ES2343419T3 - Vacuna quimiocina antigenica recombinante. - Google Patents
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Abstract
Secuencia genética recombinante que comprende un gen de la SLC humana, un gen antigénico y un gen del fragmento de la IgG1-Fc, enlazándose el gen de la SLC en dirección 5'' con el gen antigénico, y enlazándose el gen del fragmento de la IgG1-Fc en dirección 3'' con el gen antigénico.
Description
Vacuna quimiocina antigénica recombinante.
La presente invención se refiere a una nueva
secuencia genética recombinante, a una proteína de fusión expresada
a parir del gen, y a las vacunas producidas con el gen, así como a
distintas vacunas genéticas producidas sustituyendo el gen
antigénico de la secuencia recombinante, o a la utilización de
productos de expresión tales como vacunas de péptidos de
fusión.
La quimiocina tejido linfático secundario (SLC)
en seres humanos ha llamado mucho la atención desde su
descubrimiento. La SLC regula la secreción de las citocinas, altera
los estados de inmunodepresión del microentorno de tumores, y
activa el desarrollo de los Th1. Por lo tanto, la SLC resulta útil
en la inmunidad antitumoral. Además, la SLC tiene el efecto de
atraer los linfocitos y las células dendríticas (DC). La inyección
intratumoral provoca respuestas inmunitarias antitumorales locales
y sistémicas. La SLC puede regular asimismo la inhibición de la
angiogénesis de los tumores. Por lo tanto, la SLC es muy útil en la
inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, la utilización de la
proteína SLC sola o un método transgénico no supuso unos resultados
satisfactorios en la inmunidad antitumoral. Si-Yi
Chen et al. ha propuesto que la reacción inmunitaria
antitumoral se puede potenciar inmunizando ratones con DC sometidas
a transfección con un vector retrovírico recombinante que contenga
genes que codifiquen el fragmento IgG Fc y el antígeno tumoral. El
mecanismo consiste en que la proteína de fusión secretada y
expresada a partir de las DC la vuelven a capturar las DC mediante
el receptor Fc (FcR), y a continuación el epítopo de la proteína de
fusión se presenta a linfocitos T auxiliares (Th) mediante
moléculas MHC de clase II y la presentación cruzada a linfocitos T
citotóxicos (CTL) mediante moléculas MHC de clase I, mediante las
que se provoca sistémicamente la inmunidad antitumoral
humoral-y-celular. Serre K et
al. han publicado que la capacidad de las DC para capturar
antígenos mediante la endocitosis en la que interviene el FcR es
10.000 veces superior que mediante pinocitosis. Sin embargo, el
aislamiento, amplificación y transfección génica de las DC aumentan
la complejidad de la producción de la vacuna. En este caso, se han
de preparar las DC individualmente, lo que dificulta el control de
la calidad y la producción industrial.
Para superar los inconvenientes de las técnicas
anteriores, un objetivo de la presente invención es proporcionar
una nueva secuencia genética recombinante.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar una proteína de fusión expresada por la secuencia
genética recombinante.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar a vacuna genética de la proteína de fusión codificada
por la secuencia genética recombinante según la presente
invención.
Además, el objetivo de la presente invención es
proporcionar una vacuna genética del antígeno quimiotáctico tumoral
recombinante.
Para alcanzar los objetivos de la presente
invención, se adoptaron las siguientes soluciones técnicas:
- La presente invención se refiere a una secuencia genética recombinante, que comprende un gen de la SLC humana, un gen antigénico, y un gen del fragmento de la IgG1-Fc, en la que el gen de la SLC se enlaza en dirección 5' con el gen antigénico y el gen del fragmento de la IgG1-Fc se enlaza en dirección 3' con el gen antigénico. Dicho gen antigénico comprende los marcadores Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE 2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1, tirosinasa, CEA, idiotipo de la Ig, gp100, melan A, gp75, TRP-1, TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1, y genes que codifican las proteínas relacionadas con los virus HCV, HIV y microorganismos patógenos.
En la secuencia genética recombinante según la
presente invención, sitios de la endonucleasa de restricción EcoRI
y se encuentran presentes genes de tres glicinas entre el gen de la
SLC y el gen antigénico, y sitios de la endonucleasa de restricción
EcoRV y se encuentran presentes genes de cinco glicinas entre el gen
antigénico y el gen del fragmento de la
IgG1-Fc.
La secuencia genética recombinante de la
presente invención comprende la SEC ID N.º:1 y la SEC ID N.º:
12.
La presente invención se refiere asimismo a una
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética
recombinante según la presente invención. Dicha secuencia de
aminoácidos comprende la SEC ID N.º: 2.
La presente invención se refiere asimismo a una
secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID N.º: 12. Dicha
secuencia de aminoácidos es la SEC ID N.º: 13.
La presente invención se refiere asimismo a una
vacuna genética, que comprende la secuencia genética recombinante
de la presente invención.
Además, la presente invención se refiere
asimismo a una vacuna genética. Preferentemente, la vacuna genética
comprende la SEC ID N.º: 1, la SEC ID N.º: 12 y las secuencias de
aminoácidos correspondientes.
En otras palabras, la presente invención se
refiere a una secuencia genética recombinante, que comprende un gen
de la SLC humana, un gen antigénico y un gen del fragmento de la
IgG1-Fc, en la que el gen de la SLC se enlaza en
dirección 5' con el gen antigénico, y el gen del fragmento de la
IgG1-Fc se enlaza en dirección 3' con el gen
antigénico. Dicho gen antigénico comprende los marcadores Her2/neu,
P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE 2, CAG3,
RAGE, NY-ESO-1, tirosinasa, CEA,
idiotipo de la Ig, gp100, melan A, gp75, TRP-1,
TRP-2, CDK4, CASP-8, ras, bcr/abl,
MUC-1, y otros genes que codifican las proteínas
relacionadas con los virus HCV, HIV y otros microorganismos
patógenos. Los sitios de la endonucleasa de restricción EcoRI y los
genes de tres glicinas se encuentran presentes entre el gen de la
SLC y el gen antigénico de la presente invención, y los sitios de
la endonucleasa de restricción EcoRV y los genes de cinco glicinas
se encuentran presentes entre gen el antigénico y el gen del
fragmento de la IgG1-Fc.
La presente invención se refiere asimismo a la
utilización de la secuencia genética recombinante de la presente
invención al preparar vacunas genéticas. Principalmente, una vacuna
genética, que comprende la secuencia genética de la presente
invención, en particular, la SEC ID N.º: 1, la SEC ID N.º: 12 y las
secuencias de aminoácidos correspondientes de la SEC ID N.º: 2 y la
SEC ID N.º: 13.
