CN118005750A - 猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽及其应用，涉及生物检测技术领域。本发明猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。上述表位最小基序肽在制备作为诊断猫冠状病毒识别表位标志物的应用。用于检测上述表位最小基序肽的单克隆抗体为MAb N1‑2G7。可产生上述表位最小基序肽的杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞。表位最小基序肽的编码基因。本发明最小基序肽具有较高的保守性和FCoV特异性和免疫原性。MAb N1‑2G7检测FCoV具有良好的反应性和特异性。小鼠杂交瘤细胞具有FCoV特异性和反应性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽及其应用。
背景技术
猫冠状病毒（Feline coronavirus,FCoV）是猫群中广泛流行的一种病毒，分为猫传染性腹膜炎病毒（Felineinfectious peritonitis virus,FIPV）和猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus,FECV）两个生物型，FECV 通常只引起轻微的肠炎，而FIPV是家猫和野猫致死性疾病猫传染性腹膜炎（Felineinfectiousperitonitis,FIP）的病原，在世界范围内普遍流行，具有高度传染性。目前没有相关疫苗问世，也没有特效治疗方法，严重影响宠物猫的健康。
而且众所周知，长抗原性肽中有可能存在N个表位，便可能产生N个表位抗体，而选用精细表位肽则能使N的个数减少到最低，以利目的抗体生成，同时避免可能有害的其他抗体生成。可见，鉴定发明靶蛋白上精细表位肽的意义和应用益处是显而易见的。因此，获得猫冠状病毒最小基序肽（精细表位肽）对于猫冠状病毒的抗体生成具有积极意义。
发明内容
本发明为对猫冠状病毒进行准确的检测，而提供了猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽及其应用。
本发明一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽，该猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽（N1-2G7）的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述表位最小基序肽（N1-2G7）在制备作为诊断猫冠状病毒识别表位标志物的应用。
进一步的，上述表位最小基序肽（N1-2G7）于重组猫冠状病毒表位肽疫苗制备、药物或制备检测抗体方面的应用。
用于检测上述表位最小基序肽（N1-2G7）的单克隆抗体为MAb N1-2G7，MAb N1-2G7中重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，MAb N1-2G7中轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
可产生上述表位最小基序肽（N1-2G7）的杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞N1-2G7，保藏编号为CGMCC No.45653。
上述表位最小基序肽N1-2G7的编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明另一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽，该猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽（N2-3H5）的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述表位最小基序肽（N2-3H5）在制备作为诊断猫冠状病毒识别表位标志物的应用。
进一步的，上述表位最小基序肽（N2-3H5）于重组猫冠状病毒表位肽疫苗制备、药物或制备检测抗体方面的应用。
用于检测上述表位最小基序肽（N2-3H5）的单克隆抗体为MAb N2-3H5，MAb N2-3H5中重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，MAb N2-3H5中轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
可产生上述表位最小基序肽（N2-3H5）的杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞N2-3H5，保藏编号为CGMCC No.45654。
上述表位最小基序肽N2-3H5的编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
有益效果
