KR101944743B1 - 항파울링 코팅을 갖는 미세다공성 막에 의해 세포 배양 배지로부터 미생물의 제거 - Google Patents
항파울링 코팅을 갖는 미세다공성 막에 의해 세포 배양 배지로부터 미생물의 제거 Download PDFInfo
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Abstract
화학적으로 정의된 세포 배양 배지 내의 하나 이상의 성분에 의한 파울링에 견디거나 또는 파울링 감소를 나타내는 조성의 코팅을 갖는 미세다공성 막을 사용하는 것에 의해 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 바이러스성 오염물을 제거하기 위한 조성 및 방법이 제공된다. 상기 코팅은 디아세톤 아크릴아미드(DACm) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA)를 포함하는 단량체 용액으로부터 형성된 공중합체를 포함한다.
Description
본원에 개시된 실시형태는 세포 배양 배지로부터 바이러스를 비롯한 미생물을 제거하기 위한 조성 및 방법에 관한 것이다.
단백질 제조를 위한 통상의 방법은 예를 들어 관심 단백질 (예를 들어, 단일클론 항체)을 제조하도록 재조합 처리된(recombinantly engineered) 포유동물 또는 세균 세포주를, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 사용하여 바이오리액터(bioreactor)에서 배양하는 세포 배양 방법을 전형적으로 포함한다. 세균, 진균, 미코플라스마(mycoplasma) 및 바이러스와 같은 미생물에 의한 바이오리액터 오염의 감소는 특히, 관심 단백질이 치료 용도를 위한 것일 때 바이오약학 산업에서 중요한 고려사항이다.
미생물 중에서, 세균, 진균 및 미코플라스마는 세포 배양 배지를 적절한 필터를 통하여 여과하는 것에 의해 전형적으로 제거될 수 있다. 예를 들어, 0.2 ㎛ 명목상 기공 크기 등급(nominal pore size rating)의 미세여과막(microfiltration membrane)은 브레벤두모나스 디미누타(Brevend㎛onas diminuta) 속(genus)의 세균을 제거하는데 적절한 것으로 간주된다. 0.1 ㎛ 명목상 기공 크기 등급의 막은 주로 아코레플라스마 라이드라위(Acholeplasma laidlawii) 속의 미코플라스마를 제거하는데 적합한 것으로 간주된다. 참조, 예를 들어, Folmsbee and Moussorakis, BioProcess International, Vol. 10, No. 5, 2012, pp. 60-62 (May 2012). 또한, 20 nm 명목상 기공 크기 등급의 막은 가장 작은 바이러스를 대표하는 파르보바이러스(parvorirus) 또는 파로바이러스-유사(parovirus-like) 입자에서 최소 4 로그 감소에 영향을 주는데 적합한 것으로 간주된다.
바이러스 제거를 위한 기공 크기 등급을 갖는 막을 생성하는 것은 도전적인 것으로 간주되는데, 이는 바이러스를 보유하기 위해 기공 크기 등급을 감소시키는 것은 막 기공의 일부 또는 완전한 수축을 초래하여, 결국에는 막 투과성을 바람직하지 않은 수준으로까지 현저히 감소시키게 되기 때문이다. 그런데, 상류 처리(upstream process)에서 바이러스를 제거하도록 특별히 설계되고 효과적인 상업적으로 유용한 막 필터는 현재 존재하지 않는다.
세포 배양 단계의 전형적으로 사용되는 하류(dowmnstream)인 바이러스 배리어(barrier) 필터가 바이러스 상류 제거에 효과적이지 않은 이유 중의 하나는 상류 및 하류 조성 사이의 현저한 차이에 기인한다. 예를 들어, 상류 처리의 경우에서, 세포 배양 배지 중에는세포 또는 발현된 단백질이 존재하지 않는다. 그러나, 영양분, 지질, 아미노산 및 기타 성분(예를 들어, 유체역학적 세포 보호를 제공하는 Pluronic F68)은 존재하며, 이들 모두는 세포 성장 및 생존에 필수적인 것이다. 대조적으로, 하류 처리의 경우, 세포 배양 배지는 세포, 세포 파편(cell debris), 숙주 세포 단백질뿐만 아니라 발현된 단백질을 함유한다. 그러므로, 하류 처리의 경우에서, 세포 배양 배지는 바이러스 여과 단계에 처리되기 전에 바람직하지 않은 바이러스 필터 오염물(poulant)을 제거하기 위하여 다수의 정제 단계에 흔히 처리된다.
현저하게는, 예를 들어, 상류 바이러스 제거의 경우에 화학적으로 정의된 세포 배양 배지 대 하류 바이러스 제거의 경우에 발현된 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양 배지와 같이 정제를 필요로 하는 조성에서의 차이로 인하여, 바이러스 제거를 위해 전형적으로 사용된 하류인 막 필터는 상류용으로 사용될 때 동일 목적에 대해 잘 작용하지 않는 경향이 있다. 참조, 예를 들어, Zydney et al., Journal of Membrane Science, 297: 16-50 (2007).
화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 여과하는 특별히 사용된 상류일 수 있는 바이러스 배리어 필터를 개발하려는 시도가 행해지고 있다. 참조, 예를 들어, 다양한 필터를 사용하여 얻어진 바이러스 보유 결과를 논의하는 Biotechnol Prog., 16:425-434 (2000). 상기 논문에서 밝혀진 바와 같이, 재생된 셀룰로오스 필터는 시험된 필터의 최고 플럭스(flux)를 나타내었고 또 높은 바이러스 보유를 나타내었다; 그러나, 이러한 막은 제자리에서 스팀처리(steaming in place)하는 것에 의해 또는 감마 방사선(radiation) 처리, 현재 이 산업에서 전형적으로 적용되는 멸균 방법에 의해 멸균하기에는 적합하지 않다. 상기 논문은 PES 필터를 기재하였으나, 이 필터는 낮은 플럭스로 인하여 상류 용도의 바이러스 배리어 필터로 사용하기에는 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 여겨진다.
또한, 미국 특허 공개번호 20130344535호는 24 시간보다 더 긴 여과 시간을 이용하는 것에 의해 또 특정 기공율의 필터를 이용하는 것에 의해 바이러스 오염물을 제거하는 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 여과를 논의한다.
요약
본원에 개시된 실시형태는 관심 단백질을 발현하는 세포를 배양하기 위해 사용된 화학적으로 정의된 배지로부터 미생물, 특히 바이러스를 제거하기 위한 신규 조성을 제공한다. 따라서, 이러한 조성은 세포 배양 배지를 세포, 예를 들어, 재조합 관심 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 배양하기 위한 바이오리액터로 전송하는 단계 이전에 사용될 수 있다.
본원 발명에 기재된 조성은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지가 막을 통하여 여과될 때, 상기 배지 중의 하나 이상의 성분에 의한 파울링(fouling) 감소를 나타내는 막을 초래하는 막의 표면 변형을 기본으로 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성은 무작위로(randomly) 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 표면을 갖는 다공성 막에 관한 것이다.
다양한 실시형태에서, 무작위로 배열되고 가교된 아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체는 에너지 공급원을 사용하여 다공성 막의 표면에 직접적으로 코팅된다. 예시적 에너지 공급원은 비제한적으로, 열, 전자 빔, 자외선 및 감마 방사선(gamma radiation)을 포함한다.
예시적 비-아크릴아미드 가교성 단량체는 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (PEGDA), 글리세롤 디아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 에톡시화 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트, 테트라에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 및 테트라에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 비-아크릴아미드 가교성 단량체는 PEGDA 이다.
일부 실시형태에서, 상기 다공성 막은 예를 들어, 폴리에테르술폰 (PES) 막과 같은 비대칭 막이다.
예를 들어, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 변형된 막을 통하여 여과하는 것에 의해, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 바이러스 오염물을 제거하기 위한 상기 기재된 변형된 다공성 막을 사용하는 방법이 본원발명에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, 하기 구조를 포함하는 중합체에 의해 변형된 다공성 비대칭 PES 막이 제공된다:
식 중에서,
M1은 중성 DACm 단량체: H2C = CH - C(O) - NH - C(CH3)2 - CH2 - C(O) - CH3 이고;
M2는 중성 PEGDA 단량체: H2C = CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O)- CH = CH2이며;
M1’은 라디칼화된 DACm 단량체: *H2C - CH - C(O) - NH - C(CH3)2 - CH2 - C(O) - CH3이고;
M2’는 라디칼화된 PEGDA 단량체: *H2C - CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O) - CH - CH2* 이며;
P는 랜덤 중합체 네트워크이고; n = 6, 7, 8, 9, 10, 11 이며; 또
기호 "*"는 알켄일 라디칼임.
일부 실시형태에서, 하기 구조를 포함하는 중합체에 의해 변형된 다공성 비대칭 PES 막이 제공된다:
식 중에서,
M1 및 M2는 중성 PEGDA 단량체: H2C = CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O)- CH = CH2 이고;
M1’및 M2’는 라디칼화된 PEGDA 단량체: *H2C - CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O) - CH - CH2* 이며;
P는 랜덤(random) 중합체 네트워크이고;
n = 6, 7, 8, 9, 10, 11이며; 또
기호 "*"는 알켄일 라디칼임.
일부 실시형태에서, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 하나 이상의 바이러스성 오염물을 제거하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 제공하는 단계; 및 (b) 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 바이오리액터로 전달하기 전 또는 전달하는 동안 다공성 막을 통하여 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 여과하는 단계를 포함하며, 상기 막은 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 표면을 갖고, 상기 바이오리액터 내의 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 바이러스성 오염물의 양은 변형된 막을 통하여 배지를 여과하기 전의 양보다 낮다.
일부 실시형태에서, 본원발명에 기재된 변형된 막은 장치에 혼입된다. 예시적 장치 포맷은 비제한적으로, 디스크, 주름형 카트리지, 나선형으로 구부러진 카트리지 및 복수판 평탄 시트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 화학적으로 정의된 세포 배양 배지는 예를 들어, Lonza Power CHO, CD Opti CHO, EMD Millipore Cellvento CHO 100 및 Cellvento CHO 200와 같은 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 세포 배양 배지이다.
화학적으로 정의된 세포 배양 배지 중의 하나 이상의 바이러스성 오염물의 양은 본원발명에 기재된 변형된 막을 사용하여 적어도 1 Log10 감소치(LRV) 또는 적어도 4 Log10 감소치 (LRV) 또는 적어도 6 Log10 감소치 (LRV) 만큼 감소된다.
다양한 실시형태에서, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지는 본원발명에 기재된 변형된 막을 통하여 24 시간 미만 동안 여과된다. 일부 실시형태에서, 상기 여과는 4 내지 8 범위의 pH 및/또는 20℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 실시된다.
화학적으로 정의된 세포 배양 배지 중의 하나 이상의 성분에 의한 바이러스 보유 막의 파울링(fouling)을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 바이러스 보유 막을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 막을 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형하는 단계를 포함하며, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지 중의 하나 이상의 성분에 의한 상기 변형된 막의 파울링은 비변형된 막에 비하여 감소된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 보유 막은 PES 막, PVDF 막, 셀룰로오스성 막 또는 나일론 막을 기본으로 한다.
일부 실시형태에서, 비-아크릴아미드 가교성 단량체는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)이다.
도 1은 CHO 세포 배양 배지를 공급스트림으로서 사용하여 Pluronic F68 노출하거나 노출 없이 디아세톤 아크릴아미드 (DACm) 동종중합체 변형된 PES 막에 대한 처리양(throughput) 성능 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 처음 5개 데이터 세트는 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같은 상이한 퍼센트의 DACm 용액 (2%, 4%, 6%, 8% 및 10%)을 사용하여 변형된 막의 막 성능을 나타내고; 또 그 다음 5개 데이터 세트는 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같은 F68 노출에 의한 동일 막의 막 성능을 도시한다.
도 2는 4% DACm-1% MBAm 변형된 PES 막 또는 4% DACm-1% PEGDA 변형된 PES 막 또는 1% HPC 변형된 PES 막 (대조군)을 함유하는 막 장치에 대한 이중으로 시험된, 플럭스 감쇄 곡선(flux decay curves)을 도시한다. Y-축은 비폐색성(non-plugging) 또는 비-파울링(non-fouling) 공급스트림 (예를 들어, 밀리-Q 워터(Milli-Q-water))에 대해 결정된 플럭스 J0 를 기본으로 하는 퍼센트인 (J/J0) % 퍼센트로 표시된 플럭스 감쇄를 나타내고 또 X-축은 막 (L/m2)의 제곱미터당 수집된 여액의 리터로 표시된 막의 처리량 또는 능력을 나타낸다.
