CN105713224B - 从细胞培养基中去除微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于从化学成分确定的细胞培养基中去除病毒污染物的组合物和方法。本文提供的组合物耐受被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染减少。

Description

从细胞培养基中去除微生物
技术领域
本文公开的实施方案涉及从细胞培养基中去除包括病毒在内的微生物的组合物和方法。
背景技术
用于蛋白生产的常规方法通常包括细胞培养方法，例如重组工程化以在生物反应器中利用化学成分确定的细胞培养基产生所关注的蛋白(例如，单克隆抗体)的培养哺乳动物或细菌细胞系。减少生物反应器被微生物如细菌、真菌、支原体和病毒污染是生物制药产业的重要问题，特别是在所关注的蛋白用于治疗用途时更是如此。
在微生物中，细菌、真菌和支原体通常可以通过适当滤器过滤细胞培养基来去除。例如，一般认为具有0.2μm(um)标称孔径评级的微滤膜适合用于去除Brevendumonasdiminuta属的细菌。认为具有0.1μm标称孔径评级的膜适合用于去除支原体，主要是莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)属。参见，例如，Folmsbee和Moussorakis,BioProcessInternational,Vol.10,No.5,2012,pp.60–62(May 2012)。此外，认为具有20nm标称孔径评级的膜适合实现代表最小病毒的细小病毒或细小病毒样颗粒的最小4对数减少。
人们认为产生具有用于病毒去除的孔径评级的膜是具有挑战性的，因为减少孔径评级从而保留病毒可以导致膜孔的部分或完全收缩，从而使膜通透性显著降低至不期望的水平。此外，目前没有特别设计用于在上游过程中有效去除病毒并可商购的膜滤器。
通常用于细胞培养步骤下游的病毒屏障滤器对于去除上游病毒无效的原因之一是由于上游和下游组合物之间的显著差异。例如，在上游过程的情况下，细胞培养基中没有细胞或表达的蛋白。但是，存在营养素、脂质、氨基酸和其他组分(例如，提供流体动力学细胞保护的普流罗尼克(Pluronic)F68)，全部是细胞生长和成活所需要的。相比之下，在下游过程的情况下，细胞培养基包含细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白以及表达的蛋白。因此，在下游过程的情况下，常使细胞培养基在进行病毒过滤步骤之前进行许多纯化步骤以去除不期望的病毒过滤污染物。
值得注意的是，因为需要纯化的组合物性质的差异，例如，在上游病毒去除情况下的化学成分确定的细胞培养基相比在下游病毒去除情况下的包含表达的重组蛋白的细胞培养基，通常在下游用于病毒去除的膜滤器在上游为了相同目的使用时往往不会工作太好。参见，例如，Zydney et al.,Journal of Membrane Science,297:16-50(2007)。
已尝试开发病毒屏障滤器，其可以特异性地用于在上游过滤化学成分确定的细胞培养基。参见，例如，Biotechnol Prog.,16:425-434(2000)讨论了用各种滤器获得的病毒保留结果。如这篇论文中证实的，再生纤维素滤器显示出测试的任何滤器中最高的通量，并且还表现出高病毒保留；但是，这样的膜并不适合于目前工业中通常采用的灭菌方法，通过适当汽蒸或通过γ辐射灭菌。虽然，这篇论文还描述了PES滤器，但是由于其低通量，一般认为这种滤器不适合作为病毒屏障滤器用于上游用途。
此外，美国公开第20130344535号讨论了利用超过24小时的过滤时间和利用某些孔隙度的滤器过滤化学成分确定的细胞培养基以去除病毒污染物。
发明内容
本文公开的实施方案提供新组合物，其用于从化学成分确定的培养基中去除微生物，特别是病毒，所述化学成分确定的培养基用于培养表达所关注的蛋白的细胞。因此，这类组合物可以在将细胞培养基转入生物反应器的步骤之前使用，所述生物反应器用于培养细胞，例如表达所关注的重组蛋白的哺乳动物细胞。
本文所述的组合物是基于膜的表面改性，其获得这样的膜，当化学成分确定的细胞培养基滤过所述膜时，所述膜表现出被所述培养基中的一种或多种组分污染减少。
在一些实施方案中，本文所述的组合物涉及具有用聚合物改性的表面的多孔膜，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺(diacetone acrylamide)单体以及一种或多种非丙烯酰胺(non-acrylamide)可交联单体。
在各种实施方案中，利用能源将包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体的聚合物直接包覆在多孔膜的表面上。示例性能源包括但不限于热、电子束、紫外光和γ辐射。
示例性非丙烯酰胺可交联单体包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甘油二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯。在一具体实施方案中，非丙烯酰胺可交联单体为PEGDA。
在一些实施方案中，所述多孔膜为不对称膜，例如，聚醚砜(PES)膜。
本文还提供利用所述改性的多孔膜从化学成分确定的细胞培养基中去除病毒污染物的方法，例如，通过所述改性的膜过滤化学成分确定的细胞培养基。
在一些实施方案中，用包含以下结构的聚合物改性多孔不对称PES膜：
其中，
M1为中性DACm单体：H2C＝CH-C(O)-NH-C(CH3)2-CH2-C(O)-CH3；
M2为中性PEGDA单体：H2C＝CH-C(O)-O-(CH2-CH2-O)n-C(O)–CH＝CH2；
M1’为自由基化的DACm单体：*H2C-CH-C(O)-NH-C(CH3)2-CH2-C(O)-CH3；
M2’为自由基化的PEGDA单体：*H2C-CH-C(O)-O-(CH2-CH2-O)n-C(O)-CH-CH2*；
P指随机聚合物网络；
n＝6、7、8、9、10、11；并且
符号“*”指烯基自由基。
在一些实施方案中，用聚合物改性多孔不对称PES膜，所述聚合物包含以下结构：
其中，
M1和M2指中性PEGDA单体：H2C＝CH-C(O)-O-(CH2-CH2-O)n-C(O)–CH＝CH2；
M1’和M2’指自由基化的PEGDA单体：*H2C-CH-C(O)-O-(CH2-CH2-O)n-C(O)-CH-CH2*；
P指随机聚合物网络；
n＝6、7、8、9、10、11；并且
符号“*”指烯基自由基。
在一些实施方案中，提供从化学成分确定的细胞培养基中去除一种或多种病毒污染物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供化学成分确定的细胞培养基；以及(b)在将培养基转入生物反应器之前或期间通过多孔膜过滤所述化学成分确定的细胞培养基，其中所述膜具有用聚合物改性的表面，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体，其中所述生物反应器内的化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种病毒污染物的水平低于通过所述改性的膜过滤所述培养基之前的水平。
在一些实施方案中，将本文所述改性的膜并入装置。示例性装置形式包括但不限于圆盘(disc)、折叠筒(pleated cartridge)、卷绕式筒(spirally wound cartridge)和多片平板(multi-plate flat sheet)。
在一些实施方案中，所述化学成分确定的细胞培养基是可商购的化学成分确定的细胞培养基，例如，Lonza Power CHO、CD Opti CHO、EMD Millipore Cellvento CHO 100和Cellvento CHO 200。
利用本文所述的改性的膜，化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种病毒污染物的水平降低至少1Log10减少值(LRV)或至少4Log10减少值(LRV)或至少6Log10减少值(LRV)。
在各种实施方案中，将化学成分确定的细胞培养基通过本文所述的改性的膜过滤少于24小时的时间。在一些实施方案中，在范围为4-8的pH下和/或在范围为20℃-25℃的温度下进行过滤。
本文还提供减少病毒保留膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供病毒保留膜；以及(b)用包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体的聚合物改性所述膜，其中相对于未改性的膜，改性的膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染减少。
