JP2004357711A - Ｇｌｙｔ１機能に関するトランスジェニック動物モデル - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、Glyt1機能に関するトランスジェニック動物モデルを提供することである。
【解決手段】本発明は、ゲノム中でglyt1遺伝子内に条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するためのベクター構築物および方法を提供するが、本動物をさらに用いて、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質を生成するトランスジェニック動物を作製することができる。さらに、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質を生成する前記トランスジェニック動物、およびそれらを作製するための方法もまた提供される。本発明はまた、GLYT1機能を評価するための手段としての、およびシナプスNMDA受容体機能を増強する効果を研究するためのモデルとしての、および精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしてのこれらの動物の使用に関し、かつGLYT1機能のインビボ効果を評価するため、および、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害剤を試験するための方法にも関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、ゲノム中でglyt1遺伝子内に条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するためのベクター構築物および方法を提供するが、本動物をさらに用いて、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質を生成するトランスジェニック動物を作製することができる。さらに、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質を生成する前記トランスジェニック動物、およびそれらを作製するための方法もまた提供される。本発明はまた、GLYT1機能を評価するための手段としての、およびシナプスNMDA受容体機能を増強する効果を研究するためのモデルとしての、および精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしてのこれらの動物の使用に関し、かつGLYT1機能のインビボ効果を評価するため、および、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害剤を試験するための方法にも関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、Glyt1機能に関するトランスジェニック動物モデルに関する。
グリシンは脊髄および脳幹における主要な抑制性神経伝達物質であり、また、NMDA受容体におけるコアゴニスト（co-agonist）でもある。グリシンの細胞外濃度は、少なくとも2種類のNa+/Cl-依存性グリシントランスポーター（GLYT1およびGLYT2）により制御されるが、これらはシナプス後グリシン作動性作用の終結、並びに、シナプス前神経末端および周囲の微細グリア突起へのグリシンの再取り込みによる細胞外グリシン低濃度の維持において、重要な役割を果たす。GLYT2はげっ歯類の脊髄、脳幹および小脳で高発現され、ここで、その発現はストリキニーネ感受性グリシン受容体の存在と非常によく相関する（非特許文献1、2、および3参照)。免疫組織化学的分析により、推定グリシン作動性ニューロンにおける支配的なシナプス前局在が示唆され（非特許文献1および4参照)、これはグリシン作動性抑制性シナプス伝達の終結における役割を強く示唆している。ヒトGLYT2がクローニングされており、類似の発現パターンを呈すると考えられる（非特許文献5参照)。GLYT2はある程度の異種性を有している。実際に2種類のGLYT2アイソフォーム（2aおよび2b）が、げっ歯類の脳において同定されている。
GLYT1は、サルコシンおよびグリシンNメチル化誘導体による遮断に対する感受性により、薬理学的にGLYT2と区別されうる（非特許文献6および7参照)。ヒトglyt1遺伝子がクローニングされており、これは3つのアイソフォーム、GLYT1a、GLYT1bおよびGLYT1cをコードする（非特許文献7参照）が、2種類のラットアイソフォーム、GLYT1aおよびGLYT1bしか同定されていない（非特許文献8、9、および10参照)。GLYT1はラットCNSにおいてグリア細胞およびニューロンの両方で発現すると考えられているが（非特許文献1、9、10、および11参照)、GLYT1aは見かけ上、灰白質およびある種の末梢組織において発現されており、一方GLYT1bはCNSの白質においてのみ発現される（非特許文献10参照)。ヒトでは、全GLYT1アイソフォーム共通のプローブの発現が、いくつかの末梢組織、特に腎臓において見出されたが、一方で、GLYT1cは脳特異的であると考えられる（非特許文献7参照)。GLYT1アイソフォームは、アミノ末端および5'非コード領域のみにおいて違いを有する（非特許文献7および10参照)。GLYT1aおよびGLYT1bは代替プロモーターによる転写に起因するが、一方、ヒトGLYT1cはGLYT1b転写物のスプライスバリアントである（非特許文献7；非特許文献12；並びに非特許文献13)。GLYT1の末梢発現と、アイソフォームの差次的CNS発現パターンの間に重大な不一致があることが、公開された研究の間で明らかになり、これは、幾分議論の的になっている。GLYT1は脊髄、脳幹および間脳においてGLYT2と一緒に発現される。興味深いことに、前脳領域、例えば皮質、海馬および嗅球においても発現されるが（非特許文献1、8、9、10、および11参照)、ここではGLYT1はまた、抑制性グリシン作動性ニューロンが見出されておらず、従ってこれにより、NMDA受容体媒介性神経伝達の調節を含み得る、GLYT1のさらなる役割が示唆される（非特許文献9参照)。
グルタミン酸とグリシン両方の結合が、NMDA受容体活性化に必要である。グルタミン酸が活性依存的な様式でシナプス前末端から放出される一方、グリシンは見かけ上、より定常的なレベルで存在しており、これによりさらなる調節機能が示される。細胞外液および脳脊髄液におけるグリシン濃度の測定により、存在するマイクロモル濃度レベルが低いことが示唆される（非特許文献14参照)。しかしながらグリシントランスポーターはNMDA受容体の局所微小環境において顕著にグリシン濃度を低下させうる。実際に、アメリカツメガエル卵母細胞におけるGLYT1bの発現が、同時発現されたNMDA受容体でのグリシン濃度を低下させることが示されている（非特許文献15および16参照)。さらに、最近の研究により、グリシン取り込み機構はシナプスNMDA受容体活性を調節できることが示唆されている（非特許文献17および18参照)。NMDA受容体-グリシン親和性は、受容体NR2サブユニットの同一性により影響を受け、かつ組換え系においては、NR2B、NR2CまたはNR2Dを含有する受容体と比べて、NR2Aを含有する受容体は、グリシンに対する親和性が顕著に低下する（非特許文献19、20、および21参照)。NR2A発現の発達的増加と並行して、成熟の間、グリシンに対する親和性が顕著に低いNMDA受容体の集団が見られることが示されており（非特許文献22参照)、これは、正常な生理学的条件下でグリシンにより飽和されないNMDA受容体の集団の存在を示唆している。グルタミン酸神経伝達、特にNMDA受容体活性は、シナプス可塑性、学習、および記憶において決定的な役割を果たし、例えばNMDA受容体はシナプス可塑性および記憶形成の閾値をゲート制御するための段階的スイッチとしてはたらくと考えられる（非特許文献23および24参照)。NMDA NR2Bサブユニットを過剰発現するトランスジェニックマウスは、増大されたシナプス可塑性ならびに、学習および記憶における優れた能力を示した（非特許文献25参照)。
GLYT1を選択的に阻害することにより、または遺伝的介入を通じてその機能を低減するもしくは消失させることにより、NMDA受容体活性を促進することができる。このようなアプローチは局所的グリシン濃度を上昇させるが、一方、GLYT2による抑制性グリシン作動性機能の調節は影響を受けないままである。
シナプスNMDA受容体機能のこのような促進は、認知増強効果を生じることが予測される。この戦略の裏付けとして、NMDA受容体-グリシン部位部分的アゴニストであるD-シクロセリンが、老齢ラットにおける水迷路課題の習得を増強すること（非特許文献26参照)および内側中隔損傷（medial septal lesion）により引き起こされるこの課題における欠損を部分的に軽減すること（非特許文献27参照)が示されている。NMDA受容体-グリシン親和性が穏やかに低下した変異マウスもまた、海馬LTP、およびMorris水迷路における空間学習の欠損を呈する（非特許文献28参照)。
NMDA受容体機能低下は、統合失調症の病態生理に関与している（非特許文献29および30参照)。非競合性NMDA受容体アンタゴニスト、例えばPCPおよびケタミンは、統合失調症様の精神病を誘発することができる（非特許文献31、32および33参照)。げっ歯類におけるPCP誘発性活動亢進は、グリシンおよびその誘導体により阻害され（非特許文献34および35参照)、かつ興味深いことに、前脳のグリシン取り込みを阻害するグリシルドデシルアミド（非特許文献36参照)によっても、阻害される（非特許文献37参照)。
最後にグリシンおよびD-シクロセリンもまた、神経遮断薬部分的応答性の統合失調症患者の陰性症状および認知症状を有意に低下させることが示されている（非特許文献38、39、および40参照)。
GLYT1ノックアウトマウスにより、GLYT1の生理学的機能を評価するための貴重な手段が提供され、かつまた純粋なGLYT2発現系も提供される。これらのマウスは前脳におけるグリシンレベルの上昇を呈すると考えられ、NMDA受容体-グリシン部位占有の積極的な制御が生理学的なNMDA受容体機能に重要であるかどうかの問題に対処するのに有用でありうる。
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本発明の課題は、Glyt1機能に関するトランスジェニック動物モデルを提供することである。
本発明は、ゲノム内のglyt1遺伝子内において条件的標的変異（conditional targeted mutation）を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製するための、ベクター構築物および方法を提供する。これらのトランスジェニック動物をさらに使用して、活性が低いかまたは活性がないGLYT1タンパク質を生成するトランスジェニック動物を作製することができる。さらに、活性が低いかまたは活性がないGLYT1タンパク質を生成するトランスジェニック動物、およびそれらを作製する方法もまた提供される。本発明はまた、GLYT1機能を評価するための手段としての、およびシナプスNMDA受容体機能の増強効果を研究するためや精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしての、これらの動物の使用に関し、かつ、GLYT1機能のインビボ効果を評価して、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害剤を試験するための方法にも関する。