도 3은 4% DACm-1% MBAm, 4% DACm-1% PEGDA 및 1% HPC (대조군) 표면 변형된 PES 막의 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 화학적으로 정의된 세포 배양 배지인 CHO 세포가 공급스트림으로 사용된다. X-축은 막을 나타내고 또 Y-축은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)를 나타낸다.
도 4는 V75, V90 및 10X 투과율로 측정된 바와 같은, 시험된 다양한 막의 평균 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 막 장치는 다양한 표면 변형된 막 각각의 단일층 (1L-)을 포함하도록 구성된다. 1% HPC는 침지에 의해 적용된 흡수된 중합체 예비처리를 갖고 또 막 습윤조제로 사용된 10% 헥실렌 글리콜과 함께 수성 1.00 Wt% 히드록시프로필 셀룰로오스 (HPC) 용액을 포함하는 단일층 막 장치를 지칭하고; 3.75% LB20은 그자리(in situ) 전자 빔 경화에 의해 3.75% 농도로 적용된 자가-가교성의 고-에톡시화 트리아크릴레이트 단량체를 갖는 단일층 막 장치를 지칭하며; 4.00%-DACm-1% MBAm은 4% 디아세톤 아크릴아미드 (DACm), 단일작용성 비닐성(vinylic) 단량체, 및 1% 메틸렌-비스-아크릴아미드 (MBAm), DACm과 공중합체를 형성하는 디아크릴아미드 가교제를 갖는 단일층 막 장치를 지칭하고; 2.00% LB20-1% HEA-0.75% TEGDA는 2% LB20, 1% 히드록시에틸 아크릴레이트 (HEA), 및 0.75% 테트라에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 이작용성 또는 가교성 단량체를 갖는 단링층 막 장치를 지칭하며; 또 4.00%-DACm1%-PEGDA575는 4% DACm 및 575 수평균 MWt 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트인 1% PEGDA575를 갖는 단일 막 장치를 지칭한다.
도 5는 이중으로 시험된 단일층 막 장치 각각에 대한 평균 부피 대 시간 곡선을 나타내는 그래프를 도시한다. 상기 시험된 막 장치는 1% HPC; 3.75% LB20; 4.00% DACm-1%MBAm; 2.00%LB20-1%HEA-0.75% TEGDA; 및 4.00%-DACm1%-PEGDA575이다. X-축은 다양한 막 장치를 통하여 CHO 세포 배양 배지를 통과시킨 후 수집된 여액의 부피(ml)를 나타내고; 또 Y-축은 시간 (분)을 나타낸다.
도 6은 이중으로 시험된 단일층 막 장치 각각으로부터 얻은 플럭스 감쇄 곡선을 나타내는 그래프를 도시한다. 시험된 막 장치는 1%HPC; 3.75%LB20; 4.00%DACm-1%MBAm; 2.00%LB20-1%HEA-0.75% TEGDA; 및 4.00%-DACm1%-PEGDA575 이다. X-축은 막 능력 (L/m2)을 나타내고 또 Y-축은 플럭스 감쇄 (J/J0)를 나타낸다. 도 6에 도시된 바와 같이, DACm-PEGDA575 공중합체 변형된 막 장치는 더 느린 플럭스 감쇄에 의해, 시험된 다른 변형에 비하여 처리량 성능 이점을 가졌다.
도 7은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같이, 열 처리 전 후에 다양한 일련의 막 장치의 성능 및 투과율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 시험된 막 장치는 3개 종류이다: 1L-DP4100 AM (즉, 4.00%-DACm1%-PEGDA); 2L-DP4100 AM1; 및 IL- DP4100 AM2와 같이 열처리 없이 변형된 막(AM); 1L-DP4100 ACD; IL-DP4125 ACD (즉, 4.00%-DACm1.25%-PEGDA) 및 IL-DP4 150 ACD (즉, 4.00%-DACm1.50%-PEGDA)와 같이, 134℃ 장치에서 1시간 동안 오토클레이브처리로 변형된 막(ACD); IL-DP4100 ACM; IL-DP4125 ACM 및 IL-DP4150 ACM과 같은, 134℃에서 1시간 오토클레이브처리에 이어 장치 배열된 변형된 막(ACM). 단일층 1L-1%HPC 막은 대조군으로 사용된다. X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y축은 아세테이트 완충액 중의 4g/L 인간 혈장 유래 IgG 를 사용하여 pH 4 및 2 mS/cm 도전율에서 결정되는 바와 같이, 능력 V75, V90 및 10X 투과율을 나타낸다.
도 8은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같이, 건식 열처리 (DH) 전(AM) 및 후의 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프이다. 시험된 막은 본원에서 P1 및 P2이라 칭하는 2개의 상이한 공급원으로부터의 PES 중합체로부터 캐스팅된다. 시험된 막 장치는 1%HPC P1 및 1% HPC P2 대조군; DP4100 AM P1; DP4200 AM P1 (즉, 4.00%-DACm2.00%-PEGDA); DP4100 AM P2 및 DP4200 AM P2와 같은 열 처리 없이 변형된 막 (AM); DP4100 DH P1, DP4100 DH P2 및 DP4200 DH P2와 같이 건식 가열(DH)에 의해 처리된 변형된 막. X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y 축은 아세테이트 완충액 중의 4g/L 인간 혈장 유래 IgG 를 사용하여 pH 4 및 2 mS/cm 도전율에서 결정되는 바와 같이, 능력 V75, V90 및 10X 투과율을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 실험 개시시(초기 LRV, 9a에 도시) 및 실험 말기 (최종 LRV, 9b에 도시)에 측정된 바와 같은, 제자리 스팀 (SIP: steam-in-place) 처리 전 후의 다양한 막의 로그 보유치 (LRV) Phi-X174를 도시하는 막대 그래드이다. 시험된 막은 P1 및 P2로 칭하는 2개의 상이한 공급원으로부터의 PES 중합체로부터 캐스트되며 이중으로 시험된다(A 및 B라 칭함). 시험된 막 장치는 열처리없는 대조군으로서 1%HPC P1 (AM), 이중으로 사용(1%HPC P1 AM A 및 B라 칭함); DP4100P1 AM A; DP4100 P2 AM A; DP100 P2 AM A; D4 100 P1 AM B; 및 D4100P2 AM B와 같은 열처리 없이 변형된 막(AM) (즉, 4.00%-DACm1.00%-PEGDA); 및 DP4100P1 SIP A; DP4100P2 SIP A; DP4100 P1 SIP B; 및 DP4100 P2 SIP B와 같은 제자리 스팀 처리 (SIP)된 변형된 막(즉, 4.00%-DACm1.00%-PEGDA). X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y 축은 LRV를 나타낸다.
도 10은 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지를 사용하여 2 내지 5% 범위의 PEGDA-575에 의해 변형된 PES 막에 의해 얻어진 평균 능력 및 투과율 결과 (V75, V90 및 10X 투과율)를 도시하는 막대 그래프이다. 1%HPC 막은 대조군으로 사용된다.
도 11은 2 내지 5% 범위의 PEGDA-575에 의해 변형된 PES 막의 능력 및 4 시간 동안 1000 리터의 배지를 여과하는데 필요한 최소 면적을 도시하는 막대 그래프이다. 1% HPC는 대조 막으로 사용된다. 좌측 Y-축은 150분에서 Opti-CHO 여액 부피 및 막 능력을 나타내고 또 우측 Y-축은 4시간 동안 1000 리터를 여과하기 위한 최소 면적을 나타낸다.
도 12는 3개의 상이한 화학적으로 정의된 배지 (즉, Cellvento CHO-200, CD Opti-CHO 및 2g/L Pluronic F68에 의해 스파이크처리된)를 사용한 다양한 막의 능력을 도시하는 막대 그래프이다. 시험된 막은 1%HPC에 의해 변형된 PES (대조군으로 사용됨); 4%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 0%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 1%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 및 4%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막. X-축은 막의 유형을 나타내고 또 Y-축은 4 시간 동안 1000 리터의 배지를 여과하는데 필요한 최소 면적인 Amin을 나타낸다.
도 2는 4% DACm-1% MBAm 변형된 PES 막 또는 4% DACm-1% PEGDA 변형된 PES 막 또는 1% HPC 변형된 PES 막 (대조군)을 함유하는 막 장치에 대한 이중으로 시험된, 플럭스 감쇄 곡선(flux decay curves)을 도시한다. Y-축은 비폐색성(non-plugging) 또는 비-파울링(non-fouling) 공급스트림 (예를 들어, 밀리-Q 워터(Milli-Q-water))에 대해 결정된 플럭스 J0 를 기본으로 하는 퍼센트인 (J/J0) % 퍼센트로 표시된 플럭스 감쇄를 나타내고 또 X-축은 막 (L/m2)의 제곱미터당 수집된 여액의 리터로 표시된 막의 처리량 또는 능력을 나타낸다.
도 3은 4% DACm-1% MBAm, 4% DACm-1% PEGDA 및 1% HPC (대조군) 표면 변형된 PES 막의 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 화학적으로 정의된 세포 배양 배지인 CHO 세포가 공급스트림으로 사용된다. X-축은 막을 나타내고 또 Y-축은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)를 나타낸다.
도 4는 V75, V90 및 10X 투과율로 측정된 바와 같은, 시험된 다양한 막의 평균 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 막 장치는 다양한 표면 변형된 막 각각의 단일층 (1L-)을 포함하도록 구성된다. 1% HPC는 침지에 의해 적용된 흡수된 중합체 예비처리를 갖고 또 막 습윤조제로 사용된 10% 헥실렌 글리콜과 함께 수성 1.00 Wt% 히드록시프로필 셀룰로오스 (HPC) 용액을 포함하는 단일층 막 장치를 지칭하고; 3.75% LB20은 그자리(in situ) 전자 빔 경화에 의해 3.75% 농도로 적용된 자가-가교성의 고-에톡시화 트리아크릴레이트 단량체를 갖는 단일층 막 장치를 지칭하며; 4.00%-DACm-1% MBAm은 4% 디아세톤 아크릴아미드 (DACm), 단일작용성 비닐성(vinylic) 단량체, 및 1% 메틸렌-비스-아크릴아미드 (MBAm), DACm과 공중합체를 형성하는 디아크릴아미드 가교제를 갖는 단일층 막 장치를 지칭하고; 2.00% LB20-1% HEA-0.75% TEGDA는 2% LB20, 1% 히드록시에틸 아크릴레이트 (HEA), 및 0.75% 테트라에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 이작용성 또는 가교성 단량체를 갖는 단링층 막 장치를 지칭하며; 또 4.00%-DACm1%-PEGDA575는 4% DACm 및 575 수평균 MWt 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트인 1% PEGDA575를 갖는 단일 막 장치를 지칭한다.
도 5는 이중으로 시험된 단일층 막 장치 각각에 대한 평균 부피 대 시간 곡선을 나타내는 그래프를 도시한다. 상기 시험된 막 장치는 1% HPC; 3.75% LB20; 4.00% DACm-1%MBAm; 2.00%LB20-1%HEA-0.75% TEGDA; 및 4.00%-DACm1%-PEGDA575이다. X-축은 다양한 막 장치를 통하여 CHO 세포 배양 배지를 통과시킨 후 수집된 여액의 부피(ml)를 나타내고; 또 Y-축은 시간 (분)을 나타낸다.
도 6은 이중으로 시험된 단일층 막 장치 각각으로부터 얻은 플럭스 감쇄 곡선을 나타내는 그래프를 도시한다. 시험된 막 장치는 1%HPC; 3.75%LB20; 4.00%DACm-1%MBAm; 2.00%LB20-1%HEA-0.75% TEGDA; 및 4.00%-DACm1%-PEGDA575 이다. X-축은 막 능력 (L/m2)을 나타내고 또 Y-축은 플럭스 감쇄 (J/J0)를 나타낸다. 도 6에 도시된 바와 같이, DACm-PEGDA575 공중합체 변형된 막 장치는 더 느린 플럭스 감쇄에 의해, 시험된 다른 변형에 비하여 처리량 성능 이점을 가졌다.
