ES2267115T3 - Uso de filtros estructurados profundos para la eliminacion de virus. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA REDUCIR EL TITULO VIRAL EN UNA SOLUCION DE PROTEINAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS SIN AFECTAR NEGATIVAMENTE A LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA. EL METODO CONSISTE EN PASAR LA SOLUCION A UN PH COMPRENDIDO ENTRE 5,0 Y 7,0 APROXIMADAMENTE A TRAVES DE UN FILTRO EN PROFUNDIDAD ESTRUCTURADO QUE TIENE UN ELEMENTO POROSO CARGADO POSITIVAMENTE, SIENDO EL DIAMETRO MEDIO DEL PORO DEL ELEMENTO DEL FILTRO MAYOR QUE EL DIAMETRO MEDIO DE LOS VIRUS Y REALIZANDOSE LA FILTRACION EN CONDICIONES QUE PRODUCEN UNA REDUCCION CONSIDERABLE DEL TITULO VIRAL EN LA SOLUCION FILTRADA, A LA VEZ QUE SE MANTIENE LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS PROTEINAS.

Description

Uso de filtros estructurados profundos para la eliminación de virus.

Antecedentes de la invención Campo

La presente invención se refiere generalmente a la eliminación de virus a partir de soluciones, relacionándose específicamente con la utilización de filtros estructurados profundos para reducir el título vírico de soluciones que contienen proteínas biológicamente activas.

Antecedentes

Para la filtración a partir de líquidos, de contaminantes con un tamaño fino de partícula, se utilizan diversos medios de filtros porosos. Para actuar como un filtro, los medios deben permitir que el líquido, agua habitualmente, pase a su través, mientras que retienen los contaminantes particulados. Esta retención de los contaminantes particulados se lleva a cabo operando, dentro del medio poroso, con uno de o con los dos mecanismos distintos de filtración, principalmente el de presión mecánica (1), y el de captura electrocinética de partículas (2). En la presión mecánica, una partícula se elimina de la corriente del líquido mediante retención física cuando intenta atravesar un poro más pequeño que ella misma. En el caso del mecanismo electrocinético de captura, la partícula choca con una superficie en el interior del material poroso y es retenida en esta superficie por las fuerzas de atracción de tipo van der Waal de corto
alcance.

Los medios de los filtros se describen a menudo según su forma física. Algunos medios de filtros son esencialmente membranas diferenciadas que funcionan reteniendo los contaminantes en su superficie (filtros superficiales). Así, estos medios de filtros operan primariamente mediante presión mecánica, y es necesario que el tamaño del poro del medio del filtro sea más pequeño que el de la partícula de los contaminantes que van a ser eliminados del líquido. Dicho medio de filtro muestra normalmente velocidades escasas del flujo y una tendencia a obstruirse rápidamente.

Otros medios de filtros adquieren la forma de una masa o lecho de material fibroso fino o particulado que se deposita sobre un soporte o sustrato poroso. La solución que va a filtrarse debe entonces iniciarse a través de una vía tortuosa de poros formados en los intersticios del material fino, dejando que los contaminantes coloidales sean retenidos por el material del filtro. A causa de la profundidad del material del filtro, los filtros se denominan filtros profundos (contrarios a los filtros superficiales). Los filtros profundos retienen típicamente contaminantes mediante ambos mecanismos, el de presión y el de captura electrocinética de partículas. En el modo de captura electrocinética de partículas, no es necesario que el medio del filtro tenga dichos tamaños pequeños de poro. La capacidad de alcanzar la eliminación requerida de los contaminantes particulados suspendidos, con un medio de filtro de un tamaño de poro significativamente más grande, es atractiva, ya que permite velocidades de flujo más altas. Además, los filtros tienen una capacidad mayor de retención de partículas, mostrando así una tendencia reducida a la obstrucción. Véase Curling (1980) y Meltzer (1987) para una consideración general de la filtración, aplicada especialmente a la industria farmacéutica.

Medios de inactivación vírica. Muchas proteínas biológicamente activas se utilizan para tratar situaciones patológicas en el hombre. Sin embargo, debido a las fuentes de la proteína (por ejemplo, el plasma humano o los sistemas de expresión celular), existe la posibilidad de contaminación vírica en los productos. Es por tanto típico en la preparación de los productos que contienen la proteína incorporar etapas de reducción o inactivación vírica para obtener productos más seguros que disminuyan el riesgo de infección vírica. La reducción en los títulos víricos puede conseguirse inactivando o eliminando los virus.