在一些实施方案中，病毒保留膜是基于PES膜、PVDF膜、纤维素膜或尼龙膜。
在一些实施方案中，非丙烯酰胺可交联单体为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
附图说明
图1的条形图示出利用CHO细胞培养基作为进料流，有或无普流罗尼克F68暴露的双丙酮丙烯酰胺(DACm)均聚物改性的PES膜的处理量性能结果。前5个数据集代表如通过V75(L/m2)、V90(L/m2)和10X通透性(L/m2h psi)测量的，利用不同百分比的DACm溶液(2％、4％、6％、8％和10％)改性的膜的膜性能；而后5个数据集代表也通过V75(L/m2)、V90(L/m2)和10X通透性(L/m2h psi)测量的，有F68暴露的相同膜的膜性能。
图2示出一式两份测试的，包含4％DACm-1％MBAm改性的PES膜或4％DACm-1％PEGDA改性的PES膜或1％HPC改性的PES膜(作为对照)的膜装置的通量衰减曲线。Y-轴代表表示为(J/J0)％百分比的通量衰减，该百分比是基于对非阻塞性或非污染性进料流(例如，Milli-Q水)确定的通量J0的百分比；而X-轴代表通过每平方米膜收集的滤液的升数(L/m2)表示的膜的处理量或容量。
图3的条形图示出4％DACm-1％MBAm、4％DACm-1％PEGDA和1％HPC(作为对照)表面改性的PES膜的容量和通透性。CHO细胞化学成分确定的细胞培养基用作进料流。X-轴代表膜，而Y-轴代表V75(L/m2)、V90(L/m2)和10X通透性(L/m2h psi)。
图4的条形图示出测试的各种膜装置的平均容量和通透性，为测量的V75、V90和10X通透性。构建每个膜装置以容纳各种表面改性的膜中每种的单层(1L-)。1％HPC指单层膜装置，其具有通过浸没施用的吸附聚合物预处理，并且包含1.00重量(Wt)％羟丙基纤维素(HPC)水溶液，以10％己二醇用作膜湿润助剂；3.75％LB20指单层膜装置，其具有通过原位电子束固化以3.75％的浓度施用的自交联的高度乙氧基化的三丙烯酸酯单体；4.00％-DACm-1％MBAm指单层膜装置，其具有单官能团的乙烯基单体4％双丙酮丙烯酰胺(DACm)，以及与DACm形成共聚物的二丙烯酰胺交联剂1％亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAm)；2.00％LB20-1％HEA-0.75％TEGDA指单层膜装置，其具有2％LB20，1％丙烯酸羟乙酯(HEA)以及0.75％四乙二醇二丙烯酸酯(双官能团或交联单体)；而4.00％-DACm1％-PEGDA575指单层膜装置，其具有4％DACm和1％PEGDA575，PEGDA575为575数均分子量(MWt)的聚乙二醇二丙烯酸酯。
图5示出的图代表一式两份测试的每种单层膜装置的平均体积对时间的曲线。测试的膜装置为：1％HPC；3.75％LB20；4.00％DACm-1％MBAm；2.00％LB20-1％HEA-0.75％TEGDA；和4.00％-DACm1％-PEGDA575。X-轴代表使CHO细胞培养基通过各种膜装置之后收集的滤液的体积(ml)；而Y-轴代表时间(min)。
图6示出的图代表获得自一式两份测试的每种单层膜装置的通量衰减曲线。测试的膜装置为：1％HPC；3.75％LB20；4.00％DACm-1％MBAm；2.00％LB20-1％HEA-0.75％TEGDA；和4.00％-DACm1％-PEGDA575。X-轴代表膜容量(L/m2)，而Y-轴代表通量衰减(J/J0)。如图6所示，通过较慢通量衰减的方式，DACm-PEGDA575共聚物改性的膜装置具有优于测试的其他改性的处理量性能优势。
图7的条形图代表如通过V75(L/m2)、V90(L/m2)和10X通透性(L/m2h psi)测量的，热处理之前和之后一系列各种膜装置的容量和通透性。测试的膜装置为3类：未热处理(AM)的改性膜，其如下所示：1L-DP4100AM(即，4.00％-DACm1％-PEGDA)；2L-DP4100AM1；和IL-DP4100AM2；在装置中于134℃下高压灭菌1小时的改性膜(ACD)，其如下所示：1L-DP4100ACD；IL-DP4125ACD(即，4.00％-DACm1.25％-PEGDA)和IL-DP4150ACD(即，4.00％-DACm1.50％-PEGDA)；在134℃下高压灭菌1小时然后进行装置配置的改性膜(ACM)，其如下所示：IL-DP4100ACM；IL-DP4125ACM和IL-DP4150ACM。单层1L-1％HPC膜用作对照。X-轴代表各种膜装置，而Y-轴代表容量V75、V90和10X通透性，利用pH 4和2mS/cm电导率的乙酸盐缓冲液中的4g/L人血浆衍生的IgG确定。
图8的条形图代表如通过V75(L/m2)、V90(L/m2)和10X通透性(L/m2h psi)测量的，干热处理之前(AM)和之后(DH)膜的容量和通透性。测试的膜流延(cast)自两种不同来源的PES聚合物，在本文中称作P1和P2。测试的膜装置为：1％HPC P1和1％HPC P2作为对照；没有热处理(AM)的改性膜，其如下所示：DP4100AM P1；DP4200AM P1(即，4.00％-DACm2.00％-PEGDA)；DP4100AM P2和DP4200AM P2；用干热(DH)处理的改性膜，其如下所示：DP4100DHP1、DP4100DH P2和DP4200DH P2。X轴代表各种膜装置，而Y轴代表容量V75、V90和10X通透性，利用pH 4和2mS/cm电导率的乙酸盐缓冲液中的4g/L人血浆衍生的IgG确定。
图9a和9b的条形图示出如在实验开始(初始LRV，在9a中示出)和实验结束(最终LRV，在9b中示出)时测量的，在线蒸汽(steam-in-place，SIP)处理之前和之后各种膜的对数保留值(LRV)Phi-X174。测试的膜流延自两种不同来源的PES聚合物，在本文中称作P1和P2，并且一式两份测试(称作A和B)。测试的膜装置为：1％HPC P1作为没有热处理(AM)的对照，一式两份使用(称作1％HPC P1AM A和B)；没有热处理(AM)的改性膜(即，4.00％-DACm1.00％-PEGDA)，其如下所示：DP4100P1AM A；DP4100P2AM A；DP100P2AM A；D4100P1AMB；和D4100P2AM B；以及用在线蒸汽处理(SIP)的改性膜(即，4.00％-DACm1.00％-PEGDA)，其如下所示：DP4100P1SIP A；DP4100P2SIP A；DP4100P1SIP B；和DP4100P2SIP B。X-轴代表各种膜装置，而Y-轴表示代表LRV。
图10的条形图示出利用化学成分确定的CHO细胞培养基用范围2-5％的PEGDA-575改性的PES膜获得的平均容量和通透性结果(V75、V90和10X通透性)。1％HPC膜用作对照。
图11的条形图示出用范围2-5％的PEGDA-575改性的PES膜容量以及在4小时内过滤1000升培养基所需要的最小面积。1％HPC用作对照膜。左边的Y-轴代表在150分钟时Opti-CHO滤液体积和膜容量，而右边的Y-轴代表在4小时内过滤1000升的最小面积。
图12的条形图示出利用3种不同化学成分确定的培养基(即，Cellvento CHO-200、CD Opti-CHO和掺入2g/L普流罗尼克F68的DMEM)的各种膜的容量。测试的膜为：用1％HPC改性的PES(用作对照)；用4％DACm-1％PEGDA改性的PES膜；用0％DACm-1％PEGDA改性的PES膜；用1％DACm-1％PEGDA改性的PES膜；以及用4％DACm-1％PEGDA改性的PES膜。X-轴代表膜的类型，而Y-轴代表Amin，其为在4小时内过滤1000升培养基所需要的最小面积。
具体实施方式
本文所述的实施方案涉及从化学成分确定的细胞培养基中去除微生物如病毒污染物的组合物和方法，其中所述组合物表现出被化学成分确定的细胞培养基的组分污染减少。
具体地，本文所述的实施方案提供组合物和方法，其采用具有用聚合物改性的表面的多孔膜，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体如聚乙二醇二丙烯酸酯。
本文还提供通过用聚合物改性膜表面来制备抗化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染的病毒屏障膜的方法，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体(例如，PEGDA)。