도 7은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같이, 열 처리 전 후에 다양한 일련의 막 장치의 성능 및 투과율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 시험된 막 장치는 3개 종류이다: 1L-DP4100 AM (즉, 4.00%-DACm1%-PEGDA); 2L-DP4100 AM1; 및 IL- DP4100 AM2와 같이 열처리 없이 변형된 막(AM); 1L-DP4100 ACD; IL-DP4125 ACD (즉, 4.00%-DACm1.25%-PEGDA) 및 IL-DP4 150 ACD (즉, 4.00%-DACm1.50%-PEGDA)와 같이, 134℃ 장치에서 1시간 동안 오토클레이브처리로 변형된 막(ACD); IL-DP4100 ACM; IL-DP4125 ACM 및 IL-DP4150 ACM과 같은, 134℃에서 1시간 오토클레이브처리에 이어 장치 배열된 변형된 막(ACM). 단일층 1L-1%HPC 막은 대조군으로 사용된다. X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y축은 아세테이트 완충액 중의 4g/L 인간 혈장 유래 IgG 를 사용하여 pH 4 및 2 mS/cm 도전율에서 결정되는 바와 같이, 능력 V75, V90 및 10X 투과율을 나타낸다.
도 8은 V75 (L/m2), V90 (L/m2) 및 10X 투과율 (L/m2 h psi)에 의해 측정되는 바와 같이, 건식 열처리 (DH) 전(AM) 및 후의 능력 및 투과율을 나타내는 막대 그래프이다. 시험된 막은 본원에서 P1 및 P2이라 칭하는 2개의 상이한 공급원으로부터의 PES 중합체로부터 캐스팅된다. 시험된 막 장치는 1%HPC P1 및 1% HPC P2 대조군; DP4100 AM P1; DP4200 AM P1 (즉, 4.00%-DACm2.00%-PEGDA); DP4100 AM P2 및 DP4200 AM P2와 같은 열 처리 없이 변형된 막 (AM); DP4100 DH P1, DP4100 DH P2 및 DP4200 DH P2와 같이 건식 가열(DH)에 의해 처리된 변형된 막. X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y 축은 아세테이트 완충액 중의 4g/L 인간 혈장 유래 IgG 를 사용하여 pH 4 및 2 mS/cm 도전율에서 결정되는 바와 같이, 능력 V75, V90 및 10X 투과율을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 실험 개시시(초기 LRV, 9a에 도시) 및 실험 말기 (최종 LRV, 9b에 도시)에 측정된 바와 같은, 제자리 스팀 (SIP: steam-in-place) 처리 전 후의 다양한 막의 로그 보유치 (LRV) Phi-X174를 도시하는 막대 그래드이다. 시험된 막은 P1 및 P2로 칭하는 2개의 상이한 공급원으로부터의 PES 중합체로부터 캐스트되며 이중으로 시험된다(A 및 B라 칭함). 시험된 막 장치는 열처리없는 대조군으로서 1%HPC P1 (AM), 이중으로 사용(1%HPC P1 AM A 및 B라 칭함); DP4100P1 AM A; DP4100 P2 AM A; DP100 P2 AM A; D4 100 P1 AM B; 및 D4100P2 AM B와 같은 열처리 없이 변형된 막(AM) (즉, 4.00%-DACm1.00%-PEGDA); 및 DP4100P1 SIP A; DP4100P2 SIP A; DP4100 P1 SIP B; 및 DP4100 P2 SIP B와 같은 제자리 스팀 처리 (SIP)된 변형된 막(즉, 4.00%-DACm1.00%-PEGDA). X-축은 다양한 막 장치를 나타내고 또 Y 축은 LRV를 나타낸다.
도 10은 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지를 사용하여 2 내지 5% 범위의 PEGDA-575에 의해 변형된 PES 막에 의해 얻어진 평균 능력 및 투과율 결과 (V75, V90 및 10X 투과율)를 도시하는 막대 그래프이다. 1%HPC 막은 대조군으로 사용된다.
도 11은 2 내지 5% 범위의 PEGDA-575에 의해 변형된 PES 막의 능력 및 4 시간 동안 1000 리터의 배지를 여과하는데 필요한 최소 면적을 도시하는 막대 그래프이다. 1% HPC는 대조 막으로 사용된다. 좌측 Y-축은 150분에서 Opti-CHO 여액 부피 및 막 능력을 나타내고 또 우측 Y-축은 4시간 동안 1000 리터를 여과하기 위한 최소 면적을 나타낸다.
도 12는 3개의 상이한 화학적으로 정의된 배지 (즉, Cellvento CHO-200, CD Opti-CHO 및 2g/L Pluronic F68에 의해 스파이크처리된)를 사용한 다양한 막의 능력을 도시하는 막대 그래프이다. 시험된 막은 1%HPC에 의해 변형된 PES (대조군으로 사용됨); 4%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 0%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 1%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막; 및 4%DACm-1%PEGDA에 의해 변형된 PES 막. X-축은 막의 유형을 나타내고 또 Y-축은 4 시간 동안 1000 리터의 배지를 여과하는데 필요한 최소 면적인 Amin을 나타낸다.
상세한 설명
본원에 기재된 실시형태는 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 미생물, 예를 들어, 바이러스 오염물을 제거하기 위한 조성 및 방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 성분에 의해 오염 감소를 나타낸다.
특히, 본 발명에 기재된 실시형태는 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 같은 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 표면을 갖는 다공성 막을 적용하는 조성(composition) 및 방법을 제공한다.
무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체 (예를 들어, PEGDA)를 포함하는 중합체에 의해 막의 표면을 변형하는 것에 의해 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분에 의한 파울링을 견디는(resistant) 바이러스 배리어 막을 제조하는 방법이 제공된다.
본원에 개시된 실시형태가 더욱 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 개시된다.
I. 정의
용어 "화학적으로 정의된 세포 배양 배지"는 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 또는 동물 세포)의 세포 배양을 위해 적합한 성장 배지를 지칭하며, 이들의 화학 성분은 전부 공지되어 있다. 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 예는, 비제한적으로, Lonza Power CHO, CD Opti CHO, EMD Millipore Cellvento CHO 100 및 Cellvento CHO 200을 포함한다. 유체역학적 세포 보호성 양쪽성 화합물, 특히 Pluronic F68 (BASF) 및/또는 Poloxamer 188 (ICI)은 다양한 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에서 막 필터 파울링에 관여하는 주요 배지 성분이라는 것이 밝혀져 있다. 이들 성분의 하나 이상은 막 오염을 유발하는 것으로 관찰되어 있기 때문에, 이들은 바이러스 오염물을 제거하기 위한 막 필터의 효능을 현저히 감소시킨다.
본 발명에 기재된 실시형태는 예를 들어, Pluronic F68과 같이 막을 오염시키는 것으로 공지된 배지 성분의 존재하에서도 바이러스 오염물을 제거하는데 효과적인 막 조성에 관한 것이다.
본원발명에 상호교환적으로 사용된 용어 "오염물", "불순물" 및 "파편"은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에 존재할 수 있는 바람직하지 않은 또는 부적당한 미생물을 지칭한다. 특별한 실시형태에서, 이러한 미생물은 바이러스 또는 바이러스 입자이다. 다양한 실시형태에서, 본원발명에 기재된 조성 및 방법은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에 전형적으로 존재하는 특정 성분에 의한 파울링을 감소 또는 제거하도록 변형된 막 필터를 통하여 여과하는 것에 의해 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 그러한 바이러스 오염물을 효과적으로 제거하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명에 기재된 실시형태는 대부분의 바이러스 보유 막을 전형적으로 파울링하는 성분에 노출될 때에도 바이러스 보유 능력 및 막 처리량를 보유하는 조성을 제공한다.
본원발명에 기재된 조성 및 방법을 이용하여 제거될 수 있는 바이러스성 오염물 또는 잠재적 바이러스성 오염물은 오르토믹소비리다애(Orthomyxoviridae), 아레나비리다애(Arenaviridae), 파라믹소비리다애(paramyxoviridae), 라브도비리다애(Rhabdoviridae), 코로나비리다애(Coronaviridae), 플라비비리다애(Flaviviridae), 피코르나비리다애(Picornaviridae), 토가비리다애(Togaviridae), 아르테리비리다애(Arteriviridae), 레트파르보비리다애(Retparvoviridae), 분야비리다애(Bunyaviridae), 칼리시비리다애(Caliciviridae), 레트로비리다애(Retroviridae), 레오비리다애(Reoviridae), 씨르코비리다애(circoviridae), 아데노비리다애(adenoviridae), 폭스비리다애(Poxviridae), 허피스비리다애(Herpesviridae), 이리도비리다애(Iridoviridae) 또는 레오비리다애(Reoviridae) 목(family)의 구성원을 포함한다. 보다 자세하게는, 상기 바이러스성 오염물은 개의 파르보비리다애(CPV), 마우스의 미세 바이러스(MVM), 캐쉬 밸리(Cache Valley) 바이러스, 분얌웨라 바이러스, 노쓰웨이 뇌염 바이러스, 인플루엔자 NB 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1/2/3, 시미안 바이러스 5, 볼거리 바이러스, 소 합포성 폐렴 바이러스, 센다이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마우스의 폐렴 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 소의 코로나 바이러스, 쥐의 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기매개 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 베시 바이러스 2117, 뇌척수심근염 바이러스, 콕사키 바이러스 B-3, 타일러의 마우스 뇌염 바이러스, 구제역 바이러스, 소의 엔테로바이러스, 돼지의 엔테로바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 신드비스 바이러스, 풍진 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 돼지의 생식 및 호흡기 증후군 바이러스, 거품형성 바이러스, 레오바이러스 1/2/3, 조류 레오바이러스, 로타바이러스, 돼지의 씨르코바이러스 1, 아데노바이러스, 슈도광견병 바이러스, 쥐의 감마허피스 68, 단순포진 바이러스 1, 프로그 바이러스 3, 마우스 커터의 미세 바이러스 (MVMc), 청설병 바이러스 (BTV), 유행성 출혈병 바이러스 (EHDV), 소의 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 돼지의 파르보바이러스 (PPV), 뇌척수심근염 바이러스 (EMCV), 레오바이러스 3, 및 쥐의 백혈병 바이러스 (MuLV), A형 간염, 소아마비, 또는 파르보비리다애 B19 중의 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "로그 감소치" (LRV: Log Reduction Value)는 입자, 예를 들어, 바이러스 오염물을 보유하는 막의 효능 정도를 지칭하는 것으로, 바이러스 필터 막 투과액 중의 입자 개수에 대한 공급 스트림 (예를 들어, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지) 중의 입자 개수의 비율을 로그(베이스 10)로 규정한 것이다. 본원발명에 기재된 다양한 실시양태에서, 막 필터는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 1 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 2 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스 오염물에 대하여 적어도 3 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 4 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 5 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 6 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 7 Log10 감소치(LRV), 또는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 8 Log10 감소치(LRV)를 달성하며, 바람직하게는 바이러스성 오염물에 대하여 적어도 4 Log10 감소치(LRV)이다.
용어 "파울링"은 막 플럭스 및/또는 처리량에서 감소와 같은 막 성능을 저하시키는 방식으로 막 표면 또는 막 기공 내로 용질 또는 입자 퇴적물이 들어가는 과정을 지칭한다. 본원발명에 기재된 다양한 실시형태에서, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에 존재하는 하나 이상의 성분에 의한 파울링을 견디거나 파울링 감소를 나타내는 바이러스 막 필터가 제공된다. 또한, 본원발명에서 제공된 방법은 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분에 의한 파울링을 견디거나 또는 파울링 감소를 나타내는 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "플럭스" 또는 "막 플럭스" (J)는 그 성질이 일반적으로 다양한 순간 투과액 유동량을 지칭한다 (단위 시간 당 유효 여과 면적 (EFA) 단위 당 바이러스 여과 막을 통과하는 투과액 용액의 부피 또는 중량, 예를 들어 L/(m2×hr), 또는 g/(m2 hr), 또는 Kg/(m2 hr)으로 표시).
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "초기 플럭스" 또는 "초기 막 플럭스" (Jo)는 투과액 스트림이 비폐색성 유체(즉, 막 파울링 성분을 함유하지 않는 물 또는 용액)로 구성될 때 성질에서 대개 일정한 투과액 유동량을 지칭한다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "플럭스 감쇄" 또는 "막 플럭스 감쇄" (J/Jo)는 비폐색성 투과액 스트림이 필터 또는 막을 통과하는 것에 의해 결정된, 초기 플럭스 또는 플럭스에 대한 폐색성(plugging) 투과액 스트림에서 순간적 막 플러스량을 지칭한다. 이것은 흔히 퍼센트, 즉, (J/Jo)%로서 나타낸다.
