CN114073865B - 去除血清中外泌体的方法及过滤装置 - Google Patents

Abstract

本申请涉及去除血清中外泌体的方法及过滤装置。过滤装置包括装置主体、固定相和过滤件，固定相填充于装置主体内部，固定相为外泌体吸附物质，外泌体吸附物质为负载有核酸适配体的基质；核酸适配体为能够特异性识别外泌体表面的跨膜蛋白CD9/CD63/CD81的核酸适配体；基质为全多孔硅胶微球或高分子多孔微球；过滤件设置于装置主体的一端。并提供了使用此过滤装置去除血清中外泌体的方法，将血清通过超速离心，再通过上述过滤装置，最后进行无菌处理。处理后的血清通过ZETAVIEW、SEM透射电镜、细胞培养和血清外泌体ELISA试剂盒等检测，均未检测到外泌体，取得了比较优异的去除血清中外泌体的效果。

Description

去除血清中外泌体的方法及过滤装置

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及去除血清中外泌体的方法及过滤装置。

背景技术

对血清进行研究是常用的疾病诊断方法。在每毫升血清中，往往会含有约10¹⁰～10¹¹个外泌体，外泌体为携带有蛋白质、脂质和遗传物质等组分的囊泡结构，直径大小在30～200nm。血清中的外泌体可以调控肿瘤生长、免疫应答和血管疾病等多种病理生理过程，能够对细胞的表型产生影响，进而改变细胞自身外泌体的蛋白表达质谱，从而对血清检测的结果产生不同程度的干扰。

目前，去除血清中外泌体主要采用超速离心法和免疫磁珠法等方法，超速离心法需要进行连续多次操作，并且需要静置较长时间，但得到的血清中仍然残留部分外泌体。而免疫磁珠法的成本比较高，一次操作只能处理少量的血清，并且只能去除血清中的部分外泌体。使用目前存在的方法处理血清，经过处理后的血清中仍存在较多外泌体，依然会对下游细胞外泌体的研究产生一定的影响，因此存在改进空间。

发明内容

为了降低处理后的血清中外泌体的含量，进而降低血清中的外泌体对研究血清时的影响，本申请提供去除血清中外泌体的方法及过滤装置。

第一方面，本申请提供了外泌体吸附物质，所述外泌体吸附物质为负载有核酸适配体的基质；所述核酸适配体为能够特异性识别外泌体表面的跨膜蛋白CD9/CD63/CD81的核酸适配体；所述基质为全多孔硅胶微球或高分子多孔微球。

外泌体的表面上有跨膜蛋白CD9/CD63/CD81，选择能够特异性识别外泌体表面的跨膜蛋白CD9/CD63/CD81的核酸适配体，并将该核酸适配体负载于全多孔硅胶微球或高分子多孔微球上，以得到合适的外泌体吸附物质。全多孔硅胶微球的多孔结构使其具有吸附特性，可以负载核酸适配体，并且较大的比表面积使其可以负载较多的核酸适配体，从而能够更高效的分离血清和外泌体。而高分子多孔微球可通过人为控制其孔径和表面性质，可以将核酸适配体负载在高分子表面微球上形成外泌体吸附物质。并且高分子表面微球的比表面积较大，圆球形颗粒容易填充均匀，可以使得到的外泌体吸附物质比较均匀，能够更好的分离血清和外泌体。因此选择全多孔硅胶微球或高分子多孔微球作为基质均能较好的负载核酸适配体,从而能够更好的与外泌体结合，进而达到比较理想的去除外泌体的效果，降低血清中的外泌体对研究血清时的影响。

第二方面，本申请提供了用于去除血清中的外泌体的过滤装置，包括装置主体、固定相和过滤件，所述固定相填充于装置主体内部，所述固定相为上述所述的外泌体吸附物质；所述过滤件设置于装置主体的一端。