Los procedimientos para la inactivación de virus mediante tratamiento con sustancias químicas y/o calor son habituales en la técnica. La patente U.S. nº 4.540.573 de Neurath et al, por ejemplo, describe el tratamiento de composiciones que contienen proteínas con trialquilfosfato y detergente par inactivar los virus. La patente U.S. nº 5.151.499 de Kameyama et al, añade una etapa de calor seco al proceso trialquilfosfato/detergente, para alcanzar una reducción mayor en el título vírico.

Los títulos víricos pueden reducirse mediante el procedimiento utilizado para purificar la proteína. Se ha encontrado que el procedimiento de Cohn-Oncley utilizado para purificar las fracciones IgG del plasma sanguíneo, da lugar a proteínas con títulos víricos reducidos. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 4.762.714 de Mitra et al. Véase también Friedman et al (1995) para una breve consideración general de la reducción de la infectividad de los componentes sanguíneos.

Varios fabricantes han desarrollado productos que eliminan virus de la solución, mediante la acción tamizante de hacer que la solución atraviese filtros de membrana con tamaños de poro más pequeños que las partículas víricas. Estos procedimientos se describen en Yuasa et al (1991), Nader (1994) y DiLeo et al (1992). Los virus (y sus diámetros promedio) que se informaron en estas referencias fueron: virus de la hepatitis C (30-38 nm), bacteriófago fr (aprox. 23 nm), X174 (aprox. 28 nm), y bacteriófago (aprox. 78 nm).

Los filtros profundos se utilizan típicamente como prefiltros para prolongar la vida útil del filtro final, típicamente un filtro (o membrana superficial). Sin embargo, los filtros profundos se conocen también por ser útiles para retener los virus, incluso allí donde el tamaño nominal del poro es más grande que el diámetro promedio de los virus. McConell et al. (1984) muestra una depuración vírica de 4 unidades log en base 10, a partir de agua, utilizando una filtración en arena a baja velocidad, un procedimiento que utiliza un filtro profundo "no estructural". Véase Meltzer (1987),
p. 8.

Dicha alta depuración vírica no se ha informado con filtros profundos "estructurados". Los filtros profundos estructurados, disponibles preformados en tamaños y formas definidos, se preparan mediante diversas tecnologías. Su fabricación comprende el posicionamiento fijo de fibras individuales, o fragmentos y piezas de cerámica, metal, o polímeros en una forma. Esto puede implicar la matificación, el tapizado con fieltro, el entrelazado, el encolado, el calor o la sinterización del disolvente, etc. La unión orgánica de fibras o partículas que resulta, es el elemento del filtro. Los intersticios entre las partículas unidas de los componentes comprenden los poros del filtro. La acción de filtración ocasionada por estos poros implica el tamizado, así como la retención mediante adsor-
ción.

Un ejemplo de un medio profundo de medio estructurado se da en la Patente U.S. nº 4.859.340 de Hou et al, que describe una lámina del medio del filtro que comprende un fino particulado y una matriz de auto-unión de fibra de celulosa, la cual o ambas están revestidas con una resina catiónica. Las patentes relacionadas son las Patentes U.S. nºs 4.007.113 y 4.007.114.

Jones et al (1978) describe la utilización de filtros profundos cargados positivamente para retener y concentrar a los poliovirus a partir del agua. Payment et al (1988) describe la utilización de filtros profundos de fibra de vidrio para recuperar los virus a partir del agua. Tanto Jones et al como Payment et al, muestran una adsorción de los virus al filtro superior al 99%.

La carga superficial de los medios de los filtros profundos se ha demostrado que juega un papel en la adsorción y elusión de los virus. Véase Borrego et al (1991); Sobsey et al (1984); Jones et al (1978). Para una consideración general de los filtros profundos modificados por la carga, véase Mandaro (en Meltzer, 1987, capítulo 5). La finalidad de los ensayos de recuperación vírica fue generalmente recuperar y concentrar los virus a partir de grandes volúmenes de solución, para mejorar la sensibilidad de la detección de los virus en los ensayos más tardíos. Se aplicaron generalmente pues, los procedimientos para ensayar la presencia o la cantidad de contaminación vírica en el tratamiento del agua. Goyal et al (1980) han aplicado el procedimiento para recuperar el virus de los líquidos
alantoideos.