용어 "플럭스 감쇄 곡선"은 플럭스 감쇄 (J/Jo)가 수집된 여액의 시간 (t)에 대해, 또는 부피 (v)에 대해 또는 질량(m)에 대해 플럿될 때, 또는 바람직하게는, 유효 여과 면적 당 수집된 여액의 부피 (v)에 대해 또는 질량(m)에 대해 플럿될 때 생성된 곡선을 지칭한다(즉, L/m2에 대한 (J/Jo)% 또는 kg/m2에 대한 (J/Jo)%.
용어 "처리량 성능"은 플럭스가 초기 플럭스 (비폐색성 스트림에 대해 결정된 플럭스)의 25% 또는 10%로 떨어지기 전에 유효 여과 면적의 단위 면적당 재회수될 수 있는 여액의 양을 지칭한다.
본원발명에서 용어 "뱃치 여과"는 특정량 또는 부피의 화학적으로 정의된 배지가, 여과된 매질이 공정의 다음 단계로 전달되거나 또는 사용되기 전에 여과 공정을 달성하기 위하여, 1개 뱃치로 막 필터를 통하여 여과되는 여과 공정을 지칭한다.
용어 "연속 여과" 또는 "인라인(in line) 여과"는 특정량 또는 부피의 화학적으로 정의된 세포 배양 배지가 막 필터를 통하여 연속적으로 여과되고 또 여과된 배지가 여과되는 공정에서 다음 공정으로 전달되거나 사용되는, 여과 공정을 지칭한다.
본원발명에 기재된 모든 실시형태는 뱃치 또는 연속 여과를 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "고체 지지체"는 일반적으로 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 물질을 지칭한다. 예시적 비-아크릴아미드 가교성 단량체는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (PEGDA)이다.
본원발명에 기재된 방법 및 조성물에 사용된 고체 지지체 포맷의 예는, 비제한적으로, 막 및 모노리스(monoliths)를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 본 발명에 기재된 바와 같이 표면이 변형된 다공성 막이다. 예시적 막은 다공성 비대칭 막, 예를 들어, 미국 특허 공개번호 20120076934호에 기재된 방법을 이용하여 제조된 막과 같은 폴리에테르술폰 막 (PES)이다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "표면"은 다공성 매질 또는 막의 외부 표면 및 내부 표면을 비롯한, 다공성 매질 또는 막의 전체 표면 면적을 지칭한다. 용어 "외부 표면"은 외부에 노출된 표면이다. 용어 "내부 표면"은 다공성 네트워크의 내부 표면, 즉 다공성 매질 또는 막의 내부 면적을 의미하는 것으로 이해된다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "중합체"는 반응성 부위를 갖는 적어도 2개의 가교된 단량체로부터 제조된 중합체를 지칭하며, 상기 단량체들은 무작위로 배열되고 중합 반응에 관여할 수 있고 또 적어도 하나의 단량체는 디아세톤 아크릴아미드이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 디아세톤 및 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (PEGDA)와 같은 적어도 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함한다.
단일작용성 단량체는 단일 불포화 작용기를 갖는 단량체이다. 다작용성 단량체는 하나 이상의 불포화 작용기를 갖는 분자이다.
용어 "바이러스 필터" 또는 "바이러스 보유 필터" 또는 "바이러스성 보유 필터" 또는 "바이러스 배리어 필터"는 상류 사용 (즉, 세포와 접촉하기 전에 세포 배양 배지를 여과) 또는 하류 사용 (즉, 재조합 발현된 단백질을 함유하는 세포 배양 배지를 여과) 동안 바이러스 제거 또는 바이러스 정리를 제공하기 위하여 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 보유하는 막 또는 매질을 지칭한다. 상업적으로 입수가능한 바이러스 보유 필터의 예는 Viresolve® Pro, Viresolve® NFP 및 Virosolve® NFR를 포함하며, 이들은 크기 배제 메카니즘을 통하여 주로 작용한다. 본 발명에 기재된 실시형태는 상류 사용을 의도하는 것이고 관심 단백질을 발현하는 세포를 배양하기 위해 사용된 바이오리액터의 상류에 위치하는 바이러스 배리어 필터에 관한 것이다. 이러한 바이러스 배리어 필터는 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분에 의한 파울링에 견디거나 오염 감소를 나타내도록 변형된다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "공급물" 또는 "공급스트림"은 여과 공정에 처리되는 용액 또는 혼합물, 예를 들어, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 지칭한다.
본 발명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "여액" 또는 "투과액"은 필터 또는 막을 지나가는 용액뿐만 아니라 필터 또는 막을 지나간 용액을 지칭한다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "보유액"은 보유되어 필터 또는 막을 거치지 않을뿐만 아니라 필터 또는 막을 거치지 않은 용액 성분을 지칭한다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "바이오리액터"는 생물학적 활성 환경을 지지하는 제조된 또는 엔지니어링된 장치 또는 시스템을 지칭한다. 일부 예에서, 바이오리액터는 생물 또는 이러한 생물로부터 유래한 생화학적 활성 성분을 포함하는, 세포 배양 공정이 실시되는 용기이다. 이러한 공정은 호기성 또는 혐기성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오리액터는 리터 내지 m3 크기 범위이고 또 스테인레스강으로 제조된다. 일부 실시형태에서, 바이오리액터는 강철 이외의 재료로 제조되며 또 일회용 또는 단일 사용이다. 바이오리액터의 전제 부피는 특정 공정에 따라서 100 mL 내지 10,000 리터 또는 그 이상 범위의 부피일 수 있다. 본원발명에 기재된 공정 및 시스템에 따른 일부 실시형태에서, 상기 바이오리액터는 본원발명에 기재된 바이러스 필터에 연결되며, 상기 바이러스 필터는 바이오리액터의 상류에 존재한다.
II. 예시적 고체 지지체
본원에 개시된 실시형태는 무작위로 배열된 가교된 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 고체 지지체를 제공한다. 본 출원에 포함되는 고체 지지체는 하류 바이러스 정제 적용에 사용된 바이러스 보유 막을 신속하게 파울링하는 것으로 알려진 세포 배양 성분의 존재하에도 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에 존재하는 바이러스 오염물을 보유한다. 본원발명에 포함된 고체 지지체는 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에 존재하는 하나 이상의 성분에 대해 견디거나 오염 감소를 나타낸다.
어떠한 이론에 구속됨 없이, 적합한 고체 지지체 포맷 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성이거나 또는 모노리스(monolith) 또는 막 형태와 같이 연속적일 수 있다. 예시적 연속 다공성 고체 지지체는 약 0.05 마이크론 내지 10 마이크론 사이의 기공 크기를 갖는 미세다공성 막을 포함한다. 본원발명에 기재된 실시형태에 따른 조성 및 방법에 사용될 수 있는 다공성 막은 대칭 또는 비대칭 성질로 분류되며, 이는 막의 두께에 걸친 또는 중공 섬유의 경우, 섬유의 미세다공성 벽에 걸친, 기공 크기의 균일성을 지칭한다.
본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "대칭 막"은 막 단면에 걸쳐 실질적으로 균일한 기공 크기를 갖는 막을 지칭한다. 특별한 실시형태에서, 비대칭 막은 고체 지지체로서 사용된다. 본원발명에 사용된 바와 같이, 용어 "비대칭 막"은 막 단면에 걸쳐서 평균 기공 크기가 일정하지 않은 막을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 비대칭 막의 경우, 기공 크기는 막 단면을 통하여 위치 함수로서 균일하게 또는 불연속적으로 변한다. 일부 실시형태에서, 비대칭 막은 대향하는 외부 표면 사응 기공 크기에 대한 1개의 외부 표면 상에서 기공 크기의 비율을 가지며, 상기 비율은 실질적으로 1보다 크다. 본원발명에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 비대칭 막은 폴리에테르술폰 (PES) 막이다. PES 막은 스미토모 및 솔베이와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
다양한 재료로부터 제조된 다양한 막이 본원발명에 기재된 조성 및 방법에 사용될 수 있다. 본원발명에 기재된 조성 및 방법에 사용될 수 있는 막을 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시적 중합체는, 비제한적으로, 치환된 또는 비치환된 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리메타크릴아미드, 폴리이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 친수성 중합체, 폴리스티렌, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 공중합체 또는 스티렌 및 디비닐벤젠, 방향족 폴리술폰, 폴리테르플루오로에틸렌 (PTFE), 퍼플루오르화된 열가소성 중합체, 폴리올레핀, 방향족 폴리아미드, 지방족 폴리아미드, 초고분자량 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리에테르에테르케톤 (PEEK), 폴리에스테르, 및 그의 조합을 포함한다.
예시적 상업적으로 입수가능한 미세다공성 막은 밀리포어 코포레이션(미국 매사추세츠 빌레리카 소재)으로부터 입수가능한 Durapore® and Millipore Express®; 팔 코포레이션(미국 뉴욕 포트 워싱톤 소재)으로부터 입수가능한 Supor®; 및 사르토리우스 스테딤 바이오테크 에스.에이 (프랑스, 아우바그네 세덱스 소재)로부터 입수가능한 Sartopore® 및 Sartobran® 이다. 다른 예시적 연속 고체 지지체는 BIA Separations (호주 빌라크 소재)로부터 입수가능한 CIM® 모노리스 재료와 같은 모노리스이다.
상업적으로 입수가능한 바이러스 보유 필터의 예는 Viresolve® Pro, Viresolve® NFP 및 Virosolve® NFR를 포함하며, 이들은 크기 배제 메카니즘을 통하여 주로 작용한다. 이들 바이러스 보유 필터 제조에 사용된 기본 막 재료는 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분에 대해 견디거나 오염 감소를 나타내는 막을 얻도록 본원 발명에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
III.
고체 지지체의 변형 방법
본원발명에 기재된 조성 및 방법에서, 적합한 고체 지지체(예를 들어, 비대칭 막, 또는 특히, 비대칭 PES 막)는 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트)를 포함하는 중합체에 의해 변형된다.
본원발명에 기재된 방법을 비롯하여 고체 지지체를 변형하는 다양한 방법이 당해 분야에 알려져 있다.
다양한 실시형태에서, 고체 지지체 (예를 들어, 다공성 막)의 표면은 에너지 공급원을 사용하여 변형된다. 중합 반응을 통한 변형을 개시하기 위하여, 예를 들어, 감마선, x-선, 자유 전자, UV, 청색광 및 열과 같은 다양한 에너지 공급원이 이용될 수 있다. 감마, x-선, 및 전자 빔 방법은, 중성 단량체를 이온화하기에 충분한 에너지를 가지기 때문에 중합반응을 유발하는데 추가의 화학적 개시제를 필요로 하지 않는다. 그러나, UV 및 가시광은 라디칼 종을 생성한 다음 단량체를 활성화하여 고반응성(라디칼화된) 종으로 만들고, 이를 다시 반응시켜 랜덤 중합체를 형성하기 위하여 광개시제를 필요로 한다. 이것은 열적으로 개시된 중합반응에서도 적용되며, 여기서 개시제는 광활성 또는 광 활성화되거나 되지 않을 수 있다.
본원발명에 기재된 일부 실시형태에서, 고체 지지체 (예를 들어, 폴리에테르술폰 막과 같은 비대칭 다공성 막)는 이하에 설명하는 바와 같이 전자빔을 이용하여 변형된다.
전형적으로, 전자 빔 공정을 이용하여, 막은 단량체의 혼합물의 적절한 농축물에 침지된다. 단량체 용액의 표면 장력이 너무 높은 경우, 막 샘플은 저분자량 알코올(메탄올 또는 이소프로판올과 같은)에 의해 미리 습윤된 다음 단량체 용액에 침지되기 전에 수조로 교환된다. 일부 예에서, 상기 단량체 용액은 막 표면을 습윤시키는 충분히 낮은 표면 장력을 가지며 또 이 경우, 미리 습윤하는 단계 및 교환 단계는 불필요하다. 상기 막 샘플은 단량체 용액으로부터 취출되고 또 과량의 단량체를 제거하고 또 단량체 용액이 전체 막 샘플을 통하여 균일하게 분포되는 것을 보증하기 위하여 닙-롤(nip-rolled) 처리된다. 이어 상기 막 샘플은 질소 또는 아곤 가스의 불활성 블랭킷 하, 전자 빔하에서 막 샘플을 통과시키는 것에 의해 자유 전자에 노출시킨다. 일부 실시형태에서, 3 내지 10 m/분의 선속이 이용된다. 전자 빔 가속 전압은 170 내지 200 KV 사이로 설정되며 또 선속과 조합된 빔 전류는 20 내지 30 KGy 투여량을 막 샘플에 전달하도록 조정된다. 이들 조건은 막 샘플이 막의 전체 단면을 통하여 완전히 변형되게 한다.