通过采用上述技术方案，固定相填充于装置主体内，血清通过固定相时，固定相可以与血清中的外泌体结合从而将外泌体留在装置主体内，将血清和外泌体分离，可以得到外泌体含量极少的血清，过滤件可进一步将血清中残留的少量外泌体和微生物除去。

优选的，所述装置主体包括柱体、前封端和后封端，所述前封端设置于柱体远离过滤件的一端，所述后封端设置于柱体与过滤件之间。

通过采用上述技术方案，前封端和后封端用于保护柱体内的固定相，从而降低固定相流失的可能。

优选的，所述前封端与柱体螺纹连接，所述前封端远离柱体的端面设置有第一凸出端，所述第一凸出端的端面直径小于柱体的端面直径,所述第一凸出端螺纹连接有螺帽。

通过采用上述技术方案，前封端与柱体螺纹连接，在装填固定相时拆下前封端，固定相装填完后再将前封端安装于柱体，比较方便装填固定相。并且前封端上设置的第一凸出端可以降低柱体内部的固定相裸露的可能，同时使血清具有进入柱体的通道，螺帽可以在不使用时将柱体封闭,以便更好的保护柱体内部的固定相。

优选的，所述后封端与柱体螺纹连接，所述后封端远离柱体的端面设置有第二凸出端，所述第二凸出端的端面直径小于柱体的端面直径；所述过滤件螺纹连接于第二凸出端。

通过采用上述技术方案，后封端与柱体螺纹连接，并且后封端上设置的第二凸出端与过滤件螺纹连接，一方面保护柱体内部的固定相，另一方面可以更换不同孔径的过滤件，并且方便更换使用后的过滤件，比较方便实用。

优选的，所述过滤件包括过滤层、进样端和出样端，所述过滤层设置于进样端和出样端之间，所述进样端螺纹连接于第二凸出端。

通过采用上述技术方案，过滤层可以拆卸，以方便选择不同材质和孔径的过滤层，在过滤层使用后可将过滤层拆下并进行更换，无需更换进样端和出样端，十分方便并且比较环保。

优选的，所述出样端设置为锥形出口，所述锥形出口上设置有阀门。

通过采用上述技术方案，锥形出口比较方便收集处理后的血清，并且锥形出口上设置的阀门可以控制处理后的血清的流出量，从而便于按照用量收集血清。

优选的，所述柱体为玻璃套管或不锈钢套管。

使用玻璃套管作为柱体的优点是玻璃的化学惰性较好，与固定相结合效果好，并且便于观察制作情况和固定相的填充情况，操作比较方便。使用不锈钢套管的优点是使用寿命长，耐高温耐高压，与固定相结合良好，便于操作并且不易发生形变。可根据不同使用要求任意选择其中一种柱体。

优选的，所述柱体的直径不小于5厘米。

通过采用上述技术方案，柱体的直径不小于5厘米，可以增大柱体内的血清的通过量，从而提高过滤血清的效率，节省过滤的时间。

第三方面,本申请提供去除血清中外泌体的方法，包括以下步骤：

S1.将血清进行超速离心，收集血清上清液；

S2.将收集到的血清上清液通过上述所述的外泌体吸附物质进行吸附处理，得到处理后的血清上清液；

S3.收集处理后的血清上清液并进行过滤；

S4.将过滤后的血清上清液进行无菌处理并进行封装。

在上述技术方案中，首先将血清通过超速离心去除部分外泌体，再将超速离心后得到的上清液通过此外泌体吸附物质，此外泌体吸附物质可将血清中大部分的外泌体去除。然后将过滤后的血清再通过滤膜过滤，并进行无菌处理和封装，以得到可用于研究的血清。

