反应。KLH-aa^280-288或aa^280-288表位肽刺激不同组PBMCs的代表性ELISpot图像；不加刺激物的PBMCs作为阴性对照，用ConA刺激的PBMCs作为阳性对照；E：利用柱状图表示KLH-aa^280-288或表位肽aa^280-288刺激的不同组的PBMCs细胞形成的IFNγ斑点数。统计差异用*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001，****p值<0.0001表示)；

图10KLH-S^280-288免疫对挑战PDCoV仔猪的保护效果评价。(A：荧光定量PCR对免疫组及对照组仔猪粪便拭子中的病毒含量的检测；B：荧光定量PCR对免疫组及对照组仔猪肠组织中的病毒含量的检测；C：HE染色检测攻毒仔猪组织病理变化；D：免疫荧光染色检测攻毒仔猪病毒抗原含量。

具体实施方式

实施例1靶向猪δ冠状病毒S1蛋白研究

1、试验材料

1.1细胞、病毒、表达载体及实验动物

SP2/0和ST细胞系、pET32a(+)原核载体、PDCoV四川分离株CHN-SC2015(GeneBank登录号：KY398010)及PDCoV N蛋白单克隆抗体4E88由四川农业大学猪病研究中心保存；6周龄雌性Balb/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2主要试剂

HRP-羊抗鼠IgG和Alexa Fluor 555标记的羊抗小鼠IgG购自购自北京Biossan公司；胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；DMEM培养基购自GIBCOL公司；Montanide^TMGel 01佐剂购自SEPPIC公司；HAT和HT培养基、PEG(MW1400)均购自Sigma公司；小鼠Ig类/亚型鉴定试剂盒购自Proteintech公司。

2方法

2.1 PDCoV S1-CTD蛋白的表达及纯化

复苏已构建的pET32-S1-CTD重组菌，吸取1ml菌液加入到LB培养基中培养，诱导加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG,在37℃条件下诱导8h。5000rpm离心15min收集诱导后的菌液,弃上清后用PBS重悬并洗涤3遍,最后用20ml PBS重悬菌体,使用超声破碎仪破碎菌体；在12000r/min，4℃条件下离心10min，收集沉淀；向沉淀内加入20ml 2M尿素震荡混匀，在同样条件下离心，后依次按照相同步骤加入4M尿素与6M尿素震荡混匀后离心，最终弃上清加入20mL 8M尿素，于漩涡震荡仪上震荡至沉淀溶解，对包涵体进行初步纯化；将溶解有包涵体蛋白的溶液12000r/min离心10min，取上清过滤(0.22μm孔径)，分装于50mL离心管中于-20℃保存备用；按照BIO-RAD公司Bio-Scale Mini Profinity IMAC预装层析柱(#7800811)说明书对重组包涵体蛋白进行纯化。取纯化后的包涵体50μL加入10μL 6×Loading Buffer混合后沸水煮10min后，进行SDS-PAGE电泳鉴定。

2.2PDCoV S1-CTD蛋白的复性

将纯化后的PDCoVS1-CTD蛋白转入透析袋中(将包涵体蛋白测定浓度后稀释成1～2mg/mL，按照包涵体蛋白液与透析缓冲液体积1:50比例进行透析复性)，于4℃下缓慢进行磁力搅拌，在此条件下依次用不同尿素浓度(6mol/L、4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L、0mol/L)的复性缓冲液进行梯度透析复性。复性缓冲液体系(2.7mmol/L KCL，137mmol/L NaCl，2mmol/L KHPO4，10mmol/LNa2HPO4，1mmol/L GSH，0.2mmol/L GSSG，400mmol/L L-精氨酸盐酸盐)，每种透析液的透析时间为6h。透析完成后，测定蛋白浓度，-80℃保存备用。

