JP6088020B2 - 細胞培養培地からの微生物の除去 - Google Patents

Description

本明細書に開示されている実施態様は、ウイルスを含む微生物を細胞培養培地から除去するための組成物および方法に関する。

タンパク質の製造のための従来のプロセスは、典型的には、細胞培養法、例えば、目的のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を製造するように遺伝子組み換えにより操作された哺乳動物または細菌の細胞株を、化学的に規定された細胞培養培地を用いてバイオリアクター中で培養することを含む。細菌、真菌、マイコプラズマおよびウイルスなどの微生物によるバイオリアクターの夾雑を減少させることは、特に、目的のタンパク質が治療に使用されることを意図している場合には、バイオ医薬品産業にとって重要な検討事項である。

微生物の中では、バクテリア、真菌類およびマイコプラズマは、典型的に細胞培養培地を適切なフィルターを通して濾過することにより除去できる。例えば、公称孔径が０．２μｍサイズ等級のミクロ濾過の膜がブレブンディモナス・ディミニュタ（Ｂｒｅｖｅｎｄｕｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）属のバクテリアを除去するのに適していると考えられている。０．１μｍの孔径サイズ等級の膜が、主として、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）属のマイコプラズマを除去するのに適していると考えられている。例えば、ＦｏｌｍｓｂｅｅおよびＭｏｕｓｓｏｒａｋｉｓ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１０巻、５号、２０１２、６０−６２頁（２０１２年５月）参照。さらに、公称孔径が２０ｎｍサイズ等級の膜が、パルボウイルスまたはパロウイルス様粒子において、これがウイルスにおいて最小を表している、最低４ｌｏｇ減少を実行するのに適していると考えられている。

ウイルス除去のための孔径サイズ等級を有する膜を作ることは、ウイルスを保持できるように孔径サイズ等級を小さくすることが、膜の孔の部分的なまたは完全な狭窄を起こし、それにより膜の透過性を望ましくないレベルにまで著しく減少させることとなり得るため、課題であると考えられている。ちなみに、上流の工程でウイルスの除去のために特に設計され、そのことにおいて有効な膜フィルターは現在のところ市販されてはいない。

細胞培養ステップの下流で典型的に使用されているウイルスバリアフィルターが、上流でのウイルスの除去に対して有効ではないことの理由の一つは、上流と下流の組成物の間の顕著な差異のためである。例えば、上流工程の場合は、細胞培養培地には細胞もまたは発現したタンパク質もない。しかしながら、栄養素、脂質、アミノ酸および他の成分（例えば、水力学的な細胞保護を提供するＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）は存在し、それらの全ては細胞の成長と生存に必要である。対照的に、下流工程の場合は、細胞培養培地は、細胞、細胞のデブリ、宿主細胞タンパク質だけでなく、発現したタンパク質を含む。対照的に、下流工程の場合は、細胞培養培地は、ウイルス濾過ステップに掛けられる前に、望ましくないウイルス濾過汚染物を除くために、しばしば多くの精製ステップに掛けられる。

特に、例えば、上流のウイルス除去の場合の化学的に規定された細胞培養培地に対して下流のウイルス除去の場合の発現された遺伝子組み換えタンパク質を含む細胞培養培地のような、精製が必要な組成物の性質の差のために、下流でウイルス除去に典型的に使用される膜フィルターは、上流で使用された場合、同じ目的に対してあまり良く働く傾向がない。Ｚｙｄｎｅｙら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７：１６−５０頁（２００７年）参照。

化学的に規定された細胞培養培地を濾過するために、特に上流で使用し得るウイルスバリアフィルターの開発の試みが行われた。例えば、種々のフィルターを用いて得られたウイルス保持の結果を議論している、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．、１６：４２５−４３４頁（２０００年）を参照。この論文に示されているように、再生セルロースフィルターが試験されたフィルターの中で最高の流束を示し、また高いウイルス保持を示した。しかしながら、そのような膜は、産業で今日典型的に使われている殺菌法であり、その場に置いての蒸気またはガンマ線での殺菌に不適である。この論文はまた、ＰＥＳフィルターも記載しているが、このフィルターは、流束が低いために、ウイルスバリアフィルターとしての上流での使用には一般的には適していないと考えられている。

さらに、米国特許出願公開第２０１３０３４４５３５号明細書は、ウイルス性夾雑物を除去するために、２４時間よりも長い濾過時間、ある多孔性を有するフィルターを使用して、化学的に規定された細胞培養培地を濾過することについて考察している。

米国出願公開第２０１３／０３４４５３５号明細書

ＦｏｌｍｓｂｅｅおよびＭｏｕｓｓｏｒａｋｉｓ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１０巻、５号、２０１２、６０−６２頁（２０１２年５月） Ｚｙｄｎｅｙら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７：１６−５０頁（２００７年） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．、１６：４２５−４３４頁（２０００年）

本明細書に開示されている実施形態は、目的のタンパク質を発現する細胞を培養するのに用いられる、化学的に規定された培地から、微生物、特にウイルスを除去するための新規の組成物を提供する。したがって、そのような組成物は、細胞、例えば、遺伝子組み換えによる目的のタンパク質を発現する哺乳動物細胞などを培養するために、細胞培養培地をバイオリアクター中に移動するステップの前に使用し得る。

本明細書に記載の組成物は、このような培地が膜を通して濾過されたときに、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上の成分による汚染の減少を示す膜を与える膜の表面修飾に基づく。

ある実施態様においては、本明細書に記載の組成物は、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで修飾された表面を有する多孔性膜に向けられる。

種々の実施形態において、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーは、多孔性膜の表面上に直接被覆される。エネルギー源の例としては、熱、電子ビーム、紫外光およびγ線が含まれるがこれらに限られるわけではない。

非アクリルアミド架橋性モノマーの例としては、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、グリセロールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、エトキシレート化トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、およびテトラエチレングリコールジメタクリレートが含まれるが、これらに限られるわけではない。特定の実施形態においては、非アクリルアミド架橋性モノマーは、ＰＥＧＤＡである。

ある実施形態においては、多孔性膜が、例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜などの非対称性膜である。

本明細書ではまた、例えば、化学的に規定された細胞培養培地を修飾された多孔性膜を通して濾過することにより、化学的に規定された細胞培養培地からウイルス性夾雑物を除去するために、記載された修飾された多孔性膜を用いる方法が提供される。

ある実施態様においては、下記の構造を含むポリマーで修飾された多孔性非対称性ＰＥＳ膜。

［式中、
Ｍ１は、中性のＤＡＣｍモノマー：Ｈ_２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３であり、
Ｍ２は、中性のＰＥＧＤＡモノマー：Ｈ_２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ_２であり、
Ｍ１’は、ラジカル化されたＤＡＣｍモノマー：_＊Ｈ_２Ｃ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３であり、
Ｍ２’は、ラジカル化されたＰＥＧＤＡモノマー：_＊Ｈ_２Ｃ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−ＣＨ_２＊であり、
Ｐは、ランダムポリマーネットワークを指し、
ｎ＝６、７、８、９、１０、１１であり；
記号「^＊」は、アルケニルラジカルを指す。］

ある実施態様においては、下記の構造を含むポリマーで修飾された多孔性非対称性ＰＥＳ膜。

［式中、
Ｍ１およびＭ２は、中性のＰＥＧＤＡモノマー：Ｈ_２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ_２を指し、
Ｍ１’およびＭ２’は、ラジカル化されたＰＥＧＤＡモノマー：_＊Ｈ_２Ｃ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−ＣＨ_２＊であり、
Ｐは、ランダムポリマーネットワークを指し、
ｎ＝６、７、８、９、１０、１１であり、
記号「^＊」は、アルケニルラジカルを指す。］

ある実施態様においては、化学的に規定された細胞培養培地から１種以上のウイルス性夾雑物を除去する方法が提供される。該方法は、ａ）化学的に規定された細胞培養培地を用意するステップ：およびｂ）培地をバイオリアクター中へ移動する前にまたは間に、多孔性膜を通して化学的に規定された細胞培養培地を濾過するステップを含み、該膜は、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで修飾された表面を有し、該バイオリアクターの内部の化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上のウイルス性夾雑物のレベルが、前記修飾された膜を通して培地を濾過する前のレベルよりも低い。

ある実施態様においては、本明細書に記載の修飾された膜は、デバイスの中に組み込まれている。デバイスの形態の例としては、ディスク、折りたたみカートリッジ、螺旋状に巻かれたカートリッジおよび多数の板状フラットシートが含まれるが、これらに限られるわけではない。

ある実施態様においては、化学的に規定された細胞培養培地は、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｐｏｗｅｒ ＣＨＯ、ＣＤ Ｏｐｔｉ ＣＨＯ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ ＣＨＯ １００およびＣｅｌｌｖｅｎｔｏ ＣＨＯ ２００などの市場で入手できる化学的に規定された細胞培養培地である。

本明細書に記載の修飾された膜を用いて、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上のウイルス性夾雑物のレベルが、少なくとも１Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）または少なくとも４Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）または少なくとも６Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）だけ減少する。

種々の実施形態において、化学的に規定された細胞培養培地は、２４時間未満の時間の間、本明細書に記載の修飾された膜を通して濾過される。ある実施態様においては、濾過は、４から８までの範囲のｐＨでおよび／または２０℃から２５℃の間の範囲の温度で実行される。

また、本明細書においては、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上の成分によるウイルス保持性膜の汚染を減少させる方法が提供される。該方法は、ａ）ウイルス保持性膜を用意するステップ、およびｂ）ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の架橋性モノマーとを含むポリマーで膜を修飾するステップを含み、ここで、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上の成分による修飾された膜の汚染が、修飾されていない膜に比べて減少している。

