RU2396348C2 - Рекомбинантная генная конструкция для индукции иммунного ответа, рекомбинантный полипептид и вакцина - Google Patents
Рекомбинантная генная конструкция для индукции иммунного ответа, рекомбинантный полипептид и вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396348C2 RU2396348C2 RU2006142760/13A RU2006142760A RU2396348C2 RU 2396348 C2 RU2396348 C2 RU 2396348C2 RU 2006142760/13 A RU2006142760/13 A RU 2006142760/13A RU 2006142760 A RU2006142760 A RU 2006142760A RU 2396348 C2 RU2396348 C2 RU 2396348C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- recombinant
- fragment
- antigen
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 30
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 23
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 17
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 17
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 101001001271 Mus musculus Prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 9
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 9
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 8
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 8
- 101100243447 Arabidopsis thaliana PER53 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 101150080074 TP53 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 6
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 2
- 108010083702 Chemokine CCL21 Proteins 0.000 description 2
- 102000006435 Chemokine CCL21 Human genes 0.000 description 2
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100039701 G antigen 2B/2C Human genes 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000886151 Homo sapiens G antigen 2A Proteins 0.000 description 2
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001005718 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001005719 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 2
- 101001057131 Homo sapiens Melanoma-associated antigen D4 Proteins 0.000 description 2
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010043496 Immunoglobulin Idiotypes Proteins 0.000 description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 2
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100025081 Melanoma-associated antigen 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101100268648 Mus musculus Abl1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108010071652 human kallikrein-related peptidase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000007579 human kallikrein-related peptidase 3 Human genes 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101150063074 HP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000592517 Homo sapiens Puromycin-sensitive aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101000707152 Homo sapiens SH2B adapter protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 101001035658 Mus musculus 28 kDa heat- and acid-stable phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000785917 Mus musculus Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000735426 Mus musculus Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920006355 Tefzel Polymers 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N ethene;1,1,2,2-tetrafluoroethene Chemical compound C=C.FC(F)=C(F)F QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 gp75 Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229940030749 prostate cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению генно-инженерных вакцин, и может быть использовано в медицине. Получают рекомбинантную генную конструкцию, содержащую последовательно расположенные ген SLC человека, ген антигена и ген Fc-фрагмента IgG1. Изобретение позволяет значительно повысить эффективность иммунного ответа организма на вводимый антиген, по сравнению с известными антигенными конструкциями. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл., 15 ил.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к новой рекомбинантной генной последовательности, гибридному белку, экспрессируемому с этого гена, и вакцине, полученной с этим геном, а также различным генным вакцинам, получаемым заменой гена антигена в рекомбинантной последовательности, или применению продуктов экспрессии в качестве вакцин гибридных пептидов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
С момента открытия вторичного лимфоидного хемокина человека (SLC, от англ. secondary lymphoid tissue chemokine) ему было уделено очень много внимания. SLC регулирует секрецию цитокинов, изменяет иммуносупрессорные статусы микроокружения опухоли и способствует развитию Th1. Таким образом, SLC полезен в противоопухолевом иммунитете. Далее, SLC оказывает влияние на привлечение лимфоцитов и дендритных клеток (DC, от dendritic cells). Внутриопухолевая инъекция индуцирует местный и системный противоопухолевые иммунные ответы. SLC может также контролировать супрессию ангиогенеза в опухолях. Таким образом, SLC весьма полезен в иммунотерапии рака. Однако применение белка SLC самого по себе или трансгенный метод не дали удовлетворительных результатов в отношении противоопухолевого иммунитета. Предполагалось (Cancer Research 61, 197-205, January 1, 2001), что противоопухолевая иммунная реакция может быть усилена с помощью иммунизации мышей дендритными клетками, которые трансфицированы рекомбинантным ретровирусным вектором, несущим гены, кодирующие фрагмент IgG Fc и антиген опухоли. Механизм заключается в том, что гибридный белок, экспрессирующийся и секретирующийся из DC, повторно захватывается дендритными клетками через рецептор Fc (обозначен далее как FcR), и затем эпитоп гибридного белка презентируется Т-хелперным клеткам (Th) через молекулы МНС класса II и перекрестно презентируется цитотоксическим Т лимфоцитам (CTL) через молекулы МНС класса I, в результате чего индуцируется системно противоопухолевый гуморальный-и-клеточный иммунитет. Сообщалось (the Journal of Immunology, 1998, 161: 6059-6067), что способность DC no захвату антигенов с помощью FcR-опосредованного эндоцитоза в 10000 раз выше, чем с помощью пиноцитоза. Однако выделение, амплификация и трансфекция гена в DC увеличивает сложность производства вакцины. В этом случае дендритные клетки должны готовиться индивидуально, что затрудняет контроль качества и промышленное производство.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Чтобы преодолеть недостатки прототипов, целью изобретения является создание новой рекомбинантной генной конструкции для индукции иммунного ответа.
Другой целью данного изобретения является создание гибридного (слитого) белка, зкспрессируемого этой рекомбинантной генной конструкцией.
Другой целью данного изобретения является создание вакцины гибридного белка, кодируемого рекомбинантной генной конструкцией по изобретению, и вакцины рекомбинантного опухоль-хемотаксического антигена.
Для достижения целей изобретения предложены следующие технические решения.
Изобретение относится к рекомбинантной генной конструкции для индукции иммунного ответа, содержащей ген SLC человека, ген антигена и ген Fc-фрагмента IgG1, где ген SLC находится слева от гена антигена и ген Fc-фрагмента IgG1 находится справа от гена антигена. Указанный ген антигена содержит Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, Тирозиназу, СЕА, Ig идиотип, gp100, melan A, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1 и гены, кодирующие белки, имеющие отношение к вирусам гепатита С, ВИЧ и патогенным микроорганизмам
В рекомбинантной генной конструкции по изобретению сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRI и гены трех глицинов находятся между геном SLC и геном антигена, а сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRV и гены пяти глицинов находятся между геном антигена и геном Fc-фрагмента IgG1.
Рекомбинантная генная конструкция по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:12.
Изобретение также относится к аминокислотной последовательности, кодируемой рекомбинантной генной конструкцией по изобретению. Эта аминокислотная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:2.
Изобретение также относится к аминокислотной последовательности, кодируемой SEQ ID NO:12. Эта аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:13
Изобретение также относится к генной вакцине, содержащей рекомбинантную генную последовательность по изобретению.
Кроме того, изобретение также относится к вакцине. Предпочтительно вакцина содержит SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12 и соответствующие аминокислотные последовательности
Другими словами, изобретение относится к рекомбинантной генной конструкции, содержащей ген SLC человека, ген антигена и ген Fc-фрагмента IgG1, где ген SLC находится слева от гена антигена и ген Fc-фрагмента IgG1 находится справа от гена антигена. Указанный ген антигена содержит Her2/neu, Р53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, Тирозиназу, CEA, Ig идиотип, gp100, melanA, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1 и другие гены, кодирующие белки, имеющие отношение к вирусам гепатита С, ВИЧ и другим патогенным микроорганизмам. Сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRI и гены трех глицинов находятся между геном SLC и геном антигена, а сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRV и гены пяти глицинов находятся между геном антигена и геном Fc-фрагмента IgG1.