IV.
막의 처리량 성능
의
측정 방법
일부 실시형태에서, 본원발명에 기재된 변형된 고체 지지체 (예를 들어, 다공성 막)는 장치, 예를 들어, 본원발명의 실시예에 사용된 장치에 혼입되며, 상기 장치는 막 또는 막 장치의 처리량 성능을 측정하기 위해 이용된다.
본 발명은, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에서 발견된 막 오염 성분의 존재에도 막의 처리량 성능이 나쁜 영향을 받지 않는 점에서, 본 발명에 기재된 변형된 막의 우수한 특성을 적어도 일부 기본으로 한다. 따라서, 본원발명에 기재된 고체 지지체를 변형하는 방법은 막을 통하여 배지를 여과할 때, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분에 의한 다공성 막의 오염을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
상기 처리량 성능은 비폐색성 공급스트림을 사용한 막 장치의 투과율 (플럭스/구동 전압의 단위)을 제일 먼저 결정하는 것에 의해 측정될 수 있다. 비폐색성 공급스트림은 일반적으로 순수한 물, 또는 용존 산소 및/또는 무기 염을 함유하는 수성 완충액으로 구성된다.
막 또는 막 장치의 투과율은 단위 압력 당 단위 시간 당 단위 면적 당 재료의 양(리터 또는 킬로그램)으로 규정되며, 흔히 L/(m2 h psi), 또는 "시간 당 제곱미터당 리터"로 표시한다. 상기 실험이 일정한 구동 압력으로 실시되면, 장치 유효 여과 면적 (EFA) 및 구동 압력은 일정하다. 관측가능한 것은 여액의 질량 및 시간(또는 여액의 부피 및 시간)이다. 질량 및 부피는 여액 밀도가 균일에 가까울 때 상호교환적으로 사용될 수 있다. 공급스트림이 비폐색성이면, 투과율은 일정하게 보유되며 또 장치 "J0"의 완충액 플럭스는 수집된 여액 질량 또는 부피 대 시간을 플러팅하는 것에 의해 얻어진 직선의 기울기에 의해 결정된다.
동일 실험을 폐색성 스트림(예를 들어, 이 경우, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지)를 사용하여 실시할 때, 플럭스는 장치 기공이 폐색성 스트림이 함유하는 어떠한 파울링에 의해 막히게 됨에 따라서 시간에 따라 감쇄된다. 이 플럭스를 간단히 "J"라 칭한다. %로 표시된 상대적 플럭스 감쇄 ((J/J0)%)로 표시됨)가 소정 값, 예컨대 25%에 도달하면, 상기 장치의 능력은 플럭스가 장치의 최대 가능한 플럭스 값의 25%로 감쇄한 시간에 의해 회수될 수 있거나 또는 비폐색성 공급스트림을 사용하여 얻은 플럭스인 장치의 단위 면적당 (폐색성 공급스트림의) 여액의 양으로 규정된다. 상기 설명에서 규정된 능력은 처리량 성능의 1개의 숫자 또는 정량 정도이다. 이것은 처리량 성능을 측정하는 유일한 방법은 아니지만, 꽤 전형적인 방법이다.
장치 성능이 결정되는 2개의 공통적으로 사용되는 포인트는 다음과 같다:
(a) 플럭스가 최대 장치 플럭스의 25%로 감쇄될 때 (V75 - 플럭스가 75% 감쇄되었을 때); 및, (b) 플럭스가 최대 장치 플럭스의 10%로 감쇄될 때 (V90 - 플럭스가 90% 감쇄되었을 때). 다르게는, 상기 능력은 소정 양의 특정 공급스트림을 여과하는데 필요한 최소 여과 면적으로 또는 필터 특정 양의 특정 공급스트림를 여과하는 시간 간격으로 규정될 수도 있다. 이들 양의 일부 또는 전부는 처리량 성능의 측도로 간주될 수 있다.
V.
본원발명에 기재된 조성 및 장치를 사용하는 방법
다양한 실시형태에서, 본원발명에 기재된 변형된 바이러스 보유 막은 바이오리액터에 전달되기 전에 화학적으로 정의된 세포 배양 배지 내에 존재할 수 있는 바이러스를 보유하기 위하여 바이오리액터의 상류에 사용된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 바이러스 보유 막은 멸균되는 장치에 혼입될 수 있다. 상기 장치는 멸균 커넥터를 이용하여 바이오리액터의 상류(입구 포트)에 위치될 수 있고, 또 새로이 제조된 세포 배양 배지가 바이오리액터로 전달되는 동안 그 세포 배양 배지를 정상 여과 모드로 여과하기 위해 사용된다. 따라서, 파르보바이러스 오염은 여과하기 전에 비하여 1/10000 로 감소될 수 있다 (최소 로그 감소치 (LRV) 4에 해당).
제한을 의미하지 않는 하기 실시예에 의해 실시형태를 더욱 자세히 설명한다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원 및 도면의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
실시예
실시예
1:
디아세톤
아크릴아미드 단량체에 의한 막 표면의 변형 방법
디아세톤 아크릴아미드 단량체를 사용하여 막 표면을 변형하는 다양한 방법을 탐구하였다.
제1 방법은 침지 코팅을 포함한다. 10중량% 수성 헥실렌 글리콜 용액을 준비하였다. 6 g의 디아세톤 아크릴아미드 (DACm) 단량체를 194 g의 헥실렌 글리콜-물 용액에 용해시켜 3% w/w 디아세톤 아크릴아미드인 최종 용액을 얻었다. 14cm x 14 cm 고도의 비대칭 비변형 소수성 폴리에테르술폰 (PES) 바이러스 막을 얕은 직사각형 파이렉스 베이킹 팬에 든 DACm 용액에 위치시켜서, 막의 개방 면이 용액과 먼저 접촉하게 한 다음 막을 DACm 용액에 수분간 침지시키게 하였다. 상기 막을 꺼내고 흡수성 시트 상에 놓아 과량의 용액을 제거한 다음 주위 공기 건조 조건하 종이 타월 상에서 공기 건조시켰다. 상기 건조 막을 밀리-Q 워터와 접촉시키면 즉각적인 물 습윤을 나타내었다. 습윤 막은 DACm 단량체 또는 헥실렌 글리콜 공용매 잔류물이 발견되지 않을 때까지 물로 헹군 후, 샘플을 다시 공기 건조시켰다. 재건조된 막이 밀리-Q 워터와 접촉하도록 위치하면, 상기 막은 습윤되지 않는다. 초기 단량체 처리 이후 물이 DACm 단량체를 용이하게 제거하기 때문에 PES 막 기질에 대한 DACm 단량체의 어떠한 흡착도 나타나지 않았다.
다른 실험에서, 4.00 g의 DACm을 196.00 g의 밀리-Q 워터에 용해시키는 것에 의해 2.00중량% DACm 수용액을 제조하였다. 상기 용액은 14cm x14 cm 크기의 메탄올 예비 습윤 (및 물 교환됨) 고도의 비대칭, 소수성 PES 바이러스 제거 막 상에 침지하는 것에 의해 적용하였다. 상기 과정은 상기 막의 개방 면을 얕은 직사각형 파이렉스 팬에 든 DACm 용액과 접촉시킨 다음 부드럽게 진탕하여 상기 막을 용액에 침지시키는 것에 의해 실시되며, 수분(2-3분)간 정치시킨 후, 헹굼 수에 계면활성제 활성(거품)이 관찰되지 않을 때까지 단량체 용액을 물로 헹구었다. 건조하고 수분 습윤을 위한 시험 후, 막 위에는 DACm가 잔존하지 않음이 관측되는데, 이는 막이 상기 처리된 후에도 소수성으로 보유되기 때문이다. 따라서, DACm 단량체를 단순히 PES 막 상에 흡착시키는 것은 어떠한 영구적 친화력을 보이지 않아, 이러한 침지 코팅 전략은 이용되지 않는다.
다른 실험에서, DACm를 막 위로 전자 빔 중합화하는 방법을 조사하였다. 이 실험에서, DACm 단량체의 동일 2.00 중량%% 수용액을 다른 동일한 고도의 비대칭 소수성 PES 바이러스 제거 예비 습윤 막에 적용한 후 상기 막을 2개의 100 ㎛ 두께 투명 폴리프로필렌 시트 사이에 들어가게 하여 과량의 단량체 용액을 제거하였다. 상기 막이 전자빔 공급원 (170 KeV 전자에 대해 25 KGy 노출) 하를 통과하여 DACm 단량체를 상기 막 위에 중합시켰다. 놀랍게도, 그 결과 생성한 막은 상기 단량체 자체가 수용성이라 하더라도 물에 느리게 습윤되었다. 그러나, 생성한 막은 밀리-Q 워터 조(bath)에서는 45초 내에 완전히 습윤되었는데, 이는 DACm 동종중합체가 상기 처리에 의해 막 위에 형성됨을 나타낸다. 상기 시험된 막은 어떠한 가교성 단량체도 DACm 단량체와 조합되어 사용되지 않았음에도 불구하고 오토클레이브 및 건조 열에 대해서 불투성(impervious)인 것으로 관찰되었다. 또한, 0.2M NaOH(aq) 중 실온에서 2시간 침지한 후에도 수분 습윤 거동 또는 수분 투과율에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 상기 코팅은 메탄올에 의해 씻겨 없어지지 않는다.
0.5M NaOH에서 16시간 동안 정적 침지하는 시험은 생성한 동종중합체 막이 4 시간까지 안정하지만, 그 후부터, 상기 동종중합체 표면 변형이 개시되어 열화되는 것을 나타내다. 이는 일련의 동일한 미리 중량을 잰 막 샘플을 동일한 단량체 용액을 사용하여 변형하고 이들을 동일한 e-빔 개시된 중합화 공정에 처리하는 것에 의해 나타났다. 상기 샘플들을 표면 변형 후 다시 중량을 재고 디아세톤 아크릴아미드 동종중합체에 의한 건조 및 중량 부가를 각각의 막 샘플에 대하여 결정하였다. 이들 막 샘플은 0.5M NaOH 용액에 침지하고 연속 시간 간격으로 하나씩 꺼내었다. 상기 표면 변형은 단 4 시간 후에 열화하기 시작함이 관찰되었다.
전자 빔 개시된 DACm의 막으로의 중합화는 상기 다른 방법에 비하여 성공적이지만, 막 처리량에 대한 효과는 연구될 필요가 있다.
실시예
2:
전자 빔
개시된
중합화를
이용하고
Pluronic
F68 노출은 없이 DACm 동종중합체-변형된 막의 처리량 성능
수성 DACm 용액을 2, 4, 6, 8, 및 10 중량%로 제조하였다. 이들 용액은 14 cm x 14 cm 치수의 고도의 비대칭 소수성 PES 막을 상기 기재한 전자 빔 공정을 이용하여 표면 변형하기 위하여 사용하였다.
이하의 개략적 과정에 대해 상기 막을 처리량 시험처리하였다.
25 mm 직경의 원형 막 샘플을 상기 기재한 바와 같이 제조된 변형된 막 각각으로부터 절단해내고 오버-몰드된(over-molded) 미소규모 필터 장치에 조립하였다. 상기 장치는 하우징의 중앙 방사상 부분에 함유된 디스크 형상 필터 요소와 함께 상부에 유체 입구 및 저부에 유체 출구를 갖는 하우징을 포함한다. 각 유체 입구는 공기 및 유체가 실제 필터 요소 위로 직접적으로 부피를 탈출 및 퍼징하게 하는 일체형 벤트(integral vent)를 갖는다.
각 장치는 0.25 인치 폴리프로필렌 튜브뿐만 아니라 호환성 루어 피팅(Luer fittings) 및 밸브로부터 조립된 서브-매니폴드에 의해 0.25 인치 폴리프로필렌 튜브로 구성된 2개의 유체 전달 매니폴드(manifold)에 연결된다. 1개의 매니폴드는 밀리-Q 워터 (비폐색성 스트림)를 장치의 각각에 전달하고 또 나머지 매니폴드는 밀리-Q 워터에 용해된 화학적으로 정의된 세포 배양 배지(폐색성 스트림)를 장치의 각각에 전달한다. 각 매니폴드는 10개의 그러한 필터 장치를 지지하고 공급하도록 작성된다. 유체 전달 매니폴드 각각은 시험 유체 저장소로서 작용하는 별개의 압력 용기에 연결된다. 각 압력 용기는 조절된 가압 공기 공급 세트에 의해 개별적으로 공급되어 유체를 상기 장치에 30 psi 또는 약 2 바 (2 x 105 Pa)로 전달한다. 유체 수집 용기를 갖는 부하 셀(load cell)은 각 필터 장치 아래에 장착되어 시간의 함수로 수집된 여액의 질량을 측정한다. 각 부하 셀은 다채널 데이터 습득 보드에 연결되며, 이는 다시 컴퓨터 조작 데이터 습득 소프트웨어에 인터페이스(interfaced)되어 시간(조정가능한 단위이지만, 전형적으로 분)당 수집된 여액 질량을 기록한다.