Breitenbach et al (1995) describe un nuevo material de filtro que inactiva a los virus e informa de las tasas de inactivación vírica que superan 5 unidades logarítmicas en base 10. Estos nuevos filtros comprenden dos capas distintas de material de filtro. Una capa libera un viricida químico, en este caso yodo, y la otra capa elimina al viricida, pues la solución atraviesa esta segunda capa del filtro. Aunque la inactivación vírica es sustancial, el carácter oxidativo del viricida puede afectar de modo adverso la actividad biológica del material que atraviesa este
filtro.

El documento GB-A-2045828 se relaciona con una lámina del medio del filtro que comprende un fino particulado y una matriz de auto-unión de la fibra celulósica, las superficies por lo menos de una de las cuales se modifican con sílice coloidal catiónico.

La captura de perlas de látex, bacterias, endotoxinas y virus mediante filtros modificados por la carga, se describe en Hou K et al, Applied and Environmental Microbiology, Vol 40, nº 5, 11/1980, pág 892-896.

Ambas citas silencian el procedimiento presente para reducir el título vírico.

Tal como se ha precisado anteriormente, los filtros profundos se utilizan habitualmente en la industria farmacéutica como prefiltros. En otras aplicaciones, se utilizan típicamente como prefiltros o como filtros finales para eliminar las partículas sólidas de las soluciones, un procedimiento denominado aclaración. Alguna eliminación vírica es inherente en las etapas de precipitación en el proceso de purificación proteica; las soluciones pueden entonces aclararse de los precipitados residuales mediante la utilización de filtros profundos. Sin embargo, no ha llegado hasta nosotros la noticia de la utilización de filtros profundos estructurados cargados positivamente que presenten tamaños de poro más grandes que los tamaños víricos parra producir reducciones sustanciales en el título vírico de soluciones aparte de una etapa de precipitación.

Sumario de la invención

Hemos ahora descubierto condiciones bajo las cuales la utilización de filtros profundos estructurados para la filtración de una solución de proteínas biológicamente activas da lugar a una disminución de magnitud sorprendente en el título vírico. La solución que va a filtrarse deberá tener un pH que oscile entre 5,0 y 7,0 aproximadamente, y la filtración deberá realizarse utilizando un filtro profundo cargado catiónicamente que posea un diámetro promedio de poro, mayor que el diámetro promedio de los virus que se eliminan. El título vírico en el filtrado se reduce en por lo menos alrededor de 3 unidades logarítmicas de base 10, o, más preferentemente, en por lo menos alrededor de 4 unidades logarítmicas en base 10. La actividad biológica de la proteína se conserva sustancialmente: la filtración da lugar a una retención de por lo menos el 80% aproximadamente y más preferentemente, de por lo menos alrededor del 90% de la actividad original (pre-filtración). El diámetro preferido promedio del poro del filtro puede oscilar entre 0,1 \mum aproximadamente y alrededor de 5 \mum, siendo un intervalo más preferido el de entre 0,25 \mu m y 2 \mum aproximadamente. Un filtro preferido se obtiene a partir de un soporte del filtro tal como la diatomita y una matriz de auto-unión de fibra celulósica, estando revestidas cada una de las cuales, o las dos, con una resina catiónica; un filtro más preferido es un filtro de la marca ZETA PLUS comercializado por Cuno
(Meriden, CT).

Formas de realización específicas

Este informe presenta datos que evalúan la eliminación de diversos virus tipo, que incluyen al virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), escogido para modelizar el virus de la hepatitis C; el virus de la seudorabia (PRV), escogido para modelizar los virus de la hepatitis B y del herpes; y el tipo 3 de reovirus (Reo), escogido para modelizar los virus sin envoltura y respecto a su resistencia a los procedimientos químicos y físicos de inactivación.