En otras palabras, la presente invención se
refiere a una secuencia genética recombinante, que comprende un gen
de la SLC humana, un gen antigénico y un gen del fragmento de la
IgG1-Fc (véase la figura 13). El gen de la SLC se
enlaza en dirección 5' con el gen antigénico, y se introducen los
sitios de la endonucleasa de restricción EcoRI y los genes de tres
glicinas. El gen del fragmento de la IgG1-Fc se
enlaza en dirección 3' con el gen antigénico, y se introducen los
sitios de la endonucleasa de restricción EcoRV y los genes de cinco
glicinas.
Según la presente invención, la sustitución del
gen antigénico en dichos genes mediante los sitios de la
endonucleasa de restricción puede producir diversos genes de fusión
antigénicos quimiotácticos. En particular, la presente invención se
refiere a un gen recombinante que comprende la secuencia de ácido
nucleico SEC ID N.º: 1. La secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º:
1 es la secuencia artificialmente ligada de
SLC-Her2/P53-Fc, en la que el gen
de la SLC se dispone desde la posición 1 hasta la posición 402 del
ácido nucleico; el gen ligador Her2 se dispone desde la posición
418 hasta la posición 711 del ácido nucleico. Los ácidos nucleicos
que se encuentran desde la posición 418 hasta la posición 444 en el
gen recombinante corresponden a los de la posición 1105 hasta la
posición 1131 en el marco de lectura abierto (ORF) del gen Her2/neu.
Los ácidos nucleicos desde la posición 445 hasta la posición 546 en
el gen recombinante corresponden a aquellos desde la posición 244
hasta la posición 345 en el marco de lectura abierto (ORF) del gen
Her2/neu, en el que se introduce una mutación desde G hasta C en la
posición 250. Los ácidos nucleicos desde la posición 547 hasta la
posición 711 en el gen recombinante corresponden a aquéllos desde
la posición 1333 hasta la posición 1479 en el ORF del gen Her2/neu.
En el gen recombinante, una parte del gen P53 se dispone desde la
posición 712 hasta la posición 1113, correspondiendo a los ácidos
nucleicos desde la posición 475 hasta la posición 876 del ORF p53.
El gen del IgG Fc gen (comprendiendo los intrones) se dispone desde
la posición 1147 hasta la posición 2057 en el gen recombinante, en
el que los dos intrones se disponen desde la posición 1189 hasta la
posición 1309, y desde la posición 1640 hasta la posición 1739,
respectivamente. La secuencia de ácido nucleico desde la posición
1147 hasta la posición 1189 es la secuencia bisagra de la región C.
La secuencia de ácido nucleico desde la posición 1310 hasta la
posición 1369 es para el CH2 y la secuencia de ácido nucleico desde
la posición 1740 hasta la posición 2057 es para el CH3. Se
introducen tres genes de glicinas y sitios de la endonucleasa de
restricción EcoRI en dirección 5' en el fragmento Her2/P53, y se
introducen cinco genes de glicinas y sitios de la endonucleasa de
restricción EcoRV en dirección 3' en Her2/P53. Según la presente
invención, para hacer que sea normal la función biológica de los
factores expresados, se introducen entre 3 y 5 genes de glicinas en
dirección 5' y en dirección 3' en el gen antigénico. El efecto de
los genes glicina es evitar que el antígeno recombinante interfiera
con la estructura tridimensional.
La presente invención se refiere asimismo a una
secuencia de aminoácidos (612aa, mat589aa) de la SEC ID N.º: 2
codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º: 1, en
la que SEC ID N.º: 1 es un gen artificialmente recombinante
SLC-Her2/P53-Fc. En dicha secuencia
de aminoácidos, el fragmento SLC se dispone desde la posición 1
hasta la posición 134, tres glicinas se disponen desde la posición
135 hasta la posición 137, y una parte del péptido Her2 se dispone
desde la posición 140 hasta la posición 237. Los aminoácidos desde
la posición 140 hasta la posición 148 en la proteína de fusión
corresponden a los desde la posición 369 hasta la posición 377 en
Her2/neu. Los aminoácidos desde la posición 149 hasta la posición
182 en la proteína de fusión corresponden a los desde la posición
82 hasta la posición 115 en Her2/neu, en los que se introduce una
mutación desde V hasta L en la posición 84. Los aminoácidos desde
la posición 183 hasta la posición 238 en la proteína de fusión
corresponden a los desde la posición 445 hasta la posición 499 en
Her2/neu. Una parte del péptido P53 se dispone desde la posición
238 hasta la posición 371 en la proteína de fusión (que corresponde
a los aminoácidos desde la posición 159 hasta la posición 292 en la
forma natural P53). Las cinco glicinas se disponen desde la posición
374 hasta la posición 378. El IgG Fc se dispone desde la posición
383 hasta la posición 612, en el que la secuencia desde la posición
383 hasta la posición 396 es para la articulación de la región C, la
secuencia desde la posición 397 hasta la posición 506 es para el
CH2, y la secuencia desde la posición 507 hasta la posición 612 es
para el CH3.
La presente invención se refiere asimismo a otro
gen recombinante para la vacuna del cáncer de próstata, cuya
secuencia se representa mediante la SEC ID N.º: 12. La secuencia de
nucleótidos de la SEC ID N.º: 12 es una secuencia del gen
artificialmente ligado
SLC-PSM-mPAP-PSA-Fc
(SLC-3P-Fc), en el que únicamente se
introducen las secuencias parciales del PSM (antígeno de membrana
específico de la próstata humana), mPAP (fosfatasa ácida prostática
de ratón), y PSA (antígeno específico de la próstata humana). En el
gen de fusión, el gen de la SLC se dispone desde la posición 1
hasta la posición 402; una parte del gen del PSM se dispone desde
la posición 418 hasta la posición 603, correspondiendo a la
secuencia desde la posición 1987 hasta la posición 2172 en el marco
de lectura abierto (ORF) del PSM; el gen mPAP se dispone desde la
posición 604 hasta la posición 759, correspondiendo a la secuencia
desde la posición 328 hasta la posición 484 en el ORF del mPAP; el
gen del PSA se dispone desde la posición 760 hasta la posición 981,
correspondiendo a la secuencia desde la posición 151 hasta la
posición 372 en el ORF del PSA; el gen del IgG Fc (comprendiendo los
intrones) se dispone desde la posición 1003 hasta la posición 1925,
en el que los dos intrones se disponen desde la posición 1057 hasta
la posición 1177 y desde la posición 1508 hasta la posición 1607,
respectivamente. Se introducen los genes de las tres glicinas y los
sitios de la endonucleasa de restricción EcoRI en dirección 5' hasta
3P, y se introducen los genes de las cinco glicinas y los sitios de
la endonucleasa de restricción EcoRV en dirección 3' hasta 3P.