부가적으로, Pluronic F68 막 노출 또는 예비처리의 효과를 조사하였다. Pluronic F68에 대한 예비처리 또는 노출은 수 (~5) 밀리리터의 저장 수성 10% (100 g/리터) Pluronic F68 용액을 주사기에 의해 각 필터 어셈블리를 통과시킨 다음 밀리-Q 워터 헹굼이 실시되는 동안 헹굼수 내에서 어떠한 거품이 관찰되지 않을 때까지 밀리-Q 워터에 의한 방대한 추출성 헹굼을 실시하는 것을 포함한다.
Pluronic F68에 의해 예비처리된 샘플들은 Pluronic F68 예비처리를 받지 않은 샘플에 비하여 개선된 처리량 성능을 나타냄이 밝혀졌다. 이들 결과는 DACm 처리된 막이 Pluronic F68를 함유하는 세포 배양 배지에 대하여 향상된 오염 저항성을 제공할 수 있음을 나타낸다. 상기 처리량 성능 시험 결과는 하기 표 I 및 도 1에 요약되어 있다.
처리량 성능은 정량적 막 능력으로 지칭된다. 따라서, 막 능력은 공급 스트림 의존적이다. 성능은 V75 및 V90로 지칭되는 2개의 측정에 의해 상기 실험으로 제공되며, 이는 플럭스가 초기 플럭스 ([L/m2] 단위)의 25% 및 10%로 각각 감쇄되었을 때 유효 막 표면 면적 제곱 미터당 수집된 여액 리터에 상응한다. 초기 플럭스는 막 투과율로부터 결정되며, 이는 다시 구동 압력 당 단위 시간 당 막을 통과한 비폐색성 스트림의 부피를 측정하는 것에 의해 결정된다. 여기서 막 투과율은 단위 구동 압력 (psi) 당 단위 시간(hrs) 당 단위 면적 (m2) 당 수집된 여액 리터 단위, 또는 L/(m2 h psi)로 표시된다. 본 실험 및 다음 처리량 실험에 대해 구동 압력 30 psi가 이용된다.
표 I은 Pluronic F68 노출 또는 예비처리를 하지 않거나(1-5행) 및 실시하여(두번째 5개 행; 6-10행) 디아세톤 아크릴아미드 동종중합체 변형된 막에 대한 막 처리량 성능 결과를 나타낸다.
표 I
일반적으로, 막의 처리량 성능은 막 처리에 사용된 DACm 양 증가에 따라 10%까지 증가함이 관찰되었다. 부가적으로, 처리량 성능에서의 개선은 Pluronic F68에 예비처리되지 않거나 또는 노출되지 않은 막에 비하여 Pluronic F68에 예비처리되거나 노출된 DACm 변형된 막에서 관찰되었다. 그러므로, Pluronic F68은 DACm 변형된 막에 대한 파울링 효과를 갖는 것으로 보이지 않는다.
그러나, 상기 막을 사용한 침출(leaching) 시험은 적어도 DACm 양이 높을 수록, 메탄올과 접촉시 DACm 동종중합체 침출되며, 그후 상기 막 유동 특징 및 습윤성이 영향을 받음을 알 수 있다. 상기 침출 시험은 DACm 단량체 가교없이는 낮은 추출물을 보증할 수 없고 일정한 막 성능을 달성할 수 없음을 제시한다. 또한, 저분자량 알코올에 대한 우연한 노출은 바람직하지 않은 재료 취약성을 제공한다.
실시예
3:
DACm
단량체에 대한
가교제의
선택
DACm 단량체에 대한 몇개의 잠재적 가교제를 본 실시예에서 시험하였다. 테트라에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (TEDGA)는 DACm 단량체에 대한 잠재적 가교제로 조사하였다. 그러나, DACm 및 TEGDA에 의한 변형은 안정한 가교된 표면 변형을 생성하지 않는다. 이어, 수용성 및 비-아크릴아미드 가교성 단량체, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (PEGDA)를 TEGDA 대신 가교제로서 시험하였다. 575 평균 MWt PEG 디아크릴레이트 (PEGDA575)는 이용가능한 MWt PEG 디아크릴레이트의 가장 좋은 수용성을 보유하는 것으로 보고되어 있다. 시험된 제1 가교제 양은 1%이다.
가교제와 조합될 출발 DACm 양을 선택하기 위하여, 수 습윤 속도 및 투과율에 대하여 2 내지 10 Wt% DACm 동종중합체 변형된 막을 조사하였다. 4% DACm-변형된 막은 다른 DACm 동종중합체 변형된 막에 비하여 물에서 더욱 신속하고 균일하게 습윤됨이 밝혀졌다. 따라서, 4.00% DACm는 1% PEGDA575를 사용한 가교된 표면 변형 화학에 사용될 출발 DACm 양으로 선택되었다. 상기 단량체 혼합물은 단량체 용액이 95 Wt%의 밀리-Q 워터 내에서 4.00 Wt% DACm 단량체와 1.00 Wt% PEGDA 단량체로 구성되는 점을 제외하고는, 상기와 동일한 방식으로 e-빔에 의해 적용되었다. .
상기 코팅의 성능에 의해 특징화된 가교의 효과는 생성한 변형된 막 샘플을 메탄올에 침지한 다음 물로 헹구고 건조시키는 것에 의해 확인하며, 이어 습윤 및 투과율을 재시험한다. 수분 습윤 및 수분 투과율 시험의 결과는 메탄올 추출 단계 이전에 기록된 것과 본질적으로 동일하였다. 그러므로, 상기 변형은 안정한 것으로 간주된다.
또한, 별도 실험에서, 비-아크릴아미드 가교제의 사용을 조사하고 또 막 처리량 성능에 대한 효과에 관하여 아크릴아미드 가교제와 비교하였다. PEGDA575는 비-아크릴아미드 가교성 단량체로 사용되고 또 메틸렌-비스-아크릴아미드(MBAm)는 아크릴아미드 가교성 단량체로 사용된다. 실험적 원형으로 이 실험에서는 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지, MX-201 또는 Beta-CHO를 폐색성 또는 파울링성 공급 스트림으로 사용하였다. 각 가교성 단량체 (PEGDA 또는 MBAm)는 동일한 1.00 중량% 처리 양 (1.00 Wt%)으로 사용되었다. 이들 가교제 각각은 개별적으로 4% DACm (디아세톤 아크릴아미드)와 조합되어 밀리-Q 워터를 용매로 사용하여 중합체 혼합물을 형성하였다.
도 2는 3개의 표면 변형된 막 중의 하나를 사용하여 25mm 직경 막 장치에 대해 이중으로 실시한 플럭스 감쇄 곡선을 나타낸다. 이들은 다음과 같다: (a) 4% DACm-1% MBAm; (b) 4% DACm-1% PEGDA575; 및 (c) 1% HPC.
하기 표 II는, 1% HPC 대조 막에 대한 4%DACm-1%MBAm 및 4%DACm-1%PEGDA 변형된 PES 막의 성능 및 투과율을 도시하는 도 3에 도시된 바와 같이, 플럭스 감쇄, V70, V90 및 10X 투과율을 측정하기 위해 사용된 이러한 하나의 실험 결과를 요약한 것이다. 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지는 공급스트림으로 사용된다.
관찰된 바와 같이, 4% DACm-1% MBAm 막은 1% HPC 막에 대하여 낮은 처리량 성능을 나타낸다. 그러나, 4% DACm-1% PEGDA575 막은 1% HPC에 비하여 더 높은 처리량 성능을 나타낸다.
표 II.
따라서, 비-아크릴아미드계 가교성 단량체 (예를 들어, PEGDA)는 아크릴아미드계 가교성 단량체 (예를 들어, MBAm)에 비하여 DACm와 함께 사용할 훨씬 더 우수한 선택이다.
실시예
4:
가교된
공중합체 변형된 막의 비교 처리량
성능 시험
표면 변형은 처리량 성능에 대해 이전에 기재한 방법과 동일한 방식으로 더욱 시험하였다. 이하의 결과는 DACm-PEGDA575 공중합체 화학을 이용하여 실시된 제1 능력 시험으로부터 취한 것이다.
DACm 동종중합체를 사용한 이전의 실시예에서 설명한 바와 같이, 하기 표 III에 제시된 모든 양은, 이중 샘플이 제공한 평균값을 제외하고는 동일 의미 및 단위를 갖는다.
표 III은 DACm-PEGDA575 공중합체 막 표면 변형 화학을 이용한 제1 비교 시험으로부터 이중으로 측정한 능력 결정에 대한 평균 능력([L/m2] 단위의 V75 및 V90 및 [L/(m2 h psi] 단위의 투과율)을 나타낸다.
표 III
모든 장치는 동일 출발 막 재료로 작성하였다 (20 nm 명목상 기공 크기 등급을 갖는 고도의 비대칭 비변형 소수성 PES 바이러스 보유 막). 각 필터 장치는 다양한 표면 변형된 막 각각의 단일층(1L-)을 하우징하도록 작성되었다. 각 막 샘플에 적용된 표면 변형 화학은 아래에 기재한다.
HPC는 침지에 의해 적용된 흡착된 중합체 예비처리이고 막 습윤 조제로 사용된 10% 헥실렌 글리콜과 함께 수성 1.00 Wt% 히드록시프로필 셀룰로오스 용액을 포함한다. LB20은 그자리 전자 빔 경화에 의해 적용된 자가-가교성 고도의 에톡시화 트리아크릴레이트 단량체이다. DACm은 디아세톤 아크릴아미드, 단일작용성 비닐성 단량체를 의미하고, 또 MBAm는 DACm와 공중합체를 형성하는 메틸렌-비스-아크릴아미드, 디아크릴아미드 가교제를 의미한다. HEA는 히드록시에틸 아크릴레이트, 단일작용성 비닐성 단량체를 의미한다. TEGDA는 테트라에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 이작용성 또는 가교성 단량체를 의미하며, PEGDA575는 575 수평균 MWt 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트이다. DACm-MBAm은 전자 빔 경화에 의해 적용된 공중합체성 표면 변형이며, DACm-PEGDA575이다. LB20, HEA, 및 TEGDA는 삼중합체성 표면 변형을 형성하며, 전자 빔 경화 공정에 의해 막 상에 적용된다.
도 4는 상기 기재한 바와 같이 시험된 다양한 막 장치의 평균 능력 및 투과율을 도시하는 막대 그래프이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 처리량 성능에서의 현저한 개선은 본 실시예에 시험된 다른 변형에 비하여 DACm-PEGDA575 공중합체 변형된 막 장치에 대하여 관찰된다.
도 5는 본 발명에서 시험된 각 장치에 대한 부피 대 시간 곡선을 도시한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서 시험된 다른 변형에 비하여 DACm-PEGDA575 공중합체 변형된 막 장치의 경우에 훨씬 더 많은 여액 양이 수집되었다.
다른 실험에서, 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지, MX-201 (또는 Beta-CHO)는 공급 스트림으로 사용한다. V-Pro 막 (1% 히드록시프로필 셀룰로오스에 의해 변형된 PHHC 막) 함유 장치는 대조군으로 사용하였다. 375LB20으로 라벨링된 장치는 밀리-Q과 3.75% LB20 (20 몰-에톡시화 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트) 단량체 혼합물에 의해 제조되고 e-빔에 의해 막 상에 경화되었다. 200L, 100H 및 075T로 라벨링된 장치는 각각 2% LB20, 1% HEA, 및 0.75% TEGDA이고, 이들 모두는 밀리-Q 워터에 용해된다. 4DACm1PEGDA로 라벨링된 장치는 밀리-Q 워터 중에 4% DACm 및 1% PEGDA575를 포함한다. 모든 화학은 25 KGy e-빔 투여량에 의해 적용된다.
시험된 다른 후보 화학에 비하여 4DACm1PEGDA 장치의 처리량 성능에서 매우 현저한 증가가 관찰되었다.