ある実施態様においては、ウイルス保持性膜が、ＰＥＳ膜、ＰＶＤＦ膜、セルロース系膜またはナイロン膜である。

ある実施態様においては、非アクリルアミド架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）である。

供給流としてＣＨＯ細胞培養培地を用いて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の曝露ありまたはなしで、ジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）ホモポリマーで修飾したＰＥＳ膜に対する、スループット性能の結果を表示した棒グラフである。最初の５個のデータセットは、Ｖ７５（Ｌ／ｍ^２）、Ｖ９０（Ｌ／ｍ^２）および１０Ｘ透過率（Ｌ／ｍ^２ｈｐｓｉ）で測定して、異なる百分率（２％、４％、６％、８％および１０％）のＤＡＣｍ溶液を用いて、修飾した膜の膜性能を表し、および続く５個のデータセットは、Ｖ７５（Ｌ／ｍ^２）、Ｖ９０（Ｌ／ｍ^２）および１０Ｘ透過率（Ｌ／ｍ^２ｈｐｓｉ）で測定して、Ｆ６８へ曝露による同じ膜の膜性能を表す。 ４％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍで修飾したＰＥＳ膜、または４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜、または１％ＨＰＣで修飾したＰＥＳ膜（対照として）を含む膜デバイスに関する、二連で試験した流束低下曲線を表す図である。Ｙ軸は（Ｊ／Ｊ_０）を、詰まりのないすなわち汚染のない供給流（例えば、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）について測定した流束Ｊ_０を基準とした、百分率で表した流束の低下を表し、Ｘ軸は、膜の平方メートルあたり集められた濾液のリットル（Ｌ／ｍ^２）で表した膜のスループットまたは容量を表す。 ４％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍ、４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡおよび１％ＨＰＣ（対照として）で表面修飾したＰＥＳ膜の容量と透過率を表す棒グラフである。ＣＨＯ細胞の化学的に規定された細胞培養培地が供給流として使用される。Ｘ軸は、膜を表し、Ｙ軸は、Ｖ７５（Ｌ／ｍ^２）、Ｖ９０（Ｌ／ｍ^２）および１０Ｘ透過率（Ｌ／ｍ^２ｈｐｓｉ）を表す。 Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率で測定した、試験された種々の膜デバイスの平均の容量と透過率を表す棒グラフである。それぞれの膜デバイスは、種々の表面修飾された膜のそれぞれの単層（１Ｌ）を収容するように構築されている。１％ＨＰＣは、膜湿潤剤として、１０％のヘキシレングリコールを用いた１．００重量％のヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）溶液を含み、浸漬により適用された吸着したポリマー予備処置を有する単層の膜デバイスを指し、３．７５％ＬＢ２０は、インサイチュでの電子ビーム硬化による、３．７５％の濃度で適用された自己架橋した高度にエトキシレート化されたトリアクリレートモノマーを有する単層の膜デバイスを指し、４．００％−ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍは、４％のジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）、単官能ビニルモノマー、およびＤＡＣｍとコポリマーを形成する、ジアクリルアミド架橋剤である１％のメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡｍ）を有する単層の膜デバイスを指し、２．００％ＬＢ２０−１％ＨＥＡ−０．７５％ＴＥＧＤＡは、２％のＬＢ２０、１％のヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）、および２官能性または架橋性のモノマーである、０．７５％のテトラエチレングリコールジアクリレートを有する単層の膜デバイスを指し、４．００％−ＤＡＣｍ１％−ＰＥＧＤＡ５７５は、４％のＤＡＣｍおよび１％の、数平均分子量が５７５であるポリエチレングリコールジアクリレートのＰＥＧＤＡ５７５を有する単層の膜デバイスを指す。 二連で試験した、単層の膜デバイスのそれぞれについての平均体積対時間曲線を表すグラフである。試験した膜デバイスは、１％ＨＰＣ、３．７５％ＬＢ２０、４．００％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍ、２．００％ＬＢ２０−１％ＨＥＡ−０．７５％ＴＥＧＤＡ、および４．００％−ＤＡＣｍ１％−ＰＥＧＤＡ５７５である。Ｘ軸は、種々の膜デバイスを通してＣＨＯ細胞培養培地を通した後に集められた濾液の体積（ｍｌ）を表し、Ｙ軸は、時間（分）を表す。 二連で試験した、単層の膜デバイスのそれぞれから得られた流束低下曲線を表すグラフである。試験した膜は、１％ＨＰＣ、３．７５％ＬＢ２０、４．００％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍ、２．００％ＬＢ２０−１％ＨＥＡ−０．７５％ＴＥＧＤＡ、および４．００％−ＤＡＣｍ１％−ＰＥＧＤＡ５７５である。Ｘ軸は、膜の容量（Ｌ／ｍ^２）を表し、Ｙ軸は、流束低下（Ｊ／Ｊ_０）を表す。図６で見られるように、ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマーで修飾した膜デバイスは、流束低下がより遅いという点で、試験した他の修飾物に対してスループット性能の優位さがあった。 Ｖ７５（Ｌ／ｍ^２）、Ｖ９０（Ｌ／ｍ^２）および１０Ｘ透過率（Ｌ／ｍ^２ｈｐｓｉ）で表した、一連の種々の膜デバイスについての熱処理の前後における、容量および透過率を表す棒グラフである。試験した膜デバイスは、３つのカテゴリーに分かれ；熱処理をしなかった（ＡＭ）修飾された膜で以下のもの；１Ｌ−ＤＰ４１００ ＡＭ（すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ１％−ＰＥＧＤＡ）、２Ｌ−ＤＰ４１００ＡＭ１、およびＩＬ−ＤＰ４１００ＡＭ２；１３４℃で１時間、デバイス中でオートクレーブ処理（ＡＣＤ）された修飾された膜で以下のもの；１Ｌ−ＤＰ４１００ＡＣＤ、ＩＬ−ＤＰ４１２５ＡＣＤ （すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ１．２５％−ＰＥＧＤＡ）、およびＩＬ−ＤＰ４ １５０ＡＣＤ（すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ１．５０％−ＰＥＧＤＡ）；１３４℃で１時間、オートクレーブ処理された修飾された膜で、デバイスの形態（ＡＣＭ）が続いている以下のもの；ＩＬ−ＤＰ４１００ ＡＣＭ、ＩＬ−ＤＰ４１２５ＡＣＭ、およびＩＬ−ＤＰ４１５０ＡＣＭである。単層の１Ｌ−１％ＨＰＣ膜を対照として使用する。Ｘ軸は、種々の膜デバイスを表し、Ｙ軸は、４ｇ／Ｌのヒト血清由来ＩｇＧを用い、ｐＨ４のアセテート緩衝液中および伝導度２ｍＳ／ｃｍで測定した、容量Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率を表す。 乾燥熱処理の前（ＡＭ）および後（ＤＨ）の、Ｖ７５（Ｌ／ｍ^２）、Ｖ９０（Ｌ／ｍ^２）、および１０Ｘ透過率（Ｌ／ｍ^２ｈｐｓｉ）により測定した、膜の容量と透過率を表した棒グラフである。試験した膜は、本明細書においてＰ１およびＰ２として参照される、２つの異なる供給源からのＰＥＳポリマーからキャストした。試験した膜デバイスは、対照として、１％ＨＰＣ Ｐ１および１％ＨＰＣ Ｐ２；熱処理をしない修飾された膜（ＡＭ）として以下のもの：ＤＰ４１００ ＡＭ Ｐ１、ＤＰ４２００ ＡＭ Ｐ１（すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ２．００％−ＰＥＧＤＡ）、ＤＰ４１００ ＡＭ Ｐ２およびＤＰ４２００ ＡＭ Ｐ２；乾燥熱で処理した修飾された膜（ＤＨ）として以下のもの：ＤＰ４１００ ＤＨ Ｐ１、ＤＰ４１００ ＤＨ Ｐ２およびＤＰ４２００ ＤＨ Ｐ２である。Ｘ軸は、種々の膜デバイスを表し、Ｙ軸は、４ｇ／Ｌのヒト血清由来ＩｇＧを用い、ｐＨ４の緩衝酢酸溶液中および伝導度２ｍＳ／ｃｍで測定した、容量Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率を表す。 実験の開始前に測定した、その場に置いてのスチーム処理（ＳＩＰ）前の、種々の膜のｌｏｇｐｈｉ−Ｘ１７４保持値（初期ＬＲＶ）を表す棒グラフである。 実験の終了時に測定した、その場に置いてのスチーム処理（ＳＩＰ）後の、種々の膜ｐｈｉ−Ｘ１７４ｌｏｇｐｈｉ−Ｘ１７４保持値（最終ＬＲＶ）を表す棒グラフである。試験した膜は、本明細書では、Ｐ１およびＰ２として参照される、２つの異なる供給源からのＰＥＳポリマーからキャストし、二連で試験する（ＡおよびＢと表示）。試験した膜デバイスは、対照としての、二連で使用される、熱処理なし（ＡＭ）の１％ＨＰＣ Ｐ１（１％ＨＰＣ Ｐ１ ＡＭ ＡおよびＢと表示される。）；以下のもの：ＤＰ４１００Ｐ１ ＡＭ Ａ、ＤＰ４１００ Ｐ２ ＡＭ Ａ、ＤＰ１００ Ｐ２ ＡＭ Ａ、Ｄ４ １００ Ｐ１ ＡＭ Ｂ、およびＤ４１００Ｐ２ ＡＭ Ｂである、熱処理なし（ＡＭ）の修飾された膜（すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ１．００％−ＰＥＧＤＡ）；以下のもの：ＤＰ４１００Ｐ１ ＳＩＰ Ａ、ＤＰ４１００Ｐ２ ＳＩＰ Ａ、ＤＰ４１００ Ｐ１ ＳＩＰ Ｂ、およびＤＰ４１００ Ｐ２ ＳＩＰ Ｂである、その場に置いてのスチーム処理（ＳＩＰ）をした修飾された膜（すなわち、４．００％−ＤＡＣｍ１．００％−ＰＥＧＤＡ）。Ｘ軸は、種々の膜デバイスを表し、Ｙ軸は、ＬＲＶを表す。 化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地を用いて、２から５％までの範囲のＰＥＧＤＡ−５７５で修飾したＰＥＳ膜で得られた、平均の容量および透過率の結果（Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率）を表した棒グラフである。１％ＨＰＣ膜が対照として用いられる。 ２から５％までの範囲のＰＥＧＤＡ−５７５で修飾したＰＥＳ膜の容量および１０００リットルの培地を４時間で濾過するのに必要な最低面積を表した棒グラフである。１％ＨＰＣが対照膜として用いられる。左側のＹ軸は、Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ濾液の体積および１５０分における膜の容量を、右側のＹ軸は、１０００リットルを４時間で濾過するための最低面積を表す。 ３種の異なる化学的に規定された培地（すなわち、Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ ＣＨＯ−２００、ＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯおよび２ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を混ぜたＤＭＥＭ）を用いた、種々の膜の容量を表す棒グラフである。試験された膜は、１％ＨＰＣで修飾したＰＥＳ（対照として）；４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜；０％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜；１％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜；および４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜である。Ｘ軸は、膜のタイプを表し、Ｙ軸は、１０００リットルの培地を４時間で濾過するのに必要な最低面積である、Ａｍｉｎを表す。

本明細書に記載の実施形態は、化学的に規定された細胞培養培地から、微生物、例えば、ウイルス性夾雑物を除去するための組成物および方法に関する。ここで、組成物は、化学的に規定された細胞培養培地の成分による汚染の減少を示す。

特に、本明細書に記載の実施形態は、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと、例えば、ポリエチレングリコールジアクリレートなどの、１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで修飾された表面を有する多孔性膜を利用する組成物および方法を提供する。

本明細書においてはまた、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマー（例えば、ＰＥＧＤＡ）とを含むポリマーでそのような膜の表面を修飾することにより、化学的に規定された細胞培養培地の１種以上の成分による汚染に対してウイルスバリア膜を抵抗性にする方法を提供する。