La presente invención se refiere asimismo a la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 13 codificada por la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º: 12. En particular, la
presente invención se refiere a la secuencia de aminoácidos (568aa)
que corresponde al gen artificialmente recombinante
SLC-3P-Fc. En dicha secuencia de
fusión de aminoácidos, la SLC se dispone desde la posición 1 hasta
la posición 134, tres glicinas se dispone desde la posición 135
hasta la posición 137, PSM se dispone desde la posición 140 hasta la
posición 201, una parte del péptido mPAP se dispone desde la
posición 202 hasta la posición 253, una parte del péptido PSA se
dispone desde la posición 254 hasta la posición 327, cinco glicinas
se disponen desde la posición 374 hasta la posición 378, y el
IgG1-Fc se dispone desde la posición 335 hasta la
posición 568.
La presente invención se refiere asimismo a la
utilización de la secuencia genética recombinante de la presente
invención, que comprende la SEC ID N.º: 1, en la preparación de
vacunas.
Tal como se puede observar a partir de lo
anterior, la estrategia para el antígeno quimiotáctico de la
presente invención es la siguiente: enlazar la quimiocina de la SLC
en dirección 5' con el antígeno y enlazar el Fc de la IgG en
dirección 3' con el antígeno; introducir el gen de tres partes
fusionadas directamente en tejidos sanos o tumorales para su
expresión y secreción; y formar un cuerpo de dos partes unidas en la
región bisagra del Fc. Dicha proteína recombinante atrae
activamente las DC y los linfocitos T gracias a la actividad
quimiotáctica de la SLC in vivo. Las DC capturan la proteína
de fusión con eficiencia elevada mediante pinocitosis,
especialmente con la ayuda del receptor Fc y el receptor SLC CCR7.
Mientras tanto, la DC transporta el antígeno hacia la célula. Una
vez se ha procesado y tratado, se presenta el antígeno a Th y CTL
mediante la molécula MHC-II o
MHC-I. Por último, se provoca completamente la
respuesta específica humoral antitumoral e inmunitaria celular.
Además, se pueden activar las DC mediante la combinación del
fragmento Fc con el receptor Fc de las DC. SLC pueden abstraer
activamente las DC y los linfocitos T, así como activar la secreción
de citocinas tales como IL-12,
IFN-\gamma, y proteína provocada por el interferón
(IP-10), activa el desarrollo de Th1, regula por
disminución la producción de TGF-\beta y VEGF. Por
lo tanto, la SLC resulta muy útil en la inmunidad antitumoral. Por
el motivo mencionado anteriormente, dicha combinación tiene efecto
sinérgico y puede provocar una respuesta inmunitaria antitumoral
más fuerte (véase la figura 1).
En la presente invención, se utilizan genes
recombinantes, pero no se pretende limitar la presente invención.
Los estudios del control han demostrado que en forma de plásmido
como en forma de proteína de fusión, se puede producir el antígeno
de la quimiocina recombinante a escala industrial. Se ha omitido la
etapa de preparación de las DC en la solicitud. Sin embargo, se
pueden seleccionar las DC con eficiencia elevada in vivo.
Además, la introducción de sitios de endonucleasas de restricción
en los dos extremos de gen antigénico permite sustituir el antígeno
para producir diversas vacunas del antígeno de la quimiocina contra
las enfermedades tumorales o no tumorales. Por ejemplo, se puede
producir una nueva vacuna del antígeno de la quimiocina sustituyendo
el antígeno HP en SLC-HP-Fc con el
antígeno relacionado con el cáncer de próstata.
Se puede construir el gen recombinante en
vectores eucariotas utilizando la inyección directa del plásmido en
el organismo o tumor. Otras técnicas tales como la pistola genética
y los impulsos eléctricos pueden aumentar la velocidad de
transfección y la eficiencia de la expresión. Se pueden utilizar
asimismo virus recombinantes construidos, tales como retrovirus,
adenovirus, dependovirus, virus vacunales, virus del herpes común,
etc., como vacuna para la inyección in vivo. Se puede
realizar la transfección del plásmido en una célula eucariota (por
ejemplo, CHO) y cultivada in vitro para su secreción y
expresión. Mediante el fragmento Fc, se puede aislar fácil y
eficientemente la proteína de fusión se puede purificar mediante el
método de cromatografía de afinidad y se puede utilizar como vacuna
proteica.
La figura 1 representa a esquema del mecanismo
de la vacuna genética del antígeno quimiotáctico de la presente
invención.
La figura 2 representa la construcción de los
plásmidos. HP indica el gen de fusión Her2/neu-p53;
sig indica el gen del péptido secretado de la SLC.
La figura 3 representa la recombinación de
SLC-Her2/neu-Fc de la presente
invención.
La figura 4 representa la detección por
inmunotransferencia de tipo Western de la expresión celular y la
secreción de la proteína de fusión en las células sometidas a
transfección con la vacuna genética
pSLC-HP-Fc. A indica lisados
celulares pSLC-HP-Fc sometidos a
transfección; B indica el sobrenadante del cultivo de células
sometidas a transfección con
pSLC-HP-Fc; C indica el sobrenadante
del cultivo de células sometidas a transfección con pcDNA.
La figura 5 representa el efecto inhibidor de
tumores in vivo mediante la vacunación previa de la vacuna
genética del antígeno quimiotáctico tumoral
(pSLC-HP-Fc).
La figura 6 representa el período de
supervivencia de ratones con masa tumoral mediante la vacunación
previa de la vacuna genética del antígeno quimiotáctico tumoral
(pSLC-HP-Fc).
La figura 7 representa el efecto inhibidor de
tumores in vivo mediante el tratamiento de la vacuna genética
del antígeno quimiotáctico tumoral
(pSLC-HP-Fc).
La figura 8 representa el período de
supervivencia mediante el tratamiento de la vacuna genética del
antígeno quimiotáctico tumoral
(pSLC-HP-Fc).
La figura 9 representa la actividad de los CTL
tras la inmunización con la vacuna genética del antígeno
quimiotáctico tumoral
(pSLC-HP-Fc).
La figura 10 representa las cantidades de
anticuerpo específico anti-HP en el suero 2 y 4
semanas después de la vacunación. Se diluyó el suero de los ratones
a 1:100. se utilizó la prueba de inmunoabsorción enzimática
(ELISA).
La figura 11 representa que la vacuna
pSLC-HP-Fc pueden estimular los CTL
específicamente contra Her2/neu y p53 in vitro.