다른 실험에서, 상기 기재한 바와 같이 동일한 막 장치 상의 PEGDA575는 2% 내지 5% 범위의 농도(상기 기재한 바와 같이 동일 e-빔 공정에 의해 제조됨)에서 시험되며 또 처리량 성능은 4DACm1PEGDA 장치를 이용하여 관찰된 성능에 필적한다.
이어서, 상기 기재한 바와 같이 동일한 화학적으로 정의된 세포 배양 배지는 5% PEGDA575를 함유하는 장치에 대해 사용된다. 개선된 처리량 성능 이점이 다시 확인되었다.
다른 실험에서, 상이한 농도의 DACm 및 PEGDA 단량체를 함유하는 조성물은 이들 단량체를 사용하여 변형된 막의 처리량 성능에 대해 평가하였다. 하기 조성물을 제조하고 시험하였다: 4% DACm와 함께 0.75%, 1.25%, 1.50% 2.00% 및 2.50% PEGDA를 함유하는 조성물을 제조한다. 또한, 3% DACm와 함께 3% PEGDA575를 함유하는 조성물을 제조한다.
도 6은 시험된 막 장치 각각으로부터 얻은 플럭스 감쇄 곡선을 도시한다. 도 6에 도시된 바와 같이, DACm-PEGDA575 공중합체 변형된 막 장치는 더 느린 플럭스 감쇄에 의해 시험된 다른 변형에 비하여 처리량 성능 이점을 갖는다.
실시예
5:
DACm
-
PEGD
공중합체 변형된 막의 열적 안정성의 평가
멸균에는 열적 안정성이 바람직하므로, DACm-PEGD 공중합체 변형된 막을 열적 안정성에 대해 또한 평가하였다.
열적 안정성은 변형된 막을 습윤 오토클레이브 조건(134℃에서 1 Hr 주기), 건조 가열 조건(135℃에서 1 Hr 주기), 및 제자리 스팀 (SIP) 조건(1/2 Hr 갓나온 스팀-제자리 주기)에 처리하는 것에 의해 다루었다.
오토클레이브 처리는 물체를 멸균시키는데 필요한 시간 간격 초과 및 그 이상 동안 대기입 이상의 증기와 평형하여 존재하는 조건하에서 물과 정적 폐쇄 챔버 가열 주기에 물체(이 경우, 막 또는 장치)를 처리하는 것을 포함한다.
건식 열처리는 용어가 제시하는 바와 같이, 장치 제작 동안 조우할 수 있는 조건이 물체의 성능에 해를 줄 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 물체(막 또는 장치)를 컨벡션 오븐에서 기재된 오토클레이브 온도와 등가인 소정 온도(이 경우)의 건조 공기에 처리하는 것을 포함한다.
제자리 스팀 처리는 물체(막 또는 장치)를 스팀이 비응축성(특정 온도 및 물의 비등점을 초과하는 압력)인 다이나믹 조건하에서 갓나온 스팀에 처리하고 막 또는 막과 같은 것 (필터) 요소를 하우징하는 장치를 통하여 수송하여 스팀에 노출된 모든 표면을 멸균시키는 것을 포함한다.
각 경우에서, 상기 막 성능은 상기 기재한 바와 같이 열 처리된 막을 사용하여 마이크로규모의 장치를 제작하고, 처리량 성능을 측정하며, 또 대조군으로서 열처리되지 않은 장치로부터 얻은 것과 처리량 성능 결과를 비교하는 것에 의해 시험하였다.
제1 세트 실험에서, 막을 습윤 오토클레이브 조건에 노출시켰다.
IL-1%HPC 대조군을 제외한 모든 장치는 4.00% 디아세톤 아크릴아미드 (DACm)를 함유하는 단량체 혼합물을 사용하여 제작하였다. PEGDA575 양을 달리하고 1.00% 1.25% 및 1.50%를 포함한다. 일부 장치는 2-층 필터 요소를 사용하며 이는 2L-로 표시한다.
표 IV는 열처리 없이 또는 장치를 오토클레이브 처리 한 후 또는 장치 제조전에 막을 오토클레이브 처리한 후 다양한 막의 V75, V90 및 10X 투과율에 의해 측정되는 바와 같은 막 처리량 성능을 나타낸다.
표 IV
AM = 변형됨 (무 열처리); ACD = 오토클레이브처리된 장치; 및 ACM = 오토클레이브처리된 막 (장치 제작 이후 시험 전)
이러한 대표적 실험의 결과를 도 7에 도시하며, 이는 무 열처리(AM) 후, 막 함유 장치 (ACD)의 오토블레이브 처리 후 또는 장치 제작 전 막의 오토클레이브 처리 후 (ACM) V75, V90 및 10X 투과율을 사용한 다양한 막의 막 처리량 성능을 도시한다. 상기 성능 결과는 막 장치 투과율 (미소규모 장치(3.1 cm2 유효 여과 면적(EFA)에 의한 비폐색성 스트림(물)의 일정한 유동), 및 아세테이트 완충액 중의 4 g/L 인간 혈장 유래 IgG를 사용하여 pH 4 및 2 mS/cm 도전율에서 결정된, V75 및 V90에서 결정된 성능을 포함한다. 도 7에서, IL 및 2L는 1층 및 2층 막 장치를 각각 의미한다; DP4100는 4.00% DACm 및 1.00% PEGDA를 의미한다; DP4125는 4.00% DACm 및 1.25% PEGDA를 의미한다; DP4150는 4.00% DACm 및 1.50% PEGDA를 의미한다.
관찰된 바와 같이, 대부분의 경우, 오토클레이브에 처리된 모든 막 장치의 경우, 상기 막을 함유하는 장치는 오토클레이브처리되거나 또는 상기 막이 장치 제작 전에 오토클레이브 처리되며, 상기 막 성능은 PEGDA 양 증가에 따라 뿐만 아니라 대조 1L-1%HPC 막에 비해 개선되는 것으로 보여진다.
다른 실험에서, 유사하지만 완전하지는 않지만 동일한 유형의 막 장치는 건조 열 주기(135℃에서 1 Hr)에 노출된다. 이 실험에서, 모든 막은 단일층 장치로 제작된다. 실험한 막 장치는 4.00% 디아세톤 아크릴아미드 (DACm) 및 1% PEGDA575 (DP4100)를 함유하는 단량체 혼합물 또는 4% DACm 및 2% PEGDA575 (DP4200)를 함유하는 단량체 혼합물을 사용하여 변형된 막을 사용하여 제작된다. 대조 장치(2)는 동일한 장치로 제작된 1% 히드록시프로필셀룰로오스 (1% HPC)의 흡착된 코팅을 사용하여 출발 막을 변형하는 것에 의해 제조되며, 이는 상기 장치가 DACm 및 PEGDA에 의해 변형된 막을 하우징하고 있기 때문이다. 변형된 막은 P1 및 P2로 지칭하는 2개의 별개의 공급원으로부터 제조된 PES 막이다.
표 V는 도 8에 도시된 바와 같이 이러한 실험의 결과를 나타낸다. 상기 막 처리량 성능은 앞서 설명한 바와 같이, V75, V90 및 10X 투과율 값을 이용하여 측정된다. 관측된 바와 같이, 변형된 막을 함유하는 모든 실험 장치의 성능(V75 및 V90)은 막 변형 배합물(DP4100, DP4200) 사이의 차이에도 불구하고, 또 막이 건조열처리되었는지 여부에 관계없이 아주 유사하다; 그러나, 일반적으로 변형된 막의 성능은 대조 막(1L-1%HPC P1 및 1L-1%HPC P2)의 성능보다 더 높다. 흥미로운 것은, 그러나, 성능 개선은 PEGDA 양(수준) 증가에 의해 얻어지는데, 오토클레이브 처리에 의해 얻어진 것은 건식 열처리를 이용하여 관찰되지 않는다.
표 V는 변형된 막 샘플(AM)을 사용하여 제작한 장치를 이용하고 부가적 건식열처리 (135℃, 1 시간)에 처리된 동일한 장치를 비교하는 비교 처리량 실험으로부터 능력 및 투과율 결과를 도시한다.
표 V
다른 실험에서, 다양한 막 장치는 제자리 스팀 (SIP) 공정에 처리되어 표준 제자리 스팀 공정이 처리량 성능 (물 투과율, 배지 능력, 보유)에 어떻게 영향을 주는지를 결정한다.
본원발명에 기재된 화학은 2개의 상이한 PES 막 공급원 (막 P1 및 P2)으로부터 제조한 막에 적용된다. 제조된 막 샘플의 1/2은 SIP 조건에 처리한다. 모든 막 샘플을 미세규모 장치로 조립하고 처리량 성능 (투과율 및 능력), 및 바이러스-유사 입자의 보유에 대해 시험한다.
표 VI는 박테리오파지의 투과율, 공급물 처리량, 능력, 및 보유가 다양한 막에 대해 결정되는 실험의 결과를 나타낸다. 공급물은 1x108 pfu/uL PHI-X174 박테리오파지가 스파이크 처리된 밀리-Q 워터 중의 실험용 MX-201 (Beta-CHO) 세포 배양 배지로 구성된다. 결과는 단일 막 요소 25mm 직경 미소규모 장치 (3.1 cm2 EFA)에 대해 결정된다. 각 장치는 어떠한 열처리에 처리되지 않은 변형된(AM) 표시 또는 제자리 스트림 (SIP) 표시를 갖는 상이한 막을 함유한다. 모든 막은 조성에서 PES이며 또 P1 또는 P2로 지칭되고 확인되는 2개의 상이한 중합체 공급원 중의 하나로부터 제조된다. 각각의 막은 A 또는 B로 확인되는 바와 같이 이중으로 시험된다. 1% HPC로 확인된 막은 이 시험의 경우 SIP 처리되지 않는다. 이들은 대조군으로 사용되며 또 장치 성능에서 다양성 정도를 나타내는 작용을 한다. 이들 막 장치는 1% HPC에 의해 변형된 P1 중합체로부터 제작된다. DP4100로 확인된 막은 P1 중합체 및 P2 중합체 막에 모두 적용된 본 발명의 표면 변형 실시형태인 4% DACm - 1% PEGDA를 사용하여 변형된다.
표 VI.
투과율은 비폐색성 완충액(이 경우에서는 밀리-Q 워터)을 장치를 통하여 10분 내지 15분 간격 동안 통과시키고 수집된 완충액의 양을 기록하는 것에 의해 결정된다. 밀리-Q 워터에 용해된 세포 배양 배지를 함유하는 폐색성 스트림은 장치를 통과한다. 배지 처리량(수집된 여액 질량 또는 부피)은 실험 개시로부터 120분에서 측정한다. 막 능력은 제곱 미터(m2)의 단위로서 Amin으로 표시된 최소 면적으로 결정된다. 최소 면적은 임의적으로 소정 시간 간격 내에 소정의 여액 양을 수집하는데 필요한 막 면적으로서 규정될 수 있다. 이 경우에서, 최소 면적은 4 시간 동안 1000 리터의 공급물을 수집하거나 여과하는데 필요한 필터 면적으로서 정의되며 또 각 장치에 대해 기록된 플럭스 감쇄 곡선 (실험 원료 부피 대 시간 데이터)으로부터 산출된다.
보유는 2-5 x 107 pfu/uL (마이크로리터당 플라크 형성 단위)의 역가로 Phi-X174 박테리오파지 (Promega Catalog No. I1041)를 공급물에 스파이킹하는 것에 의해 결정된다. 처리량 실험 개시 전에 1 ml의 공급물 샘플을 공급물 저장소로부터 취한다. 일단 실험이 시작되면, 초기 1 ml 보유 샘플은 약 1분 후 각 장치의 출구에서 안전하게 유지된다. 실험 종료 전에, 최종 1ml 보유 샘플은 각 장치에서 안전하게 유지된다. 상기 실험이 종료되면, 공급물 저장소에서 공급물을 다시 샘플링한다. 상기 공급물 저장소 샘플은 시험의 개시 및 종료시에 파지의 역가 및 따라서 생존을 측정한다. 시험 하는 동안 초기 및 최종 지점에 있는 장치 출구에서 취한 여액 샘플은 초기 생존성 박테리오파지 역가 및 최종 생존성 박테리오파지 역가 사이의 수치적 차이를 결정하기 위해 사용된다. 공급물 저장소 샘플에 대하여 장치 출구로부터 초기 및 최종 역가 사이의 이들 차이는 각 장치에 대한 로그 감소치 (LRV)를 결정하기 위해 사용된다. 일반적으로, LRV는 바이러스 제거가 얼마나 효과적인지의 정도이다. 각 단위 로그 값은 배수(order of magnitude )(10X)로 바이러스 역가에서 감소를 나타낸다. 그러므로, LRV 5는 여액의 바이러스 농도가 공급물의 바이러스 농도의 1/100000임을 의미한다. 초기 및 최종 보유 결과는 도 9a 및 9b에 각각 도시한다. 도 9a는 각 장치의 하나에서 초기 LRV 값을 나타낸다. 도 9b는 각 장치의 하나에서 최종 LRV 값을 나타낸다. 분명히 SIP 처리 후에는 LRV에서 어떠한 유의한 변화도 없고, 또 이 실험에서 시험된 장치에 대한 초기 및 최종 LRV 측정 사이에서 LRV에서 어떠한 유의한 변화도 없었다. 그러나, 1% HPC 장치에 비교하여 모든 DP4100 장치에 대해서는 현저한 능력 개선이 관찰되었다.