Los datos que se presentan muestran que los filtros profundos de los ejemplos pudieron reducir los títulos víricos tanto de los virus con envuelta como sin envuelta. Así, este estudio proporciona la seguridad adicional de que las soluciones tratadas proporcionan un alto margen de seguridad respecto al riesgo de transmisión vírica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, diámetro promedio de poro significa el tamaño de poro que corresponde al rechazo producido por la acción de filtrado por parte del filtro de por lo menos, aproximadamente, el 90% de las partículas de ese tamaño.

Tal como se utiliza en la presente memoria, diámetro promedio del virus significa el valor generalmente aceptado del diámetro del virus, del que como tal, se informa en la literatura científica importante.

Tal como se utiliza en la presente memoria, reducción sustancial en el título vírico significa alrededor de una reducción de por lo menos 3 unidades logarítmicas base 10 en el título vírico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, proteína biológicamente activa significa una proteína que demuestra una función o actividad que puede medirse o es útil para un resultado que se pretende (especialmente respecto a la misma proteína en un estado desnaturalizado o inútil). La función, actividad, o resultado que se pretende podría ser, por ejemplo, una actividad enzimática o una afinidad de unión.

Tal como se utiliza en la presente memoria, actividad biológica conservada significa la conservación de por lo menos el 80% aproximadamente o más preferentemente, del 90% aproximadamente, por lo menos, de la actividad biológica.

Materiales y Métodos

El efluente III se obtuvo del conjunto de los plasmas humanos fraccionados utilizando el procedimiento Cohn-Oncley con etanol enfriado, modificado según la Patente U.S. nº 4.396.608 de Tenold. El procedimiento de fraccionamiento de Cohn ha sido considerado generalmente para producir productos inmunoglobulínicos seguros respecto a la potencial transmisión vírica. Cada unidad individual de plasma utilizada se ensayó y no se encontró reactiva respecto al antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg) y negativa respecto a los anticuerpos para los tipos 1 y 2 (HIV-1, HIV-2) del Virus de la Inmunodeficiencia Humana, así como para el virus de la hepatitis C (HCV). La alanina transaminasa (ALT), un marcador para la función hepática y por deducción del daño causado por los virus de la hepatitis, no excedió el doble del valor normal. De este modo, el material de origen, plasma, se seleccionó y ensayó para confirmar la ausencia de virus clínicamente significativos a partir del efluente
III.

Los virus escogidos para este estudio y sus características, se resumen en la Tabla 1. El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), un virus ARN con envuelta, se seleccionó como el modelo pertinente para el virus de la hepatitis C. El virus de la seudorabia (PRV), un virus ADN con envuelta, fue escogido como el modelo para los virus herpes clínicamente apropiados: virus CMV, de Epstein-Barr, y tipos 1,2, 6 y 7 del Herpex simple. Además, el virus ARN sin envuelta, el tipo 3 de reovirus (Reo), se escogió como un virus modelo con resistencia a los reactivos físico-
químicos.

TABLA 1 Virus tipo utilizados

Característica	Virus BVDV	Virus seudorabia	Reovirus tipo 3
Cepa	NADL	PRV dl tk	Abney
	(ATCC VR-534)	(ATCC VR-2074)	(ATCC VR-232)
		o PRV Backer
		(DuPont/Merck)
		Wilmington, DE
Acido nucleico	ARN	ADN	ARN
Con envuelta	Si	Si	No
Tamaño	80-100 nm	120-220 nm	60-80 nm
Resistencia a agentes	Media	Media	Alta
físico-químicos
Sistemas de ensayo	Células BT	RAB-9	Células BSC-1
	(ATCC CRL 1390)	(ATCC CRL 1414)	(ATCC CCL 26)

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Para cada virus, se llevaron a cabo un mínimo de dos procesamientos independientes. Los virus se titularon en cada muestra en el tiempo 0, para determinar la carga vírica. Una solución de 150 mL y 500 mL del efluente III cargada con el virus tipo se hizo pasar a través de un filtro profundo ZETA PLUS ZPO4701-50 CP (Cuno, Inc., Meriden, CT). Se llevó a cabo una filtración adicional añadiendo Reo que utilizó 650 mL para maximizar el volumen respeto al área superficial para la filtración. El efluente III se cargó con una parte de virus y 19 partes del material de inicio para los experimentos con 150 mL y para el experimento Reo con los 650 mL adicionales (para aumentar la carga vírica Reo y proporcionar de este modo una prueba de la solidez de la filtración) y una parte de virus más 99 partes del material inicial para los experimentos con 500 mL, para conservar los
virus.