Изобретение также относится к применению рекомбинантной генной конструкции по изобретению в приготовлении вакцин. А именно, вакцине, содержащей рекомбинантную генную конструкцию по изобретению, в частности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12 и соответствующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:13.
Другими словами изобретение относится к рекомбинантной генной конструкции, содержащей человеческий ген SLC, ген антигена и ген Fc-фрагмента IgG1 (см. Фиг. 13). Ген SLC помещен до гена антигена, и вставлены сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRI и гены трех глицинов. Ген Fc-фрагмента IgG1 помещен после гена антигена, и вставлены сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRV и гены пяти глицинов.
Согласно изобретению замена гена антигена в указанных генах по сайтам эндонуклеазы рестрикции может привести к различным гибридным генам хемотаксического антигена. В частности, это изобретение относится к рекомбинантному гену, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1. Последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 представляет собой искусственно лигированную последовательность SLC-Her2/P53-Fc, где ген SLC находится с положения 1 до положения 402 нуклеиновой кислоты; лигирующий ген Her2 находится с положения 418 до положения 711 нуклеиновой кислоты. Нуклеотиды с положения 418 до положения 444 в рекомбинантном гене соответствуют нуклеотидам с положения 1105 до положения 1131 в открытой рамке считывания (ОРС) гена Her2/neu. Нуклеотиды с положения 445 до положения 546 в рекомбинантном гене соответствуют нуклеотидам с положения 244 до положения 345 в открытой рамке считывания (ОРС) гена Her2/neu, куда включена мутация с G на С в положении 250. Нуклеотиды с положения 547 до положения 711 в рекомбинантном гене соответствуют нуклеотидам с положения 1333 до положения 1479 в ОРС гена Her2/neu. В рекомбинантном гене часть гена Р53 находится с положения 712 до положения 1113, соответствующим нуклеотидам с положения 475 до положения 876 ОРС р53. Ген IgG Fc (включая интроны) находится с положения 1147 до положения 2057 в рекомбинантном гене, причем два интрона находятся с положения 1189 до положения 1309 и с положения 1640 до положения 1739 соответственно. Последовательность нуклеиновой кислоты с положения 1147 до положения 1189 является последовательность. шарнира С-области. Последовательность нуклеиновой кислоты с положения 1310 до положения 1369 является последовательностью для СН2, последовательность нуклеиновой кислоты с положения 1740 до положения 2057 является последовательностью для СН3. Три гена глицинов и сайты EcoRI эндонуклеазы рестрикции вставлены перед фрагментом Неr2/Р53, и пять генов глицинов и сайты EcoRV эндонукпеазы рестрикции вставлены после Her2/Р53. Согласно этому изобретению, чтобы сделать нормальной биологическую функцию экспрессированных факторов, 3~5 генов глицинов вставлены перед и после (справа и слева от) гена антигена. Эффект генов глицина заключается в том, чтобы предотвратить интерференцию рекомбинантного антигена с трехмерной структурой.
Данное изобретение также относится к аминокислотной последовательности (612 а.к., зрел589а.к.) SEQ ID NO:2, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, где SEQ ID NO:1 представляет собой искусственно рекомбинантный SLC-Her2/P53-Fc ген. В указанной аминокислотной последовательности фрагмент SLC находится с положения 1 до положения 134, три глицина находятся с положения 135 до положения 137, и часть пептида Неr2 находится с положения 140 до положения 237. Аминокислоты с положения 140 до положения 148 в гибридном белке соответствуют аминокислотам с положения 369 до положения 377 в Her2/neu. Аминокислоты с положения 149 до положения 182 в гибридном белке соответствуют аминокислотам с положения 82 до положения 115 в Her2/neu, где имеется мутация с V на L в положении 84. Аминокислоты с положения 183 до положения 238 в гибридном белке соответствуют аминокислотам с положения 445 до положения 499 в Her2/neu. Часть пептида Р53 находится с положения 238 до положения 371 в гибридном белке (соответствуя аминокислотам с положения 159 до положения 292 в природной форме Р53). Пять глицинов находятся с положения 374 до положения 378. IgG Fc находится с положения 383 до положения 612, где последовательность с положения 383 до положения 396 представляет собой петлю С-области, последовательность с положения 397 до положения 506 является последовательностью для СН2, и последовательность с положения 507 до положения 612 является последовательностью для СН3.
Данное изобретение также относится к другому рекомбинантному гену для вакцины против рака простаты, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 12. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность искусственно лигированного SLC-PSM-mPAP-PSA-Fc (SLC-3Р-Fc) гена, куда введены только частичные последовательности PSM (human Prostate Specific Membrane Antigen), mPAP (mouse Prostatic Acid Phosphatase) и PSA (human Prostate Specific Antigen). В гибридом гене ген SLC находится с положения 1 до положения 402; часть гена PSM находится с положения 418 до положения 603, соответствуя последовательности с положения 1987 до положения 2172 в открытой рамке считывания (ОРС) PSM; ген mPAP находится с положения 604 до положения 759, соответствуя последовательности с положения 328 до положения 484 в mPAP ОРС; ген PSA находится с положения 760 до положения 981, соответствуя последовательности с положения 151 до положения 372 в PSA ОРС; ген IgG Fc (включая интроны) находится с положения 1003 до положения 1925, причем эти два интрона находятся с положения 1057 до положения 1177 и с положения 1508 до положения 1607 соответственно. Гены трех глицинов и сайты EcoRI эндонуклеазы рестрикции вставлены перед (слева от) 3P, и гены пяти глицинов и сайты EcoRV эндонуклеазы рестрикции вставлены после (справа от) 3P.
Данное изобретение также относится к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12. В частности, изобретение относится к аминокислотной последовательности (568 а.к.), соответствующей искусственно рекомбинантному гену SLC-3P-Fc. В этой гибридной аминокислотной последовательности SLC находится с положения 1 до положения 134, три глицина находятся с положения 135 до положения 137, PSM находится с положения 140 до положения 201, часть пептида mPAP находится с положения 202 до положения 253, часть пептида PSA находится с положения 254 до положения 327, пять глицинов находятся с положения 374 до положения 378, и IgG1-Fc находится с положения 335 до положения 568.
Данное изобретение также относится к применению рекомбинантной генной последовательности по изобретению, включая SEQ ID NO:1, в получении вакцин.