2.3PDCoV S1-CTD蛋白Western-blot鉴定

将纯化后的PDCoV S1-CTD蛋白进行SDS-PAGE，随后将凝胶取出，同在甲醇中浸泡30s激活的PVDF膜与转膜用滤纸置于转膜缓冲溶液中浸泡15min；利用湿转仪进行转膜，电流200mA转印30min。转膜完毕后，将PVDF膜用甲醇中浸泡5s后用超纯水清洗；加入含5％脱脂奶粉的PBST，室温封闭2h；弃去封闭液，用TBST按每次4min的频率清洗4次。加入用一抗稀释液稀释的猪抗PDCoV多克隆抗体(1:500)，在4℃冰箱内孵育过夜；后用TBST按每次4min的频率清洗4次；加入稀释后的HRP-羊抗猪IgG(1:5000)，室温孵育30min，用TBST清洗4次，每次4min；加底物反应液ECL，利用凝胶成像仪曝光照相。

2.4抗PDCoV单克隆抗体的制备

2.4.1BALB/c小鼠免疫

BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化的PDCoV S1-CTD蛋白进行浓度测定，小鼠的注射剂量为每只50μg，稀释后与Montanide^TM GEL01 ST佐剂进行混合，间隔两周进行加强免疫。免疫程序如下表(表1)。使用建立好的间接ELISA对小鼠抗体效价进行测定。

表1免疫程序

2.4.2基于PDCoV S1-CTD蛋白间接ELISA检测方法的建立

参照瞿欢等猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立.生物技术通报37:273-280.，建立的PDCoV S1-CTD蛋白间接ELISA检测方法进行PDCoV S1-CTD免疫小鼠血清IgG抗体效价的测定及后续单克隆抗体的筛选。最佳条件如下：1μg/100μL的PDCoVS1-CTD蛋白37℃包被2h，用2％BSA在37℃封闭1.5h；血清最佳稀释度为1：50，在37℃反应1h；HRP-羊抗鼠IgG抗体以1：5 000稀释在37℃下作用30min，TMB在37℃显色15min。

2.4.3细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的建立

免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5：1比例混合后加PEG1400融合，于96孔培养板中37℃、CO2培养箱中培养。当杂交瘤细胞的培养液开始变黄，或杂交瘤细胞长满至孔底面积的1/10时，吸取上清液，经PDCoV S1-CTD蛋白间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法对阳性孔进行3次亚克隆，至所有单克隆孔均为阳性为止。将最终获得的单克隆扩大培养后建株，冻存。

2.4.4单抗腹水的制备及纯化

8周龄BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂(每只0.5ml)，7d后将生长状态良好的杂交瘤细胞，以每只约1×10⁶个腹腔注射BALB/c小鼠。7d左右小鼠腹部开始明显膨大，抽取腹水，以10000r/min离心10min除去细胞成分和其他沉淀，收集上清液。利用硫酸铵盐析法对制备的腹水进行粗提，再使用Protein G亲和层析柱进一步纯化得到纯度较高的IgG抗体，后加入0.02％叠氮钠，分装，-80℃保存。

2.5抗PDCoV单克隆抗体的鉴定

2.5.1单抗亚型鉴定

按照亚型鉴定试剂盒操作说明书对以上试验中得到的单克隆抗体进行亚型鉴定。

2.5.2单抗的IFA检测

以PDCoV N蛋白单克隆抗体4E-3作为阳性对照，对本发明筛选的单克隆抗体进行IFA检测。ST细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长2至3d,当细胞在12孔板上长满80％。奇数孔用PDCoV病毒液(0.1MOI)感染,用含10％胎牛血清的DMEM培养,将12孔板孵育20至24h。倒掉培养基,将细胞用PBS洗涤两次,并用4％甲醛固定,然后在室温下用PBST膜通透30min。使用含2％ BSA的封闭液固定细胞1.5h,然后与单克隆抗体在含1％ BSA封闭液中孵育1h。将细胞洗涤3次,并用Alexa Fluor 555标记的羊抗小鼠IgG(在PBST中以1:500稀释)完成染色。使用DAPI对细胞核进行染色，在倒置荧光显微镜下经行观察。

2.5.3阳性杂交瘤细胞株分泌单抗稳定性的测定

将冻存3个月的阳性杂交瘤细胞复苏，24孔细胞板培养，检测上清是否呈阳性来判定复苏的阳性细胞是否有分泌抗体的能力。将经过3次亚克隆的阳性率达100％的杂交瘤细胞进行体外连续传代培养3个月，每隔2周检测1次细胞上清液。

