ES2955737T3

ES2955737T3 - Secuencia génica que codifica una PCR específica para el complejo de clase I de MHC humana para el complejo HLA-AO2 y el péptido HTERT865-873, así como su uso en el tratamiento por ingeniería genética de linfocitos T para posibles aplicaciones clínicas de transferencia adoptiva

Info

Publication number: ES2955737T3
Application number: ES16719507T
Authority: ES
Inventors: Stefano Ugel; Vincenzo Bronte; Sara Sandri; Sara Bobisse
Original assignee: Degli Studi Di Verona, University of; Universita degli Studi di Verona
Current assignee: Degli Studi Di Verona, University of; Universita degli Studi di Verona
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2036-03-17
Also published as: EP3271384A1; EP3271384B1; EP3271384C0; WO2016147145A1

Abstract

La presente invención proporciona las secuencias que codifican las cadenas α y β del TCR transgénico específico para el complejo MHC clase I/péptido hTERTB65-873 restringido para HLA-A02, que se expresa fisiológicamente en la membrana de células cancerosas inmortalizadas, y el uso terapéutico. de linfocitos T transducidos contrastan con la progresión neoplásica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencia génica que codifica una PCR específica para el complejo de clase I de MHC humana para el complejo HLA-AO₂y el péptido HTERT865-873, así como su uso en el tratamiento por ingeniería genética de linfocitos T para posibles aplicaciones clínicas de transferencia adoptiva

La telomerasa (TERT) es la transcriptasa inversa principalmente implicada en el alargamiento de telómeros en células de mamíferos y es un antígeno tumoral universal importante; de hecho, la TERT es expresada en más de un 85% de células tumorales, independientemente del origen o tipo histológico. El documento WO 2005/116646 describe, en el ejemplo 2, un método para generar TCR's dirigidos contra el complejo de HLA-A02 que presenta el péptido hTERT865-873 creando una biblioteca de TCR's, que son seguidamente seleccionadas usando ELISA.

Objeto de la invención

Un primer objeto de la presente invención, por lo tanto, es proporcionar las secuencias que codifican las cadenas a y p del TCR transgénico específico para el complejo de clase I de MHC/ péptido hTERT865-873 restringido para HLA-A2.

En otro aspecto, la invención describe un constructo que comprende estas secuencias y un vector que comprende este constructo.

Se proporcionan también de las secuencias de las subunidades específicas a5 y p3 del TCR.

Las células de linfocitos aislada transducidas con el vector descrito son un objeto adicional de la invención.

En todavía otro objeto adicional, se describe el uso de linfocitos T obtenidos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades tumorales en seres humanos y animales.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados de ensayos de liberación funcional de un IFNy (A) y cromo (B); la Figura 2 muestra los resultados de la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos para TERT para verificar la capacidad para contrastar in vivo un crecimiento tumoral en animales inmunodeficientes inoculados con células inmortalizadas (SW480 y DG75); la Figura 3 muestra los datos de los clones aislados y su actividad, medida mediante ensayos de liberación funcional de IFNy y cromo; La figura 4 muestra los cebadores específicos para las cadenas a (A) y p (B) del TCR usado para la identificación de las regiones de CDR3; la Figura 5 muestra los resultados del análisis de IMGT (A) que condujeron a la identificación de las subunidades específicas del TCR (as y B3) y las secuencias completas; la Figura 6 muestra los vectores pcDNA 3.1 y las secuencias que contienen las cadenas a (6A) y p (6B) del TCR específico para hTERT865-673; la Figura 7 muestra el constructo (A) optimizado para la expresión en el vector retroviral, compuesto por las secuencias de las cadenas a y p del TCR específico para hTERT865-873, a partir de dos sitios de escisión y la secuencia codificadora para la forma truncada de CD34 (y secuencia relacionada) y la secuencia relacionada (B); la Figura 8 muestra el vector retroviral que contiene el constructo (A) optimizado para la expresión de las cadenas a y p del TCR específico para hTERT865-873 y la secuencia relacionada (B); La Figura 9 muestra los resultados de los ensayos de infección de PBMC humanas por medio de un vector retroviral que genera una población de linfocitos T que expresan la cadena correcta del TCR específico para hTERT865-873 (A) y es capaz de reconocer específicamente el tetrámero hTERT865-873 (B); la Figura 10 muestra los resultados de los ensayos funcionales (lisis específica, 10 A y liberación IFN ^y, 10 B) de PBMCs que expresan el TCR específico para hTERT865-873 que es capaz de reconocer in vitro células de cáncer inmortalizadas que expresan niveles elevados de actividad de telomerasa; la Figura 11 muestra los resultados de una transferencia adoptiva in vivo de los linfocitos específicos para hTERT865-873 que son capaces de controlar la extensión de la línea celular tumoral leucémica en ratones inmunodeficientes; la Figura 12 muestra los linfocitos específicos para el péptido hTERT865-873 que son capaces de regular el crecimiento in vivo de tumores de un origen histológico diferente; la Figura 13 muestra los resultados del ensayo funcional (ELISA para IFN- y) de PBMCs transducidas específicas para hTERT865-873 que son capaces de reconocer in vitro leucemia linfoblástica aguda y líneas de leucemia mieloide aguda; la Figura 14 muestra los resultados del tratamiento in vivo de animales con leucemia linfoblástica aguda (ALL-CM-hTERT: n=8; ctrl CTLs: n=6).