Как может быть видно из вышесказанного, стратегия для хемотаксического антигена по изобретению является следующей: присоединение хемокина SLC слева от антигена и присоединение Fc иммуноглобулина IgG справа от антигена; введение гибридного гена, состоящего из трех частей, непосредственно в здоровую или опухолевую ткань для экспрессии и секреции; образование состоящего из двух частей объединенного тела через шарнирную область Fc. Указанный рекомбинантный белок активно привлекает DC и Т клетки благодаря хемотаксической активности SLC in vivo. DC захватывает гибридный белок с высокой эффективностью с помощью пиноцитоза, особенно с помощью рецептора Fc и SLC рецептора CCR7. При этом DC несет антиген в клетку. После процессинга и обработки антиген представляется Th и CTL с помощью молекул MHC-II или MHC-I. И, наконец, полностью индуцируется специфический противоопухолевый гуморальный и клеточный иммунный ответ. Кроме того, DC может быть активирована комбинацией фрагмента Fc с Fc рецептором DC. SLC может активно извлекать DC и Т лимфоциты, а также способствовать секреции цитокинов, таких как ИЛ-12, интерферон-γ и интерферон-индуцируемый белок (IP-10), способствовать развитию Th1, подавлять продуцирование TGF-β и VEGF. Таким образом, SLC очень полезен для противоопухолевого иммунитета. По вышеописанным причинам такая комбинация обладает синергическим эффектом и может индуцировать более сильный противоопухолевый иммунный ответ (см. Фиг.1).
В данном изобретении использованы различные рекомбинантные гены, но ими это изобретение не ограничивается. Исследование контроля выявило, что и в форме плазмиды, и в форме гибридного белка рекомбинантный хемокиновый антиген может быть получен промышленным путем. Стадия приготовления DC в данной заявке была опущена. Однако DC могут быть с высокой эффективностью нацелены in vivo. Более того, введение сайтов эндонуклеазы рестрикции с двух сторон гена антигена делает возможной замену антигена для получения вакцин различных хемокиновых антигенов против опухолевых и неопухолевых заболеваний. Например, новая вакцина хемокинового антигена может быть получена заменой антигена HP в SLC-HP-Fc на антиген, относящийся к раку простаты.
Рекомбинантный ген может быть сконструирован в эукариотических векторах с использованием непосредственной инъекции плазмиды в тело или опухоль. Другие методики, такие как генная пушка или электрический импульс, могут увеличить степень трансфекции и эффективность экспрессии. Сконструированный рекомбинантный вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус коровьей оспы, вирус простого герпеса и тому подобные, также могут быть использованы как вакцины для инъекции in vivo. Эукариотические клетки (например СНО) могут быть трансфицированы плазмидами и культивированы in vitro для экспрессии и секреции. Благодаря фрагменту Fc гибридный белок может быть легко и эффективно выделен и очищен методами аффинной хроматографии и использован в качестве белковой вакцины.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает схему механизма генной вакцины хемотаксического антигена по изобретению.
Фиг.2 показывает конструкции плазмид. HP обозначает Her2/neu-р53 гибридный ген; sig обозначает сигнальный пептид.
Фиг.3 показывает рекомбинацию SLC-Her2/neu-Fc по изобретению.
Фиг.4 показывает определение вестерн-блотингом клеточной экспрессии и секреции гибридного белка в клетках, трансфицированных генной вакциной pSLC-HP-Fc. А обозначает лизаты клеток, трансфицированных pSLC-HP-Fc; В обозначает супернатант культуры клеток, трансфицированных pSLC-HP-Fc; С обозначает супернатант культуры клеток, трансфицированных pcDNA.
Фиг.5 показывает эффект по ингибированию опухоли in vivo с помощью предварительной вакцинации генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-HP-Fc).
Фиг.6 показывает время выживания мышей, которым введена опухоль, с помощью предварительной вакцинации генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-HP-Fc).
Фиг.7 показывает эффект по ингибированию опухоли in vivo при воздействии генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-HP-Fc).
Фиг.8 показывает время выживания при воздействии генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-HP-Fc).
Фиг.9 показывает активность CTL после иммунизации генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-HP-Fc).
Фиг.10 показывает количества специфичных антител к HP в сыворотке через 2 и 4 недели после вакцинации. Сыворотку мышей разводили в отношении 1:100. Использовали анализ ELISA.
Фиг.11 показывает, что вакцина pSLC-HP-Fc может индуцировать CTL специфически против Her2/neu и р53 in vitro.
Фиг.12 показывает конструкцию плазмиды pSLC-3P-Fc.
Фиг.13 показывает эффект по ингибированию опухоли in vivo после воздействия генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-3P-Fc).
Фиг.14 показывает время выживания после воздействия генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена (pSLC-3P-Fc).
Фиг.15 показывает принципиальную структуру рекомбинантного гена по изобретению.
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение будет описано далее в деталях и проиллюстрировано. Необходимо понимать, что целью показанных воплощений является лишь пояснить, но никак не ограничить данное изобретение.
Пример 1. Клонирование человеческого гена SLC
мРНК экстрагировали из лимфатических узлов пациента, страдающего раком. С использованием методов, хорошо известных специалистам, сайт Kpnl эндонуклеазы рестрикции был добавлен к прямому праймеру SLC (5'-cggtaccacagacatggctcagtcac-3') и последовательность, кодирующая три глицина и сайт EcoRI эндонуклеазы рестрикции, была добавлена к обратному праймеру SLC (5'-taaattctcctcctcctggccctttagg-3'). Ген SLC был получен ОТ-ПЦР амплификацией. Полученный фрагмент был очищен и вставлен в вектор pUCmT для секвенирования (pUC-SLC). Результаты показывают, что последовательность полученного фрагмента соответствует запланированной последовательности (подчеркнутый фрагмент).
В данном изобретении секвенирование продуктов ПЦР осуществляли с использованием 377 ДНК секвенатора (фирма ABI) методом четырехцветного флуоресцентного терминаторного секвенирования, основанного на методе Сэнгера терминирующих дидезоксинуклеотидов. Последовательность с положения 36 до положения 464 представляет собой последовательность клонированного фрагмента по изобретению (ссылка на SEQ ID NO: 3).
Пример 2. Приготовление и соединение гена Her-2/neu
Сначала два фрагмента гена Her-2/neu клонировали методом ПЦР. Первый фрагмент получали следующим образом: использовался прямой праймер 5'-agaattcaagatctttgggagcctggcatttctgggctacctgctcatcgctcac-3', несущий сайт EcoRI эндонуклеазы рестрикции, и использовался обратный праймер 5'-gatgcccagcccttgca gggccagggcatagttgtc-3'. Плазмиду, содержащую внеклеточный сегмент гена neu, взяли в качестве матрицы и амплифицировали фрагмент, соответствующий аминокислотной последовательности с положения 82 до положения 115, где аминокислота V в положении 103 была заменена аминокислотой L. Второй фрагмент был получен следующим образом: использовали прямой праймер 5'-ctgcaagggctgggcatc-3' и обратный праймер, несущий сайт NcoI эндонуклеазы рестрикции 5'-tccatggcccggttggcagtgtggag-3'. Был амплифицирован фрагмент, соответствующий аминокислотной последовательности с положения 445 до положения 499.