2.5.4单抗中和活性测定

2.5.4.1病毒中和试验

基于ELISA的病毒中和试验如前所述(28)。将2倍稀释的单克隆抗体(从0.73μg/ml到375μg/ml)与等体积200TCID50 PDCoV混合，在37℃下孵育1h。然后将抗体-病毒混合物转移到铺有ST细胞的96孔板孔中，后在37℃下孵育1.5h。随后，清洗去除未结合的病毒。培养72h后，细胞用4％多聚甲醛固定，用0.2％ Triton X-100在室温下通透30min，然后用2％BSA在37℃下封闭2h。以PDCoV N蛋白单克隆抗体4E88作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB显色后，在450nm处测量OD值。IC50定义为：对PDCoV感染50％抑制时的抗体浓度。

2.5.4.2噬斑减少中和试验

将ST细胞接种在六孔板中，并在37℃下用5％ CO₂孵育直至细胞大约90％。将单克隆抗体进行连续稀释(0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml),并将每种稀释液与50PFU的PDCoV菌株在37℃,5％ CO₂下孵育1h。孵育后，将抗体-病毒混合物转移至ST细胞孵育1.5h，轻轻摇动平板(每20min),使接种物均匀分布在整个孔中。用1％低熔点琼脂糖培养基(2×DMEM)覆盖细胞，并在37℃,5％ CO₂下孵育72h。接下来，向每个孔中加入1mL 4％甲醛固定2h，后加入1％结晶紫溶液染色2h，冲洗并计算病毒噬斑数。每种抗体的噬斑计数用于计算斑块的减少百分比如下：％减少＝100×[1-(每个稀释的平均斑块数/病毒对照孔中平均噬斑数)。将斑块数量减少50％用作截断值以确定中和抗体滴度。

2.5.5单抗的抗原表位鉴定

2.5.5.1单抗的抗原表位的初步鉴定

PDCoV S1-CTD蛋白分段表达策略如图(图5A)所示，根据IEDB抗原表位预测在线网站对S1-CTD蛋白B细胞抗原表位预测结果，先将S1-CTD蛋白分为6段进行原核表达，每段之间有部分氨基酸重叠，并且每对引物上游插入Xho I位点，下游插入BamHⅠ位点(表2)。经PCR扩增纯化及酶切后与pET32a(+)载体连接，将质粒转化入Transetta DE3感受态细胞，进行表达，利用western blot以及斑点免疫印迹方法(Dot-blot)对单克隆抗体4E-3所识别的部分进行分析。

表2 PCR所用引物

2.5.5.2单抗识别最小肽段及关键氨基酸的鉴定

为了确定单克隆抗体4E-3所识别到的最小氨基酸序列，送往金斯瑞生物科技有限公司合成8条多肽，多肽的氨基酸序列如图所示(图6A)。通过Dot-blot对多肽进行鉴定。随后，将单克隆抗体4E-3识别的最小肽段的氨基酸序列依次突变为丙氨酸，如图所示(图6B)，通过Dot-blot和间接ELISA方法对单克隆抗体4E-3识别的关键氨基酸进行鉴定。

2.5.6抗原表位同源性分析

利用MEGA-X软件对鉴定的表位与PDCoV参考株的保守性进行分析(表3)。表位序列还使用MEGA-X和DNASTAR与其他δ冠状病毒及猪冠状病毒进行了比对(表4和表5)。

表3用于比对aa^280-288序列在猪δ冠状病毒间同源性的毒株

表4用于比对aa^280-288序列在δ冠状病毒间同源性的毒株

表5用于比对aa^280-288序列在猪冠状病毒间同源性的毒株

2.6PDCoV S^280-288表位肽在小鼠体内的主动免疫效果评价

将鉴定出的抗原表位S^280-288送公司偶联KLH蛋白，-20℃保存备用。将BALB/c小鼠随机分组，每组6只，每只免疫50μg重组蛋白，同时设置了PBS对照组。首次免疫21天后加强免疫一次，每只小鼠免疫50μg相同的重组蛋白，免疫方式为皮下注射。实验期间每隔7天使用毛细管于眼眶静脉丛采血并分离血清，利用PDCoV S1-CTD蛋白间接ELISA抗体检测方法检测特异性血清抗体水平，利用病毒中和试验及噬斑减少中和试验验证免疫后小鼠血清中PDCoV特异的中和抗体水平。