本明細書に開示されている実施形態がより容易に理解され得るために、ある用語を最初に定義する。更なる定義は、詳細な記述により以下に説明される。

Ｉ．定義
用語「化学的に規定された細胞培養培地」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒトのまたは動物の細胞）の細胞培養に適した成長培地を指す。その中の全ての化学成分は既知である。市販の化学的に規定された細胞培養培地の例としては、Ｌｏｎｚａ Ｐｏｗｅｒ ＣＨＯ、ＣＤ Ｏｐｔｉ ＣＨＯ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ ＣＨＯ １００およびＣｅｌｌｖｅｎｔｏ ＣＨＯ ２００が含まれるがこれらに限られるわけではない。

水力学的細胞保護の両親媒性の化合物、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＢＡＳＦ）および／またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（ＩＣＩ）は、種々の市販の化学的に規定された細胞培養培地において膜フィルター汚染の原因となる主要な培地成分であることはこれまで示されてきた。１種以上のこれらの成分が、膜の汚染を引き起こしていることが観測されているので、これらの成分がウイルス性夾雑物を除去するための膜フィルターの効率を減少させている。

本明細書に記載の実施形態は、膜を汚染することが知られている培地成分、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の存在下ですらも、ウイルス性夾雑物の除去において有効である、膜組成物に関する。

用語「夾雑物」、「不純物」および「デブリ」は、本明細書では、互換的に使用されるが、化学的に規定された細胞培養培地に存在し得る、望ましくないまたは障害となる微生物を指す。特定の実施形態においては、そのような微生物は、ウイルスまたはウイルス粒子である。様々な実施形態においては、本明細書に記載の組成物および方法は、市販の化学的に規定された細胞培養培地中に典型的に存在するある成分による汚染を、減少するまたは少なくするように修飾されている膜フィルターを通して、化学的に規定された細胞培養培地を濾過することにより、化学的に規定された細胞培養培地からそのようなウイルス性夾雑物を効率的に除去することを意図している。したがって、本明細書に記載の実施形態は、たいていのウイルス保持膜を典型的には汚染するような成分に曝露されたときでも、そのウイルス保持容量および膜スループットを保つ組成物を提供する。

本明細書に記載の組成物および方法を用いて除去され得るウイルス性夾雑物または可能性のあるウイルス性夾雑物としては、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ＲｅｔＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはレオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）の科のものが含まれる。さらに詳細には、ウイルス性夾雑物は、カニンパルボビリダエ（ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（ＣＰＶ））、マウスのマイニュートウイルス（ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ（ＭＶＭ））、カシェバレーウイルス（Ｃａｃｈｅ Ｖａｌｌｅｙ ｖｉｒｕｓ）、ブニャムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ ｖｉｒｕｓ）、ノースウエイエンセファリティスウイルス（Ｎｏｒｔｈｗａｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＮＢウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＮＢ ｖｉｒｕｓ）、ユニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ １／２／３）、シミアンウイルス５（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５）、マンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、ボビンリスピラトリシンシティアルウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスルディジーズウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、マウスのニューモニアウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）、ベシキュラーストマティティスウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ラビーズウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ボビンコロナウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ムリンヘパティティスウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、イエローフィーバーウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）、チックボーンエンセファリティスウイルス（Ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、セントルイスエンセファリティスウイルス（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ベシウイルス２１１７（Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ ２１１７）、エンセファロミオカルディティスウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、コクサキーウイルスＢ−３（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ Ｂ−３）、テイラーズマウスエンセファリティスウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ‘ｓ ｍｏｕｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、フートアンドマウスディジーズウイルス（Ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、ボビンエンテロウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ポルシンエンテロウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、シムリキフォレストウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ）、ジャパニーズエンセファリティスウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、イースタンエクインエンセファリティスウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ポルシンリプロダクティブアンドレスピラトリィシンドロームウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、フォーミィウイルス（Ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、レオウイルス１／２／３（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ １／２／３）、アイビアンレオウイルス（Ａｖｉａｎ ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ポルシンシルコウイルス１（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ １）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、シュードラビーウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ムリンガンマヘルペス６８（Ｍｕｒｉｎｅ ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓ ６８）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １）、フロッグウイルス３（Ｆｒｏｇ ｖｉｒｕｓ ３）、マイスカッターのマイニュートウイルス（ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ−ｃｕｔｔｅｒ（ＭＶＭｃ））、ブルータングウイルス（ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ （ＢＴＶ））、エピゾーチックヘモラジックディジーズウイルス（Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＥＨＤＶ））、ボビンバイラルダイアリアウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ））、ポルシンパルボウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ））、エンセファロミオカルディティスウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＥＭＣＶ））、レオウイルス３（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ ３）、およびムリンリュウケミアウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＭｕＬＶ））、ヘパティティスＡ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）またはパルボビリダエＢ１９（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ Ｂ１９）のいずれか一つであり得る。

用語「ｌｏｇ減少値」（ＬＲＶ）は、本明細書で使用する場合、粒子、例えば、ウイルス性夾雑物を保持する膜の効率の測定値を指し、ウイルスフィルター膜透過流中の粒子数に対する供給流（例えば、化学的に規定された細胞培養培地）中の粒子数の比の（１０を底とする。）対数で定義される。本明細書に記載の様々な実施形態においては、膜フィルターは、ウイルス性夾雑物に対して少なくとも１Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも２Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも３Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも４Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも５Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも６Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも７Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、またはウイルス性夾雑物に対して少なくとも８Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）、好ましくは、ウイルス性夾雑物に対して少なくとも４Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）を達成する。

用語「汚染」は、膜の流束および／またはスループットの低下などの膜性能を劣化させるような形で、膜表面上または膜の孔の中への、溶質または粒子が蓄積するようなプロセスを指す。本明細書に記載の種々の実施形態において、化学的に規定された細胞培養培地中に存在する１種以上の成分による汚染に対して抵抗性であるまたは汚染を減少させる、ウイルス膜フィルターが提供される。さらに、本明細書において提供される方法は、化学的に規定された細胞培養培地中に存在する１種以上の成分による汚染に対して抵抗性であるまたは汚染を減少させる組成物の作製のために使用し得る。

用語「流束」または「膜流束」（Ｊ）は、本明細書で使用される場合、濾過流の瞬間的な速度を指し、一般的には、本質において変動する（単位時間あたり単位有効濾過面積（ＥＦＡ）あたりでウイルス濾過膜を通して流れる濾液の体積または重量として、例えば、Ｌ／（ｍ^２×ｈｒ）、またはｇ／（ｍ^２×ｈｒ）、またはＫｇ／（ｍ^２×ｈｒ）で表される。）。

用語「初期流束」または「初期膜流束」（Ｊ_０）は、本明細書で使用される場合、透過液の流れが詰まりを起こさない流体（すなわち、水または膜夾雑物を含まない溶液）からなる場合の、通常は本質としては一定であるが、透過液の流れの速度を指す。

用語「流束低下」または「膜流束低下」（Ｊ／Ｊ_０）は、本明細書で使用される場合、初期流束またはフィルターもしくは膜を通しての詰まりを起こさない透過液の流れを通して測定される流束に対する詰まりを起こす透過液の流れにおける瞬間の膜流束の比を指す。しばしば百分率、すなわち、（Ｊ／Ｊ_０）％で表現される。

用語「流束低下曲線」は、流束低下が時間、または集められた濾液の体積（ｖ）または重量（ｍ）、または好ましくは、単位の有効濾過面積あたりの集められた濾液の体積（ｖ）または重量（ｍ）に対してプロットされた時（すなわち、（Ｊ／Ｊ_０）％対Ｌ／ｍ^２、または（Ｊ／Ｊ_０）％対Ｋｇ／ｍ^２）にできる曲線を指す。

用語「スループット性能」は、本明細書で使用される場合、流束が初期の流束（詰まりのない流に対して測定された流束）の２５％または１０％にまで低下する前に、有効濾過面積の単位面積あたりに回収できた濾液の量を指す。

用語「バッチ濾過」は、本明細書で使用される場合、化学的に規定された培地の特定の量または体積が、濾過された培地が工程の次のステップへ移送されるまたは用いられる前に、濾過工程を完了するまで１バッチで、膜フィルターを通して濾過される、濾過工程を指す。

用語「連続濾過」または「インライン濾過」は、化学的に規定された細胞培養培地の特定の量または体積が膜フィルターを通して連続的に濾過される、および濾過された培地が、濾過されるにつれて工程の次のステップに移送されるまたは使われ得る、濾過工程を指す。

本明細書に記載の全ての実施形態は、バッチまたは連続濾過を用いて実行され得る。

用語「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、一般に、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで修飾されたいずれかの材料を指す。非アクリルアミド架橋性モノマーの例は、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）である。

本明細書に記載の方法および組成物に使用される固体支持体の形態の例としては、膜およびモノリスが含まれるが、これらに限られるわけではない。ある特定の実施形態においては、固体支持体は、その表面が本明細書に記載のように修飾された多孔性膜である。膜の例としては、多孔性の非対称性膜、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００７６９３４号明細書に記載された工程を用いて作製された膜などのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「表面」は、外部の表面および多孔性媒体または膜の内部表面を含んで、多孔性媒体または膜の全表面を指す。用語「外部表面」は、外観にさらされている表面を意味する。用語「内部表面」は、多孔性媒体または膜の多孔性ネットワークの内部表面、すなわち、間質領域を指すことを意図している。

本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」は、反応性部位を有する少なくとも２種の架橋されたモノマーから作製されたポリマーを指し、その場合、モノマーは、ランダムに配列されており、重合反応に参加でき、少なくとも１種のモノマーがジアセトンアクリルアミドである。ある実施態様においては、ポリマーは、ジアセトンと、少なくとも１種以上の、例えば、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）などの非アクリルアミド架橋性モノマーを含む。

単官能性モノマーは、１個の不飽和官能基を有するものである。多官能性モノマーは、２個以上の不飽和官能基を有する分子である。

用語「ウイルスフィルター」または「ウイルス保持フィルター」または「ウイルスバリアフィルター」は、上流での（すなわち、細胞と接触する前に細胞培養培地を濾過する。）使用にまたは下流での（すなわち、遺伝子組み換えにより発現されたタンパク質を含む細胞培養培地を濾過する。）使用の間に、ウイルスの除去またはウイルスのクリアランスを提供するためにウイルスまたはウイルス様の粒子を保持する膜または媒体を指す。市販のウイルス保持フィルターの例としては、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＰおよびＶｉｒｏｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＲが含まれ、これらは、主としてサイズによる排除機構により機能する。本明細書に記載の実施形態は、上流での使用を意図しており、目的のタンパク質を発現する細胞を培養するために使用されるバイオリアクターの上流に配置されるウイルスバリアフィルターに関する。そのようなウイルスバリアフィルターは、化学的に規定された細胞培養培地の１種以上の成分による汚染に対して抵抗性であり、汚染の減少を示すように修飾されている。