La figura 12 representa la construcción del
plásmido pSLC-3P-Fc.
La figura 13 representa el efecto inhibidor de
tumores in vivo tras el tratamiento de la vacuna genética
del antígeno quimiotáctico tumoral
(pSLC-3P-Fc).
La figura 14 representa el período de
supervivencia tras el tratamiento de la vacuna genética del antígeno
quimiotáctico tumoral
(pSLC-3P-Fc).
La figura 15 representa la estructura
característica del gen recombinante de la presente invención.
La presente invención se describirá en detalle
con la ilustración de la presente invención. Se ha de comprender
que el objetivo de las formas de realización relacionadas es
únicamente proporcionar una explicación, pero no pretenden limitar
la presente invención.
Ejemplo
1
Se extrajo el ARNm de ganglios linfáticos de
pacientes que padecían cáncer. Utilizando los procedimientos bien
conocidos por los expertos en la materia, se añadió el sitio de la
endonucleasa de restricción KpnI al cebador directo de la SLC
(5'-cggtaccacagacatggctcagtcac-3')
y se añadió la secuencia que codifica tres glicinas y el sitio de
la endonucleasa de restricción EcoRI al cebador inverso de la SLC
(5'-tgaattctcctcctcctggccctttagg-3').
Se obtuvo el gen de la SLC mediante amplificación por
RT-PCR. Se purificó el fragmento obtenido y se
introdujo en un vector pUCmT (pUC-SLC) para su
secuenciación. El resultado demuestra que la secuencia del fragmento
obtenido se ajustaba a la secuencia diseñada (el fragmento
subrayado).
En la presente invención, se realizó la
secuenciación de los productos de la PCR utilizando un secuenciador
de ADN 377 (ABI Company) mediante el método de la secuencia de
finalización de fluorescencia con cuatro colores basándose en el
método de finalización de la cadena de didesoxinucleótidos SANGER.
La secuencia desde la posición 36 hasta la posición 464 es la
secuencia del fragmento clonado de la presente invención (véase la
SEC ID N.º: 3).
Ejemplo
2
En primer lugar, se clonaron dos fragmentos del
gen Her-2/neu mediante el método de la PCR. El
primer fragmento se obtuvo del siguiente modo: El cebador directo
utilizado es
5'-agaattcaagatctttgggagcctggcatttctgggctacctgctcatcg
ctca c-3', que presenta el sitio de la endonucleasa de restricción EcoRI, y el cebador inverso utilizado es 5'-gatgcc
cagcccttgcagggccagggcatagttgtc-3'. Se adoptó el plásmido que contiene el segmento extracelular de gen neu como molde y se amplificó el fragmento que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 82 hasta la posición 115, en la que aminoácido V de la posición 103 se sustituyó con el aminoácido L. Se obtuvo el segundo fragmento del siguiente modo: el cebador directo era 5'-ctgcaagggctgggcatc-3', y el cebador inverso que presentaba el sitio de la endonucleasa de restricción NcoI era 5'-tccatggccggttggcagtgtggag-3'. Se amplificó el fragmento que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 445 hasta la posición 499.
ctca c-3', que presenta el sitio de la endonucleasa de restricción EcoRI, y el cebador inverso utilizado es 5'-gatgcc
cagcccttgcagggccagggcatagttgtc-3'. Se adoptó el plásmido que contiene el segmento extracelular de gen neu como molde y se amplificó el fragmento que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 82 hasta la posición 115, en la que aminoácido V de la posición 103 se sustituyó con el aminoácido L. Se obtuvo el segundo fragmento del siguiente modo: el cebador directo era 5'-ctgcaagggctgggcatc-3', y el cebador inverso que presentaba el sitio de la endonucleasa de restricción NcoI era 5'-tccatggccggttggcagtgtggag-3'. Se amplificó el fragmento que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 445 hasta la posición 499.
Se recogieron los dos productos de la PCR y se
enlazaron entre sí en un sistema de PCR. Además, el fragmento
resultante se utilizó como molde, utilizando el cebador directo del
primer fragmento y el cebador inverso del segundo fragmento; se
amplificó un gen de fusión con un tamaño de 294 pares de bases. A
continuación, el gen de fusión resultante se incorporó al vector
pUCmT (pUC-Her2P) y se secuenció. El resultado
indica que la secuencia del gen de fusión obtenido se ajusta a la
secuencia diseñada (la secuencia subrayada).
El resultado se indica en la SEC ID N.º: 4, en
la que la secuencia desde la posición 121 hasta la posición 465 es
la secuencia del fragmento clonado de la presente invención.
Ejemplo
3
Se clonó un fragmento del gen de 402 pares de
bases que codifica los aminoácidos desde la posición 156 hasta la
posición 289 en la proteína p53 del plásmido que contenía toda la
longitud del gen p53. Los cebadores utilizados fueron los
siguientes: el cebador directo con un sitio de la endonucleasa de
restricción NcoI era 5'-acc atg gcc atc tac aag cag
tca cag cac atg ac-3'; el cebador inverso con un
sitio de la endonucleasa de restricción EcoRV era
5'-tga tat ctt tct tgc gga gat tct ctt
c-3'. El fragmento obtenido se incorporó al vector
pUCmT (pUC-p53P) para su secuenciación. El
resultado indica que la secuencia del fragmento obtenido se ajusta a
la secuencia esperada (el segmento subrayado).
El resultado se indica en la SEC ID N.º: 5, en
la que la secuencia desde la posición 39 hasta la posición 445 es
la secuencia del fragmento inventivo.
Ejemplo
4
Tal como se representa en la figura 3, el
recorte más pequeño del fragmento de pUC-Her2P
mediante EcoRI/NcoI y el recorte más pequeño del fragmento de
pUC-p53P mediante NcoI/EcoRV se enlazaron con el
recorte más grande del fragmento de pcDNA3z mediante EcoRI/EcoRV
para construir un plásmido de pcDNA-Her2/p53,
denominado asimismo pcDNA-HP. HP significa un gen
enlazado por Her2/neu y p53. El fragmento enlazado artificialmente
Her2/neu-p53 contiene genes que codifican el
péptido de enlace de las moléculas HLA-I y
HLA-II.
Ejemplo
5
En primer lugar, se utilizaron sitios de
clonación múltiple sintetizados químicamente para sustituir los
sitios de clonación múltiple de pcDNA3.1.
El proceso de construcción fue el siguiente:
Síntesis química de dos oligonucleótidos.