2.7PDCoV S^280-288表位肽在仔猪体内的主动免疫效果评价

2.7.1仔猪免疫程序

选择10头5日龄仔猪(PEDV、TGEV和PDCoV抗体检测阴性)进行主动免疫试验；免疫前先观察2天，正常猪随机分为3组，5头免疫表位肽，3头免疫PBS作为阴性对照，2头作为正常对照。免疫程序：7日龄时首次免疫，14d后(21日龄)第二次免疫，每次每头猪免疫500μgKLH S^280-288表位肽。

2.7.2KLH-S^280-288免疫后体液免疫水平检测

主动免疫后每周进行采血，分离血清。用已建立的基于PDCoV S1-CTD的ELISA检测方法检测血清中的PDCoV特异性的IgG抗体。参照3.5.4.2进行噬斑减少中和试验，其中血清稀释度为1：8-1：256。

2.7.3KLH-S^280-288免疫后细胞免疫水平检测

按照猪外周血淋巴细胞(PBMC)分离试剂盒说明书从免疫组及对照组猪血液中分离PBMC，通过Pig IFN-γELISpot检测试剂盒检测PBMC中T细胞IFN-γ应答。ELISpot板中首先加入稀释于PBS溶液中的包被抗体，并于4℃下孵育过夜，其中IFN-γ实验使用抗猪IFNγ抗体，抗体浓度为10μg/ml，体积为100μl/孔。孵育完成后移去ELISpot板中的抗体并用PBS溶液清洗5遍后加入10％FBS DMEM培养基进行封闭。封闭完成后用PBS清洗孔板，加入分离得到的猪PBMC，细胞数量为10⁵细胞/孔，体积为200μl。之后迅速向PBMC中加入PBS溶液以及蛋白刺激物，并将孔板置于37℃，5％CO₂条件下培养36～48h，使细胞在抗原刺激下充分分泌细胞因子。培养完成后，移去细胞，用PBS清洗孔板5遍后加入检测二抗(生物素)，抗体浓度为1μg/ml，抗体体积为100μl。室温孵育2h后移去抗体并用PBS清洗孔板5遍，加入1:500稀释的Streptavidin-HRP底物，室温孵育1h。移去底物并用PBS清洗孔板5遍后，100μl/孔加入TMB底物，显色5-10min后用清水冲洗并终止反应。每孔中分泌特定细胞因子的细胞数量可通过CTL免疫斑点读数仪扫描得到以用于后续分析。

2.7.4仔猪的攻毒试验

对仔猪进行第2次免疫两周后，即35日龄时，对仔猪进行攻毒试验，免疫组和对照组猪口服接种PDCoV CHN-SC2015感染仔猪的肠道内容物10ml，每头猪接种2×10⁸个病毒RNA拷贝。在我们之前的PDCoV攻毒研究中，我们收集了PDCoV CHN-SC2015感染仔猪的肠道内容物并用PBS稀释，使病毒RNA拷贝数达到2×10⁷/ml。攻毒后对仔猪进行观察，待仔猪发病时进行安乐死，并剖检观察病理变化。

2.7.4.1粪便排毒检测

仔猪攻毒后，每日采集仔猪的肛门拭子，放于装有PBS溶液的试管中。使用已经建立基于PDCoV M基因的荧光定量检测方法检测拭子中的病毒载量，分析仔猪的排毒情况。

2.7.4.2仔猪的病理变化分析

当仔猪攻毒后出现临床症状后对仔猪进行安乐死，并剖杀检测，观察肠道病变情况。剖检仔猪并采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等组织，用无菌剪刀，剪取1-2cm肠组织用4％多聚甲醛在常温下固定48h，然后处理组织样品并采用石蜡进行包被、切片、HE染色、封片，最后放置于显微摄像系统下对切片进行图像采集。同时，采用PDCoV N蛋白单克隆抗体4E88对肠道样品进行免疫荧光分析。

2.7.4.3组织病毒载量检测

剖杀仔猪时采集分装猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠等肠组织各1cm于离心管中，用于肠组织中PDCoV病毒含量的检测。称取0.1g肠组织并加入至2mL的圆底离心管中，加入TIZOL裂解液，用研磨器研磨成匀浆状态。参照生工生物公司总RNA提取试剂步骤进行RNA的提取，将提取的RNA保存在-80℃保存备用。使用已经建立基于PDCoV M基因的荧光定量检测方法检测肠道组织中的病毒载量。