用語「供給」または「供給流」は、本明細書では互換的に使用されるが、濾過工程に掛けられる溶液または混合物、例えば、化学的に規定された細胞培養培地を指す。

用語「濾液」または「透過液」は、本明細書では互換的に使用されるが、フィルターまたは膜を通り抜ける溶液だけでなくフィルターまたは膜を通り抜けた溶液を指す。

用語「保持物」は、本明細書で使用される場合、保持され、フィルターまたは膜を通り抜けないだけでなくフィルターまたは膜を通り抜けなかった溶液の成分を指す。

用語「バイオリアクター」は、本明細書で使用される場合、生物学的に活性な環境を支える、製造されたまたは操作された何らかのデバイスまたはシステムを指す。ある実施態様においては、バイオリアクターは、その中で、生物またはそのような生物に由来する生物学的に活性の物質が関係する細胞培養工程が実行される、容器である。そのような工程は、好気性または嫌気性のどちらかであり得る。ある実施態様においては、バイオリアクターは、リットルから立方メートルまで、大きさにおいて様々であり、ステンレス鋼で作られている。ある実施態様においては、バイオリアクターは、鋼鉄以外の材料で作られており、そのまま廃棄でき、使い捨てである。バイオリアクターの総容積は、特定の工程に依存するが、１００ｍＬから１０，０００Ｌに至るまでまたはそれ以上のいずれかの容積であり得る。本明細書に記載の工程およびシステムに関するある実施形態においては、バイオリアクターは、本明細書に記載のウイルスフィルターに連結されており、そこではウイルスフィルターが、バイオリアクターの上流に存在する。

ＩＩ．固体支持体の例
本明細書に開示された実施形態は、ランダムに配置され、架橋されたモノマーを含むポリマーで修飾された固体支持体を提供する。本出願により包含される固体支持体は、下流のウイルス精製用途に用いられるウイルス保持膜を急速に汚染することが公知である細胞培養成分の存在においてすらも、化学的に規定された細胞培養培地中に存在するウイルス性夾雑物を保持する。本出願により包含される固体支持体は、化学的に規定された細胞培養培地中に存在する１種以上の成分による汚染に対して抵抗性であり汚染の減少を示す。

理論にこだわるつもりはないが、適切な固体支持体の形態であれば、いかなるものも使用し得ると考えられる。例えば、固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、またはモノリスまたは膜の形態のように連続的であり得る。連続的な多孔性固体支持体の例としては、ミクロポーラスな、すなわち、約０．０５ミクロンと１０ミクロンの間の孔径を有する膜が含まれる。本明細書に開示されている実施形態に記載の組成物および方法に使用され得る多孔性膜は、本質として対称性または非対称性に分類され得る。それらは、膜の厚さ方向を横切っての、または中空繊維の場合には、繊維のミクロポーラスな壁を横切っての、孔径の均一性を指す。

本明細書で使用される場合、用語「対称性膜」は、膜の断面を横切って実質的に均一な孔径を有する膜を指す。特定の実施態様においては、非対称性膜が固体支持体として使用される。本明細書で使用される場合、用語「非対称性膜」は、平均孔径が、膜の断面を横切って一定ではない膜を指す。ある実施態様においては、非対称性膜の場合には、孔径は、膜の断面を通しての位置の関数としてなだらかにまたは非連続的に変化し得る。ある実施態様においては、非対称性膜は、一方の外面の孔径の反対側の外面の孔径に対する比、その比は実質的には１よりも大きい、を有し得る。修飾され得る非対称性膜の例としては、本明細書に記載されるように、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜である。ＰＥＳ膜は、ＳｕｍｉｔｏｍｏおよびＳｏｌｖａｙなどの販売者から市場で入手できる。

広範囲の材料から作製される広範囲の膜が本明細書に記載の組成物および方法において使用し得る。本明細書に記載の組成物および方法において使用し得る膜を製造するのに使用し得るポリマーの例としては、置換または無置換のポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリメタクリルアミド、ポリイミド、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、芳香族ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロ化された熱可塑性ポリマー、ポリオレフィン、芳香族ポリアミド、脂肪族ポリアミド、超高分子量ポリエチレン、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限られるわけではない。

市販のミクロポーラスな膜の例としては、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から入手し得るＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）から入手し得るＳｕｐｏｒ（登録商標）；ならびにＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．（Ａｕｂａｇｎｅ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手し得るＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）およびＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）がある。連続的な固体支持体の他の例としては、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｖｉｌｌａｃｈ，Ａｕｓｔｒｉａ）から入手可能な、ＣＩＭ（登録商標）モノリス材料などのモノリスがある。

市販のウイルス保持フィルターの例としては、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＰおよびＶｉｒｏｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＲが含まれるが、これらは主として大きさによる排除機構により機能している。これらのウイルス保持フィルターの製造に用いられる基礎となる膜基材は、化学的に規定された細胞培養培地の１種以上の成分による汚染に対して抵抗性であるまたは汚染を減少するような膜を得るために、本明細書に記載のように、修飾されていてもよい。

ＩＩＩ．固体支持体の修飾の方法
本明細書に記載の組成物および方法において、適切な固体支持体（例えば、非対称性膜、または特に、非対称性ＰＥＳ膜）は、ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマー（例えば、ポリエチレングリコールジアクリレート）とを含むポリマーで修飾されていてもよい。

種々の方法が、本明細書に記載のものを含めて、固体支持体を修飾するために当技術分野において公知である。

種々の実施形態において、固体支持体（例えば、多孔性膜）の表面は、エネルギー源を用いて修飾される。種々のエネルギー源、例えば、γ線、Ｘ線、自由電子、ＵＶ、青色光および熱が、重合反応を経由して修飾を開始するのに用い得る。γ線、Ｘ線、および電子ビーム法は、中性のモノマーをイオン化させるのに十分なエネルギーがあるので、重合を起こすのに、追加の化学的開始剤を必要としない。しかしながら、ＵＶおよび可視光の両方は、ラジカル種を発生させるために光開始剤を必要とし、次いで、それがモノマーを活性化し、高度に反応性の（ラジカル化された）種とし、それが順にランダムコポリマーを形成するように反応することができる。このことは、熱的に開始された重合においても真であり、その場合、開始剤は、光活性または光により活性化されてもされなくてもよい。

本明細書に記載のある実施形態においては、固体支持体（例えば、ポリエーテルスルホン膜などの非対称性膜）は、以下に記載するように電子ビームを用いて修飾される。

典型的には、電子ビーム工程を用いると、膜は適当な濃度のモノマーの混合物に浸漬される。モノマー溶液の表面張力が高すぎる場合、膜試料は、（メタノールまたはイソプロパノールのような）低分子量のアルコールで予備湿潤され、その後、モノマー溶液中に浸漬される前に水浴中で「交換」される。ある場合には、モノマー溶液は、膜の表面を湿らせるに十分に低い表面張力を有し、この場合は、予備湿潤および交換のステップは、不必要になる。膜試料は、モノマー溶液から引き上げられ、モノマー溶液が膜試料の上全体にわたって等しく分布するのを確実にするために、余分のモノマーをニップロールで除く。膜試料は、次いで、窒素またはアルゴンガスで不活性化したブランケットのもとで、電子ビームの下を膜試料を通過させることにより自由電子に曝露する。ある実施態様においては、線速度３から１０ｍ／分が用いられる。電子ビーム加速電圧は、１７０と２００ＫＶの間に設定され、線速度と組み合わせてビーム電流は、２０から３０ＫＧｙの投与が膜試料に行われるように調節される。こうした条件は、膜試料に対して、膜の断面全体にわたって完全に修飾されるようにさせる。

ＩＶ．膜のスループット性能の測定方法
ある実施態様においては、本明細書に記載の修飾された固体支持体（例えば、多孔性膜）は、デバイス、例えば、本明細書に記載の実施例において用いられるデバイス、に組み込まれ、およびデバイスは、次いで、膜または膜デバイスのスループット性能を測定するのに用いる。

本発明は、少なくとも部分的には、本明細書に記載の修飾された膜の優れた特性に基礎を置いており、そこでは、膜のスループット性能は、化学的に規定された細胞培養培地中に見出される膜汚染成分が存在しても悪影響を受けない。したがって、本明細書に記載の固体支持体を修飾する方法は、膜を通して培地を濾過するときに、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上の成分による多孔性膜の汚染を減少させるために用い得る。

スループット性能は、最初に、詰まりのない供給流を用いて膜デバイスの透過率（流束／操作圧力の単位）を測定することにより測定できる。詰まりのない供給流は、一般に、純水または溶解した有機および／または無機の塩を含む水性緩衝液からなる。

膜または膜デバイスの透過率は、単位面積当たり単時間当たり単位圧力当たりの材料の量として（リットルまたはキログラムで）、しばしばＬ／（ｍ^２ｈｐｓｉ）で、または「ｐｓｉ当たり時間当たりメートル２乗当たりのリットル」で表して定義される。実験が一定の操作圧力で行われるならば、デバイスの有効濾過面積（ＥＦＡ）および駆動圧力は定数である。唯一の観測可能量は、濾液の質量および時間（または濾液の体積および時間）である。濾液の密度が１に非常に近い場合は、質量および体積は互換的に使用可能である。供給流が詰まりを起こすものでない時、透過率は一定であり、デバイスの「緩衝液」流束「Ｊ_０」は集められた濾液の質量または体積を時間に対してプロットして得られる直線の傾きにより測定される。

同じ実験が詰まりのある流れ（例えば、この場合、化学的に規定された細胞培養培地）で実行される場合、詰まりを起こす流れが含有している何らかの汚染種でデバイスの孔が塞がれるにつれて、流束は時間に連れて低下する。この時の流束は、単純に「Ｊ」と表される。百分率で表される（および（Ｊ／Ｊ_０）％で表される）相対的な流束の低下が、あらかじめ決められたある値、例えば、２５％、に到達する時、そのデバイスの容量は、流束がデバイスの可能な最大流束値、または詰まりのない供給流を用いて得られた流束値の２５％に低下した時の時間により回収され得る、デバイスの単位面積当たりの濾液の（詰まりのある供給流の）量として定義される。上記の記述により定義される容量は、スループット性能の１つの数的なまたは定量的な尺度である。それはスループット性能を測定する唯一の方法ではないが、かなり典型的なものである。

デバイスの容量が測定されるのに通常使われる２つの点は、（ａ）流束がデバイスの最大流束の２５％になるまで低下する（Ｖ７５−流束が７５％ほど低下した）とき；および（ｂ）流束がデバイスの最大流束の１０％になるまで低下する（Ｖ９０−流束が９０％ほど低下した）ときである。代替として、容量はまた、特定の供給流の決められた量を濾過するのに必要な最小濾過面積、または特定の供給流の特定の量を濾過するのに必要な時間間隔として定義される。こうした量のいずれもまたはすべては、スループット性能の尺度であると考えられ得る。