本発明に係るベクター構築物においては、（１）glyt1遺伝子のゲノム配列が、陽性選択マーカーおよび任意で陰性選択マーカーを含み、かつ、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部が、リコンビナーゼ認識部位により構成されている、glyt1遺伝子のゲノム配列の全体または一部を含むベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（２）ゲノム配列がglyt1遺伝子の全エキソンを含む、上記(1)記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（３）ゲノム配列が陽性選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む、上記(1)または(2)記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（４）ゲノム配列が任意で陰性選択マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子を含む、上記(1)または(2)記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（５）ゲノム配列が、陽性選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含み、かつ陰性選択マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子を含む、上記(1)または(2)記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（６）陽性選択マーカーがリコンビナーゼ認識部位により構成されている、上記(1)から(5)のいずれか一つ記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（７）glyt1遺伝子のエキソン5〜11がリコンビナーゼ認識部位により構成されている、上記(1)から(6)のいずれか一つ記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（８）glyt1遺伝子のゲノム配列がマウス配列である、上記(1)から(7)のいずれか一つ記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係るベクター構築物においては、（９）配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、上記(1)記載のベクター構築物であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法においては、（１０）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（c）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（c）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
また、本発明に係る方法においては、（１１）（d）段階（c）で作製したトランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のゲノム配列内の選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物とさらに交雑させる段階
をさらに含む、上記(10)記載の方法であることを特徴とする。
をさらに含む、上記(10)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法においては、（１２）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、上記(10)または(11)記載の方法の任意の段階を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階をさらに含む方法であることを特徴とする：
（e）トランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物と交雑させる段階；並びにそれにより
（f）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（e）トランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物と交雑させる段階；並びにそれにより
（f）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
また、本発明に係る方法においては、（１３）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物において、該リコンビナーゼが組織特異的プロモーター系の調節下で発現される、上記(12)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法においては、（１４）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物において、該リコンビナーゼが調節プロモーター系の調節下で発現される、上記(12)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法においては、（１５）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（d）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（d）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
また、本発明に係る方法においては、（１６）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（d）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（e）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（a）上記(1)から(9)のいずれか一つ記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（d）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（e）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１７）上記(10)または(11)記載の方法により作製された、トランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１８）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（１９）条件的標的変異がGLYT1活性に必須のアミノ酸をコードするglyt1ゲノム配列の一部を構成するリコンビナーゼ認識部位を含む、上記(18)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２０）動物がげっ歯類である、上記(17)から(19)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２１）げっ歯類がマウスである、上記(20)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２２）上記(12)から(16)のいずれか一つ記載の方法により作製された、トランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２３）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２４）ゲノムが、上記対立遺伝子の一方または両方において、エキソン5〜11が欠失したglyt1遺伝子を含む、上記(23)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２５）ゲノムが、上記対立遺伝子の一方または両方において、天然glyt1遺伝子の代わりに配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、上記(24)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２６）動物がげっ歯類である、上記(22)から(25)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物においては、（２７）げっ歯類がマウスである、上記(26)記載のトランスジェニック非ヒト動物であることを特徴とする。
また、本発明に係る子孫においては、（２８）同一のまたは別の遺伝子型の動物との交配により得られる、上記(17)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫であることを特徴とする。
また、本発明に係る細胞系または初代細胞培養物においては、（２９）上記(22)から(28)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する、細胞系または初代細胞培養物であることを特徴とする。
また、本発明に係る組織または脳切片器官型培養物においては、（３０）上記(22)から(28)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する、組織または脳切片器官型培養物であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用においては、（３１）精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしての、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用においては、（３２）シナプスNMDA受容体機能を増強する効果を研究するためのモデルとしての、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用においては、（３３）GLYT1機能を評価するための手段としての、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法においては、（３４）以下の段階を含む、NMDA受容体活性化に及ぼすGLYT1機能のインビボ効果を評価するための方法であることを特徴とする：
上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物における、NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および学習と記憶を含む行動を決定する段階；並びに
NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および行動を、天然glyt1遺伝子を含む動物と比較する段階。
上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物における、NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および学習と記憶を含む行動を決定する段階；並びに
NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および行動を、天然glyt1遺伝子を含む動物と比較する段階。
また、本発明に係る方法においては、（３５）以下の段階を含む、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法であることを特徴とする：
GLYT1阻害化合物を、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物に投与する段階；並びに
行動、電気生理学および組織学の評価と、行動、電気生理学および組織学の対照との比較を含む、化合物の効果を決定する段階。
GLYT1阻害化合物を、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物に投与する段階；並びに
行動、電気生理学および組織学の評価と、行動、電気生理学および組織学の対照との比較を含む、化合物の効果を決定する段階。
また、本発明に係るキットおよび手段においては、（３６）上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物を含む、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するためのキット、並びに、GLYT1阻害剤がGLYT1特異的効果以外の効果を呈するかどうかを判定するための手段であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用においては、（３７）GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するための、上記(22)から(27)のいずれか一つ記載のトランスジェニック非ヒト動物、または上記(29)記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または上記(30)記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用であることを特徴とする。
本発明により、Glyt1機能に関するトランスジェニック動物モデルが提供された。
従って本発明は、glyt1遺伝子のゲノム配列全体または一部を含むベクター構築物を提供するが、ここでゲノム配列は陽性選択マーカーおよび任意で陰性選択マーカーを含み、かつglyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部はリコンビナーゼ認識部位により構成される。
マウスのglyt1遺伝子のゲノム配列は、エキソン1a、1b、1cおよび2〜13を含む。本ベクター構築物は、相同組換えに必要なglyt1遺伝子のゲノム配列を十分含み、かつglyt1遺伝子のエキソンの一部またはリコンビナーゼ認識部位により構成されるglyt1遺伝子の1つもしくは複数のエキソンを含む、ゲノム配列の一部を含む。本ベクター構築物は、glyt1遺伝子の全エキソン、好ましくはエキソン1c〜13を含むことができる。
ベクター構築物中のゲノム配列は陽性選択マーカーを含み、ここで、陽性選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む群から選択されうる。陽性選択マーカーをリコンビナーゼ認識部位で構成することもでき、これにより、相同組換え事象成功について選択した後、陽性選択マーカー遺伝子を切除することが可能になる。それにより、陽性選択マーカー発現がglyt1遺伝子発現に及ぼす影響を全て回避することができる。リコンビナーゼ認識部位を、flpリコンビナーゼ用のfrt部位およびcreリコンビナーゼ用のlox部位を含む群から選択することができる。好ましくは、陽性選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子である。任意で、ベクター構築物内のゲノム配列はさらに陰性選択マーカーを含み、ここで陰性選択マーカーはジフテリア毒素遺伝子およびHSVチミジンキナーゼ遺伝子を含む群から選択されうる。好ましくは、陰性選択マーカーはジフテリア毒素遺伝子である。
glyt1遺伝子のゲノム配列においては、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部は、リコンビナーゼ認識部位により構成されている。次いで、このglyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を、リコンビナーゼの助けにより除去することができる。リコンビナーゼ認識部位を、flpリコンビナーゼ用のfrt部位およびcreリコンビナーゼ用のlox部位を含む群から選択することができる。従って、その機能および活性に必要なGLYT1タンパク質のアミノ酸配列の一部をコードするエキソンの一部、すなわちglyt1遺伝子のエキソンの1つまたは複数は、リコンビナーゼ認識部位により構成される。好ましい態様において、glyt1遺伝子のエキソン5〜11が、リコンビナーゼ認識部位により構成される。
さらに好ましい態様において、図1で表されるpGLYT1ベクター構築物が提供される。
さらに好ましい態様において、glyt1遺伝子のゲノム配列は、マウス配列である。
別の好ましい態様において、ベクター構築物は、配列番号：1のヌクレオチド配列を含む。
本発明はさらに、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であり、以下の段階を含む方法を提供する：
（a）上述のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（c）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（a）上述のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（c）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
上述の方法の段階（c）において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載のMT1構築物を含む、トランスジェニック動物を作製できる。
本明細書で用いるトランスジェニック動物という用語は、遺伝子に条件的標的変異を含む動物、遺伝子に標的ヌル変異を含むノックアウト動物、遺伝子の標的化された挿入を含むノックイン動物、および、導入遺伝子の無作為挿入を含む動物を含む。本明細書で用いる、特定の遺伝子に条件的標的変異を含む動物とは、前記遺伝子が、そのタンパク質コード機能を損うことなく、リコンビナーゼによる組換えの際に前記遺伝子における機能変異が生じるように修飾されている動物である。
さらなる態様において、上述の方法は、（d）段階（c）で作製されたトランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物とさらに交雑させる段階を含む。
上述の方法の段階（d）において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載のMT1.2構築物を含む、トランスジェニック動物を作製することができる。
別の態様において、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であり、以下の段階を含む方法が提供される：
（e）上述の方法の段階（c）で作製されたトランスジェニック動物または段階（d）で作製されたトランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物と交雑させる段階；並びにそれにより
（f）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（e）上述の方法の段階（c）で作製されたトランスジェニック動物または段階（d）で作製されたトランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物と交雑させる段階；並びにそれにより
（f）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
上述の方法の段階（f）において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載のMT1.1構築物を含む、トランスジェニック動物を作製することができる。
特異的条件的標的構築物に基づいて、組織特異的なまたは誘導可能なGLYT1欠損動物を作製することができる。これらの動物を、遺伝的、組織学的、電気生理学的および行動的に分析することができる。
さらなる態様において、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物において、前記リコンビナーゼは組織特異的プロモーター系の調節下で発現される。組織特異的プロモーター系は、例えば脳組織、筋肉組織、肝臓組織、腎臓組織等において、組織特異的様式で遺伝子の発現を調節するおよび行う任意のプロモーター系でよい。脳に存在する細胞において特異的発現を誘発することが知られているプロモーターの例には、メタロチオネインIIIプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター、ナトリウムチャネルプロモーター、神経フィラメントM（NF-M）プロモーター、神経フィラメントL（NF-L）プロモーター、神経フィラメントH（NF-H）プロモーター、グリア繊維性酸性タンパク質（GFAP）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）プロモーター、プロテオリピドタンパク質（Plp）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター、アルドラーゼCプロモーター、シナプシンIプロモーター、ロンボチン1プロモーター、ドーパミンβヒドロキシラーゼ（DBH）プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、および、プルキンエ細胞（Pcp2）プロモーターが含まれる。
さらに別の態様において、リコンビナーゼに関してトランスジェニックである前記動物におけるリコンビナーゼが、調節（controllable）プロモーター系の調節下で発現される。調節プロモーター系は、例えば特異的インデューサーまたはリプレッサー物質の添加により、制御可能および/または誘導可能な様式で導入遺伝子の発現を調節する、任意のプロモーター系でありうる。いくつかの細菌性誘導プロモーター系が当技術分野において公知である（Schultze,N.、Burki,Y.、Lang,Y.、Certa,U.、Bluethmann,H.、Nat Biotechnol.14（4）：499-503（1996）；van der Neut,R.、Targeted gene disruption:applications in neurobiology、J.Neurosci.Methods、71（1）：19-27（1997）；Liu,H.S.、Lee,C.H.、Lee,C.F.、Su,I.J.、Chang,T.Y.、Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines.、Biotechniques.24（4）：624-628、630-632（1998))。