本发明的猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽N1-2G7和N2-3H5分别对应猫冠状病毒N蛋白上2个位点，位点N1-2G7和位点N2-3H5。本发明最小基序肽N1-2G7仅有11个氨基酸；本发明最小基序肽N2-3H5仅有29个氨基酸。本发明最小基序肽N1-2G7和表位最小基序肽N2-3H5具有较高的保守性和FCoV特异性和免疫原性。
本发明MAb N1-2G7和MAb N2-3H5检测FCoV均具有良好的反应性和特异性，MAbN1-2G7与SEQ ID NO：1所示氨基酸具有表位特异性；MAb N2-3H5与SEQ ID NO：2所示氨基酸具有表位特异性。
本发明小鼠杂交瘤细胞N1-2G7和小鼠杂交瘤细胞N2-3H5具有FCoV特异性和反应性。
利用本发明单克隆抗体为MAb N2-3H5和单克隆抗体为MAb N1-2G7制备的检测试纸具有良好的反应性和特异性、灵敏度。
本发明小鼠杂交瘤细胞N1-2G7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年8月9日，保藏编号为CGMCC No.45653。
本发明小鼠杂交瘤细胞N2-3H5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年8月9日，保藏编号为CGMCC No.45654。
附图说明
图1是实施例1中IFA法鉴定分析重组蛋白b细胞表位结果图；
图2是实施例1中重组蛋白western blot试验结果图；各泳道上样为1：N蛋白（1-377 aa），2：短肽（1-110 aa），3：短肽（1-66 aa），4：短肽（1-44 aa），5：短肽（14-34 aa），6：短肽（18-32 aa），7：短肽（18-30 aa），8：短肽（18-28 aa），9：短肽（19-28 aa），10：短肽（18-27 aa），11：N蛋白（1-377 aa），12：短肽（210-377 aa），13：短肽（220-337 aa），14：短肽（274-377 aa），15：短肽（295-325 aa），16：短肽（295-324 aa），17：短肽（295-323 aa），18：短肽（296-323 aa），19：短肽（295-322）；
图3是表位最小基序肽N1-2G7和表位最小基序肽N2-3H5与45株FCoV病毒相应的靶区域同源性比较结果图；
图4是实施例1中MAb N1-2G7和MAb N2-3H5分别与纯化的FIPV-DF-2、FPV、FCV和FHV全病毒蛋白进行western blot分析的结果图，其中泳道M为预染蛋白Marker、泳道1为pColdⅠ空载体表达蛋白、泳道2为纯化后的pColdⅠ-FIPV-DF-2全病毒蛋白；泳道3-5依次纯化的FPV、FCV和FHV全病毒蛋白；
图5是实施例1中在FPV、FCV、FHV和FIPV-DF-2感染产单抗CRFK细胞的IFA结果图；
图6是实施例1所制备纳米金免疫层析试纸针对不同病毒进行检测的结果图；图6中a为FIPV-DF-2 N蛋白、b为FIPV-DF-2、c为猫杯状病毒FCV、d为猫疱疹FHV病毒、e为猫细小病毒FPV；
图7是实施例1所制备纳米金免疫层析试纸针对FIPV-DF-2 N蛋白灵敏度检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例
猫冠状病毒（FCoV）又分为两型，一型是感染肠道的猫肠道冠状病毒（FECV），另一型是引起猫传染性腹膜炎的猫传染性腹膜炎病毒FIPV；根据NCBI上已发表的毒株FIPV-DF-2（GenBank 登录号：JQ408981.1）N蛋白的核苷酸序列（猫冠状病毒FCoV又分为两型，一型是感染肠道的猫肠道冠状病毒FECV，另一型是引起猫传染性腹膜炎的猫传染性腹膜炎病毒FIPV）和pColdⅠ原核表达载体的多克隆位点，选择BamHⅠ和HindⅢ作为载体构建的双酶切位点，设计上游引物FIPV-DF-2-N-BamHⅠ-F和下游引物FIPV-DF-2-N-HindⅢ-R，FIPV-DF-2-N-BamHⅠ-F的序列为5¢-ctcggtaccctcgagggatccATGGCCACACAGGGACAACG-3¢，FIPV-DF-2-N-HindⅢ-R的序列为5¢-agactgcaggtcgacaagcttTTAGTTCGTAACCTCATCAATCATCTC-3¢。使用FineQuick病毒DNA/RNA提取试剂盒（中国，北京，吉帆公司）提取FIPV-DF-2的RNA。使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（诺唯赞，南京，中国）进行逆转录反应，合成FIPV-DF-2的第一链cDNA，并以该cDNA为模板，PCR扩增FIPV-DF-2 N基因片段。使用DNA凝胶提取试剂盒(Omega，中国)对PCR产物进行纯化和回收。将PCR产物克隆到原核表达载体pCold I中，重组质粒命名为pColdⅠ- FIPV-DF-2-N，经DNA测序鉴定。
FIPV-DF-2 N基因引物扩增的产物大小为1134 bp，无多余条带。