Ｖ．本明細書に記載の組成物およびデバイスの使用法
種々の実施形態において、本明細書に記載の修飾されたウイルス保持膜は、バイオリアクター中へ移送する前に化学的に規定された細胞培養培地中に存在し得るウイルスを保持するために、バイオリアクターの上流で用いられる。

例えば、ある実施態様においては、そのようなウイルス保持膜は、デバイスに組み込まれ次いで殺菌される。デバイスは、次いで、殺菌した接合具を用いてバイオリアクターの上流（入口部において）に置かれ、細胞培養培地がバイオリアクターに移送される間、通常の濾過法で新しく用意された細胞培養培地を濾過するために使用される。結果的に、いかなるパルボウイルスによる汚染は、濾過前に存在するレベルの１／１００００にまで減少させ得る（最小ｌｏｇ減少値（ＬＲＶ）が４に相当する。）

実施形態は、以下の実施例によりさらに提示されるが、これらは制限的であると考えられるべきではない。本出願を通して引用されるすべての参照資料、特許および出版された特許出願の内容だけでなく図も、参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例１］
ジアセトンアクリルアミドモノマーでの膜表面の修飾のための方法
ジアセトンアクリルアミドモノマーでの膜表面の修飾のための様々な方法を試験した。

最初の方法は、浸漬被覆を含む。１０重量％の水性へキシレングリコール溶液を用意した。６ｇのジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）モノマーを、１９４ｇのへキシレングリコール−水溶液の中に溶解し、３重量％のジアセトンアクリルアミドである最終溶液を得る。１４ｃｍｘ１４ｃｍの、高度に非対称性の修飾されていない疎水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）ウイルス膜を、膜の開放面が最初に溶液と接触し、続いてＤＡＣｍ溶液の中に数分間膜が浸漬するように、浅い長方形のパイレックス（登録商標）パン焼き皿中のＤＡＣｍ溶液の中に置く。膜を引出し、吸収シート上に置き、余分の溶液を除き、次いで紙タオルの上で室温空気乾燥条件のもとで空気乾燥させる。乾燥した膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ水と接触させ急速な水による湿潤化を行う。湿った膜を、ＤＡＣｍモノマーまたはへキシレングリコール共溶媒の残分が見られなくなるまで水ですすぎ、その後、試料を再び空気乾燥させる。再乾燥された膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ水と接触させて置いた時、膜は湿らない。最初のモノマー処置の後では、水はＤＡＣｍモノマーを容易に取り除くので、ＰＥＳ膜基材の上に何らかのＤＡＣｍモノマーの吸着がないことを容易に達成することができる。

別の実験では、４．００ｇのＤＡＣｍを１９６．００ｇのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解することにより、２．００重量％のＤＡＣｍ水溶液を用意する。メタノールで予備的に湿らせた（および水と交換した）１４ｃｍｘ１４ｃｍの大きさの、高度に非対称性の疎水性ＰＥＳウイルス除去膜の上に浸漬することにより溶液を適用する。手順は、浅い長方形のパイレックスパン焼き皿中のＤＡＣｍ溶液に膜のオープンフェイスが接触し、続いて溶液中に膜を浸漬するようにゆっくりと揺すり、そのまま数（２−３）分置き、その後、何らの界面活性剤の活性（泡）がすすぎ水中に見られなくなるまで、モノマー溶液を水ですすいで除く。乾燥後および水で湿して試験した後、上記した処置に従って、膜が疎水性のままであることで膜上にＤＡＣｍがもはや残っていないことが観測される。したがって、ＰＥＳ膜上にＤＡＣｍモノマーの単純な吸着が、永久的な親和性を全く示さず、この浸漬被覆作戦は使用されない。

更なる実験において、膜上へのＤＡＣｍの電子ビーム重合を試みた。この実験では、同じ２．００重量％のＤＡＣｍモノマーの水溶液が同一の、高度に非対称性の疎水性ＰＥＳウイルス除去あらかじめ湿らせた膜に対して適用され、その後、膜を２枚の１００μｍの厚みの透明ポリエチレンシートの間に挟んで余分なモノマー溶液を除く。次いで、膜を電子ビーム源（２５ＫＧｙで、１７０ＫｅＶの電子に露光）の下を通し、膜上へのＤＡＣｍモノマーを重合させる。驚くべきことに、得られた膜は、モノマー自身が容易に水溶性であるにもかかわらず、水中で濡れるのが遅い。しかしながら、得られた膜は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水浴中では４５秒以内に完全に湿り、この処置によって膜上にＤＡＣｍホモポリマーが形成されたことを示している。処理後の膜は、ＤＡＣｍモノマーと組み合わせて何らの架橋性モノマーを用いていないにもかかわらず、オートクレーブおよび乾熱に対して影響されないことが観察される。さらに、０．２ＭＮａＯＨ水溶液中に室温で２時間浸漬した後でも、水での湿り挙動または水の透過性には何の変化もないことが観察される。しかしながら、コーティングはメタノールで洗い流せる。

０．５ＭＮａＯＨ中で１６時間にわたり静浸漬した更なる試験により、得られたホモポリマー膜は４時間までは苛性アルカリに対して安定であり、その後、ホモポリマーの表面修飾が劣化し始める。このことは、一連のあらかじめ秤量しておいた同一の膜試料を修飾することにより、同じモノマー溶液を用い同一のｅ−ビームにより開始させる重合工程にかけることにより、判る。試料は、表面修飾後および乾燥後に再び秤量され、ジアセトンアクリルアミドホモポリマーによる追加重量をそれぞれの膜試料について測定する。こうした膜試料を０．５ＭＮａＯＨ溶液中に浸漬し、連続する時間間隔で一度に引き上げる。表面修飾は、４時間後になってはじめて劣化し始めることが観測される。

電子ビームで開始される膜上へのＤＡＣｍの重合は、上記した他の方法に比べてうまくいくが、膜スループットに対する効果は調べる必要がある。

［実施例２］
電子ビームにより開始される重合を用いるＤＡＣｍホモポリマーで修飾した膜の、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８への曝露の有無によるスループット性能

一連の２、４、６、８および１０重量％の水性のＤＡＣｍ溶液を調製する。次いで、これらの溶液を、上記の電子ビーム工程を用いて、１４ｃｍｘ１４ｃｍの大きさの高度に非対称性の疎水性ＰＥＳ膜を表面修飾するために使用する。

次いで、膜は、以下にアウトラインを示した手順にしたがってスループット試験にかける。

直径２５ｍｍの円形の膜試料を、上記したようにして作製された修飾された膜のそれぞれから切り出し、オーバーモールドしたマイクロスケールの濾過デバイスに組み立てる。デバイスは、頂上部に液体の入り口、底部に液体の出口を有し、ディスク型のフィルターエレメントをハウジングの中央の円形部に収容したハウジングを含む。それぞれの液体入口は、空気と液体を逃がすことおよび実際のフィルターエレメントの上に体積を直接パージできるように積算ベントを有している。

それぞれのデバイスは、０．２５インチのポリプロピレンのチューブで構築され、０．２５インチのポリプロピレンチューブだけでなくそれに合致するＬｕｅｒ接合金具とバルブから組み立てられた副マニフォールドにより、２個の液体分配マニフォールドにつながっている。一方のマニフォールドは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（詰まらない流れ）をデバイスのそれぞれに配り、他方のマニフォールドは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した化学的に規定された細胞培養培地（詰まる流れ）をデバイスのそれぞれに配る。それぞれのマニフォールドは、そのような１０個の濾過デバイスを支持し、それに配液するように構築されている。液体配送マニフォールドのそれぞれは、別々の圧力容器に接続されており、その容器は、試験液体の貯留槽として働く。それぞれの圧力容器には、３０ｐｓｉまたは約２ｂａｒ（２ｘ１０^５Ｐａ）でデバイスに液体を送るように設定されている、設定された圧縮空気の供給により、別々に、供給される。集液コンテナを有するロードセルが、集められた濾液の質量を時間の関数として測定するために、それぞれの濾過デバイスの下側に設置されている。それぞれのロードセルは、マルチチャネルデータ収集ボードに接合されており、ボードはさらに、集められた濾液の質量（ｇで）を時間（調整可能な単位で、典型的には分の単位で）に対して記録するために、データ収集ソフトウエアを働かせているコンピュータに接続されている。

さらに、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の膜曝露または予備処置の効果が調べられた。予備処置またはＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８への曝露には、１０％（１００ｇ／Ｌ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の水溶液の数（約５）ｍｌをそれぞれの濾過アッセンブリを通して注射器で通すこと、次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水すすぎを行いながら泡やバブルがすすぎ水中に見られなくなるまでＭｉｌｌｉ−Ｑ水での大量の抽出すすぎを行う。

Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８で予備処理した試料は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８での予備処理をしていない試料よりも改善されたスループット性能を示すことが観測される。これらの結果は、ＤＡＣｍ処理した膜は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む細胞培養培地に対して増大した汚染抵抗性を与え得ることを示している。スループット性能の試験結果は以下の表Ｉおよび図１にも集められている。

スループット性能は、定量的には、膜容量として参照される。したがって、膜容量は、供給流依存性である。容量は、この実験においては、Ｖ７５およびＶ９０として示される、２つの測定により表されており、これらは、流束が、初期流束（［Ｌ／ｍ^２］単位で）の、それぞれ、２５％および１０％にまで減少するときに、１ｍ^２の有効膜表面積あたりで集められた濾液のリットル数に対応している。初期流束は、膜の透過率から決定でき、その後順次、操作圧力あたり単位時間当たり膜を通して通過する詰まりのない流れの体積を測定することにより決定できる。本明細書で使用する透過率は、単位操作圧力（ｐｓｉ）あたり単位時間（ｈｒｓ）あたり単位面積（ｍ^２）当たり集められた濾液のリットル単位で、または［Ｌ／（ｍ^２ｈｐｓｉ）］で表される。操作圧力３０ｐｓｉはこのおよび以下のスループット実験に対して使用される。

表１は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８の曝露または予備処置のなし（１−５行）およびあり（第２の５行、６−１０行）での、ジアセトンアクリルアミドホモポリマーで修飾した膜に対するスループット性能の結果を示す。

概していえば、膜のスループット性能は、膜処置に用いられるＤＡＣｍのレベルが増加するにつれて、１０％に至るまで増加することが観察されている。さらに、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８で予備処理されていないまたはこれに曝露されていない膜に比べて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８で予備処理されたまたはこれに曝露された、ＤＡＣｍで修飾された膜について、スループット性能の改善が観測されている。それゆえ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、ＤＡＣｍで修飾された膜に対して汚染効果を有するとは見えない。