さらなる態様において、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
（a）上述のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を、前記胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（d）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（a）上述のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を、前記胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（d）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
上述の方法の段階（d）において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載のMT1.1構築物を含む、トランスジェニック動物を作製することができる。
上述の方法は、段階（b）に続いて、以下の段階をさらに含むことができる：
（c）glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を、前記胚幹細胞にさらに導入する段階；
（d）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；ならびにそれにより
（e）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
（c）glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を、前記胚幹細胞にさらに導入する段階；
（d）前記胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；ならびにそれにより
（e）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。
標的変異を含むトランスジェニック動物は、Capecchi（Capecchi,M.R.、Trends Genet.5（3）：70-76頁（1989))およびThomasら（Thomas,K.R.およびM.R.Capecchi、Cell 51（3）：503-512頁（1987))により提供されるように、当技術分野において日常的に得られる。
例えば、組換え胚幹細胞クローンを選択する段階、組換え胚幹細胞クローンの標的変異を確認する段階、確認された組換え胚幹細胞を胚盤胞に注射する段階、胚盤胞からキメラを作製する段階、標的変異の生殖系伝達に関してキメラを調査する段階、ヘテロ接合性動物を産生する段階、および任意で、これらのヘテロ接合性トランスジェニック動物を交雑させてホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階により、上述の方法のヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製することができる。
細胞培養物ベースのモデルもまた、2種類の方法により調製されうる。細胞培養物を、トランスジェニック動物から単離することができ、または、同一の構築物を用いて、標準的な細胞トランスフェクション技術により確立された細胞培養物から調製することができる。
当技術分野において用いられる胚幹細胞を本発明の方法で用いることもでき、これは、C57BL/6J胚幹細胞、BALB/c胚幹細胞、およびDBA/2J胚幹細胞、CAB/J胚幹細胞、ならびにマウス129株の胚幹細胞系を含む。
本発明はさらに、上述の方法のいずれかにより作製されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
本発明の別の態様において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。好ましい態様において、条件的標的変異は、GLYT1活性に必須のアミノ酸をコードするglyt1ゲノム配列の一部を構成するリコンビナーゼの認識部位を含む。
さらなる態様において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載の構築物MT1または構築物MT1.2を含む、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。
特異的条件的標的構築物に基づいて、組織特異的なまたは誘導可能なGLYT1欠損動物を作製することができる。これらの動物を、遺伝的、組織学的、電気生理学的、および行動的に分析することができる。
本発明はさらに、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、エキソン5〜11が除去されたglyt1遺伝子を対立遺伝子の一方または両方に含む。さらなる態様において、glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が図2に記載の構築物MT1.1を含む、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。
別の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト動物は、対立遺伝子の一方または両方において、天然glyt1遺伝子の代わりに配列番号：1のヌクレオチド配列を含む。
glyt1遺伝子の1つまたは両方の対立遺伝子がほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるように変異および/または切断された上述のトランスジェニック動物では、内因性グリシンレベルの変化によるインビボにおけるNMDA受容体活性の修飾が期待される。海馬および脳の皮質領域におけるGLYT2受容体の欠如のために、これらの領域におけるGLYT1の破壊が、グルタミン酸シナプスにおけるグリシンレベルの上昇をもたらし、従ってNMDA受容体機能が増大することが予測される。これらの動物において、認知機能の変化が生じうり、かつ、精神病様の総体症状の誘導に対する感受性の可能な変化が生じうる。
トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の方法に使用されうる当技術分野において公知の任意の動物であってよい。好ましくは、本発明の動物は哺乳動物であり、本発明のトランスジェニック動物は、さらに好ましくはげっ歯類であり、最も好ましくはマウスである。
本発明はまた、本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト動物の子孫にも関し、これは、同一または別の遺伝子型との交配により得られる。
本発明はさらに、細胞系または初代細胞培養物、組織、および、本発明により提供されるトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する脳切片器官型培養物を提供する。
条件的標的変異を含む導入遺伝子の組み込みは、2週齢〜3週齢のマウスの尾生検から単離されたDNAを用いて、ゲノムサザンブロットおよびPCR分析を含む種々の方法により検出されうる。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によるまたはノーザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーションによるmRNA定量化を含むRNAレベルの方法、並びに、組織化学、免疫ブロット分析およびインビボ結合試験を含むタンパク質レベルの方法を含む、導入遺伝子の発現を検出するために用られうる非常に多くの分析手順が存在することは、当業者に明らかであろう。さらに標的化された遺伝子の発現レベルの定量化を、当業者に公知のElISA技術により決定することができる。
多くの標準的なアッセイを用いて定量測定を行うことができる。例えば、RT-PCRならびに、RNase保護、ノーザンブロット分析、およびRNAドット分析を含むハイブリダイゼーション法を用いて、転写レベルを測定することができる。APPおよびA-βレベルを、ELISA、ウェスタンブロット分析により、および免疫組織化学的染色した組織切片の比較により検定することができる。また免疫組織学的染色および免疫電子顕微鏡を用いて、GLYT1タンパク質の有無を評価することもできる。このようなアッセイの具体例を以下に示す。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、ヌクレオチド塩基A、T、CおよびGからなるDNA、または、塩基A、U（Tの代替基）、CおよびGからなるRNAでありうる、1本鎖分子または2本鎖分子を意味する。ポリヌクレオチドは、コード鎖またはその相補鎖を表しうる。ポリヌクレオチド分子は、天然配列と配列上同一であってよく、または、天然配列中に見出されるのと同一のアミノ酸をコードする代替コドンを含んでよい（Lewin、「Genes V」、Oxford University Press、第7章、171-174頁（1994）参照）。さらにポリヌクレオチド分子は、上述のアミノ酸の保存的置換を表すコドンを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNAまたはcDNAを表すことができる。
免疫組織化学、電子顕微鏡、核磁気共鳴画像（MRI）を含む当技術分野において公知の方法により、ならびに神経学的機能および認知機能に関する行動研究により、本発明のトランスジェニック動物をさらに特徴付けることができる。行動試験の例を、自発的行動、認知機能に関連する行動、薬理学的に破壊された行動、握力、ワイヤー操作、水泳試験、ロータロッド、歩行運動、モリス水迷路、Y迷路、明暗選択性（light-dark preference）、受動的および能動的回避試験である。
本発明のさらなる目的とは、上述のトランスジェニック非ヒト動物の、細胞系もしくは組織の、またはそれらに由来する脳切片器官型培養物の、精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしての使用である。加えて、これらのトランスジェニック動物、細胞もしくは組織、またはそれらに由来する脳切片器官型培養物を、シナプスNMDA受容体機能を増強する効果を研究するためのモデルとして使用することができる。さらに、これらのトランスジェニック非ヒト動物、細胞もしくは組織、またはそれらに由来する脳切片器官型培養物を、GLYT1機能を評価するための手段として使用することができる。
さらなる態様において、GLYT1機能がNMDA受容体活性化に及ぼすインビボ効果を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物におけるNMDA受容体活性、シナプス可塑性および学習と記憶を含む行動を決定する段階；ならびに
NMDA受容体活性、シナプス可塑性および行動を、天然glyt1遺伝子を含む動物と比較する段階。
ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物におけるNMDA受容体活性、シナプス可塑性および学習と記憶を含む行動を決定する段階；ならびに
NMDA受容体活性、シナプス可塑性および行動を、天然glyt1遺伝子を含む動物と比較する段階。