Ensayos de cuantificación vírica

Se utilizaron condiciones de cultivo celular para los ensayos de infecciosidad vírica con RPMI 1640 o con medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con aminoácidos no esenciales, tampón HEPES (N'-[2-hidroxietil]piperazina-N'[2-etano ácido sulfónico]), suero bovino fetal y antibióticos. El medio RPMI 1640 se utilizó sólo para las células MT'-4. Los títulos víricos se cuantificaron mediante ensayos de dosis infecciosas en cultivos de tejidos con una infectividad del 50% (TCID50). Los títulos TCID50 se calcularon mediante el procedimiento de Spearman-Karber, véase Cavalli-Sforza (1974), pág 171-173.

Placas de microtitulación con 96 pocillos se utilizaron con las células confluentes apropiadas (BVDV en las células turbinadas bovinas (BT), PRV en las células Rab-9, Reo en las células BSC-1 o Vero). La cepa Becker de PRV se utilizó para estudios en los que se requirió un título más alto. El inóculo del procedimiento de la carga vírica fue de 0,1 mL por pocillo. En HBSS se realizaron diluciones del log en base 10 o de medio log en base 10 entre 10-0.5 o 10-1 hasta 10-6, llevando a cabo para uno de los procesamientos de fraccionamiento, 4 duplicaciones del pocillo por dilución. Para el segundo procesamiento, se utilizaron 8 duplicaciones de pocillo por dilución, para un total de 12 pocillos. Esto se realizó para confirmar la sensibilidad de los ensayos que utilizaron 4 duplicaciones por pocillo, por dilución. Estos experimentos se realizaron para las filtraciones con BVDV y PRV. Se llevaron a cabo 4 experimentos cargando con Reo. Se llevaron a cabo diluciones semilogarítmicas en HBSS entre 10^{-0,5} y 10^{-7,5} con 12 duplicaciones por pocillo por dilución.

Se permitió que el material de ensayo se pusiera en contacto con las células durante 1 hora a 37ºC para dejar que el virus se adsorbiera. El material se eliminó y se añadió MEM recién preparado a los pocillos. El MEM se utilizó para PRV y Reo. Para BVDV, el MEM se suplementó con suero equino mejor que con suero bovino. Las placas se incubaron entre 5 y 7 días a 36 \pm 2ºC. Después de la incubación, las monocapas celulares se observaron microscópicamente respecto a la presencia de infección vírica, indicada por los efectos citopáticos (CPE). Después de entre 5 a 7 días, los CPE inducidos por BVDV y PRV podían distinguirse fácilmente mediante examen microscópico. Sin embargo, si la determinación de CPE era difícil debido al sobrecrecimiento celular, las células infectadas por Reo se tiñeron para potenciar la visualización de los CPE. Las células se fijaron durante 10 minutos con etanol al 95% enfriado (EtOH), eliminándose entonces el EtOH y las células se tiñeron con colorante May-Grünwald-Giemsa o Cristal Violeta. Después de teñir y lavar con agua destilada, las células se examinaron microscópicamente. Las células no infectadas aparecían como monocapas azul oscuro, mientras que los focos de las células infectadas con virus aparecían como áreas teñidas de modo muy ligero.

Ensayos para citotoxicidad e interferencia vírica

Para aquellas muestras del producto de fraccionamiento que se esperaba contuvieran niveles bajos de virus, se aplicaron a cada una de las progenies celulares indicadoras muestras no diluídas sin virus, para evaluar el efecto de la matriz (etanol, tampones del procedimiento y proteínas,) sobre las células.

El efluente III se inoculó en células Vero y BT no diluidas y al 1:10 en HBSS. El filtrado III se inoculó en células Rab 9 y BSC-1 no diluidas al 1:3.2 en HBSS. HBSS se utilizó como el control. Un control adicional incluía HBSS que contenía etanol al 17% para evaluar los efectos de la concentración del etanol sobre las células. Después de una exposición de una hora al material, el efluente se eliminó y a las células se les suministró MEM recién preparado. Las células se examinaron después de 7 días respecto a citotoxicidad.