为了可以更容易地理解本文公开的实施方案，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明书中示出。
I.定义
术语“化学成分确定的细胞培养基”指适合哺乳动物细胞(例如，人或动物细胞)的细胞培养的生长培养基，其中所有化学组分是已知的。可商购的化学成分确定的细胞培养基的实例包括但不限于Lonza Power CHO、CD Opti CHO、EMD Millipore Cellvento CHO100和Cellvento CHO 200。
已证实流体动力学细胞保护的两亲化合物，特别是普流罗尼克F68(BASF)和/或泊洛沙姆(Poloxamer)188(ICI)是各种可商购的化学成分确定的细胞培养基中导致膜滤器污染的主要培养基组分。因为已观察到这些组分中的一种或多种引起膜污染，它们显著降低膜滤器去除病毒污染物的效率。
本文所述的实施方案涉及膜组合物，其甚至在已知污染膜的培养基组分如普流罗尼克F68的存在下有效去除病毒污染物。
在本文中可交换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”指可能存在于化学成分确定的细胞培养基中的不期望的或有害的微生物。在一具体实施方案中，这样的微生物为病毒或病毒颗粒。在各种实施方案中，本文所述的组合物和方法意图通过膜滤器过滤化学成分确定的细胞培养基来从化学成分确定的细胞培养基有效去除这类病毒污染物，其中将所述膜滤器改性以减少或消除被通常存在于可商购的化学成分确定的培养基中的某些组分污染。因此，本文所述的实施方案提供甚至在暴露于通常污染大多数病毒保留膜的组分时仍保持它们的病毒保留能力和膜处理量的组合物。
可以利用本文所述的组合物和方法去除的病毒污染物或潜在的病毒污染物包括正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、RetParvoviridae、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)或呼肠孤病毒科的成员。更具体地，病毒污染物可以是以下中的任一种：犬细小病毒(canine Parvovirida)(CPV)、小鼠细小病毒(minute virus of mice)(MVM)、卡奇谷病毒(Cache Valley virus)、布尼亚维拉病毒(Bunyamwera virus)、诺斯维脑炎病毒(Northway encephalitis virus)、流感NB病毒(Influenza NB virus)、胡宁病毒(Junin virus)、副流感病毒(Parainfluenza virus)1/2/3、猿猴病毒(Simian virus)5、流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus)、仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、小鼠肺炎病毒(neumonia virus of mice)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、牛冠状病毒(Bovinecoronavirus)、鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus)、黄热病病毒(Yellow fevervirus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、登革热病毒(Dengue virus)、蜱传脑炎病毒(Tickborne encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、水泡疹病毒(Vesivirus)2117、脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)B-3、Theiler's小鼠脑炎病毒(Theiler's mouse encephalitisviru)、口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus)、牛肠道病毒(Bovineenterovirus)、猪肠道病毒(Porcine enterovirus)、西门利克森林病毒(Semliki Forestvirus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、风疹病毒(Rubella virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitisvirus)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus)、泡沫病毒(Foamy virus)、呼肠病毒(Reovirus)1/2/3、禽呼肠病毒(Avianreovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)1、腺病毒(Adenovirus)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、鼠gammaherpes 68、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)1、蛙病毒(Frog virus)3、小鼠细小病毒-cutter(minute virusof mice-cutter)(MVMc)、蓝舌病病毒(bluetongue virus)(BTV)、流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus)(EHDV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viraldiarrhea virus)(BVDV)、猪细小病毒(porcine parvovirus)(PPV)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)(EMCV)、呼肠病毒3、和鼠白血病病毒(MuLV)、甲型肝炎、脊髓灰质炎或细小病毒(Parvoviridae)B19。
如本文所用，术语“对数减少值”(LRV)指如进料流(例如，化学成分确定的细胞培养基)中的颗粒计数比病毒过滤膜穿透液中的颗粒计数的比例的对数(底数10)所定义的，膜保留颗粒如病毒污染物的效率的度量。在本文所述的各种实施方案中，膜滤器达到病毒污染物的至少1Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少2Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少3Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少4Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少5Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少6Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少7Log10减少值(LRV)，或病毒污染物的至少8Log10减少值(LRV)，优选病毒污染物的至少4Log10减少值(LRV)。
术语“污染”指溶质或颗粒以降低膜性能的方式沉积在膜表面上或沉积入膜孔的过程，例如，膜通量和/或处理量的下降。在本文所述的各种实施方案中，提供病毒膜滤器，其耐受被化学成分确定的细胞培养基中存在的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基中存在的一种或多种组分污染减少。此外，本文提供的方法可以用于制备组合物，其耐受被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染减少。
如本文所用，术语“通量”或“膜通量”(J)指穿透液流动的瞬时速率，其性质一般是可变的(表示为每单位时间每单位有效过滤面积(EFA)通过病毒过滤膜的穿透液的体积或重量，例如L/(m2×hr)或g/(m2hr)或Kg/(m2hr))。
如本文所用，术语“初始通量”或“初始膜通量”(Jo)指穿透液流动的速率，当穿透液流由非阻塞性流体(即，水或不含膜污染组分的溶液)组成时，其性质通常是恒定的。
如本文所用，术语“通量衰减”或“膜通量衰减”(J/Jo)指阻塞性穿透液流的瞬时膜通量比初始通量或者非阻塞性穿透液流通过滤器或膜确定的通量的比例。其通常表示为百分比，即，(J/Jo)％。