別の態様において、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物、細胞系もしくは初代細胞培養物、またはそれから誘導された脳切片器官型培養物に、GLYT1阻害化合物を投与する段階；ならびに
行動、電気生理学および組織学の評価と、行動、電気生理学および組織学の対照との比較を含む、化合物の効果を決定する段階。
ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物、細胞系もしくは初代細胞培養物、またはそれから誘導された脳切片器官型培養物に、GLYT1阻害化合物を投与する段階；ならびに
行動、電気生理学および組織学の評価と、行動、電気生理学および組織学の対照との比較を含む、化合物の効果を決定する段階。
本発明の方法において使用することができるGLYT1阻害化合物は、ALX5407（NPS Pharmaceuticals/NPS Allelix）およびORG24598（Akzo/Organon）を含む、当技術分野において公知のGLYT1阻害化合物のいずれであってもよい。
対照には、ほとんどもしくは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子が変異していないような、または、動物、細胞系もしくは初代細胞培養物、または脳切片器官型培養物が天然glyt1遺伝子を含むような、任意の動物、細胞系もしくは初代細胞培養物、または脳切片器官型培養物もしくは組織が含まれうる。行動の評価には、自発的行動、空間的な短期記憶と長期記憶を含む認知機能に関する行動、対象認識記憶、連合情動記憶、条件付恐怖消去、ならびに、薬物誘発性運動過剰、薬物誘発性引きこもり、プレパルス抑制の薬物誘発欠損、および薬物誘発性記憶喪失を含む薬理学的分裂行動を含むことができる。
本発明はさらに、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物、または細胞系もしくは初代細胞培養物もしくは組織またはそれらに由来する脳切片器官型培養物もしくは組織を含む、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するためのキットに関し、GLYT1阻害剤がGLYT1特異的効果以外の効果を呈するかどうかを判定するための手段に関する。
さらに、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するために、ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物の使用、または細胞系もしくは初代細胞培養物もしくは組織またはそれらに由来する脳切片器官型培養物もしくは組織が提供される。
GLYT1特異的効果以外の効果とは、GLYT1阻害化合物と任意の別の分子との相互作用により生じる任意の副作用でありうる。
本発明はさらに、特に上述の例を参照して本明細書において実質的に記載されたトランスジェニック動物、方法、組成物、キットおよび使用を提供する。
ここまで本発明を概説したが、特記しない限り限定を意図したものではない、説明目的で本明細書に含まれた具体的な実施例を、添付の図面と共に参照することにより、さらにより理解されるであろう。
実施例において言及される市販の試薬は、特記しない限り、製造者の説明書に従って使用される。
実施例１：トランスジェニックマウスの作製
A）glyt1のゲノムクローニング
標的化された破壊のための必要条件として、glyt1遺伝子をクローニングした。マウスglyt1の部分的ゲノム配列に基づいて（Adams,R.H.ら、J.Neurosci.、15（3Pt2）：2524-2532頁（1995))、エキソン1c〜2、エキソン3〜4、エキソン5〜11、およびエキソン12〜13を有する4つのゲノムDNAセグメントを、PCRにより増幅した（プローブAについては配列番号：2および3のプライマー；プローブBについては配列番号：4および5のプライマー；プローブCについては配列番号：6および7のプライマー；プローブDについては配列番号：8および9のプライマー）。増幅されたDNAセグメントをプローブとして使用し、ES細胞系mJAX32（129J/Ems）のDNAから構築したゲノムライブラリーをスクリーニングした。4つのエキソンプローブ全てにハイブリダイズした15kbのクローン一種類を単離した。このクローンをマッピングし、シークエンシングして、glyt1遺伝子の完全なコード配列を含有することを見出した（図1）。
A）glyt1のゲノムクローニング
標的化された破壊のための必要条件として、glyt1遺伝子をクローニングした。マウスglyt1の部分的ゲノム配列に基づいて（Adams,R.H.ら、J.Neurosci.、15（3Pt2）：2524-2532頁（1995))、エキソン1c〜2、エキソン3〜4、エキソン5〜11、およびエキソン12〜13を有する4つのゲノムDNAセグメントを、PCRにより増幅した（プローブAについては配列番号：2および3のプライマー；プローブBについては配列番号：4および5のプライマー；プローブCについては配列番号：6および7のプライマー；プローブDについては配列番号：8および9のプライマー）。増幅されたDNAセグメントをプローブとして使用し、ES細胞系mJAX32（129J/Ems）のDNAから構築したゲノムライブラリーをスクリーニングした。4つのエキソンプローブ全てにハイブリダイズした15kbのクローン一種類を単離した。このクローンをマッピングし、シークエンシングして、glyt1遺伝子の完全なコード配列を含有することを見出した（図1）。
B）glyt1遺伝子標的化ベクターの構築
ES細胞においてglyt1を標的化するために、条件的遺伝子破壊ベクターを構築して、組織限定的または時間限定的にGLYT1が欠損したマウスを得た。
ES細胞においてglyt1を標的化するために、条件的遺伝子破壊ベクターを構築して、組織限定的または時間限定的にGLYT1が欠損したマウスを得た。
構築物pGLYT1は、ベクターpBluescriptにクローニングされた、マウスglyt1遺伝子に相同的な全10kbの配列（図1、配列番号：1）を含む。これは、陽性選択および陰性選択両方を可能にする、置換型の遺伝子標的化ベクターである。陽性選択については、frt隣接ネオマイシン耐性遺伝子をglyt1遺伝子のイントロン11に挿入した。陰性選択を可能にするために、ジフテリア毒素遺伝子をベクターの3'末端に付加した。glyt1遺伝子の条件的破壊を達成するために、エキソン5〜11を含むglyt1遺伝子5kbに隣接して、loxP部位を挿入した。pGLYT1マウスでは、frt部位におけるFlp媒介性組換えにより、ネオマイシン耐性遺伝子を切除して、遺伝子干渉による人為的影響を完全に排除することができる（E参照）。
C）B6-glyt1tm1マウスの生成
C57BL/6J胚幹細胞（Eurogentec）を培養し、NotI直線化標的化ベクターpGLYT1でトランスフェクトした（Capecchi,M.R.、Trends Genet.5（3）：70-76頁（1989))。選択したクローンをPCRにより相同組換えに関してスクリーニングした（図2）。glyt1対立遺伝子に変異を有する、正確に標的化されたクローン（IC6、図4A）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に使用した。注射した胚盤胞を代理母（foster mother）に移植した後に生まれたキメラ雄をC57BL/6J雌と交配し、Glyt1tm1変異の生殖系伝達に関するPCR分析により、子孫を分析した（配列番号：10〜15；図4B）。ヘテロ接合性B6-Glyt1tm1+/-マウスを交雑させてホモ接合的に変異した動物を得た。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
C57BL/6J胚幹細胞（Eurogentec）を培養し、NotI直線化標的化ベクターpGLYT1でトランスフェクトした（Capecchi,M.R.、Trends Genet.5（3）：70-76頁（1989))。選択したクローンをPCRにより相同組換えに関してスクリーニングした（図2）。glyt1対立遺伝子に変異を有する、正確に標的化されたクローン（IC6、図4A）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に使用した。注射した胚盤胞を代理母（foster mother）に移植した後に生まれたキメラ雄をC57BL/6J雌と交配し、Glyt1tm1変異の生殖系伝達に関するPCR分析により、子孫を分析した（配列番号：10〜15；図4B）。ヘテロ接合性B6-Glyt1tm1+/-マウスを交雑させてホモ接合的に変異した動物を得た。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
D）B6-glyt1tm1.1マウスの生成
C）で用いたのと同一のクローン（IC6）をCre組換えに用いて、loxP部位に隣接するエキソン5〜11をインビトロで切除した。ES細胞を1.5×107個まで増殖させ、スーパーコイルpMC-Cre 20μgを用いてエレクトロポレーションした（Thomas,K.R.およびM.R.Capecchi、Cell 51（3）：503-512頁（1987))。単一のコロニーを取り、PCRにより部位特異的組換えに関してスクリーニングした（配列番号：10および16）。glyt1対立遺伝子に欠失を有する、正確な組換えが行われたクローン（IIB2）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に用いた。キメラを産生させ、上記C）で記載したように試験した（図5）。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
C）で用いたのと同一のクローン（IC6）をCre組換えに用いて、loxP部位に隣接するエキソン5〜11をインビトロで切除した。ES細胞を1.5×107個まで増殖させ、スーパーコイルpMC-Cre 20μgを用いてエレクトロポレーションした（Thomas,K.R.およびM.R.Capecchi、Cell 51（3）：503-512頁（1987))。単一のコロニーを取り、PCRにより部位特異的組換えに関してスクリーニングした（配列番号：10および16）。glyt1対立遺伝子に欠失を有する、正確な組換えが行われたクローン（IIB2）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に用いた。キメラを産生させ、上記C）で記載したように試験した（図5）。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
E）B6-glyt1tm1.2マウスの生成
C）で用いたのと同一のクローン（IC6）をFlp組換えに用いて、frt部位に隣接するネオマイシン耐性遺伝子をインビトロで切除した。ES細胞を1.5×107個まで増殖させ、Flpリコンビナーゼの発現用のスーパーコイルプラスミド20μgを用いてエレクトロポレーションした（Gu,H.、Y.R.ZouおよびK.Rajewsky、Cell 73（6）：1155-1164頁（1993))。単一のコロニーを取り、PCRにより部位特異的組換えに関してスクリーニングした（配列番号：10、12および16）。正確に組換えられたクローン（IIE5）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に用いた。キメラを産生させ、C）で記載したように試験した（図6）。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