Descripción detallada de la invención

Según un objeto de la invención, se describen las secuencias que codifican las cadenas a y p del TCR transgénico específico para el complejo de clase I de MHC/péptido hTERT865-873 restringido para HLA-A2.

En particular, estas secuencias son:

En el contexto de la presente invención, están contempladas igualmente las secuencias homólogas a las anteriormente expuestas.

“homologas” significa las secuencias de nucleótidos que, debido a la redundancia del código genético, codifican la misma secuencia.

En lo que respecta a las subunidades específicas a5 y p3 del TCR, estas son:

Según un objeto adicional, se describe el uso de las secuencias de la invención para la preparación de un constructo útil en la preparación de un vector de transfección.

El constructo, así como el vector que comprende este constructo, es un objeto adicional de la invención.

En un aspecto preferido de la invención, este constructo está representado por un plásmido para la generación de vectores virales.

En particular, este constructo comprende las secuencias que codifican las cadenas a y p del TCR transgénico específico para el complejo de clase I de MHC/péptido hTERT865-873 restringido para HLA-A2; estas secuencias corresponden preferentemente a las ID. SEC. n° 1 y 2.

En un aspecto preferido, el constructo comprende adicionalmente una secuencia que codifica la forma truncada de la molécula CDR4 que tiene una función de marcador. Esta secuencia es útil para identificar células transgénicas.

Según la presente invención, estos vectores virales son preferentemente retrovirus o lentivirus.

El experto en la técnica será capaz de preparar las modificaciones necesarias para adaptar el constructo al vector seleccionado, basándose en las finalidades que se quieren conseguir.

Las células aisladas infectadas con el vector descrito son objetos adicionales de la presente invención.

Todavía, en otro aspecto, la invención describe linfocitos T aislados transducidos con el uso de las secuencias anteriormente descritas.

Preferentemente, estos linfocitos son linfocitos de un mamífero y, más preferentemente, son linfocitos humanos.

En un aspecto particular de la invención, estos linfocitos T transducidos aislados pueden ser usados para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades de neoplásticas.

En un aspecto preferido, el tratamiento de enfermedades neoplásticas incluye la técnica de transferencia adoptiva.

Estas enfermedades neoplásticas incluyen tumores sólidos de diferente histología y neoplasias hemáticas.

Más específicamente, los tumores ensayados incluían neoplasias malignas como: linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica B-B CLL crónica, melanoma, adenocarcinoma pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML).

Parte experimental

Inmunización de ratones HHD para obtener linfocitos T específicos para el péptido hTERT865-873