3结果

3.1PDCoV S1-CTD蛋白的表达、纯化及western blot验证

pET32-S1-CTD阳性克隆表达宿主菌经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明PDCoV S1-CTD蛋白与预期目的蛋白大小一致，为56kD，而未诱导的重组菌和Transetta空载对照无相应条带(图1A)。Western blot显示，PDCoV S1-CTD蛋白可与猪抗PDCoV多克隆抗体特异性结合(图1B)，表明PDCoV S1-CTD蛋白成功表达并拥有良好的免疫反应性。经超声破碎发现蛋白主要存在于包涵体，经尿素初步纯化后，根据Ni+-NTA亲和层析说明书进行纯化，得到纯化的目的蛋白与目的蛋白大小一致。

3.2单抗间接免疫荧光(IFA)试验

选择效价较高的小鼠脾脏与SP2/0细胞进行细胞融合，融合后的细胞经过4次亚克隆筛选，最后筛选选出1株杂交瘤细胞(4E-3)进行鉴定。使用纯化后单克隆抗体4E-3作为一抗，利用IFA检测PDCoV感染的ST细胞，结果表明单克隆抗体4E-3可特异的识别PDCoV感染的ST细胞(图2)；PDCoV N蛋白单克隆抗体4E-3作为阳性对照，鼠阴性血清作为阴性对照。

3.3单抗中和活性的鉴定

采用基于ELISA的病毒中和试验和PRNT法检测单克隆抗体4E-3的中和活性。病毒中和试验结果显示，mAb 4E-3能有效中和PDCoV,IC50为3.612μg/Ml(图3A)。通过PRNT进一步评价单克隆抗体4E-3对PDCoV的中和活性。与ELISA结果相似，单抗4E-3的IC50为3.155μg/ml(图3B)。

3.4阳性杂交瘤细胞株4E-3分泌单抗稳定性的测定及单抗亚型鉴定

将冻存细胞株复苏后于6孔培养板中培养，利用PDCoV S1-CTD蛋白间接ELISA方法检测细胞上清液，结果OD450值仍很高。将细胞传代3个月，每隔2周检测1次上清液，结果显示OD450值较稳定(图4A)。将单克隆抗体4E-3进行亚型鉴定。结果表明该单抗为IgG1亚型，轻链为κ链(图4B)。

4.5单克隆抗体4E-3抗原表位的初步鉴定

为了鉴定单克隆抗体4E-3所识别的表位，将PDCoV S1-CTD蛋白进行截短，首先将S1-CTD蛋白截短为6部分进行表达，分别为CTD1、CTD2、CTD3、CTD4、CTD5和CTD6，经过western blot以及dot-blot鉴定后发现mAb4E-3识别CTD1部分，为了进一步定位被单克隆抗体4E-3识别的CTD上的表位，又构建及表达了His-S^50-290、His-S^315-422及His-S^50-327三个重组蛋白，western blot以及dot-blot试验结果表明，单克隆抗体4E-3能够识别His-S^50-290及His-S^50-327两个蛋白，而不能识别His-S^315-422蛋白，因此，初步证实单克隆抗体4E-3可识别短肽²⁷⁸DGFYSDPKSAVRA²⁹⁰(图5)。

4.6单克隆抗体4E-3识别表位及其关键氨基酸的鉴定

为了确定单克隆抗体4E-3所能够识别到的最小氨基酸序列，送往南京金斯瑞生物科技有限公司合成8条多肽，多肽的氨基酸序列如图6所示。通过dot blot证实单克隆抗体4E-3所能够识别到的表位为²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸。将表位²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸的氨基酸序列依次突变为丙氨酸，随后送往南京金斯瑞生物科技有限公司合成多肽，通过dot blot及间接ELISA证实单克隆抗体4E-3识别表位的关键氨基酸为Asp²⁸³,Lys²⁸⁵,and Val²⁸⁸(图6)。