C）で用いたのと同一のクローン（IC6）をFlp組換えに用いて、frt部位に隣接するネオマイシン耐性遺伝子をインビトロで切除した。ES細胞を1.5×107個まで増殖させ、Flpリコンビナーゼの発現用のスーパーコイルプラスミド20μgを用いてエレクトロポレーションした（Gu,H.、Y.R.ZouおよびK.Rajewsky、Cell 73（6）：1155-1164頁（1993))。単一のコロニーを取り、PCRにより部位特異的組換えに関してスクリーニングした（配列番号：10、12および16）。正確に組換えられたクローン（IIE5）を、Balb/c宿主胚盤胞への注射に用いた。キメラを産生させ、C）で記載したように試験した（図6）。ヘテロ接合性動物は生存可能であり、巨視的表現型を全く示さなかった。
実施例２：GLYT1変異マウスの分子分析
1）GLYT1変異マウスの組織学的分析
ウサギおよびモルモットの中で産生されたGLYT1特異的抗体を用いて、変異マウスの脳におけるGLYT1の発現を免疫組織化学的に分析する。GLYT1変異マウスおよび野生型マウスにおけるGLYT1発現は、NMDA受容体の発現パターンと相関する。
1）GLYT1変異マウスの組織学的分析
ウサギおよびモルモットの中で産生されたGLYT1特異的抗体を用いて、変異マウスの脳におけるGLYT1の発現を免疫組織化学的に分析する。GLYT1変異マウスおよび野生型マウスにおけるGLYT1発現は、NMDA受容体の発現パターンと相関する。
2）GLYT1変異マウスの電気生理学的分析
NMDA受容体活性化は、特定の形態の長期間増強作用（LTP）の誘導に必要である（Bliss,T.V.およびG.L.Collingridge、Nature 361（6407）：31-39頁（1993))。GLYT1変異体の海馬切片におけるシータ波刺激により誘発される増強作用を、以前記載されたテタヌス後の期間全体を通して、野生型対照と比較する（Kew,J.N.ら、J.Neurosci.20（11）：4037-4049頁（2000))。対照と比較して、GLYT1変異マウスがLTPの誘発に対する感受性の増大を示すどうかを判定する。
NMDA受容体活性化は、特定の形態の長期間増強作用（LTP）の誘導に必要である（Bliss,T.V.およびG.L.Collingridge、Nature 361（6407）：31-39頁（1993))。GLYT1変異体の海馬切片におけるシータ波刺激により誘発される増強作用を、以前記載されたテタヌス後の期間全体を通して、野生型対照と比較する（Kew,J.N.ら、J.Neurosci.20（11）：4037-4049頁（2000))。対照と比較して、GLYT1変異マウスがLTPの誘発に対する感受性の増大を示すどうかを判定する。
3）前脳および脳幹シナプトソームの調製
マウスを屠殺して脳組織を氷上で切開し、その後の手順を4℃で実施する。0.32Mショ糖および1mM Pefabloc（プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含有する10mM Tris-HCl（pH7.4）（緩衝液A）10容量（w/v）中で、ガラス/テフロンホモジナイザーを用いて（800rpm、10回）組織をホモジナイズする。ホモジネートを1300×gで5分間、遠心分離する。上清を注意深くデカンテーションして氷上に置き、一方ペレットを（元の重量の）5容量の緩衝液Aに懸濁し、前記したようにホモジナイズした後遠心分離する。第2の上清を第1の上清に加え、17,000×gで20分間遠心分離する。得られるペレット（粗シナプトソーム画分）を、10mMグルコースを含有するクレブスリンガー液（KRB）（pH7.4）（元の重量の）5容量に懸濁する。
マウスを屠殺して脳組織を氷上で切開し、その後の手順を4℃で実施する。0.32Mショ糖および1mM Pefabloc（プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含有する10mM Tris-HCl（pH7.4）（緩衝液A）10容量（w/v）中で、ガラス/テフロンホモジナイザーを用いて（800rpm、10回）組織をホモジナイズする。ホモジネートを1300×gで5分間、遠心分離する。上清を注意深くデカンテーションして氷上に置き、一方ペレットを（元の重量の）5容量の緩衝液Aに懸濁し、前記したようにホモジナイズした後遠心分離する。第2の上清を第1の上清に加え、17,000×gで20分間遠心分離する。得られるペレット（粗シナプトソーム画分）を、10mMグルコースを含有するクレブスリンガー液（KRB）（pH7.4）（元の重量の）5容量に懸濁する。
4）グリシン取り込み
アッセイを、96ウェルプレートで実施する。マウス前脳（0.1mg）および脳幹（0.05mg）シナプトソーム調製物のアリコートを、120nM［3H］グリシンを添加したKRB中（全量250μl）で30分間、22℃でインキュベートする。96ウェルのPackard GF/Bユニフィルタープレート上で急速に濾過することによりインキュベーションを停止し、続いて氷冷KRBで3回洗浄する。シンチレーション溶液を添加した後、ウェルの放射活性含量を測定する。
アッセイを、96ウェルプレートで実施する。マウス前脳（0.1mg）および脳幹（0.05mg）シナプトソーム調製物のアリコートを、120nM［3H］グリシンを添加したKRB中（全量250μl）で30分間、22℃でインキュベートする。96ウェルのPackard GF/Bユニフィルタープレート上で急速に濾過することによりインキュベーションを停止し、続いて氷冷KRBで3回洗浄する。シンチレーション溶液を添加した後、ウェルの放射活性含量を測定する。
5）MK801に対する結合飽和
96ウェル深型プレート中でアッセイを実施する。マウス前脳および脳幹シナプトソーム調製物（0.07mg）のアリコートを、漸増濃度（0.03nM〜300nM）の［3H］MK801を添加した100μMグルタミン酸および30μMグリシンを含む20mM Hepes-KOH（pH7.4）中（全量0.5ml）で1時間、22℃でインキュベートする。10μM MK801を用いて、非特異的結合を定義する。96ウェルPackard GF/Cユニフィルタープレート上で急速に濾過することによりインキュベーションを停止させ、続いて氷冷20mM Hepes-KOH（pH7.4）で3回洗浄する。シンチレーション溶液の添加後、ウェルの放射活性含量を測定する。
96ウェル深型プレート中でアッセイを実施する。マウス前脳および脳幹シナプトソーム調製物（0.07mg）のアリコートを、漸増濃度（0.03nM〜300nM）の［3H］MK801を添加した100μMグルタミン酸および30μMグリシンを含む20mM Hepes-KOH（pH7.4）中（全量0.5ml）で1時間、22℃でインキュベートする。10μM MK801を用いて、非特異的結合を定義する。96ウェルPackard GF/Cユニフィルタープレート上で急速に濾過することによりインキュベーションを停止させ、続いて氷冷20mM Hepes-KOH（pH7.4）で3回洗浄する。シンチレーション溶液の添加後、ウェルの放射活性含量を測定する。
実施例３：GLYT1欠損マウスの行動分析
GLYT1欠損マウスにおけるNMDA受容体機能の増強が認知機能に影響を及ぼすことが予想されうり、アポモルフィン、D-アンフェタミン、フェンシクリジン（PCP）を含む、統合失調症型症状に影響する薬物に対する感受性を変化させることが予測されうる。
GLYT1欠損マウスにおけるNMDA受容体機能の増強が認知機能に影響を及ぼすことが予想されうり、アポモルフィン、D-アンフェタミン、フェンシクリジン（PCP）を含む、統合失調症型症状に影響する薬物に対する感受性を変化させることが予測されうる。
1）自発的行動
体位、歩調および知覚性応答などの自然の探索行動の徴候に関して、GLYT1欠損マウス系を観察する（Gossen,M.およびH.Bujard、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89（12）：5547-5551頁（1992))。加えて、その歩行運動活性（アクティビティーボックス）および運動協調性（ロータロッド試験）を分析する。さらに、自然嫌悪刺激（高架式十字迷路試験および明/暗選択試験）に動物を曝露することにより、不安状態を評価する。
体位、歩調および知覚性応答などの自然の探索行動の徴候に関して、GLYT1欠損マウス系を観察する（Gossen,M.およびH.Bujard、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89（12）：5547-5551頁（1992))。加えて、その歩行運動活性（アクティビティーボックス）および運動協調性（ロータロッド試験）を分析する。さらに、自然嫌悪刺激（高架式十字迷路試験および明/暗選択試験）に動物を曝露することにより、不安状態を評価する。
2）認知機能に関連する行動
空間的な短期記憶および長期記憶
Durkinにより記載された通り、遅延マッチング空間作業記憶課題（delayed matching spatial working memory task）を実施する（Irwin,S.、Psychopharmacologia 13（3）：222-257頁（1968))。作業記憶を、5アーム迷路（5-arm maze）の適合遅延基準の習得に基づいて評価する。基本的な学習課題は2段階からなる。各試行は、提示段階により開始される。この段階において、動物は、準無作為選択されたあるアームへの報酬付き強制訪問（forced and remarded visit）に曝される一方、残りの4つのアームが閉鎖される。報酬を与えたら、動物を待機ケージに入れる。様々な長さの保持期間（作業記憶に関しては2秒間、20秒間、および40秒間の遅延；短期記憶および長期記憶に関しては5分間、1時間、4時間、24時間の遅延）に続いて、回復試験段階を実施するが、この段階において、動物は、5つの開口アームの間で選択する状況に曝される。以前に訪問したアームを正確に選択すると報酬が与えられる。作業記憶保持能力は、試行間期間を10秒間に固定した連続試行の際の正確な選択精度の平均割合（％）を保持期間に乗じた関数として表される。自動ビデオ追跡システムにより記憶課題をモニタリングする。
空間的な短期記憶および長期記憶
Durkinにより記載された通り、遅延マッチング空間作業記憶課題（delayed matching spatial working memory task）を実施する（Irwin,S.、Psychopharmacologia 13（3）：222-257頁（1968))。作業記憶を、5アーム迷路（5-arm maze）の適合遅延基準の習得に基づいて評価する。基本的な学習課題は2段階からなる。各試行は、提示段階により開始される。この段階において、動物は、準無作為選択されたあるアームへの報酬付き強制訪問（forced and remarded visit）に曝される一方、残りの4つのアームが閉鎖される。報酬を与えたら、動物を待機ケージに入れる。様々な長さの保持期間（作業記憶に関しては2秒間、20秒間、および40秒間の遅延；短期記憶および長期記憶に関しては5分間、1時間、4時間、24時間の遅延）に続いて、回復試験段階を実施するが、この段階において、動物は、5つの開口アームの間で選択する状況に曝される。以前に訪問したアームを正確に選択すると報酬が与えられる。作業記憶保持能力は、試行間期間を10秒間に固定した連続試行の際の正確な選択精度の平均割合（％）を保持期間に乗じた関数として表される。自動ビデオ追跡システムにより記憶課題をモニタリングする。