Mediante la inmunización de ratones transgénicos que expresan el antígeno de leucocitos humanos (HLA)-A2 (ratones HHD) se aisló una población de linfocitos T que expresan el receptor de linfocitos T (TCR) con una elevada afinidad para el péptido hTERT865-873. La inmunización se llevó a cabo mediante la inoculación de DNA plasmídico que codifica (h)TERT-LTB, clonado en el vector pVIJnsA (GENEART). La secuencia fue optimizada para producir una versión inactiva de la enzima telomerasa insertando dos mutaciones puntuales, D712A y V713I. Después de 15 días, los ratones fueron sacrificados y los cultivos de leucocitos estimulados mediante péptido fueron ajustados con los esplenocitos. Se dispusieron en placas 5 x 106 esplenocitos en placas de 24 pocillos en medio DMEM al 10%, complementado con el péptido específico hTERT865-873 (RLVDDFLLV correspondiente a ID. SEC. n° 7) 0,1 |^jM. Después de 5 días, se ensayó el reconocimiento específico del conjunto de células derivadas de ratones HHD pulsadas durante 1 hora con el péptido específico hTERT865-873 o con un péptido testigo no relacionado. Después de 24 horas de cocultivo, se valoraron los niveles de IFNy secretados en la materia sobrenadante por medio de ELISA (ensayo inmunoabsorbente) asociado a enzimas). Brevemente, este ensayo consiste en transferir el medio de cultivo a una placa de 96 pocillos específica, previamente incubada con anticuerpo purificado específico para IFNy. En algunos pocillos, en lugar de la muestra, la curva de calibración fue dispuesta usando diluciones a escala 1:2 de la citoquina en cuestión. Después de dos horas de incubación a 37° C, la placa fue marcada con el anticuerpo anti-IFNY biotinilado durante 1 hora, seguidamente mediante 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, con estreptavidina unida a peroxidasa. La reacción de peroxidasa con este sustrato (TMB-3,3',5,5'-tetrametilbencidina) permite la cuantificación de la citoquina de interés mediante una lectura a 450 nm. La actividad funcional del cultivo policlonal fue adicionalmente ensayada con un ensayo de citotoxicidad basado en la liberación de 51Cr. Los clones se cultivaron durante 5 horas con la línea T2 de HLA-A2+ humana, pulsada o no con el péptido relacionado (5-10 x 106 de células/ml de medio DMEM con 5 jg/m l de péptido) o con líneas humanas malignas inmortalizadas, siempre positivas para HLA-A2; aparte de la línea MOLT-3 que parece ser negativa para HLA-A2. Las células diana (1 x 106) fueron marcadas en el sedimento con 100 μCi de Na₂51CrO₄durante 1 h a 37 °C. Al final del marcado, las células fueron adecuadamente lavadas y seguidamente se volvieron a poner en suspensión en medio de RPMI al 5% a una concentración de 2 x 104/ml; 100 j l de esta suspensión celular fueron sembrados en una microplaca de 96 pocilios con fondo en “U” en presencia de diluciones a escala de células efectoras, que se distribuyeron también en 100 |jl y por triplicado. Después de 5 horas de incubación, la materia sobrenadante se transfirió a microplacas que contenían un centelleo sólido. La radioactividad emitida se midió por medio de un contador de centelleo para placas. El porcentaje de lisis específica se calculó usando la siguiente fórmula:

% de liberación específica = 100 x (RsPer Rspon)

(Rmax - Rspon)

en la cual:

Rspon= liberación espontánea, es decir, la cantidad de isótopo liberado por las células diana incubadas en ausencia de efectores;

Rmax =liberación máxima de radioactividad obtenida después de una descongelación repetida de las células radiomarcadas;

Rsper= liberación experimental medida para cada relación entre efector/diana, como se puede observar en la Figura 1 (Ugel S, Scarselli E, lezzi M, Mennuni C, Pannellini T, Calvaruso F, Cipriani B, De Palma R, Ricci-Vitiani L, Peranzoni E, Musiani P, Zanovello P, Bronte V. Autoimmune B-cell lymphopenia after successful adoptive therapy with telomerasespecific T lymphocytes. Blood. 2010).

Dada la especificidad por el antígeno, se cultivaron 2 x 105 linfocitos policlonales específicos con 5 x 106 esplenocitos HHD irradiados y pulsados con péptido865-873 de hTERT, en placas de 24 pocillos, en presencia de interleucina (IL)-2 a una concentración de 20 Ul/ml (Ugel S, Scarselli E, lezzi M, Mennuni C, Pannellini T, Calvaruso F, Cipriani B, De Palma R, Ricci-Vitiani L, Peranzoni E, Musiani P, Zanovello P, Bronte V. Autoimmune B-cell lymphopenia after successful adoptive therapy with telomerase-specific T lymphocytes. Blood. 2010). Esta línea de linfocitos policlonal fue ensayada también en cuanto a la habilidad de contraste con un crecimiento tumoral in vivo en animales inmunodeficientes inoculados con células inmortalizadas (SW480 y DG75) o células madre de cáncer aisladas a partir de un paciente con cáncer de colon, si están restringidas para aplotipo HLA-A2 (línea 13 de CTSC). Véase la Figura 2 (Ugel S, Scarselli E, lezzi M, Mennuni C, Pannellini T, Calvaruso F, Cipriani B, De Palma R, Ricci-Vitiani L, Peranzoni E, Musiani P, Zanovello P, Bronte V. Autoimmune B-cell lymphopenia after successful adoptive therapy with telomerase-specific T lymphocytes. Blood. 2010).

Clonación de un clon con afinidad elevada para péptido hTERT865-873 mediante dilución límite en serie

Después de 3 reestimulaciones semanales, los linfocitos T policlonales obtenidos fueron clonados a diferentes diluciones (3, 30 y 100 células por pocillo) y se valoró la afinidad por el antígeno mediante cuantificación del IFNy liberado en cultivo, como se explicó anteriormente, o mediante un ensayo de citotoxicidad para la liberación de cromo (como se explica posteriormente). Aunque la dilución más extrema generó solamente dos clones con una baja avidez y ningún clon de avidez elevada, permitiéndose con el otro la obtención de 8 clones con una baja afinidad y 1 clon con afinidad elevada, definido como el clon hTERT 20.10. Aunque la dilución menos extrema (clonación hasta 100 células) permitió el aislamiento de 2 clones con una avidez elevada y 12 con una avidez baja, como se muestra en la Figura 3.