4.6抗原表位S^280-288的同源性比对

为了确定抗原表位S^280-288(²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸)的序列保守水平，选择来自9个国家的25株PDCoV菌株进行序列比对(图7A)，使用MEGA-X和DNASTAR软件进行比较。结果表明，S^{280 -288}序列在PDCoV毒株中高度保守，氨基酸同源性为100％。

选择来自12个物种(人类、哺乳动物和鸟类)的δ-COVs毒株进行序列比对(图7B)。结果表明，PDCoV CHN-2015与人源PDCoV、中国白鼬獾冠状病毒(CFBCoV)和亚洲豹猫冠状病毒(ALCCoV)在S^280-288的序列相似性为100％，与禽冠状病毒在S^280～288序列相似度为11.3％～77.8％。PDCoV CHN-2015与α及β冠状病毒(PEDV、TGEV、SADS-CoV、PRCV和PHEV)在S^280-288的序列保守性较低(<44.4％)。(图7C)。

4.8 KLH-S^280-288可在小鼠体内诱导体液免疫应答

将表位肽S^280-288与KLH蛋白偶联后(KLH-S^280-288)，经皮下注射(50μg/只)免疫小鼠，免疫程序如图8A所示。利用PDCoV S1-CTD间接ELISA检测方法检测pdcov特异的IgG抗体。如图8B所示，KLH-S^280-288在第一次接种后即可诱导产生抗PDCoV的抗体。在二免后一周，免疫反应显著增强。使用病毒中和试验评估PDCoV的中和活性。二免后2周，血清中和抗体效价可达1:402(±40)(图8B)。如图8C所示，中和效价与IgG抗体效价高度相关(R²＝0.994)。噬斑减少中和试验显示，二免后2周收集的血清中和效价为1:256(图8D和图8E)。

4.9 KLH-S^280-288可在仔猪体内诱导体液免疫及IFN-γ应答

KLH-S^280-288通过肌注(500μg/头)的方式免疫仔猪2次，后观察其免疫反应，免疫程序如图9A所示。通过PDCoV S1-CTD间接ELISA抗体检测方法检测PDCoV特异性IgG抗体。如图9B表明，接种KLH-S^280-288后，在第1周和第2周未检测到抗PDCoV IgG抗体，但二免后，所有免疫的仔猪均产生了抗PDCoV特异性IgG抗体。图9C表明，与IgG抗体反应类似，在第1周和第2周未检测到PDCoV特异性中和抗体，在二免后1周(第3周)，才检测到PDCoV特异性中和抗体，其中和抗体效价为1:28.8±7.16，二免后2周中和抗体效价上升为1:70.4±35.1。对照组仔猪血清中未检测到PDCoV特异性中和抗体。ELISpot试验结果显示，与对照组外周血单核细胞(PBMC)相比，KLH-S^280-288免疫仔猪的PBMCs中在KLH-S^280-288刺激后分泌的IFN-γ水平显著高于对照组，而S^280-288表位肽刺激KLH-S^280-288疫苗接种仔猪的PBMCs中未检测到明显的IFN-γ释放(图9D和E)。结果表明KLH-S^280-288可诱导IFN-γ应答，表位肽S^280-288则不能。综上所述，KLH-S^280-288可诱导仔猪产生pdcov特异性的体液和细胞免疫应答。

3.10KLH-aa^280-288免疫对PDCoV攻毒仔猪具有一定的保护作用

3.10.1肛门拭子和组织中的病毒含量

肛门拭子结果显示，攻毒后4天，对照组仔猪的肛门拭子中病毒载量到达峰值，每毫升肛门拭子上清中PDCoV RNA拷贝数可达10^9.35。免疫组仔猪，粪便中病毒脱落峰值出现在攻毒后2天，最高脱落量为每毫升粪拭子上清中含10^8.19PDCoV RNA拷贝数(图10A)。总体而言，与对照组相比，免疫组仔猪的病毒脱毒时间延迟，总的病毒脱毒时间缩短。各肠道器官均可检测出PDCoV RNA，其中空肠和回肠的PDCoV RNA拷贝量较高(图10B)。