Los ensayos de interferencia vírica se llevaron a cabo diluyendo conjuntos almacenados de virus en HBSS como control y en el Efluente III diluidos 1:10 en HBSS.

Los dos virus que se utilizaron para estos experimentos fueron BVDV y Reo. Se llevaron a cabo diluciones Log_{10} y las células se inocularon con 0,1 mL, durante un tiempo de adsorción de 1 hora. El material se eliminó y se añadió medio. A los 7 días después de la infección, las células se examinaron microscópicamente respecto a los CPE
víricos.

Los ensayos de interferencia vírica parra el Filtrado III, se llevaron a cabo diluyendo conjuntos almacenados de virus en HBSS como control y en el Filtrado III diluidos 1:3,2 en HBSS. Se llevaron a cabo las diluciones semi-log_{10} y las células se inocularon e incubaron tal como se ha descrito anteriormente. Los virus utilizados fueron PRV y
Reo.

La efectividad de las etapas del proceso para clarificar los virus del modelo apropiado, se determinó comparando la carga vírica en la entrada respecto a la salida, para calcular el factor de reducción. La mayor parte de los intervalos de confianza del 95% para las titulaciones víricas que utilizaban diluciones log_{10} fueron aproximadamente 1 log_{10}. Cuando las diluciones semilogarítmicas se utilizaron, los intervalos de confianza del 95% para las titulaciones víricas fueron aproximadamente de 0,3-0,4 log_{10}.

La invención se demuestra además mediante los siguientes ejemplos demostrativos.

Ejemplo I Filtración del efluente III al filtrado III

Los resultados de los experimentos de la depuración vírica con los tres tipos de virus se indican en la Tabla 2. Para un experimento dado, el virus en Medio Esencial Mínimo (MEM) se añadió al volumen dado del Efluente III (tal como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, a 504 mL del Efluente III, se añadieron 5 g de Reovirus en MEM. El pH del Efluente III que contenía la proteína más el virus, se ajustó a 5,4 y se enfrió a -5ºC. Se añadió un Soporte del Filtro a una concentración final de 0,6%. Una muestra de 10 mL se eliminó para una titulación vírica inicial. La solución restante se filtró a través de un filtro CUNO ZETA PLUS® ZPO4701-50 CP con una presión de 10 psi. El filtrado resultante se recuperó y las muestras se titularon para detectar el virus. Después de que la filtración finalizara, el filtro se quitó y se dispuso en 50 mL de solución salina equilibrada, agitándose durante 15 minutos. (Los filtros de experimentos de volumen más pequeño se agitaron en volúmenes correspondientemente más pequeños de la solución salina equilibrada.) Una muestra de éste se tituló para la detección del virus retenido por el
filtro.

Los resultados en la Tabla 2 se expresan como el log_{10} TCID_{50} /mL en cada muestra. El factor de reducción log_{10} promedio se calculó multiplicando el log_{10} TCID_{50}/mL por el volumen del Efluente III, para determinar la carga total de la entrada vírica para cada uno de los virus [(vol) (log_{10} TCID_{50}/mL)y dividiendo entonces por el virus total que permanece en el Filtrado III [(vol) (log_{10} TCID_{50}/mL)]. El factor de reducción promedio log_{10} fue \leq 1 para BVDV, \geq 3,8 para PRV, y \geq 4,5 para Reo. Los resultados que se informan como \geq indican que se consiguió una depuración completa de la carga de entrada del virus. Podrían conseguirse una depuración más alta o factores de inactivación si fuera posible obtener títulos más altos de virus para la carga de entrada.

\newpage

TABLA 2

Filtración profunda del Efluente III al Filtrado III Virus en muestras de fraccionamiento (Log_{10} TCID_{50}/mL)