Estos datos indican la baja frecuencia de células de avidez elevada presentes en el cultivo policlonal. Por lo tanto, las nuevas estimulaciones posteriores in vitro del cultivo policlonal determinan una pérdida progresiva de reconocimiento por los linfocitos de las dianas antígenas dada la expansión de poblaciones de baja avidez para el antígeno como se pone de manifiesto por medio del documento de Maria Parkhurst en respuesta al artículo de Ugel S, Scarselli E, lezzi M, Mennuni C, Pannellini T, Calvaruso F, Cipriani B, De Palma R, Ricci-Vitiani L, Peranzoni E, Musiani P, Zanovello P, Bronte V. Autoimmune B-cell lymphopenia after successful adoptive therapy with telomerase-specific T lymphocytes. Blood. 2010 (http://www.bloodjournal.org/content/ 115/H1374.e-letters).

Sin embargo, al hacer posible la clonación de los linfocitos de T después de varias etapas, es posible superar el problema de la acumulación de la población de baja avidez haciendo posible aislar linfocitos T de actividad elevada como el clon hTERT 20.10 (como se describe en el documento Ugel Stefano http://www.bloodjournal.org/content/115/H1374.e-letters#re-evidence-forpresentation-of-htert865-873-on-tumorcells).

Identificación de las cadenas a y p del TCR específico para el péptido hTERT865-873

Se extrajo el RNA según las instrucciones del TRI Reagent (Life Technologies). Brevemente, el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 1 ml de reactivo TRI y, después de 5 minutos, de incubación a temperatura ambiente (TA) se añadieron 200 |jl de cloroformo. Después de transferir las muestras a tubos de gel de cierre por fases de 1,5 ml (5 PRIME), se centrifugaron a velocidad máxima durante 10 minutos a 4° C y la fase acuosa se transfirió a un tubo limpio. La precipitación del RNA se realizó mediante la adición de isopropanol y, después de una centrifugación apropiada, etanol a 75%. Después de una centrifugación adicional, la materia sobrenadante se retiró, el sedimento de RNA se dejó secar con aire durante 5 minutos y seguidamente se volvió a poner en suspensión en 30 j l de agua exenta de pirógenos. La solución final se cuantificó por medio de un espectofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific).

La transcripción inversa de cDNA se llevó a cabo siguiendo exactamente las instrucciones del estuche de ensayo de transcripción inversa de capacidad elevada (Applied Biosystems). El RNA se diluyó con 100 ng/ml con agua exenta de RNAasa. Para la reacción de transcripción inversa, se añadió 1 jg de RNA a una solución que contenía: 2 j l de tampón 10X, 0,8 j l de mezcla dNTP 25x (100 mM) 20 j l de cebadores aleatorios RT 10X, 1 j l de transcriptasa inversa, 50 U/ jl, 1 j l de inhibidor de RNAasa (todos los reactivos contenidos en el estuche de ensayo) y agua exenta de RNAasa, hasta un volumen final de 20 jl. Las etapas de la reacción fueron las siguientes: 10 minutos a 25°C, 120 minutos a 37° C, 5 minutos a 85° C, 4° C hasta la separación.

La calidad del cDNA así sintetizado se valoró mediante amplificación por PCR de gen de múridos de p-actina usando los cebadores:

Directo (Fx) 5'-ctaaggccaaccgtgaaaag-3'

Inverso (Rev) 5'-ggagagcatagccctcgtag-3'

La reacción se llevó a cabo mezclando los reactivos en las siguientes cantidades:

5,5 j l de agua no pirógena, 7,5 j l de mezcla maestra AmpliTaq Gold 360 (Applied Biosystems), 0,5 j l de cebador Fw 10 jM y 0,5 j l de cebador Fw 10M y 0,5 j l de cDNA. Los ciclos de la reacción se llevaron a cabo en un ciclador térmico de 96 pocillos Veriti (Applied Biosystems): 96° C 5 minutos (94° C 30 s, 60° 45 s, 72° C 10 minutos) x 30 ciclos y 73° 10 minutos. Esta reacción produjo una banda del peso molecular correcto de 180 bp.

La región de CDR3 del TCR a se identificó mediante PCR usando un panel de cebadores específico para las subfamilias del TCR AV recogidas en la Tabla A de la Figura 4.