El cebador directo era
5'-GCTAGCGAAGCTTTGGTACCGTAGGATCCACGAATTCAGTCCAGGATATCGGC
GGTGG-3'
GGTGG-3'
El cebador inverso era
5'-GGTTTAAACGTTAACCCCGGGCCCTCGAGCTCTAGAGCCTCCTCCACCGCCG
ATATC-3'
ATATC-3'
Las últimas 15 bases en los extremos 3' de cada
cebador eran complementarias entre sí. Se obtuvo el producto de la
PCR en un sistema con la mezcla de los dos cebadores en una
proporción de 1:1, Taq ADN polimerasa y dNTP a 45ºC para su
renaturalización y elongación. Se incorporó el producto purificado
en un vector pUCmT para su secuenciación. El resultado demuestra
que la secuencia del producto obtenido se ajusta a la secuencia
diseñada. La secuencia subrayada indica los sitios de clonación
múltiple sintetizados. Los sitios de clonación múltiple resultantes
finales fueron:
"NheI-HindIII-Kpn1-BamH1-EcoR1-EcoRV-Glysinex5-XbaI-Xho1-Apa1-Sma1-Hpa1-Pme1".
En dicha secuencia, se introdujo un fragmento pequeño del gen
(GGCGGTGGAGGAGGC) que codifica cinco glicinas entre los sitios
EcoRV y XbaI. Se cortó el plásmido con NheI/PmeI y se obtuvo un
fragmento de aproximadamente 100 pares de bases. A continuación, se
enlazó el fragmento con el recorte más grande del fragmento de
pcDNA3.1 mediante NheI/PmeI para construir un nuevo vector
denominado pcDNAf.
El resultado de la secuenciación del sitio de
clonación múltiple sintetizado químicamente se indica en la SEC ID
N.º: 6, en la que la secuencia desde la posición 3 hasta la posición
100 es la secuencia del fragmento inventivo.
Se cortó el fragmento Fc del plásmido que
contenía el IgG1 Fc mediante las endonucleasas de restricción
XbaI/ApaI y se introdujo en el vector pcDNAf, tratándose el vector
pcDNAf con la misma endonucleasa. La construcción resultante se
denominó PcDNA-Fc. Se confirmó la secuencia de IgG1
Fc mediante la secuenciación del plásmido resultante.
Se amplificó el fragmento Fc con un tamaño de
900 pares de bases a partir del plásmido que contenía el gen IgG1
Fc mediante PCR y se introdujo en el vector pUCmT para su
secuenciación. Los cebadores utilizados en la amplificación fueron:
cebador directo:
5'-gaattcggagttaacgagcccaaatcttg-3';
cebador inverso:
5'-gggccctcatttacccggagac-3'. El
resultado de secuenciación indica que el plásmido contenía la región
bisagra, CH2 y CH3 de IgG1. Es decir, el plásmido contenía el
fragmento Fc (véase la secuencia subrayada). El resultado se indica
en la SEC ID N.º: 7, en la que la secuencia desde la posición 78
hasta la posición 991 es la secuencia inventiva.
Ejemplo
6
Tal como se representa en la figura 3, el
recorte más grande del fragmento de pcDNA-HP con
KpnI/EcoRI se enlazó con el recorte más pequeño del fragmento de
pUC-SLC con KpnI/EcoRI para construir
pcDNA-SLC-HP. A continuación, el
recorte más pequeño del fragmento de
pcDNA-SLC-HP mediante KpnI/EcoRV se
enlazó con el recorte más grande del fragmento de
pcDNA-Fc mediante KpnI/EcoRV para construir
pcDNA-SLC-HP-Fc
(denominado asimismo
pSLC-HP-Fc).
La construcción del plásmido de control se
indica en la figura 2
Ejemplo
7
Se sometió a transfección el plásmido
recombinante de pSLC-HP-Fc en
células B16-F10 utilizando el método del liposoma.
Se seleccionaron los clones positivos mediante G418. Se cultivaron
las células en un medio 1640 sin suero durante 24 horas y a
continuación se recogió y concentró el sobrenadante. Se utilizó el
método de inmunotransferencia de tipo Western para detectar la
expresión de la proteína de fusión. El anticuerpo primario
utilizado fue el anticuerpo policlonal de conejo anti p53 humano, y
el segundo anticuerpo era el anticuerpo de conejo
HRP-conjugado de cabra. Las inmunotransferencias se
visualizaron con un equipo de detección quimioluminiscente
ECL-Plus (Amersham Pharmacia Biotech). Por último,
se expuso la película a los rayos X. El resultado indica que la
expresión de la proteína de fusión se puede detectar en el
sobrenadante y el lisado celular de las células
B16-F10 sometidas a transfección con
pSLC-HP-Fc. El peso molecular se
ajusta lo esperado (véase la figura 4). Se ha verificado que la
secuencia de proteína de fusión es la SEC ID N.º: 2.
Ejemplo
8
Se extrajo el ARN total a partir de la estirpe
celular de cáncer de próstata humano LNCaP. Se realizó la
RT-PCR utilizando un cebador directo
(5'-ACTCGAGATGAAGACATACAGTGTATC-3')
y un cebador inverso
(5'-TGATATCT
TAGGCTACTTCACTCAAAG-3'). Tras la electroforesis, se cortó una banda de hPSM con 390 pares de bases de tamaño. Se purificó el fragmento y se recuperó mediante el método de vidrio lechoso. El fragmento purificado se enlazó con un vector pUCm-T para construir el pUCm-hPSM. Se recogió el gen positivo y se secuenció. El resultado se ajusta a lo esperado. Véase, por favor, la SEC ID N.º: 8, el fragmento del gen obtenido corresponde a la secuencia desde la posición 1864 hasta la posición 2253 en el ORF del PSM humano. La secuencia desde la posición 229 hasta la posición 618 de la secuencia obtenida es la secuencia inventiva.
TAGGCTACTTCACTCAAAG-3'). Tras la electroforesis, se cortó una banda de hPSM con 390 pares de bases de tamaño. Se purificó el fragmento y se recuperó mediante el método de vidrio lechoso. El fragmento purificado se enlazó con un vector pUCm-T para construir el pUCm-hPSM. Se recogió el gen positivo y se secuenció. El resultado se ajusta a lo esperado. Véase, por favor, la SEC ID N.º: 8, el fragmento del gen obtenido corresponde a la secuencia desde la posición 1864 hasta la posición 2253 en el ORF del PSM humano. La secuencia desde la posición 229 hasta la posición 618 de la secuencia obtenida es la secuencia inventiva.