术语“通量衰减曲线”指将通量衰减(J/Jo)对时间(t)，或者对收集的滤液的体积(v)或质量(m)，或者优选地，对每单位有效过滤面积收集的滤液的体积(v)或质量(m)(即，(J/Jo)％vs L/m2，或者(J/Jo)％vs Kg/m2)作图时产生的曲线。
术语“处理量(throughput)性能”在本文中指通量降至初始通量(对非阻塞性流确定的通量)的25％或10％之前有效过滤面积的每单位面积可以回收的滤液的量。
术语“分批过滤”在本文中指过滤过程，其中将特定量或体积的化学成分确定的培养基一批过滤通过膜滤器以完成过滤过程，然后将过滤的培养基转移至或用于方法中的下一步。
术语“连续过滤”或“串联(in line)过滤”指过滤过程，其中将特定量或体积的化学成分确定的细胞培养基连续过滤通过膜滤器，并且其中在过滤时将过滤的培养基转移至或可以用于方法中的下一步。
本文所述的所有实施方案可以利用分批或连续过滤进行。
如本文所用，术语“固体支持物”一般指用包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体的聚合物改性的任何材料。示例性非丙烯酰胺可交联单体为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
用于本文所述方法和组合物的固体支持物形式的实例包括但不限于膜和整体柱。在一具体实施方案中，固体支持物为多孔膜，其表面如本文所述进行改性。示例性膜包括但不限于多孔不对称膜，例如聚醚砜膜(PES)，如利用美国专利公开第20120076934号中描述的方法制备的膜。
如本文所用，术语“表面”指多孔介质或膜的整个表面积，包括多孔介质或膜的外表面和内表面。术语“外表面”表示暴露于视野的表面。术语“内表面”意图表示多孔网络的内表面，即多孔介质或膜的空隙面积。
如本文所用，术语“聚合物”指制备自至少两种具有反应位点的交联单体的聚合物，其中所述单体随机排列且可以参与聚合反应，并且其中至少一种单体为双丙酮丙烯酰胺。在一些实施方案中，聚合物包含双丙酮以及至少一种或多种非丙烯酰胺可交联单体，例如，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
单官能单体是具有单一不饱和官能团的单体。多官能单体是具有一个以上不饱和官能团的分子。
术语“病毒滤器”或“病毒保留滤器(virus retention filter)”或“病毒保留滤器(viral retention filter)”或“病毒屏障滤器”指膜或介质，其保留病毒或病毒样颗粒以在上游使用(即，在与细胞接触之前过滤细胞培养基)或下游使用(即，过滤包含重组表达的蛋白的细胞培养基)期间提供病毒去除或病毒清除。可商购的病毒保留滤器的实例包括Pro、NFP和NFR，其主要通过大小排阻机制发挥功能。本文所述的实施方案涉及病毒屏障滤器，其意图在上游使用，并且位于用来培养表达所关注的蛋白的细胞的生物反应器的上游。将这类病毒屏障滤器改性，从而它们耐受被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染减少。
在本文中可交换使用的术语“进料”或“进料流”指经历过滤过程的溶液或混合物，例如，化学成分确定的细胞培养基。
在本文中可交换使用的术语“滤液”或“穿透液”指穿过滤器或膜的溶液以及已穿过滤器或膜的溶液。
如本文所用，术语“保留物”指保留且不穿过滤器或膜以及尚未穿过滤器或膜的溶液的组分。
如本文所用，术语“生物反应器”指支持生物活性环境的任何制造或设计的装置或系统。在某些情况下，生物反应器是其中进行生物培养过程的容器，其包含生物体或源自这类生物体的生物化学活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。在一些实施方案中，生物反应器的大小范围为升至立方米，并且由不锈钢制成。在一些实施方案中，生物反应器由除钢以外的材料制成，并且是一次性或单次使用的。考虑生物反应器的总体积可以是从100mL至高达10,000升或更多的任何体积，这取决于具体过程。在本文所述方法和系统的一些实施方案中，将生物反应器连接至本文所述的病毒滤器，其中病毒滤器位于生物反应器的上游。
II.示例性固体支持物
本文公开的实施方案提供用包含随机排列的交联单体的聚合物改性的固体支持物。本申请涵盖的固体支持物保留化学成分确定的细胞培养基中存在的病毒污染物，甚至在已知快速污染下游病毒纯化应用中使用的病毒保留膜的细胞培养组分的存在下也是如此。本申请涵盖的固体支持物耐受被化学成分确定的细胞培养基中存在的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基中存在的一种或多种组分污染减少。
不希望被理论束缚，考虑可以使用任何合适的固体支持物。例如，固体支持物可以是多孔或无孔的，或者其可以是连续的，如整体柱或膜的形式。示例性连续多孔固体支持物包括微孔膜，即具有约0.05微米-10微米的孔径。可以用于本文公开的实施方案的组合物和方法的多孔膜可以分类为性质对称或不对称，其指跨越膜厚度的孔径的均匀性，或者，对于中空纤维，指跨越纤维的微孔壁的孔径的均匀性。
如本文所用，术语“对称膜”指跨越膜截面具有基本上均匀的孔径的膜。在一具体实施方案中，不对称膜用作固体支持物。如本文所用，术语“不对称膜”指其中跨越膜截面平均孔径不恒定的膜。在一些实施方案中，在不对称膜的情况下，孔径可以作为整个膜截面的位置的函数均匀或不连续变化。在一些实施方案中，不对称膜可以具有一外表面上的孔径比相反外表面上的孔径的比例，该比例基本上大于1。可以如本文所述改性的不对称膜的实例为聚醚砜(PES)膜。PES膜可以商业上获得自供应商如Sumitomo和Solvay。
制备自各种材料的各种膜可以用于本文所述的组合物和方法。可以用来制备可以用于本文所述组合物和方法的膜的示例性聚合物包括但不限于取代或未被取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯亲水聚合物、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、全氟化热塑性聚合物、聚烯烃、芳香聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯以及它们的组合。
示例性可商购的微孔膜为可获得自EMD Millipore Corp.(Billerica,MA)的和Millipore可获得自Pall Corp.(Port Washington,NY)的以及可获得自Sartorius Stedim Biotech S.A.(Aubagne Cedex,France)的和其他示例性连续固体支持物为整体柱，如可获得自BIASeparations(Villach,Austria)的整体材料。
可商购的病毒保留滤器的实例包括Pro、NFP和NFR，其主要通过大小排阻机制发挥功能。可以如本文所述将用于制备这些病毒保留滤器的基底膜基质改性以产生膜，其耐受被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染或表现出被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染减少。
III.改性固体支持物的方法
在本文所述的组合物和方法中，将合适的固体支持物(例如，非对称膜，或特别地，非对称PES膜)用聚合物改性，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体(例如，聚乙二醇二丙烯酸酯)。
用于改性固体支持物的各种方法在本领域中是已知的，包括本文所述的方法。
在各种实施方案中，利用能源改性固体支持物(例如，多孔膜)的表面。各种能源可以用来引发通过聚合反应改性，例如γ射线、x-射线、自由电子、UV、蓝光和加热。γ、x-射线和电子束方法不需要额外的化学引发剂来引起聚合发生，因为它们有足够的能量来电离中性单体。但是，UV和可见光均需要光引发剂以产生自由基，然后自由基可以将单体激活为高反应性(自由基化)物质，其又可以反应以形成随机聚合物。对于热引发的聚合也是这样，其中引发剂可以是或不是光敏化或光激活的。
在本文所述的一些实施方案中，如下文所述，利用电子束改性固体支持物(例如，不对称多孔膜如聚醚砜膜)。