La primera y la segunda PCR se realizaron en 20 j l de volumen que contenía 7,5 j l de mezcla maestra AmpliTaq Gold 360 (Applied Biosystems), 0,5 j l de cebador y Fw cebador Rev, ambos a una concentración de 10 jM (concentración final de los cebadores 0,3 jM ) y 2 j l de una dilución 1/10 del cDNA obtenido mediante RT. Las dos PCRs se realizaron durante 35 ciclos a 94° C 30 s, 60° C 45 s y 72° C durante 10 minutos seguido de una prolongación final de 10 minutos a 72° C. Los productos de PCR (4 jl) se analizaron mediante extensión en gel de agarosa al 2%. Para la primera PCR, se usaron mezclas alternativas de cuatro cebadores Fw, cada uno más un cebador Rev constante. La única mezcla que permitió la amplificación de un fragmento fue la mezcla A. la segunda serie de PCR se realizó usando un cebador Fw, alternativamente, MAV1, MAV2, MAV5 y MAV12 emparejados con un cebador Rev constante (Tabla A, Figura 4). Los cebadores que permitieron la amplificación de un fragmento del peso molecular esperado fueron MAV1 y MAV 5 sugiriendo que el clon TCR hTERT usa un miembro de una de dos subfamilias AV. Los dos fragmentos de PCR fueron analizados mediante secuenciado directo, usando el cebador constante Rev.

Los datos de la secuencia se analizaron mediante alineación del sitio web IMGT (http://www.imgt.org) poniendo de manifiesto que el clon expresó dos cadenas de TCR a: TRAV7D/TRAJ23*01/t Ra C e TRAV3/TRAJ11*01/TRAC, pero solamente la secuencia de TCR TRAV3/TRAJ11*01/TRAC está en coherencia en marco con la síntesis de una cadena de proteína de TCR a funcional.

Sobre la base de los datos de secuencias, se diseñó un nuevo par de cebadores con el fin de amplificar un fragmento de cDNA que contiene la secuencia completa que codifica la cadena TRAV3/TRAJ11 *01/TRAC de TCR a. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de 20 j l que contenía 7,5 j l de mezcla maestra AmpliTaq Gold 360 (Applied Biosystems), 0,5 j l de cebador de Fw, cebador Rev 0,5 jm , ambos a una concentración de 10 jm y 1 l de una dilución de 1/10 del cDNA obtenido mediante RT. Las condiciones de PCR fueron las mismas que las anteriormente descritas en este párrafo con la única variación de 40 ciclos en lugar de 35. El producto de ^pC^resperado (841 bp) fue valorado mediante extensión en gel de agarosa al 2% y secuenciado según el método anteriormente descrito.

La cadena de TCR p fue identificada usando la misma estrategia descrita para la cadena del TCR a. Los cebadores usados para la amplificación de fragmento CDR3 se recogen en la Tabla B figura 4 y se usaron en reacciones de PCR según las condiciones expuestas para las correspondientes reacciones de la cadena del TCR a. Los fragmentos de DNA de peso molecular esperado fueron amplificados en presencia de mezcla D de cebadores en la segunda PCR del primer par de cebadores MVb3 y Cp AS (Tabla B, figura 4). El secuenciado del segmento amplificado puso de manifiesto que la cadena del Tc R p consiste en TRBV26/t RbJ2-7*01/TRBD2*01. Además, la secuencia de DNA se inserta en marco en plásmidos específicos (véanse las Fig. 7 y Fig.8) y parece que codifica una cadena funcional. La secuencia del TCR p completa fue identificada y amplificada (mismas condiciones de PCR) usando el par de cebadores mostrados en la Tabla B, figura 4, de los cuales el cebador Rev aparece en la parte constante C2. En conclusión, el TCR p consiste en TRBV26*01/TRBJ2-7*01/TRBD2*01/TRBC2*03.

Clonación y secuencias de cadenas de TCR a y TCR p en pcDNA3.1

Las secuencias de cDNA completas que codifican TCR a y TCR p fueron ligadas en el vector TA pCR2.1-clonación Topo (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. En particular, la secuencia de cDNA del TCR a fue amplificada como se describió en el párrafo anterior; la secuencia del TCR p fue amplificada con los cebadores

Fw 5'-ttttcggaattctaagccaccat-3'

Rev 5'-gcttaaacgtttgtctcaggaattt-3'

y que contenían, respectivamente, los sitios de restricción EcoRI y Pmel para las clonaciones posteriores. En este último caso, las variantes de la reacción de PCR fueron una temperatura de acoplamiento de 58° C y 40 ciclos de reacción. Los productos de PCR para TCR a y TCR p se extendieron en gel de agarosa al 2% y se purificaron usando el estuche de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Para la reacción de ligación, los insertos se mezclaron en una relación 3:1 con respecto al vector, en presencia de 1 |jl de enzima de ligasa T4. La mezcla de reacción se incubó durante 18 horas a 4° C. Se transformaron 5 j l del producto de ligación en bacteria competente de Escherichia coliTOP10 (Invitrogen) usando un cloque térmico. Los clones bacterianos se verificaron en presencia de la cadena del TCR a o TCR p mediante digestión enzimática con EcoRI (Neb) del DNA del plásmido obtenido usando el estuche de ensayo QIAamp DNA Mini (Qiagen). La orientación de la secuencia con el vector se determinó mediante digestión con la enzima Pstl (Neb) para el TCRa y secuenciado para el TCRp. Las secuencias que codifican TCR a y TCRp fueron posteriormente subclonadas en el vector pcDNA3.1 usando la enzima EcoRI (Fig. 6).