Ejemplo
9
Se extrajo el ARN total a partir de la estirpe
celular de cáncer de próstata humano LNCaP. Se realizó la
RT-PCR utilizando un cebador directo
(5'-TCTCGAGGGCGGTGTTCTGGTGCA-3') y
un cebador inverso
(5'-AGA
TATCATGTCCAGCGTCCAGCAC-3'). Tras la electroforesis, se cortó una banda con aproximadamente 600 pares de bases de tamaño. Se purificó el fragmento y se recuperó mediante el método de vidrio lechoso. El fragmento obtenido se incorporó en el pUCm-T para construir el pUCm-PSA. Se recogió el clon positivo y se secuenció. El resultado se indica en la SEC ID N.º: 9. El fragmento del gen obtenido corresponde a la secuencia desde la posición 151 hasta la posición 609 del ORF del PSA humano. La secuencia desde la posición 45 hasta la posición 503 en la secuencia obtenida es la secuencia inventiva.
TATCATGTCCAGCGTCCAGCAC-3'). Tras la electroforesis, se cortó una banda con aproximadamente 600 pares de bases de tamaño. Se purificó el fragmento y se recuperó mediante el método de vidrio lechoso. El fragmento obtenido se incorporó en el pUCm-T para construir el pUCm-PSA. Se recogió el clon positivo y se secuenció. El resultado se indica en la SEC ID N.º: 9. El fragmento del gen obtenido corresponde a la secuencia desde la posición 151 hasta la posición 609 del ORF del PSA humano. La secuencia desde la posición 45 hasta la posición 503 en la secuencia obtenida es la secuencia inventiva.
Ejemplo
10
Se extrajo el ARN total a partir de tejido de
próstata de ratón. Se realizó la RT-PCR utilizando
un cebador directo
(5'-TCTAGATGAGAGCTGTTCCTCTG-3') y un
cebador inverso
(5'-GGGCCCTTAATTCCGTCCTTGGTG-3').
Tras la electroforesis, se cortó una banda con 1146 pares de bases
de tamaño. Se purificó el fragmento y se recuperó mediante el método
de vidrio lechoso. El fragmento obtenido se incorporó en el
pUCm-T para construir el pUCm-mPAP.
Se recogió el clon positivo y se secuenció. El resultado se indica
en la SEC ID N.º: 10. La secuencia desde la posición 48 hasta la
posición 1193 en la secuencia obtenida es la secuencia
inventiva.
Ejemplo
11
El fragmento del gen hPSM se clonó a partir del
plásmido pUCm-hPSM mediante PCR con los siguientes
cebadores: el cebador directo que corresponde a la secuencia desde
la posición 1987 hasta la posición 2007 de ORF del hPSM (se
introdujo el sitio de la endonucleasa de restricción EcoRI) era
5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3';
el cebador inverso era
5'-AGCACTCATCAAAGTCCTGGCCTTGGAAGGGTCCAC-3'
(la sección subrayada correspondía a la secuencia desde la posición
328 hasta la posición 345 del ORF del mPAP, y la sección restante
correspondía a la secuencia desde la posición 2155 hasta la
posición 2172 del ORF del hPSM). Tras la electroforesis, se cortó
el fragmento obtenido de hPSM y se purificó mediante el método del
vidrio lechoso. El fragmento del gen mPAP se clonó a partir del
plásmido pUCm-mPAP mediante PCR con los siguientes
cebadores: el cebador directo que corresponde a la secuencia desde
la posición 328 hasta la posición 348 del ORF del mPAP era
5'-AGGACTTT
GATGAGTGCTATG-3'; el cebador inverso que corresponde a la secuencia desde la posición 463 hasta la posición 483 del ORF del mPAP era 5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3'. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de mPAP y se purificó mediante el método del vidrio lechoso. Se clonó el fragmento del gen hPSA a partir del plásmido pUCm-hPSA mediante PCR con los siguientes cebadores: el cebador directo era 5'-CCTTTCAGA
GACTGCCCTGGCGGTGTTCTGGTGCAC-3' (la sección subrayada correspondía a la secuencia desde la posición 466 hasta la posición 483 del ORF del mPAP, y la sección restante correspondía a la secuencia desde la posición 151 hasta la posición 168 del ORF del hPSA); el cebador inverso era 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGT-3'. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de hPSA y se purificó mediante el método del vidrio lechoso.
GATGAGTGCTATG-3'; el cebador inverso que corresponde a la secuencia desde la posición 463 hasta la posición 483 del ORF del mPAP era 5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3'. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de mPAP y se purificó mediante el método del vidrio lechoso. Se clonó el fragmento del gen hPSA a partir del plásmido pUCm-hPSA mediante PCR con los siguientes cebadores: el cebador directo era 5'-CCTTTCAGA
GACTGCCCTGGCGGTGTTCTGGTGCAC-3' (la sección subrayada correspondía a la secuencia desde la posición 466 hasta la posición 483 del ORF del mPAP, y la sección restante correspondía a la secuencia desde la posición 151 hasta la posición 168 del ORF del hPSA); el cebador inverso era 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGT-3'. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de hPSA y se purificó mediante el método del vidrio lechoso.
Se utilizó el cebador de
5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3'
para amplificar el hPSM y el cebador de
5'-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3' se
utilizó para amplificar el mPAP individualmente en un sistema de 25
\mul para 10 ciclos para enriquecer las cadenas simples. A
continuación, se mezclaron los dos sistemas para continuar
realizando la PCR en un sistema de 50 \mul durante 18 ciclos.
Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de
hPSM-mPAP con 352 pares de bases de tamaño y se
purificó mediante el método del vidrio lechoso.
Se utilizó el cebador de
5'-AGGACTTTGATGAGTGCTATG -3' (que corresponde a la
secuencia desde la posición 328 hasta la posición 348 del ORF del
mPAP) para amplificar el mPAP y se utilizó el cebador de
5'-AGATATCGAG
CAGCATGAGGTCGTG-3' (que corresponde a la secuencia desde la posición 355 hasta la posición 372 del ORF del PSA) para amplificar el hPSA individualmente en un sistema de 25 \mul durante 10 ciclos para enriquecer las cadenas simples. A continuación, se mezclaron los dos sistemas para continuar realizando la PCR en el sistema de 50 \mul durante 18 ciclos. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de mPAP-hPSA con 378 pares de bases de tamaño y se purificó mediante el método del vidrio lechoso.
CAGCATGAGGTCGTG-3' (que corresponde a la secuencia desde la posición 355 hasta la posición 372 del ORF del PSA) para amplificar el hPSA individualmente en un sistema de 25 \mul durante 10 ciclos para enriquecer las cadenas simples. A continuación, se mezclaron los dos sistemas para continuar realizando la PCR en el sistema de 50 \mul durante 18 ciclos. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de mPAP-hPSA con 378 pares de bases de tamaño y se purificó mediante el método del vidrio lechoso.