通常，利用电子束方法，将膜浸入适当浓度的单体混合物。在单体溶液的表面张力太高的情况下，在浸入单体溶液之前，将膜样品用低分子量醇(如甲醇或异丙醇)预湿润，随后“交换”入水浴。在某些情况下，单体溶液具有足够低的表面张力以湿润膜表面，在这种情况下，预湿润和交换步骤不是必要的。然后将膜样品从单体溶液取出并挤压翻转(nip-roll)以去除任何过滤的单体并确保单体溶液均匀分布在整个膜样品上。然后通过在氮气或氩气的惰性包层下于电子束下通过膜样品来将膜样品暴露于自由电子。在一些实施方案中，使用3-10m/分钟的线速。将电子束加速电压设置为170-200KV，并且将束流结合线速调整至递送20-30KGy剂量至膜样品。这些条件允许膜样品在膜的整个截面被完全改性。
IV.测量膜的处理量性能的方法
在一些实施方案中，将本文所述改性的固体支持物(例如，多孔膜)并入装置，例如，本文所述实施例中使用的装置，随后将装置用于测量膜或膜装置的处理量性能。
本发明至少部分是基于本文所述改性膜的优越特性，因为膜的处理量性能不受到不利影响，甚至在化学成分确定的细胞培养基中发现膜污染组分的存在下也是如此。因此，本文所述的改性固体支持物的方法可以用于在通过膜过滤培养基时减少多孔膜被化学成分确定的细胞培养基的一种或多种组分污染。
可以通过首先利用非阻塞性进料流确定膜装置的通透性(通量/驱动压力单位)来测量处理量性能。非阻塞性进料流一般包含纯水，或者包含溶解的有机和/或无机盐的含水缓冲液。
膜或膜装置的通透性定义为材料的量(以升或千克计)每单位面积每单位时间每单位压力，通常表示为L/(m2h psi)，或者“升每平方米每小时每psi”。如果实验以恒定驱动压力运行，则装置有效过滤面积(EFA)和驱动压力是恒定的。唯一可观察的是滤液的质量和时间(或者滤液的体积和时间)。当滤液密度非常接近一(unity)时，质量和体积可以交换使用。当进料流不阻塞时，通透性保持恒定，并且通过对时间作图收集的滤液的质量或体积而获得的直线的斜率确定装置的“缓冲液”通量“J0”。
当用阻塞性流(例如，在这种情况下，化学成分确定的细胞培养基)运行相同实验时，通量会随时间衰减，因为装置孔变得堵塞有阻塞性流包含的任何污染物质。这个通量简单地称作“J”。当表示为百分比(并且通过(J/J0)％表示)的相对通量衰减达到一些预定值时，比如25％，该装置的容量定义为可以通过通量衰减至装置的最大可能通量值的25％的时间回收的(阻塞性进料流的)滤液的量每装置的单位面积，或者利用非阻塞性进料流获得的通量。如前述说明中定义的容量是处理量性能的一个数值或定量度量。它不是测量处理量性能的唯一方式，但是其相当典型。
确定装置容量的两个常用点是：(a)当通量衰减至最大装置通量的25％时(V75–当通量已衰减75％时)；以及(b)当通量衰减至最大装置通量的10％时(V90–当通量已衰减90％时)。或者，容量还可以定义为过滤固定量的特定进料流所需的最小过滤面积或者其中过滤特定量的特定进料流的时间间隔。可以认为任何或所有这些量是处理量性能的度量或多个度量。
V.使用本文所述组合物和装置的方法
在各种实施方案中，本文所述改性的病毒保留膜在生物反应器的上游使用，以便在转移入生物反应器之前保留化学成分确定的细胞培养基中可能存在的病毒。
例如，在一些实施方案中，将这样的病毒保留膜并入装置，然后灭菌。然后利用无菌连接器将装置置于生物反应器的上游(在进口)，并且用来以正常过滤模式过滤新鲜制备的细胞培养基，同时将细胞培养基转移入生物反应器。结果，任何细小病毒污染可以减少至过滤之前存在的水平的1/10000(对应于4的最小对数减少值(LRV))。
通过以下实施例进一步说明实施方案，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
实施例
实施例1：用双丙酮丙烯酰胺单体改性膜表面的方法
探索用双丙酮丙烯酰胺单体改性膜表面的各种方法。
第一种方法包括浸涂。制备10重量％己二醇水溶液。将6g双丙酮丙烯酰胺(DACm)单体溶入194g己二醇-水溶液以产生3％w/w双丙酮丙烯酰胺的最终溶液。将14cm x 14cm高度不对称的未改性的疏水聚醚砜(PES)病毒膜置于浅的矩形耐热玻璃(pyrex)烤盘中的DACm溶液中，从而膜的敞开表面首先与溶液接触，然后将膜浸入DACm溶液几分钟。将膜取出并置于吸水片上以去除过量溶液，然后允许在环境空气干燥条件下于纸巾上风干。使干燥膜与Milli-Q水接触并呈现瞬间水湿润。将湿润的膜用水漂洗直至未发现DACm单体或己二醇助溶剂的残留，之后将样品再次风干。当将再次干燥的膜放置与Milli-Q水接触时，膜未湿润。无法证实任何DACm单体吸附在PES膜基底上，因为初始单体处理之后水容易去除DACm单体。
在另一实验中，通过将4.00克DACm溶入196.00克Milli-Q水来制备2.00重量％DACm水溶液。通过浸没在测量14cm x 14cm的甲醇预湿润(并且水交换)的高度不对称的疏水PES病毒去除膜上来应用溶液。该步骤这样进行，使膜的敞开表面与浅的矩形耐热玻璃烤盘中的DACm溶液接触，然后轻微振荡以将膜浸入溶液，其中允许放置几(2-3)分钟，之后用水将单体溶液漂洗掉，直至在漂洗水中未观察到表面活性剂活性(泡沫)。干燥并测试水湿润之后，观察到没有DACm遗留在膜上，因为上述处理之后膜保持疏水。因此，DACm单体简单吸附至PES膜显示没有永久亲和性，不用这种浸涂策略。
在另一实验中，研究将DACm电子束聚合至膜上。在这个实验中，将相同的DACm单体的2.00重量％水溶液施用于另一相同的高度不对称的疏水PES病毒去除预湿润膜，之后将膜夹在两张100μm厚的透明聚丙烯片之间以去除过量的单体溶液。然后使膜在电子束源(对于25KGy，暴露于170KeV电子)下通过以将DACm单体聚合在膜上。令人惊讶的是，所得的膜在水中缓慢湿润，虽然单体本身易溶于水。但是，所得的膜在Milli-Q水浴中于45秒内完全湿润，表明通过这种处理在膜上形成DACm均聚物。还观察到处理的膜不受高压灭菌和干热影响，虽然没有交联单体与DACm单体组合使用。此外，在0.2M NaOH(aq)中2小时室温浸泡之后未观察到水湿润行为或水通透性的改变。但是，包衣未用甲醇洗掉。
在0.5M NaOH中进一步测试16小时静态浸泡证实所得的均聚物膜碱稳定长达4小时，之后，均聚物表面改性开始恶化。这通过利用相同的单体溶液并使它们进行相同的电子束引发的聚合过程改性一系列相同的预先称重的膜样品证实。表面改性并干燥之后将样品再次称重，并且对每个膜样品确定双丙酮丙烯酰胺均聚物的任何附加重量。然后将这些膜样品浸没在0.5M NaOH溶液中，并且以连续时间间隔每次取出一个。观察到表面改性仅在4小时之后开始恶化。
虽然电子束引发的DACm聚合至膜上与上述其他方法相比是成功的，但是需要研究对膜处理量的影响。
实施例2：有或无普流罗尼克F68暴露的利用电子束引发的聚合DACm均聚物改性的膜的处理量性能
以2、4、6、8和10重量％制备一系列DACm水溶液。然后利用上述电子束方法将这些溶液用来表面改性测量14cm x 14cm的高度不对称的疏水PES膜。
然后按照以下概述的方法使膜进行处理量测试。
从如上文所述制备的每个改性膜剪出直径25mm的圆形膜样品，并且装入二次成型(over-molded)微型过滤装置。该装置包括外壳，在顶部有流体进口，在底部有流体出口，在外壳的中心径向部分中包含盘形过滤元件。每个流体进口具有整体通风孔以允许空气和流体直接在实际过滤元件上逃逸和清除体积。
将每个装置连接至两个由0.25英寸聚丙烯管构建而成的流体输送歧管上，每个子歧管由0.25英寸聚丙烯管以及兼容的Luer接头和阀门装配而成。一个歧管将Milli-Q水(非阻塞性流)输送至每个装置，而另一歧管将溶于Milli-Q水的化学成分确定的细胞培养基(阻塞性流体)输送至每个装置。构建每个歧管以支持并供应10个这样的过滤装置。将每个流体输送歧管连接至单独的压力容器，其充当测试流体储液器。每个压力容器由调节加压供气单独供应，所述调节加压供气设置为将流体以30psi或约2巴(2x 105Pa)输送至装置。将具有流体收集容器的测压元件安装在每个过滤装置下以测量收集的滤液的质量作为时间的函数。将每个测压元件连接至多通道数据采集板，所述多通道数据采集板又界面连接至计算机运行数据采集软件以记录收集的滤液质量(以克计)对时间(以可调整的单位计，但是通常以分钟计)。
此外，研究普流罗尼克F68膜暴露或预处理的影响。预处理或暴露于普流罗尼克F68包括通过注射器使几(～5)毫升储备10％(100g/升)普流罗尼克F68水溶液通过每个过滤装备，然后用Milli-Q水大量提取漂洗，直至在进行Milli-Q水漂洗的同时在漂洗水中未观察到泡沫或气泡。
观察到用普流罗尼克F68预处理的样品表现出比没有普流罗尼克F68预处理的那些样品提高的处理量性能。这些结果表明DACm处理的膜可以提供增强的对包含普流罗尼克F68的细胞培养基的污染耐受。处理量性能测试结果在下文表I中总结，并且还在图1中示出。