실시예
6:
무-
DACm
(
DACm
-free) 막의 처리량 성능의 평가
대표적 실험으로서, 바람직한 처리량 성능을 달성하는데 있어 DACm이 필요한 성분인지 여부를 조사하기 위하여 PEGDA 단독(2 내지 5%)에 의해 변형된 막을 제조하였다. 물에서 2% 내지 5 중량% 범위로 1%씩 증가하는 PEGDA575 농도를 이용하여 일련의 막들을 변형시켰다. PES 막은 기본 막으로 사용되었고 또 앞서 기재한 바와 같은 1% 히드록시프로필 셀룰로오스 (HPC) 변형된 막은 대조군으로 사용하였다. 상기 막 계열에 대한 처리량 성능 시험은 원형(prototype) 화학적으로 변형된 세포 배양 배지 (Beta-CHO, 또한 MX-201라고도 지칭)를 사용하여 실시하였다. 다양한 막 변형은 증가하는 (2%, 3%, 4%, 및 5%) PEGDA 처리 양으로 증가량의 중합체를 막 표면에 부여하기 위하여 PEGDA575 용액-습윤된 PES 기본 막의 전자 빔 개시된 제자리(in-situ) 중합화를 이용하여 제조하였다. 각 변형의 평균 능력 및 평균 투과율 (이중 측정)은 도 10에 도시된다.
도 10에 도시된 바와 같이, 능력은 PEGDA 처리 양 농도 증가에 따라서 증가하는 반면에, 투과율은 역으로 감소하는 것으로 관찰되었다.
전반적인 처리량 성능에 대하여, 실시된 모든 PEGDA 변형된 막은 현저한 인자(V75: 2.86 내지 4.72; V90: 3.96 내지 6.10)로 제어한다. 상기 성능 결과는 표 III에 요약된 결과와 비교되며, 여기서 4%DACm-1% PEGDA575 변형은 V75의 경우 6.78의 성능 개선 인자를 초래하며 1% HPC-변형된 막에서 V90의 경우 4.29를 초래한다. 또한, 배합물(HEA-TEGDA, 표 III 중)은 V75에 대해 2.65 또 V90에 대해 1.69인 대조 막에 비하여 성능 개선 인자를 나타내었다.
다른 대표 실험에서, 2%, 3%, 4%, 및 5% PEGDA575 처리 수준의 막을 제조하고 또 Life Technologies CD Opti-CHO 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 사용하여 시험하였다. 1% HPC 대조 막과 비교하여 상기 처리량 성능은 개선된 것으로 관찰되었다. 그러나, 성능은 PEGDA 처리 수준이 증가함에 따라서 계속 감소된다. 이것은 도 11에 도시되어 있다. 도 11에서, 능력은 단위 Amin로 측정되며, 이 경우에서 4 시간의 기간에 걸쳐 1000 리터의 배지를 처리하는데 필요한 최소 막 면적 (m2 단위)으로 정의된다. 분명히, 실험이 최초 150분간에 걸쳐 수집된 여액의 양에 대한 Amin의 정반대 관계가 관찰되었다. 그러므로, 낮은 Amin은 더 높은 능력에 상응한다. 2개의 상이한 배지 스트림에 대한 이들 막의 대향하는 성능 트렌드로 인하여, 막 성능은 다수의 공급스트림을 사용하여 더욱 평가하였다. 도 10에 도시된 MX-201 배지를 사용한 막 성능 결과는 증가하는 PEGDA 처리 수준에 따라 증가하는 반면에, 도 11에 도시된 CD Opti-CHO 결과를 사용한 막 성능 결과는 PEGDA 처리 수준에서 동일 증가에도 감소하였다. MX-201 배지는 Opti-CHO 배지보다 더 많이 오염된 것으로 보인다. 그 결과, MX-201 배지를 사용한 장치 성능은 투과율에 의한 영향을 덜받고 또 배지에 의한 오염에 의해 더 많은 영향을 받는다. 반면에, Opti-CHO 배지는 덜 오염되므로, 장치 성능은 배지에 의한 오염의 영향에 비하여 투과율에 더 많이 의존적이다.
실시예
7: 다수의
공급스트림을
사용한 무
DACm
막 및
DACm
-
PEGDA
막의 성능 평가
또 다른 대표적 실험에서, DACm를 갖지 않는 막의 매력적인 성능 트렌드로 인하여, PEGDA 단독에 의해 또는 DACm 및 PEGDA에 의해 변형된 일련의 막을 처리량 성능에 대해 조사하였다. 1개 대조군은 1% HPC 표면 변형에 의한 소수성 PES 바이러스 막으로 구성되고, 제2 대조 막은 4% DACm 및 1% PEGDA575에 의해 변형된 PES 바이러스 막으로 구성된다. 상기 제2 대조군은 이 실험에서 다른 막과 비교한 상이한 소수성 막 로트(lot)를 사용하여 제조한다. 3개의 잔류하는 막은 1% PEGDA 변형, 1% PEGDA 및 1% DACm 변형이고, 및 최종적으로 1% PEGDA575 및 4% DACm 변형이다. 상기 막 세트에 대해 이하의 공급스트림 각각으로부터 하나씩 3개의 데이터 세트를 수집한다: 1) 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지, Life Technologies CD Opti-CHO; 2) 상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 CHO 세포 배양 배지, EMD Cellvento 200; 및 3) 실험적으로 고안된 공급스트림, 2 g/리터의 Pluronic가 스파이크된 듈베코 변형된 이글 배지.
도 12는 다양한 막의 대조적 처리량 성능을 도시한다. 표면 변형은 (도에서 좌측에서부터 우측으로) 1% HPC에 의해 변형된 대조 막; 4% DACm 및 1% PEGDA575에 의해 변형된 막; 1% PEGDA575 만으로 변형된 막; 1% DACm 및 1% PEGDA575에 의해 변형된 막; 및 4% DACm 및 1%PEGDA575에 의해 변형된 막. 낮은 오염 배지로 간주되는 CD Opti-CHO 배지를 사용하면, 낮은 DACm 및 무-DACm 표면 변형된 막은 비교적 잘 실시되고 도 11에 도시된 2% PEGDA 막과 매우 유사함이 관찰된다. 높은 오염성 Cellvento-200 배지의 경우, 고 수준의 DACm 표면 변형 만이 잘 실시된다. 이는 높은 DACm-수준 표면 변형이 시험된 공급스트림의 가장 넓은 세트에 대해 개선된 처리량 성능을 제공함을 나타낸다.
본 명세서는 참조로 본 명세서에 포함되는 명세서에 인용된 참고문헌의 가르침을 참조하여 대부분 잘 이해된다. 본 명세서에 내의 실시양태는 본 발명에서 실시예의 설명을 제공하며 그 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 인지할 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 본 발명의 명세서와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 발명의 명세서에 개시된 내용이 그러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 본 발명의 명세서에서 이용된 성분, 세포 배양물, 처리 조건 등과 관련된 양을 표현하는 모든 숫자는 예를 들어 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이고 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 이 시리즈 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상적인 실험 이외에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변이는 당업자에게 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 기재된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 표시된다.
Claims (25)
- 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형된 표면을 갖는 다공성 막으로서, 비-아크릴아미드 가교성 단량체가 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트이고, 다공성 막이 비대칭 막이며, 비대칭 막이 폴리에테르술폰 (PES) 막이고, 아크릴아미드가 메틸렌-비스-아크릴아미드가 아닌 다공성 막.
- 제1항에 있어서, 상기 중합체는 에너지 공급원을 사용하여 다공성 막의 표면 상에 직접 코팅되는 다공성 막.
- 제2항에 있어서, 상기 에너지 공급원은 열, 전자 빔, 자외선 및 감마 방사선으로 구성된 군으로부터 선택되는 다공성 막.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 제1항의 다공성 막을 통하여 여과하는 것을 포함하는, 화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 바이러스 오염물을 제거하는 방법.
- 하기 구조를 포함하는 중합체에 의해 변형된 다공성 비대칭 PES 막:
식 중에서,
M1은 중성 DACm 단량체: H2C = CH - C(O) - NH - C(CH3)2 - CH2 - C(O) - CH3 이고;
M2는 중성 PEGDA 단량체: H2C = CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O)- CH = CH2이며;
M1’은 라디칼화된 DACm 단량체: *H2C - CH - C(O) - NH - C(CH3)2 - CH2 - C(O) - CH3이고;
M2’는 라디칼화된 PEGDA 단량체: *H2C - CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O) - CH - CH2* 이며;
n = 6, 7, 8, 9, 10, 11 이며; 또
기호 "*"는 알켄일 라디칼임. - 하기 구조를 포함하는 중합체에 의해 변형된 다공성 비대칭 PES 막:
식 중에서,
M1 및 M2는 중성 PEGDA 단량체: H2C = CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O)- CH = CH2 이고;
M1’및 M2’는 라디칼화된 PEGDA 단량체: *H2C - CH - C(O) - O - (CH2-CH2-O)n - C(O) - CH - CH2* 이며;
n = 6, 7, 8, 9, 10, 11이며; 또
기호 "*"는 알켄일 라디칼임. - (a) 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 제공하는 단계; 및
(b) 배지를 바이오리액터로 전달하기 전 또는 전달하는 동안 제1항에 기재된 다공성 막을 통하여 화학적으로 정의된 세포 배양 배지를 여과하는 단계를 포함하며,
상기 바이오리액터 내의 화학적으로 정의된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 바이러스성 오염물의 양은 변형된 막을 통하여 배지를 여과하기 전의 양보다 낮은,
화학적으로 정의된 세포 배양 배지로부터 하나 이상의 바이러스성 오염물을 제거하는 방법. - 제10항에 있어서, 상기 막은 장치에 혼입되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 장치는 디스크, 주름형 카트리지, 나선형으로 구부러진 카트리지 및 복수판 평탄 시트로부터 선택되는 포맷인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제10항에 있어서, 단계(b) 이후의 하나 이상의 바이러스 오염물 양은 적어도 1 Log10 감소치(LRV) 또는 적어도 4 Log10 감소치 (LRV) 또는 적어도 6 Log10 감소치 (LRV) 만큼 감소되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 여과는 24 시간 미만 동안 실시되는 방법.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 상기 여과는 24 시간 미만 동안 실시되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 여과는 4 내지 8 범위의 pH에서 실시되는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 여과는 4 내지 8 범위의 pH에서 실시되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 여과는 20℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 실시되는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 여과는 20℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 실시되는 방법.
- (a) 바이러스 보유 막을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 막을 무작위로 배열되고 가교된 디아세톤 아크릴아미드 단량체 및 하나 이상의 비-아크릴아미드 가교성 단량체를 포함하는 중합체에 의해 변형하는 단계를 포함하며,
상기 변형된 막을 화학적으로 정의된 세포 배양 배지 중의 하나 이상의 성분에 의한 파울링(fouling)은 비변형된 막에 비하여 감소되는,
화학적으로 정의된 세포 배양 배지 중의 하나 이상의 성분에 의한 바이러스 보유 막의 파울링을 감소시키는 방법으로서,
비-아크릴아미드 가교성 단량체가 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트이고, 바이러스 보유 막이 비대칭 막이며, 비대칭 막이 폴리에테르술폰 (PES) 막이고, 아크릴아미드가 메틸렌-비스-아크릴아미드가 아닌 방법. - 제23항에 있어서, 상기 바이러스 보유 막은 PVDF 막, 셀룰로오스성 막 또는 나일론 막인 방법.
- 삭제
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