Para las reacciones de secuenciado, se purificaron 10 j l de DNA añadiendo 2 j l de ExoSAP-IT® (USB Corporation) e incubando a 37° C durante 30 minutos más inactivación con calor a 80° C durante 15 minutos. La reacción de secuenciado posterior se llevó a cabo en 10 j l de reacción según las instrucciones del estuche del ensayo de secuenciado BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) usando 1,0 j l de mezcla de reacción v3.1 BigDye® Terminator Ready Reaction, cebador (3,2 μmol/μl) 1,0 jl, 1,5 j l de tampón y 2,0 j l de DNA. Las condiciones del ciclador térmico son de inactivación a 96° C durante 1 minuto, seguido de 53 ciclos de 96° C durante 10 s, 50° C durante 5 s y 60° C durante 4 minutos. El producto de reacción se purificó con columnas de purificación GE y se analizó en el secuenciador ABI 3130xlGA (Applied Biosystems).

Optimización del constructo para una expresión en vector retroviral

Posteriormente se creó un constructo (optimizado por elTCR) que contenía: las secuencias optimizadas para las cadenas a y p del TCR específico para el péptido hTERT865-873; dos sitios de escisión P2A y T2A para permitir una expresión equilibrada de las dos cadenas a y p tratadas por ingeniería genética; la secuencia que codifica la forma truncada de la molécula CD34 para permitir el enriquecimiento e identificación de las células transfectadas (Fig.7). El constructo se insertó seguidamente en un vector retroviral (gentilmente proporcionado por el Prof. M. I. Nishimura-Chicago, USA) con el fin de transducir eficazmente PBMCs humanas (^tC^roptimizada con μg1SAMEN-CMVSRa telomerasa-Fig.8). Además, el Prof. Nishimura proporcionó también el vector anteriormente mencionado que codifica las cadenas a y p del TCR específico para el péptido HCV 1406-1415, que se usó como testigo.

Producción e infección retroviral de células mononucleares periféricas humanas

Para la producción de las proteínas recombinantes retrovirales, se usó el método de precipitación con cloruro de calcio. Brevemente, los vectores de plásmidos que codifican proteínas claves para el ensamblaje de virus se adquirieron de la entidad Takara Company. Se añadió cloruro de calcio CaCh (2mM) que contenía el vector pGp, el vector pE-eco y el vector que codifica el TCR (10 jg). Posteriormente, se añadió bajo agitación el tampón HBS 2 x NaCl2 (274 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄1,5 mM dextrosa 12 mM Hepes 42 mM, pH 7,1). La mezcla de transfección se añadió seguidamente gota a gota a la placa de cultivo de células 293 T y el medio que contenía las partículas virales se recolectó después de 48 horas, se centrifugó y se filtró en filtros con poros de 0,45 jm para separar células y debris y se concentró mediante ultracentrifugación a 50.000 g durante 140 minutos a temperatura ambiente.

Las PBMCs humanas se mantuvieron en cultivo AIM-V complementado con suero humano (5%), anti-hCD3 (30 ng/ml), hIL2 (300 UI/ml) y hIL15 (100 mg/ml), con el fin de estimular la proliferación del componente de linfocitos T. La infección se llevó a cabo incubando 2x106 células/ml en medio de cultivo y añadiendo volúmenes iguales de medio complementado con el virus que codifica el TCR específico para hTERT865-873 o para HCV1406-1415 (como testigo) a 20 MOI. Después de 24 horas de incubación a 37° C y 5% de CO₂, el medio se sustituyó y las células se expandieron. Con el fin de verificar una transferencia génica satisfactoria, se realizó un control por citometría de flujo de las poblaciones clonales con una expresión elevada del TCR de interés. Las células seguidamente se lavaron en solución salina (PBS 1X) y la cadena de TCR de interés fue marcada durante 30 minutos a 4° C con anticuerpo anti-hCD8, anti-hCD34 y anti-mVp3 (Fig. 9A).