代替的に、空間学習および記憶を、Morrisにより記載された水迷路パラダイムにより評価する（Durkin,T.P.ら、Behav.Brain.Res.116（1）：39-53頁（2000）；およびMorris,R.G.ら、Nature 297（5868）：681-683頁（1982))。マウスを円形プール（直径120cm、高さ30cm）に置き、ここで、隠された踏み台を探し当てることにより乳白色の水（深さ20cm、20±1℃）から脱出することを学習させる。この目標踏み台（直径7cm、水面下1cm）をプールの特定の4分円の中央に置き、動物の航行を容易にするために外部視覚的手掛かりをプールの周りに配置する。4日間の試験期間中、固定された出発位置4つのうち無作為に選択した1つのプール壁面に面して、水中にマウスを置く（セッションあたり3回の試行、1日あたり3セッション）。自動ビデオ運動システムを用いて、マウスが目標を見つけ出す（潜伏から脱出する）のに必要な時間ならびに水泳経路および水泳速度を測定する。動物が60秒以内に目標を見つけられなかった場合、手で動物を踏み台の上に置き、試行間期間（10秒間〜20秒間）の間そこに留まらせる。各セッションの間隔は1.5時間〜2時間である。4日目の最終試行の後、踏み台を除去し、マウスを60秒間自由に泳がせる。各4分円中でマウスが過ごした期間およびその水泳経路を記録する。
物体認知記憶課題
視空間認知記憶課題とは、EnanceurおよびDelacour（Morris,R.G.ら、Nature 319（6056）：774-776頁（1986))により最初に開発された物体認知記憶試験の変法である。記憶回復の評価は、遅延非見本合わせ規則に基づく。迷路外の特定の手掛かりにより空間的に定義される、西アーム、東アーム、および南アームを有するT型配向性迷路からなる試験装置に、マウスを馴化させる。視空間認知記憶セッションには、2つの連続した5分間の試行が含まれる。第1の習得試行では、3つの異なる新規の物体（O1、O2およびO3）をT型指向性迷路内の別々の位置（例えばO1/西、O2/東、およびO3/南）に配置し、これらにマウスを曝す。5分間における各物体についての探索の回数および持続期間を測定する。種々の試行間保持期間（1時間、4時間および24時間）の後、認知試行を実施する。視覚回復関連記憶を評価するために、同一の空間配置内（例えば、T型迷路配向におけるO1/西）に2つの新規の物体O4およびO5ならびに馴化物体3つのうち1つ（馴化目標）を示す。加えて、空間回復関連記憶を評価するために、物体を新しい空間配置で示す（例えば、逆T型迷路配向におけるO1/東）。物体および空間の認知記憶能力を、第1および第2の試行間での馴化目標の探索の回数および持続期間の差に、試行間保持期間を乗じた関数として表す。
視空間認知記憶課題とは、EnanceurおよびDelacour（Morris,R.G.ら、Nature 319（6056）：774-776頁（1986))により最初に開発された物体認知記憶試験の変法である。記憶回復の評価は、遅延非見本合わせ規則に基づく。迷路外の特定の手掛かりにより空間的に定義される、西アーム、東アーム、および南アームを有するT型配向性迷路からなる試験装置に、マウスを馴化させる。視空間認知記憶セッションには、2つの連続した5分間の試行が含まれる。第1の習得試行では、3つの異なる新規の物体（O1、O2およびO3）をT型指向性迷路内の別々の位置（例えばO1/西、O2/東、およびO3/南）に配置し、これらにマウスを曝す。5分間における各物体についての探索の回数および持続期間を測定する。種々の試行間保持期間（1時間、4時間および24時間）の後、認知試行を実施する。視覚回復関連記憶を評価するために、同一の空間配置内（例えば、T型迷路配向におけるO1/西）に2つの新規の物体O4およびO5ならびに馴化物体3つのうち1つ（馴化目標）を示す。加えて、空間回復関連記憶を評価するために、物体を新しい空間配置で示す（例えば、逆T型迷路配向におけるO1/東）。物体および空間の認知記憶能力を、第1および第2の試行間での馴化目標の探索の回数および持続期間の差に、試行間保持期間を乗じた関数として表す。
連合情動記憶
NMDA受容体依存的な連合情動記憶を、2つの行動課題で評価する。
NMDA受容体依存的な連合情動記憶を、2つの行動課題で評価する。
恐怖により増強される驚愕応答：
フットショック（嫌悪US）と対になった光（CS）に対して応答するように、マウスを条件付けする。24時間遅れて、条件付け光刺激を伴うまたは伴わない、様々な音響刺激（90dB〜110dB）によって引き出される驚愕反射の大きさにより情動記憶を評価する。条件付け光刺激の提示により、音響驚愕反射の増強が起こる（Ennaceur,A.およびJ.Delacour、Behav.Brain Res.31（1）：47-59頁（1988))。
フットショック（嫌悪US）と対になった光（CS）に対して応答するように、マウスを条件付けする。24時間遅れて、条件付け光刺激を伴うまたは伴わない、様々な音響刺激（90dB〜110dB）によって引き出される驚愕反射の大きさにより情動記憶を評価する。条件付け光刺激の提示により、音響驚愕反射の増強が起こる（Ennaceur,A.およびJ.Delacour、Behav.Brain Res.31（1）：47-59頁（1988))。
状況恐怖条件付け：
状況恐怖条件付けは、潜在嫌悪連合学習プロセスであり、これにより、条件付けされていない嫌悪刺激（US）の反復的関連づけ後に、当初は中立だった状況が嫌悪特性を獲得する。動物を新しいチャンバーに曝し、数分後に、条件付けされていない恐怖応答（すくみ行動）を引き出す連続的電気フットショック（US）で処置する（Davis,M.、Psychopharmacology（Berl）、62（1）：1-7頁（1979))。状況恐怖条件付けを、その状況への再曝露に応答したすくみの合計により測定する。短期（1時間〜3時間）および長期（1日間〜10日間）の状況記憶を評価するために訓練した後の様々な時点において、条件付けすくみ応答を試験する。
状況恐怖条件付けは、潜在嫌悪連合学習プロセスであり、これにより、条件付けされていない嫌悪刺激（US）の反復的関連づけ後に、当初は中立だった状況が嫌悪特性を獲得する。動物を新しいチャンバーに曝し、数分後に、条件付けされていない恐怖応答（すくみ行動）を引き出す連続的電気フットショック（US）で処置する（Davis,M.、Psychopharmacology（Berl）、62（1）：1-7頁（1979))。状況恐怖条件付けを、その状況への再曝露に応答したすくみの合計により測定する。短期（1時間〜3時間）および長期（1日間〜10日間）の状況記憶を評価するために訓練した後の様々な時点において、条件付けすくみ応答を試験する。
条件付けされた恐怖の消滅
学習性（learned）恐怖応答の消滅は行動可塑性の形態の1つを表し、これは、元来の学習性関連性消去よりもむしろ、新しい形態の記憶の形成に依拠すると考えられる（Phillips,R.G.およびJ.E.LeDoux、Behav.Neurosci.106（2）：274-285頁（1992))。条件付けされた恐怖の消滅はNMDA受容体依存性プロセスを伴うことが、最近示されている（Tang,Y.P.ら、Nature 401（6748）：63-69頁（1999))。訓練から24時間遅れて、条件付けされたすくみの消滅を、連続した5日間における、状況への反復的曝露に応答したすくみ量の時間依存的減少により評価することができる。
学習性（learned）恐怖応答の消滅は行動可塑性の形態の1つを表し、これは、元来の学習性関連性消去よりもむしろ、新しい形態の記憶の形成に依拠すると考えられる（Phillips,R.G.およびJ.E.LeDoux、Behav.Neurosci.106（2）：274-285頁（1992))。条件付けされた恐怖の消滅はNMDA受容体依存性プロセスを伴うことが、最近示されている（Tang,Y.P.ら、Nature 401（6748）：63-69頁（1999))。訓練から24時間遅れて、条件付けされたすくみの消滅を、連続した5日間における、状況への反復的曝露に応答したすくみ量の時間依存的減少により評価することができる。
3）薬理学的に破壊された行動
過剰運動、プレパルス阻害（PPI）の欠失、および記憶欠失などの明確な範囲内の統合失調症型症状を、アポモルフィン、D-アンフェタミン、または非競合性NMDA受容体アンタゴニストPCPの投与により引き起こすことができる。野生型マウスの行動を破壊する最低限の有効量を用いる。次いで、GLYT1変異マウスが、行動の薬理学的破壊に対して耐性を有するか、低いまたは高い感受性を有するかどうかを試験する。
過剰運動、プレパルス阻害（PPI）の欠失、および記憶欠失などの明確な範囲内の統合失調症型症状を、アポモルフィン、D-アンフェタミン、または非競合性NMDA受容体アンタゴニストPCPの投与により引き起こすことができる。野生型マウスの行動を破壊する最低限の有効量を用いる。次いで、GLYT1変異マウスが、行動の薬理学的破壊に対して耐性を有するか、低いまたは高い感受性を有するかどうかを試験する。
薬物誘発性過剰運動
オープンフィールド（アクティビティボックス）において、D-アンフェタミンが運動活性および常同行動に及ぼす影響を、水平方向運動活性、垂直方向活性、常同動作、およびオープンフィールドの中央で過ごす時間を記録することにより評価する。
オープンフィールド（アクティビティボックス）において、D-アンフェタミンが運動活性および常同行動に及ぼす影響を、水平方向運動活性、垂直方向活性、常同動作、およびオープンフィールドの中央で過ごす時間を記録することにより評価する。
薬物誘発性引きこもり
D-アンフェタミンまたはPCPに応答した社会行動におけるGLYT1変異体の関与を評価するために、社会的探索試験を用いる（Falls,W.A.、M.J.Miserendino、およびM.Davis、J.Neurosci.12（3）：854-863頁（1992))。別個に収容した雄マウスを幼若雌マウスに5分間曝す。薬物投与の前後で、肛門-生殖器および首の匂い嗅ぎ動作、ヘテログルーミング、ならびに追跡などの社会的干渉をビデオ追跡システムにより記録する。薬物誘発性社会的探索の低下を、薬物投与後の様々な時点（30分、2時間、4時間、および24時間）で試験する。
D-アンフェタミンまたはPCPに応答した社会行動におけるGLYT1変異体の関与を評価するために、社会的探索試験を用いる（Falls,W.A.、M.J.Miserendino、およびM.Davis、J.Neurosci.12（3）：854-863頁（1992))。別個に収容した雄マウスを幼若雌マウスに5分間曝す。薬物投与の前後で、肛門-生殖器および首の匂い嗅ぎ動作、ヘテログルーミング、ならびに追跡などの社会的干渉をビデオ追跡システムにより記録する。薬物誘発性社会的探索の低下を、薬物投与後の様々な時点（30分、2時間、4時間、および24時間）で試験する。
プレパルス阻害の薬物誘発性欠失
アポモルフィンまたはPCPによるプレパルス阻害（PPI）の破壊は、感覚運動ゲート制御（gating）欠失のモデルとして頻繁に用いられ（Crestani,F.、F.Seguy、およびR.Dantzer、Brain Res.542（2）：330-335頁（1991）；Kretschmer,B.D.ら、Eur.J.Pharmacol.331（2-3）：109-116頁（1997）；並びにBakshi,V.P.およびM.A.Geyer、J.Neurosci.18（20）：8394-8401頁（1998))、これにより注意および感覚運動のゲート制御を評価することができる。PPIとは、非驚愕誘発型プレパルス刺激の提示に続く、音響または触覚の驚愕応答の減衰である。音響刺激後の動物の驚愕応答を評価する。