Два продукта ПЦР собрали и соединили в ПЦР системе. Далее полученный фрагмент был использован в качестве матрицы, и с использованием прямого праймера первого фрагмента и обратного праймера второго фрагмента был амплифицирован гибридный ген размером 294 п.н. Затем полученный гибридный ген был вставлен в вектор pUCmT (pUC-Her2P) и секвенирован. Результаты показывают, что последовательность полученного гибридного гена соответствует запланированной последовательности (подчеркнутая последовательность).
Результат показан в SEQ ID NO: 4, где последовательность с положения 121 до положения 465 представляет собой последовательность клонированного фрагмента по изобретению.
Пример 3. Клонирование сегмента гена р53
Фрагмент гена 402 п.н., кодирующий аминокислоты с положения 156 до положения 289 белка р53, был клонирован с плазмиды, содержащей полноразмерный ген р53. Использовали следующие праймеры: прямой праймер с одним сайтом NcoI эндонуклеазы рестрикции представлял собой 5'-асс atg gcc atc tac aag cag tca cag сас atg ac-3'; обратный праймер с одним сайтом EcoRV эндонуклеазы рестрикции представлял собой 5'-tga tat ctt tct tgc gga gat tct ctt c-3'. Полученный фрагмент вставили в вектор pUCmT (pUC-p53P) для секвенирования. Результаты показывают, что последовательность полученного фрагмента соответствует ожидаемой последовательности (подчеркнутый сегмент).
Результат показан в SEQ ID NO: 5, где последовательность с положения 39 до положения 445 представляет собой последовательность фрагмента по изобретению.
Пример 4. Соединение фрагментов Her2/neu и р53
Как показано на Фиг.3, меньший фрагмент из pUC-Her2P, разрезанной с помощью EcoRI/NcoI, и меньший фрагмент из pUC-p53P, разрезанной с помощью NcoI/EcoRV, были лигированы с большим фрагментом из pcDNA3z, разрезанной с помощью EcoRI/EcoRV, чтобы получить плазмиду pcDNA-Her2/p53, называемую также pcDNA-HP. HP означает ген, лигированный из Her2/neu и р53. Искусственно лигированный фрагмент Her2/neu-p53 содержит гены, кодирующие пептид, связывающий молекулы HLA-I и HLA-II.
Пример 5. Конструкция PcDNA-Fc
Сначала химически синтезированный полилинкер был использован, чтобы заменить полилинкер pcDNA3. 1.
Был использован следующий способ конструирования.
Химически синтезировали два олигонуклеотида.
Прямой праймер:
5'-GCTAGCGAAGCTTTGGTACCGTAGGATCCACGAATTCAGTCCA-GGATATCGGCGGTGG-3'
Обратный праймер:
5'-GGTTTAAACGTTAACCCCGGGCCCTCGAGCTCTAGAGCCTCCT-CCACCGCCGATATC-3'
Последние 15 оснований на 3' концах каждого праймера комплементарны друг другу. Продукт ПЦР получали в системе со смесью двух праймеров в соотношении 1:1, ДНК полимеразой Taq и dNTP при 45°С для ренатурации и элонгации. Очищенный продукт вставляли в вектор pUCmT для секвенирования. Результаты показывают, что последовательность полученного продукта соответствует запланированной последовательности. Подчеркнутая последовательность показывает синтезированный сайт поликлонирования. Окончательный сайт поликлонирования представлял собой: «Nhel-HindIII-Kpn1-BamH1-EcoR1-EcoRV- глицин × 5 -Xbal- Xho1- Apa1-Sma1- Hpa1-Pme1». В этой последовательности небольшой фрагмент гена (GGCGGTGGAGGAGGC), кодирующий пять глицинов, был вставлен методу сайтам EcoRV и Xbal. Разрезали клонированную плазмиду Nhel/Pmel и получили фрагмент размером около 100 п.н. Затем этот фрагмент лигировали с большим фрагментом из pcDNA3. 1, разрезанной с помощью Nhel/Pmel, чтобы получить новый вектор, названный pcDNAf.
Результаты секвенирования химически синтезированного полилинкера показаны в SEQ ID NO: 6, где последовательность с положения 3 до положения 100 представляет собой последовательность фрагмента по изобретению.
Способ конструирования плазмиды PcDNA-Fc
Фрагмент Fc был вырезан из плазмиды, содержащей IgG1 Fc, с помощью XbaI/ApaI эндонуклеаз рестрикции и вставлен в вектор pcDNAf, который был обработан теми же самыми эндонуклеазами. Полученная конструкция была названа PcDNA-Fc. Последовательность IgG1 Fc была подтверждена секвенированием полученной плазмиды.
Секвенирование фрагмента Fc
Фрагмент Fc размером 900 п.н. был амплифицирован с плазмиды, содержащей ген IgG1 Fc, с помощью ПЦР и вставлен в вектор pUCmT для секвенирования. Для амплификации использовали следующие праймеры: прямой праймер: 5'-gaattcggagttaacgagcccaaatcttg-3'; обратный праймер: 5'-gggccctcatttacccggagac-3'. Результаты секвенирования показывают, что плазмида содержит шарнирную область и области СН2 и СН3 от IgG1. Это значит, что плазмида содержит Fc (см. подчеркнутую последовательность). Результат показан в SEQ ID NO:7, где последовательность с положения 78 до положения 991 представляет собой последовательность по изобретению.
Пример 6. Соединение гена SLC-Her2/neu-Fc
Как показано на Фиг.3, больший фрагмент из pcDNA-HP, разрезанной KpnI/EcoRI, был присоединен к меньшему фрагменту из pUC-SLC, разрезанной KpnI/EcoRI, для получения pcDNA-SLC-HP. Затем меньший фрагмент из pcDNA-SLC-HP, разрезанной KpnI/EcoRV, был присоединен к большему фрагменту из pcDNA-Fc, разрезанной KpnI/EcoRV, с получением конструкта pcDNA-SLC-HP-Fc (также названного pSLC-HP-Fc).
Конструкция контрольной плазмиды показана на Фиг.2
Пример 7. Определение вестерн-блотингом клеточного и секретируемого рекомбинантного белка в клетках, трансфицированных генной вакциной
Рекомбинантной плазмидой pSLC-HP-Fc были трансфицированы клетки B16-F10 методом липосом. Положительные клоны отобрали с помощью G418. Клетки культивировали в бессывороточной среде 1640 в течение 24 часов, и затем собрали и концентрировали супернатант. Метод вестерн-блотинга был использован для определения экспрессии гибридного белка. Использованное первичное антитело представляло собой поликлональное кроличье антитело к человеческому р53, вторичное антитело представляло собой конъюгированное с пероксидазой хрена козье анти-кроличье антитело. Блоты визуализируют с помощью набора для хемилюминисцентного определения ECL-Plus (Amersham Pharmacia Biotech). В заключение пленку подвергают действию рентгеновских лучей. Результаты показывают, что экспрессия гибридного белка может быть определена в супернатанте и клеточном лизате В16-Р10 клеток, трансфицированных вектором pSLC-HP-Fc. Молекулярный вес соответствует ожидаемому (см. Фиг.4). Было подтверждено, что последовательность гибридного белка представляет собой SEQ ID NO: 2.