しかしながら、前述の膜についての洗脱試験は、少なくともより高いＤＡＣｍのレベルに対しては、ＤＡＣｍホモポリマーが、メタノールと接触させると洗脱し、その後、膜の流れ特性および濡れ性が影響を受けたことが示された。洗脱試験は、ＤＡＣｍモノマーの架橋なしでは、抽出分が低いことを保証できないし一定の膜性能を達成できない。さらに、低分子量のアルコールに対して偶然にでも曝露されると望ましくない材料の弱さを表す。

［実施例３］
ＤＡＣｍモノマーに対する架橋剤の選択
本実施例ではＤＡＣｍモノマーに対するいくつかの可能性のある架橋剤が試験される。テトラエチレングリコールジアクリレート（ＴＥＤＧＡ）がＤＡＣｍモノマーに対する可能性のある架橋剤として試験される。しかしながら、ＤＡＣｍおよびＴＥＧＤＡでの修飾は、安定な架橋された表面修飾を作らない。したがって、水溶性で非アクリルアミド架橋性のモノマー、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＤＧＡ）が、ＴＥＧＤＡの代わりに架橋剤として試験される。平均分子量５７５のＰＥＧジアクリレート（ＰＥＧＤＡ５７５）は、入手できる分子量のＰＥＧジアクリレートの中で最善の水溶性を有すると報告されている。試験された最初の架橋剤のレベルは１％である。

架橋剤と組み合わるためのＤＡＣｍの始めのレベルを選択するために、２から１０重量％までのＤＡＣｍホモポリマーで修飾された膜が、水による湿潤速度および透過率について再び試験される。４％のＤＡＣｍで修飾した膜は、他のＤＡＣｍホモポリマーで修飾した膜より水中でより速くおよびより均一に湿潤したことが見出される。したがって、４．００％ＤＡＣｍが、１％のＰＥＧＤＡ５７５での架橋された表面修飾化学において用いられるべき最初のＤＡＣｍのレベルとして選択される。モノマー溶液が、９５重量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の１．００重量％ＰＥＧＤＡモノマーと組み合わせて、４．００重量％のＤＡＣｍモノマーを含むということ以外は、モノマー混合物が、上記したのと同じような様式でｅ−ビームにより適用された。

被覆の永続性により特徴づけられる架橋の有効性は、得られた修飾された膜試料をメタノール中に浸漬し、続いて水でのすすぎ、および乾燥を行い、次いで、濡れ性と透過率を再試験することにより確かめられる。水による濡れ性と水の透過率の試験の結果は、本質的には、メタノールでの抽出工程前に記録されていたものと同じである。それゆえ、修飾は安定であると考えられる。

さらに、別の実験で、非アクリルアミド架橋剤の使用について試験し、膜スループット性能に与える効果に関して、アクリルアミド架橋剤と比較する。ＰＥＧＤＡ５７５が、非アクリルアミド架橋可能のモノマーとして使用され、メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡｍ）がアクリルアミドの架橋可能のモノマーとして使用される。実験的プロトタイプの化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地、ＭＸ−２０１またはＢｅｔａ−ＣＨＯが、この実験での詰まりのある、汚染性の供給流として使用される。それぞれの架橋性モノマー（ＰＥＧＤＡまたはＭＢＡｍ）は、同一の１．００重量％の処理レベルで用いる。これらの架橋剤のそれぞれは、別々に、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を溶媒として用い、４％ＤＡＣｍ（ジアセトンアクリルアミド）と混合し、ポリマー混合物を形成する。

図２は、表面修飾された３つの内の１つと、それぞれ二連で、直径２５ｍｍの膜デバイスについての低下曲線を表す。これらは、（ａ）４％ＤＡＣｍ−１％ ＭＢＡｍ；（ｂ）４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡ５７５；および（ｃ）１％ＨＰＣである。

下記の表ＩＩは、流束低下、Ｖ７０、Ｖ９０および１０Ｘ透過率、を測定するために使用された一つのそのような実験の結果を集めてあり、１％ＨＰＣの対照膜に比べて４％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍおよび４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡで修飾したＰＥＳ膜の容量と透過率が表されている、図３にも示されている。化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地が、供給流として使用された。

観察されるように、４％ＤＡＣｍ−１％ＭＢＡｍ膜は、１％ＨＰＣ膜に比べてより低いスループット性能を示す。しかしながら、４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡ５７５膜は、１％ＨＰＣ膜に比べてより高いスループット性能を示す。

したがって、非アクリルアミドものを基礎とした架橋性モノマー（例えば、ＰＥＧＤＡ）は、ＤＡＣｍと共に用いるのに、アクリルアミドを基礎とした架橋性モノマー（例えば、ＭＢＡｍ）に比べてずっと良い選択である。

［実施例４］
架橋されたコポリマーで修飾された膜のスループット性能の比較試験

表面修飾について、スループット性能について前述した方法と同一の様式でさらに試験を行う。ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマーの化学を用いて実行された最初の容量試験から以下の結果が得られる。

ＤＡＣｍホモポリマーを用いる前述の実施例で説明したように、以下の表ＩＩＩに挙げられるすべての量は、重複した試料については平均値を示した以外は、同じ意味と単位を有している。

表ＩＩＩは、ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマー膜表面修飾化学を用いる最初の比較試験からの重複した容量測定に対して、平均容量（［Ｌ／ｍ２］単位でＶ７５およびＶ９０、ならびに［Ｌ／ｍ２ｈｐｓｉ］単位で透過率）を表す。

すべてのデバイスは、同一の膜材料（２０ｎｍの公称孔径サイズ等級を有する高度に非対称性の修飾されていない疎水性ＰＥＳウイルス保持膜）から出発して構築される。それぞれのフィルターデバイスは、種々の表面修飾されたそれぞれの膜の単層（１Ｌ−）を収容するように構築される。それぞれの膜試料に適用される表面修飾化学については以下に記述する。

ＨＰＣは、膜湿潤助剤として用いられた１０％のへキシレングリコールとともに１．００重量％のヒドロキシプロピルセルロースの水溶液を含み、浸漬により適用される吸着したポリマー予備処理である。ＬＢ２０は、その場での電子ビーム硬化により適用された自己架橋する高度にエトキシレート化したトリアクリレートモノマーである。ＤＡＣｍは、単官能性のビニルモノマーであるジアセトンアクリルアミドを表し、ＭＢＡｍは、ＤＡＣｍとコポリマーを形成するジアクリルアミドの架橋剤である、メチレンビスアクリルアミドを表す。ＨＥＡは、単官能性のビニルモノマーである、ヒドロキシエチルアクリレートを表す。ＴＥＧＤＡは、２官能性のまたは架橋性モノマーである、テトラエチレングリコールジアクリレートを表す。ＰＥＧＤＡ５７５も同様であり、数平均分子量が５７５のポリエチレングリコールジアクリレートである。ＤＡＣｍ−ＭＢＡｍは、ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５と同様に、電子ビーム硬化により適用されるコポリマー表面修飾である。ＬＢ２０、ＨＥＡ、およびＴＥＧＤＡは、三元重合体表面修飾を形成し、電子ビーム硬化工程により膜に適用される。

図４は、上述したように、試験された種々の膜デバイスの平均容量と透過率を表す棒グラフである。図４で見られるように、本実施例で試験された他の修飾に比べてＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマーで修飾された膜デバイスについて、スループット性能において著しい改善が観察される。

図５は、ここで試験されたデバイスのそれぞれについて体積対時間の曲線を表す。図５で示されるように、本実施例で試験された他の修飾に比べてＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマーで修飾された膜デバイスにおいて、ずっと高い量の濾液が集められた。

更なる実験において、化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地、ＭＸ−２０１（またはＢｅｔａ−ＣＨＯ）が供給流として使用される。Ｖ−Ｐｒｏ膜（１％のヒドロキシプロピルセルロースで修飾されたＰＨＨＣ膜）を含むデバイスが対照として使用される。３７５ＬＢ２０とラベルを付けたデバイスは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ中で作製された、３．７５％ＬＢ２０（２０モルのエトキシレート化トリメチオールロールプロパントリアクリレート）モノマー混合物で作製され、膜上にｅ−ビームで硬化される。２００Ｌ、１００Ｈおよび０７５Ｔとラベルを付けたデバイスは、すべてＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した、それぞれ２％ＬＢ２０、１％ＨＥＡ、および０．７５％ＴＥＧＤＡである。４ＤＡＣｍ１ＰＥＧＤＡとラベルを付けたデバイスは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中に４％ＤＡＣｍおよび１％ＰＥＧＤＡ５７５を含む。すべての化学は、２５ＫＧｙのｅ−ビーム投与量で適用される。

試験された他の候補の化学に比べて４ＤＡＣｍ１ＰＥＧＤＡデバイスのスループット性能において非常に著しい増加が観測される。

更なる実験において、上述したように、同一の膜デバイス上のＰＥＧＤＡ５７５が、（上記と同じｅ−ビーム工程によって調製された）２％から５％の濃度範囲においてそれ自身の上で試験され、スループット性能は、４ＤＡＣｍ１ＰＥＧＤＡデバイスで観測されたものと比較し得るものである。

続いて、上記したのと同じ化学的に規定された細胞培養培地が、５％ＰＥＧＤＡ５７５を含むデバイスに用いられる。改善されたスループット性能の優位性が再び確認される。

なお更なる実験において、ＤＡＣｍおよびＰＥＧＤＡモノマーを異なる濃度で含む組成物が、これらのモノマーで修飾された膜のスループット性能について評価される。次の組成物が調製され試験される。０．７５％、１．２５％、１．５０％、２．００％および２．５０％のＰＥＧＤＡと４％ＤＡＣｍとを含む組成物が調製される。さらに、３％ＰＥＧＤＡ５７５と３％ＤＡＣｍとを含む組成物が調製される。

図６は、試験された膜デバイスのそれぞれから得られた流束低下曲線を示す。図６に表されているように、ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ５７５コポリマーで修飾された膜デバイスは、より遅い流束低下の点で、試験された他の修飾に対してスループット性能の優位性を有する。

［実施例５］
ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡコポリマーで修飾された膜の熱的安定性の評価
さらに、熱的安定性は殺菌に対して望ましいので、ＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡコポリマーで修飾した膜が、熱的安定性についてさらに評価される。

熱的安定性は、修飾された膜を、湿潤オートクレーブ条件（１３４℃で１時間サイクル）、乾燥熱条件（１３５℃で１時間サイクル）、およびその場に置いてのスチーム（ＳＩＰ）条件（その場に置いての生蒸気１／２時間のサイクル）に掛けることにより取り組まれる。

オートクレーブ処理は、物体（この場合、膜またはデバイス）を、物体を殺菌するために必要な時間を超えておよびそれ以上の時間の間、常圧よりも上で、液体の水が水蒸気と平衡して存在する条件下に、水とともに静的な閉じた空間の加熱サイクルに掛けることを含む。