Después de comprobar la aparición de la infección y la presencia del TCR correcto, las células fueron enriquecidas mediante un método inmunomagnético usando el estuche de ensayo Sorting hCD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec). Brevemente, las células son marcadas en tampón MACS con gránulos magnéticos conjugados con el anticuerpo monoclonal específico para hCD34. Después de 30 minutos de incubación a 4° C, el exceso se eliminó y la muestra se hizo fluir en una columna previamente equilibrada para una separación magnética. La fracción positiva para CD34 es retenida en la columna y eluida sucesivamente desplazándola fuera del campo magnético.

Validación de la especificidad del TCR para el péptido hTERT865-873 y su eficacia en el reconocimiento de líneas celulares inmortalizadas que expresan telomerasa.

La especificidad para el péptido hTERT865-873 se valoró mediante incubación de linfocitos T transducidos y las PBMCs testigos, con el tratamiento específico para hTERT865-873 o el tetrámero testigo (Fig. 9B), como se indica en las instrucciones del fabricante (prolmmune).

Los niveles de expresión y la actividad funcional de la telomerasa se evaluaron en líneas humanas diferentes de neoplasias malignas inmortalizadas: DG75 (linfoma de Burkitt), JVM13 (leucemia linfocítica crónica B - B CLL), SK₂3mel (melanoma), PT45 (adenocarcinoma pancreático), MDAMB231 (cáncer de mamas), todas restringidas a HLA-A2+ y Raji, linfoma de Burkitt restringido para HLA-A2-. Todas las líneas expresan niveles elevados de telomerasa (Datos no expresados) y se reconocieron mediante los linfocitos T específicos para hTERT865-873 después de un cocultivo in vitro en modo restringido de HLA-A2. El reconocimiento se valoró en términos de liberación de 51 Cr e IFN^y(figuras 10 A y 10B). El primero se llevó a cabo como se describió anteriormente, mientras que en lo que respecta al ensayo de liberación de IFN^y, las células dianas se pusieron en cultivo con las células efectoras a una relación de 3:1 en una placa de 96 pocillos por duplicado durante 24 horas. La materia sobrenadante seguidamente se transfirió a la placa para el ensayo ELISA, como ya se explicó. Este dato confirmó la presencia del péptido HLA/hTERT865-873 complejo en la membrana de células tumorales con diferente histología y la capacidad de la secuencia aislada para codificar un TCR funcional de elevada avidez para reconocer este complejo.

Especificidad y eficacia del clon tratado por ingeniería genética in vivo en el modelo JVM13 de leucemia linfocítica crónica humana

Diez ratones NOG inmunodeficientes fueron inyectados con un clon JVM13, que expresa luciferasa, por vía intravenosa (106 células) y fueron posteriormente tratados con dos transferencias adoptivas semanalmente de 5x106 linfocitos T transgénicos específicos para el péptido hTERT865-873 o para el péptido testigo, ambos seguidos de una administración intraperitoneal de IL-2 (180.000 UI/ratón). La expresión de las células tumorales se verificó semanalmente mediante bioluminiscencia (Fig.11A). Se hicieron mediciones antes del comienzo del tratamiento y seguidamente de forma semanal hasta el momento del sacrificio. Los animales fueron anestesiados con isoflurano y se adquirieron imágenes dorsales y frontales para cada uno de ellos 10 minutos antes y después de una inyección intraperitoneal de luciferina (150 mg/kg- PerkinElmer), para hacer posible discriminar entre la emisión específica y la línea de referencia. Los parámetros de adquisición fueron: tiempo de exposición = 5 minutos, campo de visión = 23 x 23 cm, comenzando con B = 8 y f/parada = 2. Las señales seguidamente se cuantificaron representando gráficamente la región de interés (ROI) en el animal total. Seguidamente se adquirieron las imágenes con el sistema de formación de imágenes de espectros IVIS (PerkinElmer). Cuando el tratamiento específico indujo una disminución significativa de las señales de luminosidad, los ratones fueron sacrificados y la extensión de células de leucemia para los diversos órganos se valoró mediante citometría de flujo y bioluminiscencia (Fig. 11B y 11C). En lo que respecta a la citometría de flujo, los órganos (bazo, médula ósea, hígado y pulmones) fueron tratados mecánicamente y la suspensión celular fue marcada con anticuerpos antihCD19, anti-hCD45 y anti-mCD45 para hacer más preciso el marcado, todo a 4° C durante 30 minutos. Los mismos órganos antes del tratamiento, se pusieron en contacto con luciferina en una placa de 24 pocillos oscura y las imágenes de bioluminiscencia se detectaron como se describió con anterioridad.