优选的，所述滤膜的孔径不大于0.22μm。

使用孔径为0.22μm及以下的滤膜可将血清中的微生物及少量外泌体过滤，从而可达到较高的除菌率，以使后续的无菌处理更加迅速彻底。

优选的，在步骤S2和步骤S3中，使用了如上述所述的过滤装置。

在上述技术方案中，将血清通过上述过滤装置后，使血清中外泌体含量降低至几乎检测不到的程度，从而可以极大的降低血清中外泌体对研究血清时的影响。

第四方面，本申请提供了过滤装置的制作方法，包括以下步骤：

Z1.将柱体进行反复清洗并烘干；

Z2.将上述所述的外泌体吸附物质作为固定相，并进行预处理；

Z3.将后封端螺旋安装于柱体上，并将固定相在高压下填充入柱体，压实；

Z4.将前封端螺旋安装于柱体远离后封端的一端；

Z5.对固定相进行老化处理；

Z6.将过滤件安装于后封端的第二凸出端上，再将阀门安装于出样端。

优选的，在步骤Z1中，依次使用20%～25%的氢氧化钠洗液、10%～15%的盐酸溶液和超纯水反复清洗，在100～120℃下烘干。

使用20%～25%的氢氧化钠洗液进行碱洗，再使用10%～15%的盐酸溶液进行酸洗，最后使用超纯水反复清洗后可使柱体本身保持中性，并在100～120℃下烘干使柱体保持干燥，以降低柱体内的其它物质对固定相造成影响，从而降低对血清中外泌体分离的影响。

优选的，在步骤Z5中，将此高压过滤装置的第一凸出端连接氮气，并在100～120℃下氮气流入2～3h，冷却。

使用氮气并且在100～120℃的高温下对固定相进行老化处理，除去柱内的空气，并除去柱内残留的溶剂，同时可使固定相填充的更加均匀，从而提高该装置的分离效果和使用寿命。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.本申请将能够特异性识别外泌体表面的跨膜蛋白CD9/CD63/CD81的核酸适配体负载于全多孔硅胶微球或高分子多孔微球上作为外泌体吸附物质，该外泌体吸附物质可以和血清中的外泌体特异性结合，从而将外泌体吸附，进而达到去除血清中外泌体的目的。

2.本申请将上述的外泌体吸附物质作为固定相填充于玻璃套管或不锈钢套管内，制作了用于去除血清中的外泌体的过滤装置。血清通过此过滤装置进行过滤，可以提高去除血清中外泌体的效率。

3.本申请还提供了去除血清中外泌体的方法，该方法先使用超速离心法处理血清，再使用上述过滤装置进行过滤，最后对过滤后的血清进行无菌处理并封装。经过本方法处理后的血清中几乎检测不到外泌体，得到了较佳的去除外泌体的效果。

附图说明

图1为本申请实施例的过滤装置的整体结构示意图；

图2为本申请实施例的过滤件的结构示意图；

图3为样本1和对比样本1的ZETAVIEW血清外泌体浓度检测结果；

图4为样本1和对比样本1的SEM透射电镜图；

图5为样本1的细胞培养结果图；

图6为对比样本1的细胞培养结果图；

图7为样本1和对比样本1的血清外泌体ELISA试剂盒检测结果。

附图标记：1、装置主体；11、柱体；12、固定相；13、前封端；131、第一凸出端；132、螺帽；14、后封端；141、第二凸出端；2、过滤件；21、过滤层；22、进样端；23、出样端；231、锥形出口；3、阀门。

具体实施方式

以下结合实施例、对比例和附图1～7对本申请作进一步详细说明。

在以下实施例及对比例中，部分材料的来源和所使用的仪器型号如表1和表2所示。

表1、原料来源规格表

表2、实验仪器来源规格表

以下实施例及对比例所使用的血清均为胎牛血清。

实施例1 血清中外泌体去除方法，包括如下步骤：

S1、将血清进行超速离心，收集血清上清液。具体操作方法如下：取5mL胎牛血清至超速离心管中，110000xg，4℃，离心2h，收集胎牛血清上清液；

S2.将收集到的血清上清液通过上述吸附物质进行吸附处理，得到处理后的血清上清液；

其中，外泌体吸附物质为负载有核酸适配体的基质，所用的核酸适配体的序列为ATATACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTT-Biotin，所用的基质为全多孔硅胶微球，使用的全多孔硅胶微球的平均粒径为10μm，孔径为300A。上述外泌体吸附物质委托生工生物工程股份有限公司合成。将此外泌体吸附物质作为固定相填充于过滤装置的内部。