	BVDV	PRV	Reovirus
	A^{a}	B	C^{b}	A	B	C	A	B	C	D^{c}
HBSS	4,4	5,8	5,3	5,8	5,8	5,3	6,5	6,7	6,3	7,0
Efluente III	7,0^{d}	7,7	7,7	5,4	5,3	4,7	5,3	5,8	5,6	6,6
Filtrado	5,6	6,9	7,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3
retención^{e} de la	7,1	7,7	7,6	6,8	6,9	6,1	7,1	7,2	6,4	7,4
almohadilla del filtro
Reducción del log_{10}	1,4	0,8	0,4	\geq 4,1	\geq 4,0	\geq 3,4	\geq 4,0	\geq 4,5	\geq 4,3	\geq 5,3
reducción	0,9	\geq 3,8	\geq 4,5
promedio del log_{10}
^{a}A y B = Dos experimentos de replicación-volumen de filtración de 150 mL
^{b}C = volumen de filtración de 500 mL
^{c}D = Para el volumen de filtración de 650 mL de Reo
^{d} \begin{minipage}[t]{158mm} Virus total (Total log_{10} TCID_{50}) utilizado para BVDV, a causa de que se encontró al virus en todas las muestras del Filtrado III \end{minipage}
^{e} \begin{minipage}[t]{158mm} las almohadillas del filtro se suspendieron en 12-18 mL de HBSS, y entonces se eliminó una muestra para filtración \end{minipage}

Se cree que el BVDV no fue retenido por el filtro profundo debido a que este virus puede tener una tasa de densidad de carga mucho más baja que los otros virus utilizados. La presencia de proteínas distintas a IgG que se eliminaron del Efluente III mediante el filtro profundo, pueden haber competido con este virus, de forma que el virus no fue retenido. En otros experimentos en los que las proteínas contaminantes no se encontraban y sólo estaba presente IgG en la solución proteica, el BVDV fue retenido por el filtro profundo.

Ejemplo 2

Los experimentos de depuración vírica se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1 en tres virus más: virus de la hepatitis A, parvovirus bovino y parvovirus porcino. Los resultados se presentan en la tabla 3. Las tasas de depuración fueron \geq a 4,0 unidades log_{10} para el virus de la hepatitis A, \geq 2,7 unidades log_{10} para el parvovirus bovino, y \geq 4,7 unidades log_{10} para el parvovirus porcino. Se cree que con un refinamiento más acentuado de las condiciones, que la depuración del virus para el parvovirus bovino serían también \geq a 3,0 unidades logarítmicas en base 10.

TABLA 3

Filtración profunda del Efluente III al Filtrado III Virus en muestras de fraccionamiento (Log_{10} TCID_{50}/mL)

	virus de la hepatitis A	parvovirus bovino	parvovirus porcino
	A^{a}	B^{b}	C^{a}	D^{a}	A^{a}	B^{a}	C^{b}	A^{c}	B^{a}
HBSS	6,1	4,8	6,7	5,6	5,0	5,0	5,2	6,2	6,5
Efluente III	5,6	4,0	6,2	5,5	4,0	3,8	4,3	5,8	6,1
Filtrado III	\leq 1,3	\leq 1,3	1,6	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3	\leq 1,3
retención de la	6,1	5,2	6,8	6,2	4,2	4,5	5,1	7,1	6,3
almohadilla del filtro

TABLA 3 (continuación)

	virus de la hepatitis A	parvovirus bovino	parvovirus porcino
	A^{a}	B^{b}	C^{a}	D^{a}	A^{a}	B^{a}	C^{b}	A^{c}	B^{a}
reducción del log_{10}	\geq 4,3	\geq 2,7	4,6	\geq 4,2	\geq 2,7	\geq 2,5	\geq 3,0	\geq 4,5	\geq 4,8
reducción promedio	\geq 4,0	\geq 2,7	\geq 4,7
del log_{10}
^{a}volumen de filtración de 150 mL
^{b}volumen de filtración de 500 mL
^{c}volumen de filtración de 600 mL

Basándose en nuestra experiencia en el control de la actividad de las inmunoglobulinas producidas comercialmente, no se esperaría que las condiciones descritas anteriormente que afectaran de forma adversa a la actividad biológica de las proteínas y existiría una reducción sustancial de la actividad biológica original de la proteína.

Los ejemplos anteriores tienen la intención de ilustrar la invención y se cree que tendrán lugar variaciones para los expertos en la técnica. De acuerdo con esto, se pretende que el alcance de la invención estará limitado sólo por las reivindicaciones que se expresan a continuación.

Referencias

Patente EE.UU. Nº 4,007,113 to Ostreicher, E. A., publicada 8 feb, 1977.

Patente EE.UU. Nº 4,007,114 to Ostreicher, E. A., publicada 8 feb , 1977.