Finalmente, se confirmó también la eficacia terapéutica del CTL tratado por ingeniería genética in vivo frente a tumores sólidos de diferente origen histológico Las líneas de células tumorales anteriormente ensayadas in vitro fueron inoculadas (106/ratón) por vía subcutánea en ratones NOG inmunodeficientes. Cuando la masa tumoral alcanzó 125 mm3, los animales fueron tratados con dos transferencias adoptivas de CTL específicas para el péptido hTERT865-873 o para el péptido testigo, siempre seguido de una administración de IL-2 (180.000 UI/ratón). La terapia adoptiva específica para telomerasa ha mostrado, incluso en el caso de tumores sólidos, que es capaz de regular significativamente el crecimiento tumoral, en comparación con el testigo pero, lo que es más importante, ha mostrado ser capaz de mejorar la supervivencia global (Fig.12).

Neoplasias hematológicas distintas de leucemia linfocítica crónica

Se realizó un ensayo ELISA para la liberación de IFN-y después de 24 horas de cocultivo. El ensayo mostró que los linfocitos específicos para hTERT865-873 reconocían específicamente la línea T2 pulsada con el hTERT865-873, pero no la misma línea pulsada con el péptido testigo. Además, fueron capaces de reconocer específicamente tanto la línea inmortalizada de leucemia ALL-CM linfoblástica aguda como la línea celular THP1 de leucemia mieloide aguda, ambas positivas para HLA-A2.

Esto muestra que los linfocitos específicos para hTERT865-873 son capaces de reconocer células in vitro derivadas de leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide aguda.

En un ensayo in vivo, la línea ALL-CM fue inoculada por vía intravenosa en ratones NOG (5x106) células/ratón) y cuando las células B humanas en circulación alcanzaron un 5, los animales fueron tratados con cuatro transferencias adoptivas de CTL específico para el péptido hTERT865-873 o para el péptido testigo, siempre seguido de la administración de IL-2 180000 UI/ratón). El animal fue sacrificado cuando había más de 65% de células B humanas en la circulación. En el sacrificio, el bazo y la médula ósea fueron ensayados en IHC para valorar la presencia de células leucémicas en el bazo (A) y la médula ósea (B). La Figura 14 muestra los resultados de los ensayos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Secuencia genética aislada correspondiente a la secuencia ID. SEC. n° 1, que expresa la cadena a y la secuencia genética aislada correspondiente a la secuencia ID. SEC. n° 2 que expresa la cadena p del receptor de células T (TCR) específico para el complejo HLA-A02 y el péptido de telomerasa hTERT865-873 .

2. Un constructo, que comprende las secuencias genéticas de la reivindicación 1.

3. El constructo según la reivindicación anterior, que está representado por un plásmido.

4. Un vector, que comprende el constructo según la reivindicación 2.

5. El vector según la reivindicación anterior, representado por un vector retroviral o lentiviral.

6. Una célula aislada, transducida con el vector según la reivindicación 5.

7. Una célula T de linfocito aislada, transducida con la secuencia según la reivindicación 1.

8. La célula T de linfocito aislada según la reivindicación 6 o 7, que es una célula aislada de un mamífero.

9. La célula T de linfocito aislada según la reivindicación 8, que es una célula humana aislada.

10. Una célula T de linfocito aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para ser usada como un medicamento.

11. La célula T de linfocito aislada según la reivindicación anterior, para ser usada como un medicamento en el diagnóstico o en el tratamiento de enfermedades neoplásticas.

12. La célula T de linfocito aislada, para ser usada según la reivindicación anterior, en la que la terapia comprende la técnica de transferencia adoptiva de dichas células.

13. La célula T de linfocito aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para ser usada como un medicamento en el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades neoplásticas, en que dichas enfermedades neoplásticas comprenden tumores sólidos y neoplasias hematológicas.

14. La célula T de linfocito aislada para ser usada según la reivindicación anterior, en que dichas enfermedades neoplásticas incluyen neoplasias malignas como linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica, melanoma, adenocarcinoma pancreático, cáncer de mamas, cáncer de colon, leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide aguda.

15. Uso de una o las dos secuencias según la reivindicación 1, para la generación de células T de linfocitos aislados específicas para el péptido hTERT865-873, caracterizado por la secuencia de aminoácidos correspondiente a ID. SEC. n° 7.

16. Uso de un vector según la reivindicación 4, para la generación de células T de linfocitos aisladas específicas para el péptido hTERT6-873, caracterizado por la secuencia de aminoácidos correspondiente a la ID. SEC. n° 7.

17. Método para la generación de un vector, para la transfección de células de linfocitos T aisladas, que comprende el uso de una o de las dos secuencias que tienen una secuencia correspondiente a la ID. SEC. n° 1 o 2.

18. Método para la generación de un vector para la transfección de células T de linfocitos aisladas, que comprende el uso de un constructo que comprende una o las dos secuencias que tienen una secuencia correspondiente a la ID. SEC. n° 1 o 2.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dicho vector es un vector retroviral.

20. Método según la reivindicación 18 o 19, en el que dicho vector es un retrovirus o un lentivirus.