处理量性能定量称作膜容量。因此，膜容量是进料流依赖性的。容量在这个实验中通过两个度量表示，称作V75和V90，分别对应于通量衰减至初始通量的25％和10％时每平方米的有效膜表面积收集的滤液升数(以[L/m2]计)。初始通量由膜通透性确定，膜通透性通过测量每单位时间每驱动压力通过膜的非阻塞性流的体积来确定。膜通透性在本文中以每单位面积(m2)每单位时间(hr)每单位驱动压力(psi)收集的滤液升数或[L/(m2h psi)的单位表示。30psi的驱动压力用于这个和随后的处理量实验。
表I示出无(1-5行)或有(第二个5行6-10)普流罗尼克F68暴露或预处理的双丙酮丙烯酰胺均聚物改性膜的膜处理量性能结果。
表I
一般来说，观察到膜的处理量性能随着用于膜处理的DACm水平的增加而增加，一直升至10％。此外，相对于未用普流罗尼克F68预处理或暴露于普流罗尼克F68的膜，对用普流罗尼克F68预处理或暴露于普流罗尼克F68的DACm改性膜观察到处理量性能的提高。因此，普流罗尼克F68看来对DACm改性膜没有污染效果。
但是，用前述膜的浸出测试显示，至少对于较高DACm水平，DACm均聚物在与甲醇接触时浸出，之后膜流动特征和湿润性受到影响。浸出测试表明没有交联DACm单体，不可能保证低可提取物并获得一致的膜性能。此外，偶然暴露于低分子量醇出现不期望的材料脆弱性。
实施例3：DACm单体的交联剂的选择
在这个实施例中测试DACm单体的几种潜在交联剂。研究四乙二醇二丙烯酸酯(TEDGA)作为DACm单体的潜在交联剂。但是，用DACm和TEGDA改性不产生稳定交联的表面改性。结果，尝试水溶性和非丙烯酰胺交联单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作为交联剂代替TEGDA。据报道575平均分子量的PEG二丙烯酸酯(PEGDA575)具有可用分子量的PEG二丙烯酸酯中最好的水溶性。测试的第一交联剂水平为1％。
为了选择与交联剂组合的起始DACm水平，再次检测2-10重量％DACm均聚物改性的膜的水湿润速度和通透性。发现4％DACm-改性的膜比其他DACm均聚物改性的膜在水中湿润更快且更均匀。结果，选择4.00％DACm作为起始DACm水平与1％PEGDA575用于交联表面改性化学。如上文所述以相同方式通过电子束施用单体混合物，除了单体溶液包含95重量％的Milli-Q水中的4.00重量％DACm单体组合1.00重量％PEGDA单体。
通过这种包衣的持久性表征的交联的效率是这样证实的，将所得的改性膜样品浸泡在甲醇中然后水漂洗并干燥，然后重新测试湿润和通透性。水湿润和水通透性测试的结果基本上与甲醇提取步骤之前记录的那些结果相同。因此，认为改性是稳定的。
此外，在一单独实验中，研究非丙烯酰胺交联剂的用途，并且关于对膜处理量性能的影响与丙烯酰胺交联剂进行比较。PEGDA575用作非丙烯酰胺可交联单体，而亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAm)用作丙烯酰胺可交联单体。实验原型化学成分确定的CHO细胞培养基MX-201或Beta-CHO在这个实验中用作阻塞性或污染性进料流。每种交联单体(PEGDA或MBAm)以相同的1.00重量％处理水平(1.00重量％)使用。将这些交联剂中的每种单独与4％DACm(双丙酮丙烯酰胺)组合以形成聚合物混合物，利用Milli-Q水作为溶剂。
图2示出重复的25mm直径膜装置的通量衰减曲线，所述膜装置每个具有3种表面改性膜之一。它们是：(a)4％DACm-1％MBAm；(b)4％DACm-1％PEGDA575；和(c)1％HPC。
下文表II总结了用来测量通量衰减、V70、V90和10X通透性的一个这样的实验的结果，还如图3所示，其示出4％DACm-1％MBAm和4％DACm-1％PEGDA改性的PES膜相对于1％HPC对照膜的容量和通透性。化学成分确定的CHO细胞培养基用作进料流。
如观察到的，相对于1％HPC膜，4％DACm-1％MBAm膜表现出较低的处理量性能。但是，相对于1％HPC，4％DACm-1％PEGDA575膜表现出较高的处理量性能。
表II.
*SD代表标准差
因此，与基于丙烯酰胺的可交联单体(例如，MBAm)相比，基于非丙烯酰胺的可交联单体(如PEGDA)是与DACm一起使用的更好选择。
实施例4：交联共聚物改性膜的比较处理量性能测试
以与之前所述方法相同的方式进一步测试表面改性的处理量性能。以下结果采集自用DACm-PEGDA575共聚物化学进行的第一容量测试。
如用DACm均聚物的之前实施例中解释的，下文表III中示出的所有量均具有相同含义和单位，除了示出重复样品的平均值。
表III示出来自利用DACm-PEGDA575共聚物膜表面改性化学的第一比较测试的重复容量确定的平均容量(以[L/m2]单位计的V75和V90以及以[L/(m2h psi]单位计的通透性)。
表III
用相同的起始膜材料(具有20nm标称孔径评级的高度不对称的未改性的疏水PES病毒保留膜)构建所有装置。构建每个过滤装置以容纳各种表面改性的膜中每种的单层(1L-)。施用于每个膜样品上的表面改性化学在下文中描述。
HPC是通过浸没施用的吸附聚合物预处理，并且包含1.00重量％羟丙基纤维素水溶液，具有10％己二醇用作膜湿润助剂。LB20是通过原位电子束固化施用的自交联的高度乙氧基化的三丙烯酸酯单体。DACm代表单官能乙烯基单体双丙酮丙烯酰胺，而MBAm代表与DACm形成共聚物的二丙烯酰胺交联剂亚甲基-双-丙烯酰胺。HEA代表单官能乙烯基单体丙烯酸羟乙酯。TEGDA代表双官能或交联单体四乙二醇二丙烯酸酯，例如为PEGDA575，其为575数均分子量的聚乙二醇二丙烯酸酯。DACm-MBAm通过电子束固化施用的共聚物表面改性，例如为DACm-PEGDA575。LB20、HEA和TEGDA形成三元共聚物表面改性，也通过电子束固化过程施用于膜上。
图4为条形图，其示出如上文所述测试的各种膜装置的平均容量和通透性。如图4中看到的，相对于这个实施例中测试的其他改性，对DACm-PEGDA575共聚物改性的膜装置观察到处理量性能的显著提高。
图5示出本文中测试的每个装置的体积对时间曲线。如图5所示，相对于这个实施例中测试的其他改性，DACm-PEGDA575共聚物改性的膜装置收集了高得多的滤液量。
在另一实验中，化学成分确定的CHO细胞培养基MX-201(或Beta-CHO)用作进料流。包含V-Pro膜(用1％羟丙基纤维素改性的PHHC膜)的装置用作对照。标记为375LB20的装置用3.75％LB20(20摩尔-乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯)单体混合物制备，所述单体混合物在Milli-Q中制成并通过电子束固化在膜上。标记为200L、100H和075T的装置分别为2％LB20、1％HEA和0.75％TEGDA，全部溶于Milli-Q水。标记为4DACm1PEGDA的装置包括Milli-Q水中的4％DACm和1％PEGDA575。所有化学均用25KGy电子束剂量施用。
相对于测试的其他候选化学，观察到4DACm1PEGDA装置的处理量性能的非常显著的增加。
在另一实验中，以2％-5％的浓度测试如上文所述相同膜装置上的PEGDA575本身(也通过如上文所述相同的电子束过程制备)，并且处理量性能与用4DACm1PEGDA装置观察到的处理量性能相当。
随后，将如上文所述相同的化学成分确定的细胞培养基用于包含5％PEGDA575的装置。再次证实提高的处理量性能优势。
在另一实验中，评价包含不同浓度的DACm和PEGDA单体的组合物，评价用这些单体改性的膜的处理量性能。制备并测试以下组合物：制备包含4％DACm与0.75％、1.25％、1.50％、2.00％和2.50％PEGDA的组合物。此外，制备包含3％DACm与3％PEGDA575的组合物。
图6示出获得自测试的每个膜装置的通量衰减曲线。如图6所示，通过较慢通量衰减的方式，DACm-PEGDA575共聚物改性的膜装置具有优于测试的其他改性的处理量性能优势。
实施例5：DACm-PEGDA共聚物改性膜的热稳定性的评价
进一步评价DACm-PEGDA共聚物改性膜的热稳定性，因为热稳定性对于灭菌是可取的。
热稳定性通过使改性的膜处于湿润的高压灭菌条件(在134℃下1小时(Hr)循环)、干热条件(在135℃下1小时循环)和在线蒸汽(SIP)条件(1/2小时新鲜(live)在线蒸汽循环)来处理。
高压灭菌处理包括使物体(在这种情况下，膜或装置)与水在一定条件下进行静态封闭室加热循环，其中液态水与其高于大气压的蒸汽平衡存在，循环进行灭菌该物体所必需的时间间隔或以上。
正如术语表明的，干热处理包括使物体(膜或装置)在对流加热炉中接受(在这种情况下)等于所述高压灭菌温度的一些预定温度的干燥空气，以确定装置制备期间可能遇到的条件是否可能损害物体的性能。