アポモルフィンまたはPCPによるプレパルス阻害（PPI）の破壊は、感覚運動ゲート制御（gating）欠失のモデルとして頻繁に用いられ（Crestani,F.、F.Seguy、およびR.Dantzer、Brain Res.542（2）：330-335頁（1991）；Kretschmer,B.D.ら、Eur.J.Pharmacol.331（2-3）：109-116頁（1997）；並びにBakshi,V.P.およびM.A.Geyer、J.Neurosci.18（20）：8394-8401頁（1998))、これにより注意および感覚運動のゲート制御を評価することができる。PPIとは、非驚愕誘発型プレパルス刺激の提示に続く、音響または触覚の驚愕応答の減衰である。音響刺激後の動物の驚愕応答を評価する。
薬物誘発性記憶喪失
PCP誘発性またはアポモルフィン誘発性の記憶機能損傷を、前記した遅延マッチング空間記憶課題で評価する。
PCP誘発性またはアポモルフィン誘発性の記憶機能損傷を、前記した遅延マッチング空間記憶課題で評価する。
Claims (37)
- glyt1遺伝子のゲノム配列が、陽性選択マーカーおよび任意で陰性選択マーカーを含み、かつ、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部が、リコンビナーゼ認識部位により構成されている、glyt1遺伝子のゲノム配列の全体または一部を含むベクター構築物。
- ゲノム配列がglyt1遺伝子の全エキソンを含む、請求項1記載のベクター構築物。
- ゲノム配列が陽性選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項1または2記載のベクター構築物。
- ゲノム配列が任意で陰性選択マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子を含む、請求項1または2記載のベクター構築物。
- ゲノム配列が、陽性選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含み、かつ陰性選択マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子を含む、請求項1または2記載のベクター構築物。
- 陽性選択マーカーがリコンビナーゼ認識部位により構成されている、請求項1から5のいずれか一項記載のベクター構築物。
- glyt1遺伝子のエキソン5〜11がリコンビナーゼ認識部位により構成されている、請求項1から6のいずれか一項記載のベクター構築物。
- glyt1遺伝子のゲノム配列がマウス配列である、請求項1から7のいずれか一項記載のベクター構築物。
- 配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のベクター構築物。
- glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）請求項1から9のいずれか一項記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（c）glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。 - （d）段階（c）で作製したトランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のゲノム配列内の選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物とさらに交雑させる段階
をさらに含む、請求項10記載の方法。 - ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、請求項10または11記載の方法の任意の段階を含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
（e）トランスジェニック動物を、glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物と交雑させる段階；並びにそれにより
（f）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。 - glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物において、該リコンビナーゼが組織特異的プロモーター系の調節下で発現される、請求項12記載の方法。
- glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼに関してトランスジェニックである動物において、該リコンビナーゼが調節プロモーター系の調節下で発現される、請求項12記載の方法。
- ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）請求項1から9のいずれか一項記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（d）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。 - ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）請求項1から9のいずれか一項記載のベクター構築物を胚幹細胞に導入する段階；
（b）glyt1遺伝子のエキソンの少なくとも一部を構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（c）glyt1遺伝子のゲノム配列内で選択マーカーを構成する認識部位を認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物を胚幹細胞にさらに導入する段階；
（d）胚幹細胞からヘテロ接合性トランスジェニック動物および/またはホモ接合性トランスジェニック動物を作製する段階；並びにそれにより
（e）ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物を作製する段階。 - 請求項10または11記載の方法により作製された、トランスジェニック非ヒト動物。
- glyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が条件的標的変異を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
- 条件的標的変異がGLYT1活性に必須のアミノ酸をコードするglyt1ゲノム配列の一部を構成するリコンビナーゼ認識部位を含む、請求項18記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 動物がげっ歯類である、請求項17から19のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- げっ歯類がマウスである、請求項20記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項12から16のいずれか一項記載の方法により作製された、トランスジェニック非ヒト動物。
- ほとんどまたは全く活性のないGLYT1タンパク質が発現されるようにglyt1遺伝子の対立遺伝子の一方または両方が変異および/または切断された、トランスジェニック非ヒト動物。
- ゲノムが、上記対立遺伝子の一方または両方において、エキソン5〜11が欠失したglyt1遺伝子を含む、請求項23記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ゲノムが、上記対立遺伝子の一方または両方において、天然glyt1遺伝子の代わりに配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、請求項24記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 動物がげっ歯類である、請求項22から25のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- げっ歯類がマウスである、請求項26記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 同一のまたは別の遺伝子型の動物との交配により得られる、請求項17から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫。
- 請求項22から28のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する、細胞系または初代細胞培養物。
- 請求項22から28のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物またはその子孫に由来する、組織または脳切片器官型培養物。
- 精神病的行動を誘発する化合物に対する感受性を研究するためのモデルとしての、請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用。
- シナプスNMDA受容体機能を増強する効果を研究するためのモデルとしての、請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用。
- GLYT1機能を評価するための手段としての、請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用。
- 以下の段階を含む、NMDA受容体活性化に及ぼすGLYT1機能のインビボ効果を評価するための方法：
請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物における、NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および学習と記憶を含む行動を決定する段階；並びに
NMDA受容体活性、シナプス可塑性、および行動を、天然glyt1遺伝子を含む動物と比較する段階。 - 以下の段階を含む、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験する方法：
GLYT1阻害化合物を、請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物に投与する段階；並びに
行動、電気生理学および組織学の評価と、行動、電気生理学および組織学の対照との比較を含む、化合物の効果を決定する段階。 - 請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物を含む、GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するためのキット、並びに、GLYT1阻害剤がGLYT1特異的効果以外の効果を呈するかどうかを判定するための手段。
- GLYT1特異的効果以外の効果に関してGLYT1阻害化合物を試験するための、請求項22から27のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物、または請求項29記載の細胞系もしくは初代細胞培養物、または請求項30記載の組織もしくは脳切片器官型培養物の使用。
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