Пример 8. Клонирование гена человеческого простат-специфичного мембранного антигена PSM (Prostate Specific Membrane Antigen)
Тотальная РНК была экстрагирована из клеточной линии человеческого рака простаты LNCaP. ОТ-ПЦР была осуществлена с использованием прямого праймера (5'-ACTCGAGAT GAAGACATACAGTGTATC-3') и обратного праймера (5'-TGATATCTTAGGCTAC TTCACTCAAAG-3'). После электрофореза была вырезана полоса hPSM размером 390 п.н. Фрагмент был очищен и извлечен методом Glass Milk. Очищенный фрагмент был лигирован в вектор pUCm-T с получением pUCm-hPSM. Положительный клон были взят и секвенирован. Результаты соответствуют ожидаемым. Если взглянуть на SEQ ID NO: 8, полученный фрагмент гена соответствует последовательности с положения 1864 до положения 2253 ОРС человеческого PSM. Последовательность с положения 229 до положения 618 в полученной последовательности является последовательностью по изобретению.
Пример 9. Клонирование фрагмента гена человеческого простат-специфичного антигена PSA (Prostate Specific Antigen)
Тотальная РНК была экстрагирована из клеточной линии человеческого рака простаты LNCaP. ОТ-ПЦР была осуществлена с использованием прямого праймера (5'-TCTCGAGGGC GGTGTTCTGGTGCA-3') и обратного праймера (5'-AGATATCATGTCC AGCGTCCAGCAC-3'). После электрофореза была вырезана полоса размером около 600 п.н. Фрагмент был очищен и извлечен методом Glass Milk. Полученный фрагмент был вставлен в вектор pUCm-T с получением pUCm-PSA. Положительный клон были взят и секвенирован. Результаты показаны в SEQ ID NO: 9. Полученный фрагмент гена соответствует последовательности с положения 151 до положения 609 ОРС человеческого PSA. Последовательность с положения 45 до положения 503 в полученной последовательности является последовательностью по изобретению.
Пример 10. Клонирование фрагмента гена мышиной PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
Тотальная РНК была экстрагирована из ткани мышиной простаты. ОТ-ПЦР была осуществлена с использованием прямого праймера (5'-TCTAGATGAGAGCTGTTCCTCTG-3') и обратного праймера (5'-GGGCCCTTAATTCCGTCCTTGGTG-3'). После электрофореза была вырезана полоса размером 1146 п.н. Фрагмент был очищен и извлечен методом Glass Milk. Полученный фрагмент был вставлен в вектор pUCm-T с получением pUCm-mPAP. Положительный клон были взят и секвенирован. Результаты показаны в SEQ ID NO: 10. Последовательность с положения 48 до положения 1193 в полученной последовательности является последовательностью по изобретению.
Пример 11. Соединение фрагментов генов PSM, mPAP и PSA (3P)
Фрагмент гена hPSM был клонирован с плазмиды pUCm-hPSM с помощью ПЦР со следующими праймерами: прямой праймер, соответствующий последовательности с положения 1987 до положения 2007 ОРС hPSM (вставлен сайт EcoRI эндонуклеазы рестрикции) представлял собой 5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3'; обратный праймер представлял собой 5'-AGCACTCATCAAAGTCCTGGCCTTGGAAGGGTCCAC-3' (подчеркнутая часть соответствует последовательности с положения 328 до положения 345 ОРС mPAP, остальная часть соответствует последовательности с положения 2155 до положения 2172 ОРС hPSM). После электрофореза полученный фрагмент hPSM был вырезан и очищен методом Glass Milk. Фрагмент гена mPAP был клонирован с плазмиды pUCm-mPAP с помощью ПЦР со следующими праймерами: прямой праймер, соответствующий последовательности с положения 328 до положения 348 OPC mPAP представлял собой 5'-AGGACTTTGATGAGTGCTATG-3'; обратный праймер, соответствующий последовательности с положения 463 до положения 483 OPC mPAP представлял собой 5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3'. После электрофореза полученный фрагмент mPAP был вырезан и очищен методом Glass Milk. Фрагмент гена hPSA был клонирован с плазмиды pUCm-hPSA с помощью ПЦР со следующими праймерами: прямой праймер представлял собой 5'-CCTTTCAGAGACTGCCCTGGCGGTGTTC TGGTGCAC-3' (подчеркнутая часть соответствовала последовательности с положения 466 до положения 483 OPC mPAP, и оставшаяся часть соответствовала последовательности с положения 151 до положения 168 OPC hPSA); обратный праймер представлял собой 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGT-3'. После электрофореза полученный фрагмент hPSA был вырезан и очищен методом Glass Milk.
Праймер 5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3' был использован для амплификации hPSM, а праймер 5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3' был использован для амплификации mPAP индивидуально в 25 мкл системы на 10 циклов, чтобы получить одиночные цепи. Затем две системы были смешаны для дальнейшей ПЦР в 50 мкл системы на 18 циклов. После электрофореза полученный фрагмент hPSM-mPAP размером 352 п.н. был вырезан и очищен методом Glass Milk.
Праймер 5'-AGGACTTTGATGAGTGCTATG-3' (соответствующий последовательности с положения 328 до положения 348 OPC mPAP) был использован для амплификации mPAP, и праймер 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG-3' (соответствующий последовательности с положения 355 до положения 372 OPC PSA) был использован для амплификации hPSA индивидуально в 25 мкл системы на 10 циклов, чтобы получить одиночные цепи. Затем две системы были смешаны для дальнейшей ПЦР в 50 мкл системы на 18 циклов. После электрофореза полученный фрагмент mPAP-hPSA размером 378 п.н. был вырезан и очищен методом Glass Milk.
Праймер 5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3' был использован для амплификации hPSM-mPAP, и праймер 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG-3' был использован для амплификации mPAP-hPSA индивидуально в 25 мкл системы на 10 циклов, чтобы получить одиночные цепи. Затем две системы были смешаны для дальнейшей ПЦР в 50 мкл системы на 18 циклов. После электрофореза полученный фрагмент hPSM-mPAP-hPSA размером 564 п.н. был вырезан и очищен методом Glass Milk. Полученный фрагмент был вставлен в вектор pUCm-TV для секвенирования. Результаты соответствуют ожидаемыми. Смотри SEQ ID NO: 11, где последовательность с положения 54 до положения 629 является последовательностью по изобретению.