乾燥熱処理は、用語が示すように、デバイスの組み立ての間に出会う条件が、物体の性能を損なうかどうかを決めるために、物体（膜またはデバイス）を、（この場合）対流オーブン中で記載されたオートクレーブ温度に等しい、あるあらかじめ決められた温度の乾燥空気に掛けることを含む。

その場に置いてのスチーム処理は、物体（膜またはデバイス）を、スチームが（水の沸点以上で特定の温度と圧力とにおいて）凝縮せずおよびスチームにさらされるすべての表面を殺菌するように、膜または膜を収容しているデバイスまたはそのような類似の（フィルター）要素を通してスチームが移送される、ダイナミックな条件下で、生蒸気に掛けることを含む。

それぞれの場合に、膜の容量は、上述したように、熱処理した膜を用いて、ミクロスケールのデバイスを組み立てること、スループット性能を測定すること、および熱処理していないデバイスから得られたものを対照として、スループット性能の結果を比較することにより試験される。

実験の最初の組み合わせにおいては、膜は湿潤オートクレーブ条件にさらされる。

ＩＬ−１％ＨＰＣ対照以外の全てのデバイスは、４．００％のジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）を含むモノマー混合物を用いて組み立てられる。ＰＥＧＤＡ５７５のレベルを変化させ、１．００％、１．２５％および１．５０％を含む。あるデバイスは、２層のフィルター要素を用い２Ｌと表記される。

表ＩＶは、続いて熱処理なし、または続いてデバイスのオートクレーブ処理、または続いてデバイス組み立ての前に膜のオートクレーブ処理のいずれかを行い、種々の膜のＶ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率で測定した膜スループット性能を表す。

そのような代表的な実験の結果は、続いて熱処理なし（ＡＭ）、または続いてデバイスのオートクレーブ処理（ＡＣＤ）、または続いてデバイス組み立ての前に膜のオートクレーブ処理（ＡＣＭ）のいずれかの後、Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率を用いて測定した種々の膜の膜スループット性能を表す図７に表されている。性能の結果は、膜デバイスの透過率（マイクロスケールのデバイス（有効濾過面積（ＥＦＡ）３．１ｃｍ^２）で詰まりのない流体（水）の定常流で）、およびｐＨ４で、２ｍＳ／ｃｍの抵抗でアセテート緩衝液中、４ｇ／Ｌのヒト血清由来ＩｇＧを用いて測定した、Ｖ７５およびＶ９０で測定された容量を含む。図７では、ＩＬおよび２Ｌは、それぞれ単層および２層の膜デバイスを表し、ＤＰ４１００は、４．００％ＤＡＣｍと１．００％ＰＥＧＤＡを表し；ＤＰ４１２５は、４．００％ＤＡＣｍと１．２５％ＰＥＧＤＡを表し；およびＤＰ４１５０は、４．００％ＤＡＣｍと１．５０％ＰＥＧＤＡを表す。

観察されるように、たいていの場合、膜を含むデバイスがオートクレーブにかけられる、またはデバイスに組み立てられる前に膜がオートクレーブ条件に掛けられるかのいずれかで、オートクレーブ条件に掛けられたすべての膜デバイスについて、膜の性能は、ＰＥＧＤＡのレベルが増加するにつれて改善されるだけでなく、対照の１Ｌ−１％ＨＰＣ膜よりも改善しているように見える。

他の実験では、類似のしかし完全には同一ではない一連の膜デバイスが、乾燥熱サイクル（１３５℃で１時間）にさらされる。この実験では、すべての膜は単層デバイスに組み立てられる。実験用の膜デバイスは、４．００％のジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）および１％のＰＥＧＤＡ５７５（ＤＰ４１００）を含むモノマー混合物、または４％ＤＡＣｍおよび２％ＰＥＧＤＡ５７５（ＤＰ４２００）を含むモノマー混合物を用いて修飾された膜を用いて組み立てられる。対照デバイス（２）は、１％のヒドロキシプロピルセルロース（１％ＨＰＣ）の吸着した被覆で出発膜を修飾して、ＤＡＣｍおよびＰＥＧＤＡで修飾された膜を収容するデバイスと同一のデバイスに組み立てられて作製される。修飾される膜は、Ｐ１およびＰ２と表示される２つの異なる源からのＰＥＳ膜である。

表Ｖは、そのような実験の一つの結果を表し、図８にも挙げられている。膜スループット性能が、すでに述べたように、Ｖ７５、Ｖ９０および１０Ｘ透過率の値を用いて、測定される。観察されるように、修飾された膜を含むすべての実験のデバイスの容量（Ｖ７５およびＶ９０）は、膜の修飾処方（ＤＰ４１００、ＤＰ４２００）の間の差異に関係なく、および膜が乾燥熱処理に掛けられるか掛けられないかに関係なく、非常に似ているが、しかしながら、修飾された膜の容量は一般に、対照の膜（１Ｌ−１％ＨＰＣ Ｐ１および１Ｌ−１％ＨＰＣ Ｐ２）のそれよりもより高い。しかし、興味深いことだが、オートクレーブ処理で見られるように、ＰＥＧＤＡのレベルが増加するにつれて得られた性能の改善は、乾燥熱処理を用いては観察されない。

表Ｖは、修飾されたままの膜試料（ＡＭ）で組み立てられたデバイスを用い、および追加の乾燥熱処理（１３５℃で１時間）に掛けられた同一のデバイスと比較して、比較スループット実験からの容量および透過率の結果を表す。

さらに他の実験において、種々の膜デバイスが、標準のその場に置いてのスチーム工程がスループット性能（水透過率、培地容量、保持）にどのように影響するかを測定するために、その場に置いてのスチーム工程に掛けられる。

本明細書に記載の化学が、２つの異なるＰＥＳ膜源からの膜（膜Ｐ１およびＰ２）に適用される。調製された膜の試料の半分の片側をＳＩＰ条件に掛ける。すべての膜試料が、マイクロスケールのデバイスに組み立てられ、および共にスループット性能について（透過率および容量）、およびまたウイルス様の粒子の保持に関して試験される。

表ＶＩは、透過率、供給流スループット、容量およびバクテリオファージの保持を種々の膜について測定した実験の結果を表す。供給流は、１ｘ１０^８ｐｆｕ／μＬのｐｈｉ−Ｘ１７４バクテリオファージを混合したＭｉｌｌｉ−Ｑ水中の実験用ＭＸ−２０１（Ｂｅｔａ−ＣＨＯ）細胞培養培地を含む。結果は、単層膜の直径２５ｍｍミクロスケールデバイス（３．１ｃｍ^２ＥＦＡ）について測定される。それぞれのデバイスは、どの熱処理も受けていない修飾されたままの（ＡＭ）標記のもの、またはその場に置けるスチーム処理（ＳＩＰ）標記のもののどちらかの異なる膜を含む。すべての膜は、組成はＰＥＳであり、Ｐ１またはＰ２のどちらかで表示され同定される２つの異なるポリマー源の一つから製造される。それぞれの膜は、ＡまたはＢと同定される重複物で二連で試験される。１％ＨＰＣと同定される膜は、この試験およびためにはＳＩＰ処理には掛けられない。これらは対照として用いられ、デバイス性能において有用性のレベルを示すのに役立つ。これらの膜デバイスは１％ＨＰＣで修飾されたＰ１ポリマーから組み立てられる。ＤＰ４１００として同定される膜は、４％ＤＡＣｍ−１％ＰＥＧＤＡの本発明の表面修飾の実施態様を用いて修飾され、このことは、Ｐ１ポリマーおよびＰ２ポリマーの膜の両方に適用される。

透過率は、１０から１５分の間隔で詰まりのない緩衝液（この場合はＭｉｌｌｉ−Ｑ水）をデバイスを通過させ、集められた緩衝液の量を記録して測定する。次いで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した細胞培養培地を含む詰まりのある流れをデバイスを通して流す。培地のスループット（集められた濾液の質量または体積）を実験の開始から１２０分で測定する。膜容量は、最小面積をＡｍｉｎと表して、平方メートル（ｍ^２）の単位で測定される。最小面積は、任意に定義できるが、ある与えられた時間間隔内で、ある与えられた量の濾液を集めるのに必要な膜の面積として定義される。今回は、最小面積は、４時間内で供給流の１０００リットルを集めるまたは濾過するのに必要なフィルター面積として定義され、それぞれのデバイスに対して記録された流束低下曲線（生の実験体積対時間のデータ）から計算される。

保持は、ｐｈｉ−Ｘ１７４バクテリオファージ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｉ１０４１）を、２−５ｘ１０^７ｐｆｕ／μＬ（プラーク形成単位／μＬ）の力価で供給流中に混合して測定される。スループット実験を始める前に供給流の容器から１ｍｌの供給流試料を採っておく。いったん実験が始まると、最初の１ｍｌの保持試料が約１分後にそれぞれのデバイスの出口において確保される。実験を終える前に、最終の１ｍｌの保持試料がそれぞれのデバイスに対して確保される。実験が終わった時、供給流容器において供給流を再び試料採集する。供給流容器における試料は、力価を測定するために用い、このようにして、試験の出発時および終了時のファージの生存率の測定に用いる。試験中に最初と最後の点でデバイスの出口において採取された濾液試料は、最初の生存能力のあるバクテリオファージの力価および最終の生存能力のあるバクテリオファージの力価の間の数的な差を測定するのに用いる。供給流容器試料に対してのデバイス出口からの最初と最後の力価の間のこの差は、それぞれのデバイスについてのｌｏｇ減少値（ＬＲＶ）を測定するのに用いる。一般に、ＬＲＶは、いかにウイルス除去が効率的であるかの尺度である。ｌｏｇ値の各１単位は、ウイルスの力価が桁のオーダーで（１０Ｘ）減少していることを表す。それゆえ、ＬＲＶの値が５というのは、濾液のウイルスの濃度が、供給流のウイルス濃度の１／１０００００であることを意味する。最初と最後の保持結果は、それぞれ図９ａおよび図９ｂに表されている。図９ａは、最初のＬＲＶ値、それぞれのデバイスに対して１つを表す。図９ｂは、最後のＬＲＶ値、それぞれのデバイスに対して１つを表す。特に、ＳＩＰ処置の後には、ＬＲＶにおける著しい変化は起こらず、この実験で試験されたデバイスのいずれについても最初と最後のＬＲＶ測定の間に、ＬＲＶにおける著しい変化は起こらない。しかしながら、著しい容量の改善が、１％ＨＰＣのデバイスに比べてすべてのＤＰ４１００デバイスについて観測される。