Se utilizó el cebador de
5'-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3'
para amplificar el hPSM-mPAP y se utilizó el cebador
de 5'-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG-3'
para amplificar el mPAP-hPSA individualmente en un
sistema de 25 \mul durante 10 ciclos para enriquecer las cadenas
simples. A continuación, se mezclaron los dos sistemas para
continuar realizando la PCR en el sistema de 50 \mul durante 18
ciclos. Tras la electroforesis, se cortó el fragmento obtenido de
hPSM-mPAP-hPSA con 564 pares de
bases de tamaño y se purificó mediante el método del vidrio
lechoso. El fragmento resultante se introdujo en el vector
pUCm-TV para su secuenciación. El resultado se
ajustaba a lo esperado. Véase la SEC ID N.º: 11, en la que la
secuencia desde la posición 54 hasta la posición 629 es la
secuencia inventiva.
Ejemplo
12
Tras la secuenciación, se cortó el plásmido que
contiene secuencia genética correcta 3P (3P significa un gen de
fusión PSM-PAP-PSA con 564 pares de
bases de tamaño que codifica 188 aminoácidos) mediante endonucleasas
de restricción EcoRI/EcoRV. El menor fragmento 3P obtenido se
enlazó con el vector EcoRI/EcoRV-cut
pSLC-HP-Fc para construir el
pSLC-3P-Fc (véase la figura 12). La
secuencia del gen recombinante
SLC-3P-Fc se representa en la SEC
ID N.º: 12, que corresponde a la secuencia de aminoácidos
representada en la SEC ID N.º: 13.
Prueba
1
- A.
- La estirpe celular del melanoma B16F10 se sometió a transfección con el plásmido purificado pcDNA3z-SLC-HP-Fc y el plásmido de control. 48 horas después de la incubación, se sembró el medio de cultivo y se concentró con PEG20000 (el sobrenadante de las células B16-F10 sin transfección se utilizó como control negativo).
- B.
- Se recogieron células mononucleares de la circulación periférica (PBMC) de 5 ml de sangre periférica completa sana en un medio de separación de linfocitos, se lavaron dos veces con solución salina, y se volvieron a suspender en un medio RPMI-1640 sin suero. Se contaron las PBMC y se diluyeron a la concentración de 1 x 10^{6}/ml.
- C.
- Preparación de la cámara de Boyden: se adquirió la cámara en Neuro Probe Co. Los pocillos inferiores de la cámara se llenaron con 27 \mul medio de cultivo acondicionado, mientras que los pocillos superiores se llenaron con 50 \mul de 1 x 10^{6}/ml de una suspensión celular de PBMC. Los pocillos inferiores y superiores se separaron mediante un filtro de policarbonato (Neuro Probe) con un tamaño de poro de 5 \mum. Se incubó la cámara a 37ºC con CO_{2} al 5% durante 4 h.
- D.
- Se descargó el filtro y se rasparon las células de la parte superior del filtro, realizando a continuación un lavado, fijación y tinción del filtro. Se contaron las células que habían migrado en cinco campos de alta resolución (x 200) seleccionados al azar. El CI (índice quimiotáctico) se calculó del siguiente modo: CI = número de células de los cinco campos de alta resolución de los pocillos de estudio/número de células de cinco de los cinco campos de alta resolución de los pocillos de control. El valor de CI del grupo negativo fue de 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultado: El nivel de la actividad
quimiotáctica del sobrenadante sin suero procedente de células
sometidas a transfección con el
pSLC-HP-Fc es significativamente
superior al de los demás, lo que indica que tras la transfección,
el plásmido se puede expresar y la proteína expresada presenta
actividad. El nivel de capacidad quimiotáctica de las células
sometidas a transfección pSLC-HP-Fc
es similar al de las células sometidas a transfección pSLC, lo que
indica que la proteína de fusión afecta a la actividad de las
SLC.
Prueba
2
Se cargaron los plásmidos (el gen solo) en
partículas de oro y se revistieron en la superficie interior de un
tubo de Tefzel que se cortó en segmentos adecuados como bala para
administrar 1 \mug de ADN según el manual de BioRad. Se
dividieron diversos grupos como controles: el vector de control,
pSLC-Fc, psig-HP (el plásmido que
expresa HP y que contiene el péptido señal de las SLC),
pSLC-HP y
psig-HP-Fc.
\newpage
Prueba
3
14 días y 7 días antes de la inoculación
tumoral, se vacunaron los ratones dos veces con
pSLC-HP-Fc o vectores control en la
piel del abdomen. En el día 0, se inoculó cada ratón con 5 x
10^{4} células tumorales B16F10 (Las células B16F10 se sometieron
a transfección con el gen HP y se seleccionaron mediante G418) en
una disolución de 0,2 ml. Se registraron los tamaños tumorales de 2
a 3 veces por semana. Se calculó el tamaño tumoral como la longitud
(cm) x la anchura (cm^{2}).
Resultado: La vacunación de
pSLC-HP-Fc dos veces aumenta
significativamente el efecto de inhibición tumoral (véanse las
figuras 5, 6) y se prolonga significativamente el período de
supervivencia medio de los ratones. El efecto terapéutico del
pSLC-HP-Fc es significativamente
mejor que cualquiera de los otros vectores (p < 0,05), lo
que indica el efecto inmunitario sinérgico de las SLC y los
fragmentos Fc.
Prueba
4
En el día 0, se inoculó cada ratón con 5 x
10^{4} células tumorales B16F10 en una disolución de 0,2 ml. En
los días día 6, 12, 18, se vacunaron los ratones mediante el sistema
de pistola genética. Se registraron los tamaños tumorales de 2 a 3
veces por semana. Se analizaron los tamaños tumorales tal como se ha
mencionado anteriormente.
Resultado: Tal como se representa en las
figuras 7 y 8, la vacuna pSLC-HP-Fc
realiza la inhibición de crecimiento tumoral más efectiva. En el
día 28, la diferencia entre los grupos
pSLC-HP-Fc y
psig-HP-Fc es significativa (P
< 0,05). Se prolongó período de supervivencia medio de
ratones mediante la inmunización con
pSLC-HP-Fc. Los ratones del grupo
B16 (pSLC-HP-Fc) se inocularon con
células B16 naturales. Tras inmunizar tres veces con
pSLC-HP-Fc, el grupo B16 no presenta
efecto alguno de inhibición tumoral, lo que indica que
pSLC-HP-Fc la respuesta inmunitaria
provocada es específica del antígeno HP.