Пример 12. Рекомбинация гена хемокинового антигена SLC-3P-Рс
После секвенирования плазмида, содержащая корректную генную последовательность 3P (3P обозначает гибридный ген PSM-PAP-PSA размером 564 п.н., кодирующий 188 аминокислот) была разрезана EcoRI/EcoRV эндонуклеазами рестрикции. Полученный меньший фрагмент 3P был лигирован с разрезанным EcoRI/EcoRV вектором pSLC-HP-Fc с получением конструкции pSLC-3P-Рс (см. Фиг.12). Последовательность рекомбинантного гена SLC-3P-Fc показана в SEQ ID NO: 12, которая соответствует аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13.
Тестовые примеры
Тест 1. Определение хемоатаксической активности гибридного белка в отношении иммунных клеток в камере Бойдена
Извлечение активности человеческого SLC in vitro:
А. Клеточная линия меланолмы B16F10 была трансфицирована очищенной плазмидой pcDNA3z-SLC-HP-Fc и контрольной плазмидой. Через 48 часов инкубации собрали культуральную среду и концентрировали с помощью PEG20000 (в качестве негативного контроля был использован супернатант нетрансфицированных клеток B16-F10).
Б. Клетки мононуклеаров периферической крови (РВМС, от peripheral blood mononuclear cells) были собраны из 5 мл здоровой цельной периферической крови с помощью среды для отделения лимофцитов (Lymphocyte Separation Medium), промыты дважды физиологическим раствором и ресуспендированы в бессывороточной среде RPMI-1640. РВМС были подсчитаны и разбавлены до концентрации 1×106/мл.
В. Приготовление камеры Бойдена: камера была приобретена у Neuro Probe Co. Нижние лунки камеры заполнили 27 мкл кондиционированной культуральной среды, а верхние - 50 мкл клеточной суспензии 1×106/мл РВМС. Нижние и верхние лунки были разделены поликарбонатным фильтром (Neuro Probe) с размером отверстий 5 мкм. Камеру инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 4 ч.
Г. Фильтр выгрузили, и клетки соскоблили с верхней стороны фильтра, а затем промыли, фиксировали и окрасили фильтр. Мигрировавшие клетки были подсчитаны в пяти произвольно выбранных полях большой мощности (×200). Хемотаксический индекс Cl (Chemotactic Index) был подсчитан следующим образом: Cl = число клеток пяти полей большой мощности в исследованных лунках / число клеток пяти полей большой мощности в контрольных лунках. Величина Cl негативной группы была 1.
| Таблица 1 | |||
| Определение хемоатаксической активности гибридного белка | |||
| Группы | Подсчет хемоатаксических клеток | Cl | Величина Р |
| Негативный контроль | 34±10,4 | 1 | |
| Контрольный вектор | 44,6±11,9 | 1,31 | >0,05* |
| psig-HP | 68,6±9,5 | 2,02 | <0,05* |
| pSLC-HP-Fc | 157,4±19,2 | 4,63 | <0,01*<0,05** |
| pSLC | 156,6±20,3 | 4,61 | <0,01*<0,05** |
| * относительно негативного контроля | |||
| ** относительно psig-HP | |||
Результаты: Уровень хемоатаксической активности бессывороточного супернатанта клеток, трансфицированных pSLC-HP-Fc, значительно выше, чем у других, что означает, что после трансфекции плазмида может быть экспрессирована, и экспрессируемый белок активен. Уровень хемоатаксической способности клетки, трансфицированной pSLC-HP-Fc, аналогичен таковому у клетки, трансфицированной pSLC, что означает, что гибридный белок не повреждает активности SLC.
Тест 2. Противоопухолевый иммунный ответ на генную вакцину человеческого хемотаксического антигена у мышей
Частицы золота были нагружены плазмидами (голыми генами) и нанесены на внутреннюю поверхность трубки Tefzel, разрезанной на подходящие сегменты для пуль, чтобы доставить 1 мкг ДНК, согласно инструкции BioRad. Было выделено несколько контрольных групп: контрольный вектор, pSLC-Fc, psig-HP (плазмида, экспрессирующая HP, содержащий сигнальный пептид SLC), pSLC-HP и psig-HP-Fc.
Тест 3. Иммунный ответ против рака
За 14 дней и за 7 дней до введения опухоли мышей вакцинировали дважды pSLC-HP-Fc или контрольными векторами в кожу брюшного отдела. На день 0 каждой мыши ввели 5×104 опухолевых клеток B16F10 (B16F10 клетки были трансфицированы геном HP и отобраны на G418) в 0,2 мл раствора. Размер опухоли записывали 2-3 раза в неделю. Размер опухоли подсчитывали в виде длина (см) × ширина (см2).
Результаты: Вакцинация дважды с помощью pSLC-HP-Fc значительно улучшала эффект подавления опухоли (см. Фиг.5, 6), и среднее время выживания мыши значительно продлялось. Терапевтический эффект pSLC-HP-Fc значительно лучше, чем у других векторов (р<0,05), что указывает на синергическое иммунное действие фрагментов SLC и Fc.
Тест 4. Иммунотерапия рака
На день 0 каждой мыши ввели 5×104 опухолевых клеток B16F10 в 0,2 мл раствора. В дни 6, 12 и 18 мыши были вакцинированы с помощью системы генной пушки (Gene Gun System). Размер опухоли записывали 2-3 раза в неделю. Размер опухоли оценивали, как указано выше.
Результаты: Как показано на Фиг.7 и 8, вакцина pSLC-HP-Fc демонстрирует наиболее эффективное подавление роста опухоли. На день 28 разница между группами pSLC-HP-Fc и psig-HP-Fc является значительной (Р<0,05). Среднее время выживания мыши продлялось при иммунизации pSLC-HP-Fc. Мышам в группе В16 (pSLC-HP-Fc) вводили клетки В16 дикого типа. После трех иммунизаций pSLC-HP-Fc, группа В16 показала отсутствие эффекта супрессии опухоли, означая, что иммунный ответ, индуцированный pSLC-HP-Fc, является специфичным к HP антигену.
Тест 5. CTL активность, индуцированная генной вакциной опухоль-хемотаксического антигена
Через две недели после трехкратной вакцинации системой генной пушки несущие опухоль мыши были убиты, и анализ на цитотоксичность CTL был проведен с использованием клеток селезенки с помощью LDH Kits (Promega). Отношение клеток селезенки и клеток-мишеней (отношение эффектор:мишень, Э:М) составило 40:1, 20:1 и 10:1 соответственно.
Результаты: Лимфоциты, происходящие из мышей, иммунизированных вакциной хемокинового нуклеотида, показали значительный цитотоксический эффект на клетки B16F10-HP (см. Фиг.9). Когда отношения Э:М были 40:1 или 20:1, имелась все еще значительная разница между исследуемой вакциной и контрольными векторами (Р<0,05), что подтверждает, что вакцина является более сильной в отношении индукции CTL активности.