3.10.2病理切片及免疫荧光结果

对照组仔猪小肠肠细胞出现严重坏死、空泡化和中性粒细胞浸润。在免疫组仔猪中，观察到较少的中性粒细胞浸润和小肠肠细胞坏死(图10C)。正常组仔猪保持健康，肠道无明显病变。免疫荧光(IF)染色显示，对照组仔猪空肠和回肠中主要存在PDCoV(图10D)。在免疫仔猪的空肠和回肠上皮细胞中观察到少量PDCoV抗原，与病毒RNA检测结果一致。

5讨论

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是有囊膜的单股正链RNA病毒，在遗传上可分为四个属:α、β、γ和δ属。α-CoVs和β-CoVs只感染哺乳动物，γ-CoVs主要感染鸟类，而δ-CoVs既感染鸟类也哺乳动物(4)。PDCoV是一种最近出现的δ冠状病毒，主要引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水。PDCoV还可以感染小牛、小鼠和农业上重要的家禽。更重要的是，最近，Lednicky等人在三名海地儿童的血浆样本中检测到了PDCoV。这种广泛的宿主范围表明了PDCoV有种间传播的倾向，对公共卫生具有潜在风险。COVID-19大流行再次证明了病毒跨物种传播的巨大危害以及冠状病毒控制战略的重要性。因此，PDCoV的跨物种传播不应被轻视；有效的PDCoV疫苗和抗病毒药物应是持续研究的领域。

中和抗体在抗病毒感染中起着关键作用。CoVs S蛋白的受体结合域(RBD)介导病毒入侵宿主细胞且含有主要的中和抗原表位。大多数CoVs的RBD位于S1结构域的C端结构域(CTD)。因此，S1-CTD蛋白是冠状病毒疫苗和抗病毒药物研发的主要靶蛋白。此前，我们发现PDCoV S1-CTD(aa278-683)也是一个免疫显性区域，可能包含主要的中和表位。值得注意的是，CoVs S蛋白中的非中和性抗原表位诱导的抗体可能导致ADE效应，因此鉴定S蛋白中中和抗原表位对于开发安全有效的疫苗至关重要。在本发明中，我们使用抗PDCoV单克隆抗体精确地识别了S1-CTD蛋白中的中和B细胞表位。IFA检测显示单克隆抗体特异性结合PDCoV感染细胞(图2)，但PRNT和基于ELSIA的病毒中和试验结果检测显示单克隆抗体4E-3可在体外中和PDCoV,IC50分别为3.155μg/mL和3.612μg/mL。(图3A和B)。参考其它研究发现，从PEDV、SARS-CoV-2和MERS-CoV等其他CoVs中分离出的中和性单克隆抗体，IC 50值在0.012μg/mL至28μg/mL之间。这些结果证实了，本发明制备的单克隆抗体4E-3具有较强的PDCoV中和活性，可为开发PDCoV抗病毒药物或疫苗奠定基础。

B细胞抗原表位分为线性表位和构象表位。我们用dot-blot将单克隆抗体4E-3与变性的S1-CTD蛋白反应，发现单克隆抗体4E-3能够识别变性的S1-CTD蛋白，表明它识别的是线性表位。鉴定表位的金标准是通过x射线或冷冻电镜来确定抗原抗体复合物的3D结构，但由于两种方法耗时、昂贵且局限于小的可溶性蛋白质，因此，不适用于大多抗原和抗体。本发明中，通过检测单克隆抗体4E-3与PDCoV S截短蛋白及合成肽的反应性来确定了单克隆抗体4E-3的抗原表位。如图6所示，单克隆抗体4E-3识别的最小表位为²⁸⁰FYSDPKSAV²⁸⁸(S^280-288)。同源性分析显示S^280-288在PDCoV毒株中高度保守，但与猪α-CoVs和β-CoVs以及其他物种的δ-CoVs序列相似性较低(<44.4％)。这表明这两个表位是PDCoV所特有的，可用于区分PDCoV和其他猪冠状病毒。