在线蒸汽处理包括使物体(膜或装置)在动态条件下接受新鲜蒸汽，其中蒸汽是不凝的(在水的沸点以上的特定温度和压力下)，并且将其运送通过膜或包含膜等(滤器)元件的装置以灭菌暴露于蒸汽的所有表面。
在每种情况下，通过如上文所述用热处理的膜制备微型装置，测量处理量性能并与获得自作为对照的非热处理装置的结果比较处理量性能结果来测试膜容量。
在第一组实验中，将膜暴露于湿润的高压灭菌条件。
除了IL-1％HPC对照，所有装置均用包含4.00％双丙酮丙烯酰胺(DACm)的单体混合物制备。PEGDA575水平变化，并且包括1.00％1.25％和1.50％。一些装置使用2-层过滤元件并命名为2L-。
表IV示出无热处理之后，或者装置的高压灭菌之后或者在装置制备之前高压灭菌膜之后，如通过各种膜的V75、V90和10X通透性测量的膜处理量性能。
表IV
装置ID V75[L/m<sup>2</sup>] V90[L/m<sup>2</sup>] 10X通透性[L/m<sup>2</sup>h psi]
1L-4％DACm-1％PEGDA575 AM 475 1100 303
2L-4％DACm-1％PEGDA575 AM 1 1300 1700 154
1L-4％DACm-1％PEGDA575 ACD 675 1500 313
1L-4％DACm-1.25％PEGDA575 ACD 500 1400 266
1L-4％DACm-1.5％PEGDA575 ACD 1500 2500 273
2L-4％DACm-1％PEGDA575 AM2 2100 3000 199
1L-4％DACm-1％PEGDA575 ACM 885 1500 301
1L-4％DACm-1.25％PEGDA575 ACM 1250 1800 300
1L-4％DACm-1.5％PEGDA575 ACM 1700 2500 280
1L-1％HPC 185 460 329
AM＝如改性的(无热处理)；ACD＝高压灭菌的装置；以及，ACM＝高压灭菌的膜(测试之前，然后进行装置制备)
一个这样的代表性实验的结果在图7中示出，其示出无热处理(AM)之后，包含膜的装置的高压灭菌(ACD)之后或装置制备之前高压灭菌膜(ACM)之后，如利用V75、V90和10X通透性测量的各种膜的膜处理量性能。性能结果包括膜装置通透性(用微型装置(3.1cm2有效过滤面积(EFA)的非阻塞性流(水)的恒定流)，以及在V75和V90确定的容量，利用pH 4和2mS/cm电导率的乙酸盐缓冲液中的4g/L人血浆衍生的IgG确定。在图7中，IL和2L分别代表一层和两层膜装置；DP4100代表4.00％DACm和1.00％PEGDA；DP4125代表4.00％DACm和1.25％PEGDA；而DP4150代表4.00％DACm和1.50％PEGDA。
如观察到的，对于大部分，对于接受高压灭菌的所有膜装置，高压灭菌包含膜的装置或者在装置制备之前将膜高压灭菌，膜性能看来随着PEGDA水平的增加而提高，并且优于对照1L-1％HPC膜。
在另一实验中，将相似但不完全相同的一系列膜装置暴露于干热循环(135℃保持1小时)。在这个实验中，将所有膜制备入单层装置。用利用包含4.00％双丙酮丙烯酰胺(DACm)和1％PEGDA575(DP4100)的单体混合物改性的膜制备实验膜装置，或者用包含4％DACm和2％PEGDA575(DP4200)的单体混合物制备实验膜装置。通过用1％羟丙基纤维素(1％HPC)的吸附包衣改性起始膜来制备对照装置(2)，将改性膜制备至与包含用DACm和PEGDA改性的膜的装置相同的装置。改性的膜是来自两个不同来源的PES膜，称作P1和P2。
表V示出一个这样的实验的结果，还在图8中示出。如之前所述，利用V75、V90和10X通透性值测量膜处理量性能。如观察到，所有包含改性膜的实验装置的容量(V75和V90)均非常相似，无论膜改性配方之间的差异(DP4100,DP4200)，并且无论膜是否接受干热处理；但是，改性膜的容量一般高于对照膜(1L-1％HPC P1和1L-1％HPC P2)。但是，有趣的是，如用高压灭菌处理看到的，用增加的PEGDA水平获得的性能提高，利用干热处理未观察到。
表V示出来自比较处理量实验的容量和通透性结果，利用如改性的膜样品(AM)制备的装置，并且与接受额外的干热处理(135℃，1小时)的相同装置进行比较。
表V
装置ID V75[L/m<sup>2</sup>] V90[L/m<sup>2</sup>] 10X通透性[L/m<sup>2</sup>h psi]
1％HPC P1 65 393 348
DP4100 AM P1 1000 1100 288
DP4100 DH P1 975 1100 333
DP4200AM P1 1100 1200 225
DP4200DH P1 1175 1250 261
DP4100AM P2 1150 1225 280
DP4100DH P2 1150 1225 291
DP4200AM P2 975 1000 219
DP4200DH P22 1175 1250 261
1％HPC P2 275 700 339
AM＝如改性的装置(无热处理)；DH＝干热循环的装置。P1和P2表示来自两个不同来源的PES膜。1％HPC显示对照膜装置(重复使用)。
在另一实验中，使各种膜装置进行在线蒸汽(SIP)过程以确定标准在线蒸汽过程怎样影响处理量性能(水通透性、培养基容量、保留)。
将本文所述的化学应用于来自两个不同PES膜来源的膜(膜P1和P2)。一半制备的膜样品接受SIP条件。将所有膜样品装入微型装置，并且均测试处理量性能(通透性和容量)，还测试病毒样颗粒的保留。
表VI示出实验的结果，其中对各种膜确定通透性、进料处理量、容量和噬菌体的保留。进料由掺入1x108pfu/μL(uL)PHI-X174噬菌体的Milli-Q水中的实验MX-201(Beta-CHO)细胞培养基组成。对单一膜元件25mm直径微型装置(3.1cm2EFA)确定结果。每个装置包含不同的膜，有如改性的(AM)指定，其未接受任何热处理，或者有在线蒸汽(SIP)指定。所有膜的组成均为PES，制备自两个不同聚合物来源之一，称作并识别为P1或P2。每种膜均重复运行，复制品识别为A或B。对于这个测试，识别为1％HPC的膜不接受SIP处理。这些用作对照，并且用来证实装置性能的可变性水平。这些膜装置制备自用1％HPC改性的P1聚合物。识别为DP4100的膜利用4％DACm-1％PEGDA的本发明表面改性实施方案改性，将其施用于P1聚合物和P2聚合物膜。
表VI
通过使非阻塞性缓冲液(在这种情况下Milli-Q水)通过装置10-15分钟间隔并记录收集的缓冲液的量来确定通透性。然后使包含溶于Milli-Q水的细胞培养基的阻塞性流通过装置。在实验开始后120分钟测量培养基处理量(收集的滤液质量或体积)。膜容量确定为最小面积，表示为Amin，以平方米(m2)的单位计。最小面积可以任意地定义为在给定时间间隔内收集给定量的滤液所需的膜面积。在这种情况下，最小面积定义为在4小时时间内收集或过滤1000升进料所需的滤器面积，并且计算自对每个装置记录的通量衰减曲线(原始实验体积对时间数据)。
通过将Phi-X174噬菌体(Promega Catalog No.I1041)以2-5x 107pfu/μL(空斑形成单位每微升)的滴度掺入进料来确定保留。在开始处理量实验之前从进料库取得1ml进料样品。一旦实验开始，约1分钟之后在每个装置的出口取得初始1ml保留样品。在终止实验之前，在每个装置取得最终1ml保留样品。在终止实验时，再次在进料库采样进料。进料库样品用来测量滴度，由此测量在测试开始和结束时噬菌体的活力。在测试期间于起始和最终点在装置出口采集的滤液样品用来确定初始活噬菌体滴度和最终活噬菌体滴度之间的数值差异。相对于进料库样品，来自装置出口的初始和最终滴度之间的这些差异用来确定每个装置的对数减少值(LRV)。一般来说，LRV是如何有效去除病毒的度量。每个单位对数值代表病毒滴度减少一个数量级(10X)。因此，5的LRV表示滤液的病毒浓度是进料的病毒浓度的1/100000。初始和最终保留结果分别在图9a和9b中示出。图9a示出初始LRV值，每个装置一个。图9b示出最终LRV值，每个装置一个。值得注意的是，SIP处理之后没有LRV的显著变化发生，并且对于这个实验中测试的任何装置，在初始和最终LRV测量之间没有LRV的显著变化发生。但是，相对于1％HPC装置，对所有DP4100装置均观察到显著的容量提高。
实施例6：不含DACm的膜的处理量性能评价