S3.收集处理后的血清上清液并进行过滤；

S4.将过滤后的血清上清液进行无菌处理并进行封装。

值得注意的是，在步骤S2中，外泌体吸附物质中的核酸适配体可以对跨膜蛋白CD9/CD63/CD81进行吸附，也可以换用其他具有类似吸附功能的核酸适配体。

其中，在步骤S2和步骤S3中，具体在过滤装置中进行，过滤装置结构具体参照图1，包括装置主体1、过滤件2和阀门3。过滤件2螺纹连接于装置主体1的一端，阀门3与过滤件2连接。

参照图1和图2，装置主体1包括柱体11、固定相12、前封端13和后封端14。柱体11呈圆柱体型并且柱体11的直径设置为5cm，柱体11内部中空并且填充有固定相12，固定相12为上述的外泌体吸附物质。柱体11的一端与前封端13螺纹连接，柱体11的另一端与后封端14螺纹连接。前封端13远离柱体11的端面上连接有第一凸出端131，前封端13覆盖柱体11的端口用于保护柱体11内部填充的固定相12，并且第一凸出端131的端面直径小于柱体11直径。第一凸出端131螺纹连接有螺帽132，螺帽132用于保护柱体11内部的固定相12，在需要进行过滤时，旋开螺帽132，使用完毕后，将螺帽132螺纹连接于柱体11以降低柱体11内部固定相12的流失。

后封端14远离柱体11的端面上连接有第二凸出端141，后封端14同样用于保护柱体11内部的固定相12，并且第二凸出端141的端面直径小于柱体11的直径，不仅可以保护内部的固定相12并且还可以使过滤后的血清流出。

过滤件2包括过滤层21、进样端22和出样端23，进样端22螺纹连接于第二凸出端141内，进样端22和出样端23连接的部分形成空腔。空腔内置过滤层21，并且过滤层21的直径大于进样端22和出样端23的端面直径，以便于增大过滤面积，进一步提高过滤速度。过滤层21可以拆卸，以便于在过滤完毕后进行更换。

出样端23螺纹连接有阀门3，阀门3用于控制滤出液的流量，并且出样端23为锥形出口231，更加便于收集滤出血清进行封装。

上述装置的前处理方法如下：首先将柱体11依次使用20%的氢氧化钠洗液、10%的盐酸溶液和超纯水反复清洗，在110℃下烘干。将上述外泌体吸附物质与超纯水混合并搅拌均匀，得到混合粘稠液体。将后封端14螺纹连接于柱体11的一端，将上述混合粘稠液体在高压下填充入柱体11并压实，再将前封端13螺旋安装于柱体11的另一端，从而将固定相12封装入柱体11内。最后通过第一凸出端131向柱体11内填充氮气，在110℃下使氮气流入3h后冷却至室温。然后选择具有合适孔径的过滤层21的过滤件2连接于后封端14，再将阀门3连接于出样端23内。

使用时使血清从第一凸出端131进入柱体11内部，固定相12中的核酸适配体特异性识别并结合外泌体，从而将血清中的外泌体留在柱体11内，进而将血清与外泌体分离。过滤后的血清再通过孔径为0.22μm的过滤层21的过滤，将过滤后的血清上清液进行无菌处理并进行封装。取封装后的胎牛血清100μL，然后用PBS溶液稀释至1mL，作为样本1。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，胎牛血清不通过上述过滤装置。取5mL胎牛血清至超速离心管中，110000xg，4℃，离心2h，收集胎牛血清上清液；取离心后的的胎牛血清2mL，加入1g上述外泌体吸附物质和10mL的PBS溶液进行混合，搅拌混合2h后，使用孔径为0.22μm的滤膜将混合溶液过滤，将过滤后的血清上清液进行无菌处理并进行封装。取100μL封装后的胎牛血清，用PBS溶液稀释至1mL，得到样本2。