Тест 6. Определение специфических антител в сыворотке иммунизированных мышей
Количество HP-специфичных антител в сыворотке группы иммунизированных мышей было определено с помощью ELISA через 2 и 4 недели после иммунизации (pSLC-HP-Fc). Вкратце, микротитрационные планшеты, покрытые рекомбинантным белком р53, были инкубированы в течение ночи, блокированы 20% телячьей сывороткой и инкубированы с первичными антителами (серийно разведенной мышиной сывороткой) и, в свою очередь, вторичными антителами (конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антимышиными IgG). После промывания и визуализации с помощью O-фенилендиамина, величина ОП измерялась на 490 нм. Моноклональное антитело против р53 было использовано в качестве позитивного контроля, и нормальная мышиная сыворотка была использована в качестве негативного контроля.
Результаты: Уровень антитела р53 у мышей, иммунизированных SLC-HP-Fc, является наивысшим и значительно выше, чем уровень при других векторах (см. Фиг.10).
Тест 7. Специфические человеческие CTL против Her-2/neu или р53, индуцированные иммунизацией pSLC-HP-Fc, in vitro
С помощью центрифугирования с использованием среды для отделения лимфоцитов были собраны клетки мононуклеаров (MNCs, mononuclear cells) из цельной периферической крови здоровых доноров HLA-A2+. Половина MNCs была трансфицирована плазмидой pSLC-HP-Fc с использованием липосом и инкубирована с необработанными MNCs в отношении 1:1 при 37°С с 5% CO2. На день 6 были подсчитаны жизнеспособные клетки, ресуспендированы и культивированы с различными клетками-мишенями в различных соотношениях Э:М в 96-луночных микропланшетах. Анализ LDH (Promega Kits) был использован для анализа цитотоксичности.
Результаты: После смешения культур трансфицированные pSLC-HP-Fc MNC индуцировали специфичный CTL, чтобы убить клетки опухоли, которые сверхэкспрессируют Her2/neu или р53 МНС-рестриктирующим образом (см. Фиг.11). То есть только специфичные CTL в значительной степени убивают HLA-A2+ клетки опухоли, которые экспрессируют Her2/neu или р53, указывая на специфичность CTL, индуцированных генной вакциной хемотаксического антигена.
Тест 8. Противодействие раку простаты генной вакцины хемокинового антигена pSLC-3P-Рс in vivo
5×104 клеток рака В16-3P (трансфицированные pcDNA-3P клетки рака В16, отобранные на G418) были введены в бок мышам C57BL/6 (восемь мышей в каждой группе). Мыши были иммунизированы на третий, восьмой и тринадцатый день после введения клеток опухоли. В контрольных группах были использованы контрольные векторы pSLC-Fc и psig-3P (плазмида, содержащая ген сигнального пептида SLC слева от гена 3P). Наблюдали за размерами опухоли и временем выживания.
Результаты: Как показано на Фиг.13 и 14, генная вакцина хемокинового антигена (pSLC-3P-Fc) значительно ингибирует рост опухоли (по сравнению с контрольными группами Р<0,05) и значительно удлиняет время выживания (по сравнению с контрольными группами Р<0,05), означая, что изменение антигена в генной вакцине хемотаксического антигена может дать другие вакцины против соответствующего антигена.
Claims (10)
1. Рекомбинантная генная конструкция для индукции иммунного ответа, содержащая ген SLC человека, ген антигена и ген Fc-фрагмента IgG1, где ген SLC находится слева от гена антигена и ген Fc-фрагмента IgG1 находится справа от гена антигена.
2. Рекомбинантная генная конструкция по п.1, где указанный ген антигена включает Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM.
3. Рекомбинантная генная конструкция по п.1 или 2, где сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRI и гены трех глицинов находятся между геном SLC и геном антигена, а сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRV и гены пяти глицинов находятся между геном антигена и геном Fc-фрагмента IgG1.
4. Рекомбинантная генная конструкция по п.1, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1.
5. Рекомбинантная генная конструкция по п.1, которая имеет последовательность SEQ ID NO:12.
6. Рекомбинантный полипептид для индукции иммунного ответа, характеризующийся аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:1.
7. Полипептид по п.6, где аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:2.
8. Рекомбинантный полипептид для индукции иммунного ответа, характеризующийся аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:12, где аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:13.
9. Вакцина для индукции иммунного ответа, содержащая рекомбинантную генную конструкцию по п.1 или соответствующий рекомбинантный полипептид.
10. Вакцина по п.9, где указанная генная конструкция представлена SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, или их соответствующей аминокислотной последовательностью.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100379103A CN100342017C (zh) | 2004-05-10 | 2004-05-10 | 基因重组趋化抗原疫苗 |
| CN200410037910.3 | 2004-05-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006142760A RU2006142760A (ru) | 2008-06-20 |
| RU2396348C2 true RU2396348C2 (ru) | 2010-08-10 |
Family
ID=35320238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006142760/13A RU2396348C2 (ru) | 2004-05-10 | 2005-05-09 | Рекомбинантная генная конструкция для индукции иммунного ответа, рекомбинантный полипептид и вакцина |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8133873B2 (ru) |
| EP (1) | EP1748075B1 (ru) |
| JP (1) | JP4838238B2 (ru) |
| CN (1) | CN100342017C (ru) |
| AT (1) | ATE462792T1 (ru) |
| AU (1) | AU2005240691B2 (ru) |
| CA (1) | CA2566299C (ru) |
| DE (1) | DE602005020272D1 (ru) |
| ES (1) | ES2343419T3 (ru) |
| HK (1) | HK1102076A1 (ru) |
| PL (1) | PL1748075T3 (ru) |
| RU (1) | RU2396348C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005108584A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AP2007003869A0 (en) | 2004-08-03 | 2007-02-28 | Transtech Pharma Inc | Rage fusion proteins and methods of use |
| CN102803292A (zh) | 2009-04-20 | 2012-11-28 | 辉瑞公司 | 蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法 |
| CN104877969A (zh) * | 2014-12-14 | 2015-09-02 | 刘滨磊 | 重组溶瘤性ii型单纯疱疹病毒及其药物组合物 |
| MX2017011732A (es) * | 2015-03-18 | 2018-08-15 | Omnicyte | Proteínas de fusión que comprenden glicoproteínas de la superficie del virus alfa modificado y antígeno asociado al tumor y métodos de los mismos. |
| CN105343874A (zh) * | 2015-11-11 | 2016-02-24 | 固安鼎泰海规生物科技有限公司 | 一种前列腺癌核酸疫苗 |