中和性B细胞表位与体液免疫反应有关，在疫苗生产中起着关键作用，因此，鉴定中和性B细胞表位非常重要。为了确定S^280-288是否能诱导中和抗体的产生，本发明合成S^{280 -288}肽段，并与KLH偶联(命名为KLH-S^280-288)，后免疫小鼠。制备鼠抗KLH-S^280-288血清，采用间接ELISA和病毒中和试验测定PDCoV特异的IgG抗体及中和抗体滴度；二免后2周，鼠血清中IgG和中和抗体滴度显著升高(分别为1:1600(±935)和1:402(±40))。重要的是，中和度与IgG效价之间有很强的相关性(R²＝0.994)，进一步证实了S^280-288表位是PDCoV S蛋白的中和表位。二免后2周采集的血清也有较高的中和抗体效价(1:256)，该中和抗体效价与我们之前研究中收集的鼠抗S1-CTD血清的中和抗体滴度(1：320)非常接近。这些结果表明，S^280-288表位可能是PDCoV S1-CTD蛋白的主要线性B细胞中和表位。

基于本研究结果，我们随后对KLH-S^280-288候选疫苗进行了系统评估，特别是其诱导仔猪PDCoV特异性中和抗体和IFN-γ反应的能力。KLH-S^280-288免疫组为5头，对照组为3头注射PBS。如图9B所示，KLH-aa^280-288二免后，PDCoV特异性IgG和中和滴度增加。如图9C所示，二免后2周，免疫组仔猪中和效价可达1:70.4±35.1。通过ELISpot试验评估KLH-S^280-288候选疫苗诱导的T细胞反应。如图9D和E所示，KLH-S^280-288在免疫组仔猪中引起了强烈的IFN-γ反应，而在对照组仔猪中没有引起IFN-γ反应。值得注意的是，S^280-288并没有在所有仔猪中诱导强烈的IFN-γ反应，这表明IFN-γ反应是由KLH引起的。这些发现与之前报道的KLH可以诱导T细胞反应相似。这些结果表明，KLH-S^280-288候选疫苗不仅能诱导体液免疫，还能诱导IFN-γ反应。

利用PDCoV攻毒试验评估KLH-S^280-288候选疫苗的有效性。PDCoV感染5-7日龄仔猪时，会引起严重的临床症状，而本发明使用的仔猪在病毒攻毒时为35日龄，因此使用感染PDCoV CHN-SC2015的仔猪肠道内容物来攻毒(每头猪攻毒2×10⁸病毒RNA拷贝)。与对照组相比，免疫组仔猪在攻毒后4天，病毒粒脱落明显减少。与对照组相比，H&E染色显示，免疫组仔猪空肠和回肠上皮细胞中性粒细胞浸润和坏死减少(图10C)。免疫荧光(IF)染色也显示，PDCoV抗原在免疫组仔猪中仅少量表达(图10D)。综上所述，KLH-S^280-288候选疫苗在减少病毒粒子脱落方面对仔猪具有保护作用。

综上所述，本发明首次发现PDCoV中和表位S^280-288，并以此制备的以表位肽为抗原的疫苗可以诱导仔猪产生强中和抗体，增强干扰素-γ反应，并能减轻仔猪感染PDCoV后的临床症状，减少病毒粒子脱落，具备实际推广应用价值。同时，本发明还通过杂交瘤细胞分泌获得了能识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S^280-288的单克隆抗体4E-3，将其应用于猪疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为猪的免疫诊断与免疫治疗开辟了更广阔前景。

Claims (10)

1.一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述表位肽在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。

3.一种预防猪δ冠状病毒的疫苗，其特征在于：它是以权利要求1所述的表位肽为抗原，加上药学上可接受的载体制备而成的疫苗。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述载体为具有免疫原性的蛋白载体；所述蛋白载体包括钥孔血蓝蛋白。

5.一种权利要求4所述疫苗的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取权利要求1所述的表位肽，与钥孔血蓝蛋白偶联，即得。

6.一种单克隆抗体，其特征在于：它是经猪δ冠状病毒S1-CTD蛋白激活后的B细胞，与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生并分泌的抗体。

7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S^280-288表位；所述S^280-288表位的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

8.一种制备权利要求6或7所述单克隆抗体的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔，5～8d抽取腹水，离心，取上清液采用硫酸铵盐析法提取，提取液用Protein G亲和层析柱纯化，即得；

所述杂交瘤细胞是猪δ冠状病毒S1-CTD蛋白激活后的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的能产生并分泌识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S^280-288表位的细胞；所述S^280-288表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.权利要求6或7所述单克隆抗体在制备预防和/治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。

10.一种预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物，其特征在于：它是以权利要求6所述的单克隆抗体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。