Prueba
5
Dos semanas tras vacunar tres veces con el
sistema de pistola génica, se sacrificaron ratones con tumores y se
realizó un ensayo de la citotoxicidad de los CTL con la utilización
de células esplénicas con equipos LDH (Promega). La proporción
entre células esplénicas y dianocitos (proporción E:T) resultó de
40:1, 20:1 y 10:1, respectivamente.
Resultado: Los linfocitos obtenidos de
los ratones inmunizados con la vacuna de nucleótidos de la
quimiocina presentaron un efecto de citotoxicidad significativa en
las célula B16F10-HP (véase la figura 9). Cuando las
proporciones E:T fueron de 40:1 ó 20:1, existía todavía una
diferencia significativa entre la vacuna estudiada y los vectores
de control (P < 0,05), lo que indica que la vacuna era más
potente para provocar la actividad de los CTL.
Prueba
6
La cantidad de anticuerpos específicos del HP en
el suero del grupo de los ratones inmunizados se detecto mediante
la prueba ELISA, 2 y 4 semanas tras la inmunización
(pSLC-HP-Fc). En pocas palabras, se
incubaron unas placas de microvaloración revestidas con proteínas
recombinantes p53 durante la noche, se boquearon con suero de
ternera al 20%, y se incubaron con el anticuerpo primario (suero de
ratón diluido en serie) y el secundario anticuerpo (IgG de cabra
antirratón conjugada con peroxidasa de rábano) una tras otra. Tras
lavar y visualizar mediante OPD (O-fenilendiamina),
se leyó el valor de OD a 490 nm. Se utilizó un anticuerpo monoclonal
contra el p53 como control positivo y se utilizó suero de ratón
normal como control negativo.
Resultado: El nivel de anticuerpo p53 de
ratones inmunizados SLC-HP-Fc es el
más elevado y significativamente superior al de otros vectores
(véase la figura 10).
Prueba
7
Se recogieron células mononucleares (MNC) por
centrifugación, utilizando un medio de separación de linfocitos, a
partir de la circulación periférica de donantes sanos
HLA-A2^{+}. Se sometió a transfección a la mitad
de las MNC con el plásmido
pSLC-HP-Fc utilizando liposomas e
incubando con MNC sin tratar en una proporción de 1:1 a 37ºC con
CO_{2} al 5%. En el día 6, se procedió al recuento de células
viables, se volvieron a suspender y se cultivaron con distintos
dianocitos a distintas proporciones de E:T en microplacas de 96
pocillos. Se utilizó el ensayo LDH (Promega Kits) para analizar la
citotoxicidad.
Resultado: tras mezclar el cultivo, las
MNC sometidas a transfección con
pSLC-HP-Fc estimularon los CTL
específicos para que mataran las células tumorales que
superexpresaban Her2/neu o p53 de un modo limitado por las MHC
(véase la figura 11). Es decir, las CTL específicos únicamente
mataban significativamente células tumorales
HLA-A2^{+} que expresaban Her2/neu o p53, lo que
indica la especificidad de los CTL estimulados con la vacuna
genética del antígeno quimiotáctico.
Prueba
8
Se inocularon 5 x 10^{4} células cancerosas
B16-3P (células cancerosas B16 sometidas a
transfección con pcDNA-3P mediante selección con
G418) en el costado de ratones C57BL/6 (ocho ratones cada grupo). Se
inmunizaron los ratones los días tres, ocho y trece tras la
inoculación de las células tumorales. El vector de control,
pSLC-Fc, psig-3P (el plásmido que
contiene el gen del péptido señal de las SLC en dirección 5' hasta
el gen 3P) se utilizaron como grupos de control. Se observaron los
tamaños tumorales y los períodos de supervivencia de los
ratones.
Resultado: Tal como se representa en las
figuras 13 y 14, la vacuna del antígeno de la quimiocina genética
(pSLC-3P-Fc) inhibe
significativamente el crecimiento tumoral (con respecto al grupos de
control P < 0,05), y prolonga significativamente el
período de supervivencia (con respecto al grupos de control P
< 0,05), lo que indica que un cambio de antígeno en la vacuna
genética del antígeno quimiotáctico puede producir una vacuna
distinta contra el antígeno asociado.
<110> DONGGUAN HAOFA BIO-#ENGINEERING
DEVELOPMENT CO., LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VACUNA GENÉTICA DEL ANTÍGENO
QUIMIOTÁCTICO RECOMBINANTE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CGCNC41111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2060
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
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<212> ADN
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<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 721
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 335
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1077
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 651
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
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<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano y ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1928
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano y ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano y ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Secuencia genética recombinante que comprende
un gen de la SLC humana, un gen antigénico y un gen del fragmento
de la IgG1-Fc, enlazándose el gen de la SLC en
dirección 5' con el gen antigénico, y enlazándose el gen del
fragmento de la IgG1-Fc en dirección 3' con el gen
antigénico.
2. Secuencia genética recombinante según la
reivindicación 1, en la que dicho gen antigénico comprende los
marcadores Her2/neu, P53, PSA, PAP, PSM, MAGE1, MAGE2, MAGE3, BAGE,
GAGE1, GAGE 2, CAG3, RAGE, NY-ESO-1,
tirosinasa, CEA, el idiotipo de la Ig, gp100, melan A, gp75,
TRP-1, TRP-2, CDK4,
CASP-8, ras, bcr/abl, MUC-1, y genes
que codifican las proteínas relacionadas con los virus de HCV, HIV
y microorganismos patógenos.
3. Secuencia genética recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que los sitios de
la endonucleasa de restricción EcoRI y los genes de tres glicinas se
encuentran presentes entre el gen de la SLC y el gen antigénico, y
los sitios de la endonucleasa de restricción EcoRV y los genes de
cinco glicinas se encuentran presentes entre el gen antigénico y el
gen del fragmento de la IgG1-Fc.
4. Secuencia genética recombinante según la
reivindicación 1, en la que la secuencia es la SEC ID N.º: 1.
5. Secuencia genética recombinante según la
reivindicación 1, en la que la secuencia es la SEC ID N.º: 12.
6. Secuencia de aminoácidos codificada por
secuencia genética recombinante de la SEC ID N.º: 1.
7. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 6, en la que la secuencia de aminoácidos es la SEC ID
N.º: 2.
8. Secuencia de aminoácidos codificada por el
gen recombinante de la SEC ID N.º: 12 según la reivindicación 5, en
la que la secuencia de aminoácidos es la SEC ID N.º: 13.
9. Vacuna genética que comprende la secuencia
genética recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
10. Vacuna genética según la reivindicación 9,
en la que dicha secuencia genética se representa mediante la SEC ID
N.º: 1, la SEC ID N.º:12 o la secuencia correspondiente de
aminoácidos de la misma.
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