| CN107281475B (zh) * | 2017-06-15 | 2020-12-25 | 杭州贝罗康生物技术有限公司 | 一种预防及治疗肿瘤的基因疫苗及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0974357A1 (en) * | 1998-07-16 | 2000-01-26 | Schering-Plough | Chemokines as adjuvants of immune response |
| ATE457317T1 (de) | 1999-10-12 | 2010-02-15 | Chemocentryx Inc | Chemokine rezeptor |
| AU1551801A (en) * | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Shionogi & Co., Ltd. | Chemokine slc-il2 fused protein and gene thereof |
| EP1118331A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-25 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Method for enhancing the presentation of exogenous antigen by human antigen-presenting cells and opsonized micro particle complexes for applying this method |
| WO2002058723A2 (en) * | 2001-01-24 | 2002-08-01 | Schering Corporation | Chemokines as adjuvants of immune response |
| EP1256354A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-13 | Schering Corporation | Methods for treating cancer |
| WO2003055439A2 (en) * | 2001-07-18 | 2003-07-10 | The Regents Of The University Of California | Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response |
-
2004
- 2004-05-10 CN CNB2004100379103A patent/CN100342017C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-05-09 DE DE602005020272T patent/DE602005020272D1/de active Active
- 2005-05-09 US US11/596,100 patent/US8133873B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-09 JP JP2007511835A patent/JP4838238B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-09 WO PCT/CN2005/000639 patent/WO2005108584A1/zh active Application Filing
- 2005-05-09 ES ES05745450T patent/ES2343419T3/es active Active
- 2005-05-09 PL PL05745450T patent/PL1748075T3/pl unknown
- 2005-05-09 CA CA2566299A patent/CA2566299C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-09 EP EP05745450A patent/EP1748075B1/en not_active Not-in-force
- 2005-05-09 AT AT05745450T patent/ATE462792T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-05-09 AU AU2005240691A patent/AU2005240691B2/en not_active Ceased
- 2005-05-09 RU RU2006142760/13A patent/RU2396348C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-27 HK HK07108256.5A patent/HK1102076A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЕО S.K. et aL, Immunopotentiation of DNA vaccine against herpes simplex virus via co-delivery of plasmid DNA expressing CCR7 ligands, Vaccine, 2001, v.19, n.32, p.4685-4693. YOU Z. et al., Targeting dendritic cells to enhance DNA vaccine potency, Cancer Res., 2001, v.61, n.9, p.3704-3711. KELLERMANN S.A. et al., The CC chemokine receptor-7 ligands 6Ckine and macrophage inflammatory protein-3 beta are potent chemoattractants for in vitro- and in vivo-derived dendritic cells, J. Immunol., 1999, v.162, n.7, p.3859-3864. SHARMA S. et al., Secondary lymphoid tissue chemokine mediates Т cell-dependent antitumor responses in vivo, J. Immunol., 2000, v.164, n.9, p.4558-4563. VICARI A.P. et al., Antitumor effects of the mouse chemokine 6Ckine/SLC through angiostatic and immunological mechanisms, J. Immunol., 2000, v.165, n.4), p.1992-2000. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1748075B1 (en) | 2010-03-31 |
| CA2566299C (en) | 2011-12-06 |
| EP1748075A1 (en) | 2007-01-31 |
| AU2005240691B2 (en) | 2009-06-04 |
| CN100342017C (zh) | 2007-10-10 |
| AU2005240691A1 (en) | 2005-11-17 |
| ATE462792T1 (de) | 2010-04-15 |
| CN1696293A (zh) | 2005-11-16 |
| US20090209729A1 (en) | 2009-08-20 |
| EP1748075A8 (en) | 2007-09-26 |
| WO2005108584A1 (fr) | 2005-11-17 |
| EP1748075A4 (en) | 2008-01-02 |
| ES2343419T3 (es) | 2010-07-30 |
| PL1748075T3 (pl) | 2010-09-30 |
| JP2007535949A (ja) | 2007-12-13 |
| CA2566299A1 (en) | 2005-11-17 |
| JP4838238B2 (ja) | 2011-12-14 |
| RU2006142760A (ru) | 2008-06-20 |
| US8133873B2 (en) | 2012-03-13 |
| HK1102076A1 (en) | 2007-11-02 |
| DE602005020272D1 (de) | 2010-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3907698B2 (ja) | 抗原を発現する組み換えウイルスと免疫刺激分子を発現する組み換えウイルスとを含む組成物 | |
| JP4764585B2 (ja) | タンパク質抗原およびペプチド抗原の免疫原性を増強するためのｆｃ融合タンパク質 | |
| AU705889B2 (en) | Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory peptides | |
| US5830877A (en) | Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory | |
| EP0584266B1 (en) | Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof | |
| US7083943B1 (en) | Polynucleotides related to murine anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof | |
| ES2321246T3 (es) | Nuevos vectores de expresion que contienen genes de ligandos de moleculas accesorias y su uso para inmunomodulacion y tratamiento de tumores malignos y enfermedades autoinmunes. | |
| JP2008523818A (ja) | 腫瘍免疫療法におけるフラジェリンの使用 | |
| RU2396348C2 (ru) | Рекомбинантная генная конструкция для индукции иммунного ответа, рекомбинантный полипептид и вакцина | |
| JP2006506072A (ja) | アデノウイルスベクターワクチン | |
| Warnier et al. | Induction of a cytolytic T‐cell response in mice with a recombinant adenovirus coding for tumor antigen P815A | |
| USRE39789E1 (en) | Tumor therapy | |
| WO2019101062A9 (zh) | 重组疫苗及其应用 | |
| JP2005526520A (ja) | Ｖｎｔｒ反復ユニットの数が減少したｍｕｃ−１抗原 | |
| WO2000025827A2 (en) | Dna molecules encoding muc-1 and use thereof in tumor vaccination | |
| ES2297479T3 (es) | Infiltracion aumentada en tumor de celulas t por el mutante ligth. | |
| US20050221435A1 (en) | Biological material for preparing pharmaceutical compositions intended for treating mammals | |
| US20030206886A1 (en) | Neutralization of immune suppressive factors for the immunotherapy of cancer | |
| JPH09509682A (ja) | ペスチウイルスのｔ細胞刺激性タンパク質 | |
| WO1998015285A9 (en) | Methods and compositions for inducing a protective immune response to cancers | |
| BenAmmar-Ceccoli et al. | Recombinant vaccinia viruses expressing immunoglobulin variable regions efficiently and selectively protect mice against tumoral B-cell growth | |
| WO2004092216A1 (en) | Carcinoembryonic antigen (cea) lacking a signal peptide, nucleic acid encoding it and fusion of cea with a t cell epitope and their use for the treatment and/or prophylaxis of cancer | |
| EP0926156A2 (en) | Vector comprising Mycobacterium tuberculosis 38 kDa antigen for neoplasm treatment | |
| EP1515987A2 (en) | Mutated hpv-16 e7 polypeptide, pharmaceutical composition comprising it and its preparation process |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140510 |