将确认的重组质粒pColdⅠ- FIPV-DF-2-N转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，并在16℃下用0.5mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG），在LB培养基中以150 r/min振荡培养18 h，将可溶性产物用His标签蛋白琼脂糖纯化树脂纯化（Yeasen Biotechnology (Shanghai)Co., Ltd.），然后用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达，获得纯化的FIPV-DF-2 N蛋白。
将FIPV-DF-2 N基因引物扩增产物截短，获得包括如SEQ ID NO：7所示和SEQ IDNO：8所示在内的基因片段，然后分别与载体pCMV-HA-DsRed连接获得重组质粒，再将这些重组质粒转染至293T细胞中以带DsRed标签的蛋白形式表达。之后将这些重组蛋白通过获得的单抗介导的IFA方法被识别，并使用western blot方法进行复核验证。
IFA分析结果如图1所示，显示18RGRSNSRGRKN28（SEQ ID NO：1，即表位最小基序肽N1-2G7）是MAb N1-2G7的最小线性表位；295GDQVKVTLTHTYYLPKDDAKTSQFLEQID323（SEQ IDNO：2，即表位最小基序肽N2-3H5）是MAb N2-3H5的最小线性表位。
western blot试验结果如图2所示，证实MAb N1-2G7的最小线性表位和MAb N2-3H5的最小线性表位与IFA分析结果相一致。
用MegAlign软件将表位最小基序肽N1-2G7（SEQ ID NO：1）和表位最小基序肽N2-3H5（SEQ ID NO：2）与45株FCoV病毒相应的靶区域进行同源性比较。结果如图3所示，相同的颜色表明氨基酸残基完全匹配；在各种FCoV病毒中将与表位最小基序肽N1-2G7和表位最小基序肽N2-3H5对应的靶区域用红框表示。
显示最小基序肽N1-2G7和表位最小基序肽N2-3H5具有较高的保守性。
通过细胞融合技术获得体外可无限增殖的杂交瘤细胞，结合流式细胞分选和IFA法获得抗FIPV-DF-2 N蛋白的MAb N1-2G7和MAb N2-3H5（将上述纯化的表位最小基序肽N1-2G7和表位最小基序肽N2-3H5分别作为免疫抗原，用PBS稀释后与Quick Antibody-Mouse5W免疫佐剂1:1等体积混合，以每只小鼠20 μg的剂量后小腿肌肉注射接种6-8周龄雌性BALB/c小鼠。第21天加强免疫一次，共免疫两次。在免疫第35天采用间接免疫荧光法（IFA）检测抗体滴度。如果小鼠抗体滴度没有达到1:1280的理想滴度，继续免疫。取达到理想抗体滴度的小鼠的脾脏，制备小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞使用PEG试剂以10:1的比例融合。融合细胞先在HAT培养基中培养3天，然后使用HAT培养基进行半换液；第6天由HAT培养基改为HT培养基进行融合细胞的选择。当存活的杂交瘤细胞数量增加到每孔1/3以上时，采用间接IFA法检测其上清液。采用流式细胞分选技术对上清阳性的杂交瘤细胞进行两次克隆，最终获得分别稳定分泌单克隆抗体——MAb N1-2G7、MAb N2-3H5的杂交瘤细胞——小鼠杂交瘤细胞N1-2G7和小鼠杂交瘤细胞N2-3H5。收集10周龄雌性BALB/c小鼠产生的含单克隆抗体的腹水，向每只小鼠腹腔注射500μL的腹水佐剂，一周后，腹腔注射悬浮在无菌PBS中的0.5mL杂交瘤细胞（106cells/mouse），10-14天后收集腹水；用蛋白G法纯化小鼠腹腔产生的腹水，收集中间层的抗体并分装于1 mL离心管中，-20ºC保存，获得大量的单克隆抗体（MAb N1-2G7和MAb N2-3H5）。
利用MAb N1-2G7和MAb N2-3H5分别与蔗糖密度梯度离心纯化的FIPV-DF-2、FPV、FCV和FHV全病毒蛋白介导的western blot方法对该单抗进行了免疫原性和特异性鉴定。
western blot分析结果如图4所示，MAb N1-2G7和MAb N2-3H5均与FIPV-DF-2纯化的病毒全蛋白（45.6KDa）发生反应；而与其他三种纯化的病毒蛋白FPV、FCV和FHV都不能发生反应。
利用上述融合细胞分别培养至上清变黄后，取上清作为一抗，以FIPV-DF-2感染CRFK细胞作为抗原通过IFA方法进行初步筛选。通过流式细胞仪分别分选可产单抗（MAbN1-2G7和MAb N2-3H5）CRFK细胞。再用IFA法评价单抗（MAb N1-2G7和MAb N2-3H5）能否特异性结合自然感染的病毒。IFA分析结果如图5所示，在接种FIPV-DF-2的产单抗CRFK细胞中出现绿色荧光，阴性对照和感染FPV、FCV和FHV的产单抗CRFK细胞中不出现绿色荧光，表明MAbN1-2G7和MAb N2-3H5能特异性地靶向FIPV-DF-2抗原，并具有反应原性。