实施例3

实施例3与实施例1的不同之处在于，所用的基质为高分子多孔微球，此高分子多孔微球的平均粒径为40μm，孔径为200nm，此外泌体吸附物质委托生工生物工程股份有限公司合成。使用同样的后处理方法得到样本3。

对比例1

取5mL胎牛血清至超速离心管中，110000xg，4℃，离心2h，收集胎牛血清上清液。直接取100μL离心后的胎牛血清，用PBS溶液稀释至1mL，作为对比样本1。

对比例2

对比例2使用超速离心法处理胎牛血清。取5mL胎牛血清至超速离心管中，110000xg，4℃，离心2h。转移上层清液至超速离心管中，加入1mL PBS溶液震荡后混匀，并再次110000xg，4℃，离心2h，重复2次，取上清液，从而得到处理后的胎牛血清上清液。收集处理后的胎牛血清上清液并使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，将过滤后的胎牛血清上清液进行无菌处理并进行封装。取封装后的胎牛血清100μL，然后用PBS溶液稀释至1mL，作为对比样本2。

对比例3

对比例3使用的外泌体吸附物质为表面负载有链霉亲和素的磁珠，此外泌体吸附物质委托生工生物工程股份有限公司合成。取5mL胎牛血清至超速离心管中，110000xg，4℃，离心2h，收集胎牛血清上清液。取收集到的胎牛血清上清液2mL加入盛有50μL的负载有链霉亲和素的磁珠的小管中，震荡30min。将小管置于磁场旁5min，移出胎牛血清液体，再加入1mL PBS溶液，再与负载有链霉亲和素的磁珠混合均匀后，置于磁场旁5min，吸出PBS溶液，重复3～5次，得到处理后的胎牛血清上清液。收集处理后的胎牛血清上清液并使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，将过滤后的胎牛血清上清液进行无菌处理并进行封装。取封装后的胎牛血清100μL，然后用PBS溶液稀释至1mL，作为对比样本3。

性能检测试验

使用ZETAVIEW对血清中外泌体粒子的浓度进行检测。

表3、ZETAVIEW血清外泌体浓度检测结果

根据表3和图3可以看出，经过上述过滤装置处理后的胎牛血清中检测不到外泌体，未经过处理的胎牛血清中含有较高浓度的外泌体。根据表3可以看出，采用超速离心法和使用链霉亲和素磁珠处理后的胎牛血清中依然存在较多的外泌体。通过对比数据表明，本申请所提供的使用上述过滤装置处理胎牛血清的方法具有比较优异的去除外泌体的效果。

经过对比所得到的ZETAVIEW的数据，为降低实验成本，因此只对样本1和对比样本1进行以下检测。

（1）使用负染色法分别对样本1和对比样本1进行染色，然后使用SEM透射电镜进行检测；（2）将样本1和对比样本1进行细胞培养；（3）使用血清外泌体ELISA试剂盒对样本1和对比样本1进行检测。得到的结果如附图4-7所示。

根据图4可以看出样本1的SEM透射电镜图中几乎观察不到外泌体，而对比样本1中可以看到明显的外泌体。这一结果表明经过上述过滤装置处理，并使用本申请所提供的去除外泌体的方法，最终使处理后的胎牛血清中检测不到外泌体，取得了比较优异的效果。