［実施例６］
ＤＡＣｍを含まない膜のスループット性能の評価
代表的な実験において、ＰＥＧＤＡのみで（２から５％）修飾された膜が、ＤＡＣｍが所望のスループット性能を達成するために必要な成分であるかどうかを調べるために、作製される。一連の膜が、１％刻みで水中での重量％で２から５％までの濃度範囲でＰＥＧＤＡ５７５を用いて修飾される。ＰＥＳ膜が基礎となる膜として使用され、１％ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）で修飾された膜を、前述したように、対照として使用する。この膜のシリーズについてのスループット性能の試験は、プロトタイプの化学的に規定された細胞培養培地（Ｂｅｔａ−ＣＨＯ、またＭＸ−２０１とも呼ばれるが）を用いて行われる。種々の膜修飾が、（２％、３％、４％、および５％と）ＰＥＧＤＡ処理のレベルを増加させて膜表面の上に増えていくレベルのポリマーを載せるために、ＰＥＧＤＡ５７５溶液−湿らせたＰＥＳ基礎膜の電子ビームにより開始されるインサイチュ重合を用いて行われる。それぞれの修飾レベルの平均容量および平均透過率（二連で測定して）が、図１０中に挙げられる。

図１０に示すように、容量は、ＰＥＧＤＡ処理のレベルの濃度が増加するにつれて増加するが、透過率は、逆に減少することが観察される。

全体としてのスループット性能に関しては、すべてのＰＥＧＤＡで修飾した膜は、かなりの倍率で（Ｖ７５：２．８６から４．７２まで；Ｖ９０：３．９６から６．１０まで）対照を凌いでいる。性能の結果は、表ＩＩＩに挙げられたものと比較される。そこでは、４％ＤＡＣｍ−１％ ＰＥＧＤＡ５７５修飾は、１％ＨＰＣ修飾の膜に対して、Ｖ７５で６．７８およびＶ９０で４．２９の倍率で性能の改善を得ている。さらに、（ＨＥＡ−ＴＥＧＤＡ、表ＩＩＩにも挙げたが）処方は、対照膜に対して、Ｖ７５で２．６５、Ｖ９０で１．６９の倍率で性能の改善が見られた。

他の代表的な実験では、２％、３％、４％、および５％のＰＥＧＤＡ５７５の処理レベルが用意され、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ化学的に規定された細胞培養培地で試験される。ここでも、１％ＨＰＣの対照膜に比べてスループット性能が改善していることが観察される。しかしながら、性能は、ＰＥＧＤＡ処理のレベルの増加に連れて継続して低下する。このことは図１１に挙げられる。図１１では、容量をＡｍｉｎで測定しており、それは、最小膜面積として（ｍ^２の単位で）定義され、４時間で培地１０００リットルを処理するのに必要な面積である。特に、実験の最初の１５０分で集められた濾液の量に対するＡｍｉｎとの逆の関係が観察される。それゆえ、より低いＡｍｉｎはより高い容量に対応している。２つの異なる培地流に関するこれらの膜の見かけ上逆の性能の傾向のために、膜性能が、多重の供給流を用いてさらに評価された。ＭＸ−２０１培地を用いる膜性能の結果は、図１０に示されているが、ＰＥＧＤＡ処置のレベルが増加するにつれて改善しているが、一方で、図１１に示されている、ＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯを用いる膜性能の結果は、ＰＥＧＤＡ処置のレベルの同じ増加につれて低下する。ＭＸ−２０１培地は、ＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ培地よりもより汚染を起こしやすいことが知られている。結果として、ＭＸ−２０１培地を用いるデバイス性能は、透過率の点で影響を受けにくく、培地による汚染の点でより受けやすい。Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ培地は汚染が少ないが、それゆえにデバイス性能は培地による汚染の効果よりも、透過率においてより多く依存している。

［実施例７］
多重の供給流を使用してＤＡＣｍを用いない膜およびＤＡＣｍ−ＰＥＧＤＡ膜の性能評価
ＤＡＣｍを用いない膜の魅力的な性能の傾向があるために、さらに別の代表的な実験において、ＰＥＧＤＡのみ、またはＤＡＣｍありで、およびＰＥＧＤＡで修飾された一連の膜について、スループット性能について調べる。一つの対照は、１％ＨＰＣ表面修飾の疎水性のＰＥＳウイルス膜からなり、第２の対照膜は、４％ＤＡＣｍおよび１％ＰＥＧＤＡ５７５で修飾したＰＥＳウイルス膜からなる。第２の対照は、この実験における他の膜と比較して異なる疎水性膜のロットを用いて作製される。残りの３つの膜は、１％ＰＥＧＤＡでの修飾、１％ＰＥＧＤＡで、および１％ＤＡＣｍでの修飾、ならびに最後は１％ＰＥＧＤＡ５７５および４％ＤＡＣｍでの修飾である。この膜のセットを用いて、１つは、以下の供給流、１）市販の化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ；２）市販の化学的に規定されたＣＨＯ細胞培養培地、ＥＭＤ Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ ２００；および３）実験的に用意した供給流、２ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃを混合したＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、のそれぞれを用いて３セットのデータを求めた。

図１２は、種々の膜のスループット性能を比較して示す。表面修飾は、（図中、左から右へ）１％ ＨＰＣで修飾した対照膜；４％ＤＡＣｍおよび１％ＰＥＧＤＡ５７５で修飾した膜；１％ＰＥＧＤＡ５７５のみで修飾した膜；１％ＤＡＣｍおよび１％ＰＥＧＤＡ５７５で修飾した膜；ならびに４％ＤＡＣｍおよび１％ＰＥＧＤＡ５７５で修飾した膜を含む。汚染の少ない培地と考えられているＣＤ Ｏｐｔｉ−ＣＨＯ培地で、ＤＡＣｍ表面修飾の少ないおよびＤＡＣｍ修飾のない膜は比較的良好に働き、図１１に示した２％ＰＥＧＤＡ膜と非常によく似ている。高度に汚染性のＣｅｌｌｖｅｎｔｏ−２００培地の場合には、より高レベルのＤＡＣｍ表面修飾が良好に働く。このことは、より高レベルのＤＡＣｍ表面修飾が、試験された最も広い範囲の供給流のセットに対して改善されたスループット性能を提供することを示している。

本明細書は、本明細書中に引用された参照資料、これらは参照により本明細書に組み込まれるが、の教示に照らしてもっとも完全に理解される。本明細書に記載の実施形態は、実施態様の例を供給するが範囲を制限するものと考えられるべきではない。当業者ならば、多くの他の実施態様が本開示により包含されることを容易に理解する。すべての出版物および参照資料は全体として参照により組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾するまたは不整合である範囲に対しては、本明細書は、そのような材料に優先する。本明細書に記載の参照資料の引用のいずれも、そのような参照資料が既存の技術であるということを認めるものではない。

別に記載しない限り、本明細書において使用された、成分の量、細胞培養培地、処理条件等を表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、逆に示されているのでない限り、数字のパラメーターは、近似値であり、本明細書に記載の実施形態により得ようとしている所望の特質に依存して変化し得る。別に記載しない限り、一連の要素に先だつ用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を参照するものと理解されるべきである。当業者ならば、ただの通常の実験にすぎないものを使用して、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識または確かめ得る。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図している。

当業者には明白であると考えるが、本明細書に記載の実施形態の多くの修飾および変形がその精神および範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載の特定の実施形態は、例としてのみ与えられたのであって、いかなる意味でも制限的であることを意図してはいない。本明細書および実施例は、以下の特許請求の範囲により示される開示の範囲および精神をもって、例としてであると考えられるべきものであることを意図している。

Claims (19)

1. ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで修飾された表面を有する多孔性膜であって、非アクリルアミド架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）である、多孔性膜。
2. ポリマーが、エネルギー源を用いて多孔性膜の表面上に直接被覆された、請求項１に記載の膜。
3. エネルギー源が、熱、電子ビーム、紫外光およびγ線からなる群から選択される、請求項１に記載の膜。
4. 非対称性膜である、請求項１に記載の多孔性膜。
5. 非対称性膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜である、請求項４に記載の多孔性膜。
6. 請求項１に記載の多孔性膜を通して、化学的に規定された細胞培地を濾過することを含む、化学的に規定された細胞培地からウイルス性夾雑物を除去する方法。
7. 下記の構造を含むポリマーで修飾された、請求項４に記載の多孔性非対称性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜
   

   

   
   ［式中、
   Ｍ１は、中性のジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）モノマー：Ｈ_２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３であり、
   Ｍ２は、中性のポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）モノマー：Ｈ_２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ_２であり、
   Ｍ１’は、ラジカル化されたジアセトンアクリルアミド（ＤＡＣｍ）モノマー：_＊Ｈ_２Ｃ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３であり、
   Ｍ２’は、ラジカル化されたポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）モノマー：_＊Ｈ_２Ｃ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ−ＣＨ_２＊であり、
   ｎ＝６、７、８、９、１０、１１であり、
   記号「^＊」は、アルケニルラジカルを指す。］。
8. 化学的に規定された細胞培地から、１種以上のウイルス性夾雑物を除去する方法であって、
   ａ）化学的に規定された細胞培地を用意するステップ：および
   ｂ）細胞培養培地をバイオリアクター中へ移動する前にまたは間に、請求項１に記載の多孔性膜を通して化学的に規定された細胞培養培地を濾過するステップ
   を含み、
   バイオリアクターの内部の化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上のウイルス性夾雑物のレベルが、膜を通して培地を濾過する前のレベルよりも低い、方法。
9. 膜が、デバイスの中に組み込まれている、請求項８に記載の方法。
10. デバイスが、ディスク、折りたたみカートリッジ、螺旋状に巻かれたカートリッジおよび多数の板状フラットシートから選択される形態である、請求項９に記載の方法。
11. ステップ（ｂ）の後の１種以上のウイルス性夾雑物のレベルが、少なくとも１Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）または少なくとも４Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）または少なくとも６Ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）だけ減少している、請求項８に記載の方法。
12. 濾過が、２４時間未満の期間実行される、請求項６に記載の方法。
13. 濾過が、２４時間未満の期間実行される、請求項８に記載の方法。
14. 濾過が、４から８までの範囲のｐＨで実行される、請求項６に記載の方法。
15. 濾過が、４から８までの範囲のｐＨで実行される、請求項８に記載の方法。
16. 濾過が、２０℃から２５℃までの範囲の温度で実行される、請求項６に記載の方法。
17. 濾過が、２０℃から２５℃までの範囲の温度で実行される、請求項８に記載の方法。
18. 濾過の間の、化学的に規定された細胞培養培地中の１種以上の成分によるウイルス保持性膜の汚染を減少させる方法であって、
    ａ）ウイルス保持性膜を用意するステップ、および
    ｂ）ランダムに配列され、架橋されたジアセトンアクリルアミドモノマーと１種以上の非アクリルアミド架橋性モノマーとを含むポリマーで膜を修飾するステップ、ここで、非アクリルアミド架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレートである、
    を含み、
    化学的に規定された細胞培養培地の中の１種以上の成分による、修飾された膜の汚染が、修飾されていない膜に比べて減少している、方法。
19. ウイルス保持性膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、セルロース系膜またはナイロン膜である、請求項１８に記載の方法。

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