在一代表性实验中，制备单独用PEGDA(2-5％)改性的膜，以便研究DACm是否是获得可取的处理量性能的必需组分。利用水中的1％递增的2重量％-5重量％的PEGDA575浓度改性一系列膜。如之前所述，PES膜用作基底膜，而1％羟丙基纤维素(HPC)改性的膜用作对照。利用原型化学成分确定的细胞培养基(Beta-CHO，也称作MX-201)进行对这个膜系列的处理量性能测试。利用电子束引发的PEGDA575溶液湿润的PES基底膜的原位聚合进行各种膜改性，以便用递增的(2％、3％、4％和5％)PEGDA处理水平将增加水平的聚合物给予膜表面。每个改性水平的平均容量和平均通透性(重复确定)在图10中示出。
如图10所示，容量随着PEGDA处理水平浓度的增加而增加，但是相反地观察到通透性减少。
关于总体处理量性能，所有PEGDA改性的膜均明显超过对照(V75:2.86-4.72倍；V90:3.96-6.10倍)。将性能结果与表III中总结的那些结果进行比较，其中相对于1％HPC-改性的膜，对于V75，4％DACm-1％PEGDA575改性导致6.78倍的性能提高，而对于V90，其导致4.29倍的性能提高。此外，对于V75，配方(HEA-TEGDA，也在表III中)给出2.65倍的优于对照膜的性能提高，而对于V90，其给出1.69倍的优于对照膜的性能提高。
在另一代表性实验中，制备2％、3％、4％和5％PEGDA575处理水平膜并用LifeTechnologies CD Opti-CHO化学成分确定的细胞培养基进行测试。再次观察到处理量性能相对于1％HPC对照膜提高。但是，性能继续随着增加PEGDA处理水平而降低。这在图11中示出。在图11中，依据Amin测量容量，在这种情况下其定义为在4小时时间段内加工1000升培养基所需要的最小膜面积(以m2的单位计)。值得注意的是，观察到在实验的最初150分钟内Amin比收集的滤液量的相反关系。因此，较低的Amin对应于较高的容量。由于关于两种不同培养基流，这些膜看来相反的性能趋势，利用多种进料流进一步评价膜性能。看来图10中示出的利用MX-201培养基的膜性能结果随着递增的PEGDA处理水平而提高，而图11中示出的利用CD Opti-CHO结果的膜性能结果随着PEGDA处理水平的相同增加而降低。注意到MX-201培养基比Opti-CHO培养基更具污染性。结果，利用MX-201培养基的装置性能受到通透性影响较少，而受到培养基污染的影响较多。然而，Opti-CHO污染较少，因此，与培养基污染的影响相比，装置性能更依赖于通透性。
实施例7：利用多种进料流的不含DACm的膜和DACm-PEGDA膜的性能评价
因为没有DACm的膜的引人注目的性能趋势，在另一代表性实验中，研究单独用PEGDA改性或者用DACm和PEGDA改性的一系列膜的处理量性能。一个对照由具有1％HPC表面改性的疏水PES病毒组成，而第二对照膜由用4％DACm和1％PEGDA575改性的PES病毒膜组成。在这个实验中，第二对照利用与其他膜相比不同的疏水膜批次制备。3种剩余的膜包括1％PEGDA改性、1％PEGDA和1％DACm改性，以及最后1％PEGDA575和4％DACm改性。用这个膜集合采集3个数据集，该膜使用以下进料流中的每一个：1)可商购的化学成分确定的CHO细胞培养基，Life Technologies CD Opti-CHO；2)可商购的化学成分确定的CHO细胞培养基，EMD Cellvento 200；以及，3)实验设计的进料流，掺入2g/升普流罗尼克的达尔伯克改良伊格尔培养基。
图12示出各种膜的比较处理量性能。表面改性包括(在图中从左至右)：用1％HPC改性的对照膜；用4％DACm和1％PEGDA575改性的膜；仅用1％PEGDA575改性的膜；用1％DACm和1％PEGDA575改性的膜；以及用4％DACm和1％PEGDA575改性的膜。观察到用认为较低污染性的培养基CD Opti-CHO培养基，低DACm和无DACm表面改性的膜表现相对良好，并且与图11中示出的2％PEGDA膜非常相似。在较高污染性的Cellvento-200培养基的情况下，仅较高水平DACm表面改性表现良好。这证实较高DACm-水平表面改性为测试的最广泛的进料流提供提高的处理量性能。
根据本说明书内引用的参考文献的教导最全面地理解本说明书，所述参考文献援引加入本文。本说明书内的实施方案提供实施方案的说明，并且不应当理解为限制范围。技术人员(从业人员)容易地认识到本公开涵盖许多其他实施方案。所有出版物和参考材料均整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书会取代任何这样的材料。本文中任何参考文献的引用不是承认这类参考文献是现有技术。
除非另有说明，本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，数值参数为近似值，并且可以根据通过本文公开的实施方案试图获得的期望特性而变化。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的具体实施方案的许多等同物。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚，可以进行本文公开的实施方案的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。本公开的真正范围和精神通过以下权利要求书示出，说明书和实施例仅认为是示例性的。

Claims (22)

1.一种具有用聚合物改性的表面的多孔膜，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体，
其中所述非丙烯酰胺可交联单体为聚乙二醇二丙烯酸酯。
2.权利要求1的膜，其中利用能源将所述聚合物直接包覆在所述多孔膜的表面上。
3.权利要求1的膜，其中所述能源选自热、电子束、紫外光和γ辐射。
4.权利要求1的多孔膜，其中所述多孔膜为不对称膜。
5.权利要求4的多孔膜，其中所述不对称膜为聚醚砜(PES)膜。
6.一种从化学成分确定的细胞培养基中去除病毒污染物的方法，所述方法包括通过权利要求1的多孔膜过滤所述化学成分确定的细胞培养基。
7.权利要求6的方法，其中所述化学成分确定的细胞培养基选自Lonza Power CHO、CDOpti CHO、EMD Millipore Cellvento CHO 100和Cellvento CHO 200。
8.权利要求6的方法，其中所述过滤进行少于24小时的时间段。
9.权利要求6的方法，其中过滤在4-8的pH下进行。
10.权利要求6的方法，其中过滤在20℃-25℃的温度下进行。
11.一种从化学成分确定的细胞培养基中去除一种或多种病毒污染物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供化学成分确定的细胞培养基；以及
b)在将所述培养基转入生物反应器之前或期间，通过权利要求1的多孔膜过滤所述化学成分确定的细胞培养基，
其中所述生物反应器内的化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种病毒污染物水平低于通过所述膜过滤所述培养基之前的水平。
12.权利要求11的方法，其中将所述膜并入装置。
13.权利要求12的方法，其中所述装置是选自圆盘、折叠筒、卷绕式筒和多片平板的形式。
14.权利要求11的方法，其中所述化学成分确定的细胞培养基选自Lonza Power CHO、CD Opti CHO、EMD Millipore Cellvento CHO 100和Cellvento CHO 200。
15.权利要求11的方法，其中步骤(b)之后一种或多种病毒污染物的水平减少至少1Log10减少值(LRV)。
16.权利要求11的方法，其中步骤(b)之后一种或多种病毒污染物的水平减少至少4Log10减少值(LRV)。
17.权利要求11的方法，其中步骤(b)之后一种或多种病毒污染物的水平减少至少6Log10减少值(LRV)。
18.权利要求11的方法，其中所述过滤进行少于24小时的时间段。
19.权利要求11的方法，其中过滤在4-8的pH下进行。
20.权利要求11的方法，其中正常流的过滤在20℃-25℃的温度下进行。
21.一种减少过滤期间病毒保留膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供病毒保留膜；以及
b)用聚合物改性所述膜，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种可交联单体，
其中相对于未改性的膜，所述改性的膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染减少，
其中所述可交联单体为聚乙二醇二丙烯酸酯。
22.权利要求21的方法，其中所述病毒保留膜为PES膜、PVDF膜、纤维素膜或尼龙膜。
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