这一结果也得到了对样本1和对比样本1的细胞培养结果和ELISA试剂盒检测结果的证实。如图5和图6所示，对比样本1的细胞培养结果观察到了比较明显的外泌体，而样本1未观察到外泌体。如图7所示，对比样本1中外泌体的浓度较高，而样本1中未检测到外泌体。因此，通过上述一系列实验结果证实，本申请所提供的外泌体吸附物质、过滤装置及使用该过滤装置去除胎牛血清中外泌体的方法具有比较优异去除外泌体的效果。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 深圳市达科为生物工程有限公司

<120> 去除血清中外泌体的方法及过滤装置

<140> 2022100465677

<141> 2022-01-17

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atatacaccc cacctcgctc ccgtgacact aatgctattt ttt 43

Claims (3)

1.过滤装置，其特征在于，包括装置主体(1)、固定相(12)和过滤件(2)，所述固定相(12)填充于装置主体(1)内部，所述固定相(12)为外泌体吸附物质，所述外泌体吸附物质为负载有核酸适配体的基质；所述核酸适配体为能够特异性识别外泌体表面的跨膜蛋白CD9/CD63/CD81的核酸适配体，所述核酸适配体的序列为ATATACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTT；所述基质为全多孔硅胶微球；所述过滤件(2)设置于装置主体(1)的一端；所述装置主体(1)包括柱体(11)、前封端(13)和后封端(14)，所述前封端(13)设置于柱体(11)远离过滤件(2)的一端，所述后封端(14)设置于柱体(11)与过滤件(2)之间；所述前封端(13)与柱体(11)螺纹连接，所述前封端(13)远离柱体(11)的端面设置有第一凸出端(131)，所述第一凸出端(131)的端面直径小于柱体(11)的端面直径，所述第一凸出端(131)螺纹连接有螺帽(132)；使用所述过滤装置去除血清中外泌体的方法，包括以下步骤：

S1.将血清进行超速离心，收集血清上清液；

S2.将收集到的血清上清液通过所述的外泌体吸附物质进行吸附处理，得到处理后的血清上清液；

S3.收集处理后的血清上清液并进行过滤；

S4.将过滤后的血清上清液进行无菌处理并进行封装；

在步骤S3中，使用滤膜过滤，所述滤膜的孔径不大于0.22μm；

在步骤S2和步骤S3中，使用了所述过滤装置；

所述后封端(14)与柱体(11)螺纹连接，所述后封端(14)远离柱体(11)的端面设置有第二凸出端(141)，所述第二凸出端(141)的端面直径小于柱体(11)的端面直径；所述过滤件(2)螺纹连接于第二凸出端(141)；

所述过滤件(2)包括过滤层(21)、进样端(22)和出样端(23)，所述过滤层(21)设置于进样端(22)和出样端(23)之间，所述进样端(22)螺纹连接于第二凸出端(141)；

所述出样端(23)设置为锥形出口(231)，所述锥形出口(231)上设置有阀门(3)；

所述过滤装置的制作方法，包括以下步骤：

Z1.将柱体进行反复清洗并烘干；

Z2.将上述所述的外泌体吸附物质作为固定相，并进行预处理；

Z3.将后封端螺旋安装于柱体上，并将固定相在高压下填充入柱体，压实；

Z4.将前封端螺旋安装于柱体远离后封端的一端；

Z5.对固定相进行老化处理；

Z6.将过滤件安装于后封端的第二凸出端上，再将阀门安装于出样端；

在步骤Z1中，依次使用20%～25%的氢氧化钠洗液、10%～15%的盐酸溶液和超纯水反复清洗，在100～120℃下烘干；

在步骤Z5中，将此高压过滤装置的第一凸出端连接氮气，并在100～120℃下氮气流入2～3h，冷却。

2.根据权利要求1所述的过滤装置，其特征在于，所述柱体(11)为玻璃套管或不锈钢套管。

3.根据权利要求1所述的过滤装置，其特征在于，所述柱体(11)的直径不小于5厘米。

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