Patente EE.UU. Nº 4,396,608 to Tenold, R. A., publicada 2 ago, 1983.

Patente EE.UU. Nº 4,540,573 to Neurath, A. R., et al., publicada 10 sep, 1985.

Patente EE.UU. Nº 4,762,714 to Mitra, G., et al., publicada 9 ago, 1988.

Patente EE.UU. Nº 4,859,340 to Hou, K. C., et al., publicada 22 ago, 1989.

Patente EE.UU. Nº 5,151,499 to Kameyama, S., et al., publicada 29 sep, 1992.

Borrego, J. J., et al., "Development and Application of new Positively Charged Filters for the Recovery of Bacteriophages from Water", Appl. Environ. Microbiol. 57:1218-22 (1991).

Breitenbach, J., et al., German Pat. Application No. DE 43 43 226 A1, published June 22, 1995.

Cavalli-Sforza, L., Biometrie Grunzuge Biologisch-medizinischer Statistik [Biometry, the Basics of Biological and Medical Statistics], Gustav Fischer Verlag (Stuttgart, 1974).

Curling, J. M., ed., Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press (London, 1980).

DiLeo, A. J., et al., "High Resolution Removal of Virus from Protein Solutions Using a Membrane of Unique Structure", Biol Technol., 10: 182-188 (1992).

Friedman, L. J., et al., "Reducing the Infectivity of Blood Components - What We Have Learned", Immunolog. Invest. 24: 49-71 (1995).

Goyal, S. M., et al., "Simple Method for the Concentration of Influenza from Allantoic Fluid on Microporous Filters", Appl. Environ. Microbiol 39: 500-504 (1980).

Jones, B. L., et al., "Concentration of Poliovirus from Tap Water Using Positively Charged Microporous Filters", Presented at Ann. Conf. Amer. Water Works Ass'n, Atlantic City, NJ, June 26-30, 1978.

McConnell, L. K., et al., "Reovirus Removal and Inactivation by Slow Rate Sand Filtration", Appl. Environ. Microbiol., 48: 818-825 (1984).

Meltzer, T.H., Filtration in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker (New York, 1987).

Nader, W., "Validation of a UF System for the Removal of Viruses and Scrapie Agent", Genet. Engin. News, Nov, 1, 1994, p. 16.

Payment, P., et al., "Wound Fiberglass Depth Filters as a Less Expensive Approach for the Concentration of Viruses from Water", Can. J. Microbiol., 34: 271-272 (1988).

Sobsey, M. D., et al., "Influence of Water Quality on Enteric Virus Concentration by Microporous Filter Methods", Appl. Environ. Microbiol., 47: 956-960 (1984).

Yuasa, T., et al., "The Particle Size of Hepatitis C Virus Estimated by Filtration Through Microporous Regenerated Cellulose Fiber", J. Gen. Viral., 72: 2021-2024 (1991).

Claims (5)

1. Procedimiento para reducir el título de los virus en una solución acuosa de proteínas plasmáticas biológicamente activas, sin que afecte a la actividad de la proteína, comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer que la solución atraviese, a un pH que oscila entre aproximadamente 5,0 y 7,0 aproximadamente, un filtro profundo estructurado que comprende un elemento de filtración poroso cargado positivamente, siendo el diámetro promedio del poro del elemento del filtro, más grande que el diámetro promedio de los virus, realizándose la filtración bajo condiciones que dan lugar a una reducción en el título vírico de por lo menos, alrededor de 3 unidades logarítmicas en base 10 en la solución filtrada, mientras que retiene por lo menos alrededor del 80% de la actividad biológica de las proteínas, seleccionándose los virus del grupo formado por el virus de la hepatitis A, el virus de la seudorabia, el virus herpes simplex tipo 1, el virus herpes simplex tipo 2, el virus herpes simplex tipo 6, el virus herpes simples tipo 7, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, reovirus, y parvovirus porcino.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el diámetro promedio del poro del elemento de filtro está dentro del intervalo de aproximadamente 0,25 \mum a 2 \mum.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el elemento del filtro comprende un coadyuvante de filtro y una matriz de auto-unión de fibra celulósica, por lo menos uno de los cuales está revestido con una resina catiónica.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el coadyuvante de filtro es diatomita.

5. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que las proteínas son IgG.