制备纳米金免疫层析试纸：用MAb N2-3H5与纳米金颗粒偶联，制备纳米金免疫层析试纸，其中用特异性抗体mAb N1-2G7包被检测线；质控线用特异性山羊抗小鼠IgG抗体包被。以FPV、FHV、FCV和FIPV-DF-2、FIPV-DF-2 N蛋白为样品进行测试。测试结果如图6，本实施例制备的纳米金免疫层析试纸能够检测出FIPV-DF-2 N蛋白和FIPV-DF-2，且都对FPV、FCV和FHV无交叉反应，可见MAb N1-2G7和MAb N2-3H5用于检测FCoV具有良好的反应性和特异性。
将FIPV-DF-2 N蛋白用PBS溶液稀释至6715ng/mL、3357.5ng/mL、1678ng/mL、839.4ng/mL、419.7ng/mL、209.8ng/mL、104.9ng/mL、52.5ng/mL，分别用上述制备纳米金免疫层析试纸进行检测。
检测结果如图7所示，当检测浓度为209.8 ng/ml时，免疫层析试纸条中仍可见相对清晰的检测线，表明本实施例制备的纳米金免疫层析试纸具有良好的灵敏度。
分别对生产MAb N1-2G7和MAb N2-3H5的杂交瘤细胞（小鼠杂交瘤细胞N1-2G7和小鼠杂交瘤细胞N2-3H5），以Trizol 法提取 RNA、反转录后获得 cDNA；扩增并获得鼠源抗体的重链和轻链全长；克隆至 pMD18-T 载体，测序；使用 IMGT/V-QUEST 数据库进行测序结果比对，进一步分析。其中，MAb N1-2G7的重链的可变区氨基酸序列（全长序列，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）如下：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKSSGYSFTNPGDVMNWVRQAPGKGLKWMAWINTERGETQFFKGRFAFSLEASASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRDIYYGEIKYYAMDKWGQGTSVTVSS；轻链的可变区氨基酸序列（全长序列，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）如下：DIVMTQSHKFMSTSVGDRVTITCQSAKDVSAVTAWYQQKPGQSPKLLIYYSASRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYCQQTSYHPFTFGSGTKLEIK。其中，MAb N2-3H5的重链的可变区氨基酸序列（全长序列，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）如下：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKSSGYSFTMGYNNWVRQAPGKGLKWMAGDDFWINTYTYKGSGEPRFAFSLEASASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRYGDYYDGDVVAMWGQGTSVTVSS；轻链的可变区氨基酸序列（全长序列，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）如下：DIVMTQSHKFMSTSVGDRVTITCKAVSTDVDSQDWYQQKPGQSPKLLIYRYMNTSASYGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYCGQDHYTITTPFFGSGTKLEIK。
Claims (5)
1.猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽，其特征在于，该猫冠状病毒核衣壳蛋白的表位最小基序肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述表位最小基序肽在制备作为诊断猫冠状病毒识别表位标志物的应用。
3.可产生权利要求1所述表位最小基序肽的杂交瘤细胞，其特征在于该杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞N1-2G7，保藏编号为CGMCC No.45653。
4.用于检测权利要求1表位最小基序肽的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体为mAb N1-2G7，mAb N1-2G7中重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，mAb N1-2G7中轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.权利要求1所述表位最小基序肽的编码基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
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