CN115896266A - 用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明还涉及上述试剂在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的致病基因MYPN和DSP新位点可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因MYPN和DSP开发的试剂及其检测试剂盒可以将携带MYPN c.3073dupC和DSP c.6751delT基因突变的患者和正常人群区分开，对扩张型心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。

Description

用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用。

背景技术

扩张型心肌病(diated cardiomyopathy,DCM)是引起心力衰竭(心衰)、心律失常和猝死的常见疾病之一，临床表现为：心脏逐渐扩大、心室收缩功能降低，心衰，室性和室上性心律失常，传导系统异常，血栓栓塞和猝死。2002年中国分层整群抽样调查9个地区8080例正常人群，DCM患病率为19/10万(王志民，2004)。2004年中国一项报道显示，767例DCM患者随访52个月病死率为42.24％(Liu X,2014)，给家庭和社会带来了沉重的负担。

由致病基因突变导致的DCM称为“家族性DCM(familial diated cardiomyopathy,FDCM)”，FDCM的主要致病基因有TTN、LMNA、MYH7、MYH6、MYPN、TNNT2、ACTC1、BAG3、DSP、RBM20、SCN5A、TPM1、DES和DMD，约40％的家族性DCM可筛查到明确的致病基因突变。其中，MYPN基因编码的蛋白质与骨骼肌或心肌中的伴肌动蛋白和α-肌动蛋白相互作用。z线作为横纹肌的标志，代表肌动蛋白细丝、肌连蛋白、伴肌动蛋白或星云小体以及结构和功能所需辅助蛋白的末端。此外，该基因产物可以与I-band蛋白相互作用，表明其具有调控和结构功能。DSP基因编码中间丝与染色体斑结合蛋白，结合产物形成功能性桥粒的专性组分。

基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，虽然目前已发现致病基因MYPN和DSP基因的许多突变位点，进一步发现新的MYPN和DSP基因突变将有助于进一步研究扩张型心肌病，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用。

本发明目的在于提供：用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列SEQ ID NO:9相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQID NO:1；与所述生型MYPN基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10相比，所述致病基因MYPN编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型DSP基因的参考序列SEQ ID NO:11相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；与所述生型DSP基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO:12相比，所述致病基因DSP编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

具体突变信息如下：

本发明还提供了用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

本发明的原理和有益效果在于：本发明提供的致病基因MYPN和DSP新位点可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因MYPN和DSP开发扩张型心肌病体外诊断检测试剂盒可以将携带MYPN c.3073dupC、DSP c.6751delT基因突变的患者和正常人群区分开，对扩张型心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。为生育需求的患者提供为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，能够有效减少患儿的出生。

附图说明

图1为实施例1扩张型心肌病患者的Sanger测序图；

图2为实施例2扩张型心肌病患者的Sanger测序图；

图3为实施例3中携带MYPN c.3073dupC杂合错义变异的先证者的家系图；

图4为实施例3中携带DSP c.6751delT杂合错义变异的先证者的家系图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

试剂来源：预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。

实施例1：MYPN c.3073dupC验证实验

在临床诊断为扩张型心肌病患者(男，26岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

S2、准备PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-FreeH₂O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：

正向引物(MYPN-E14F，SEQ ID NO:5)：5'TTTCCTCACCCCAGACCCT 3'；反向引物(MYPN-E14R，SEQ ID NO:6)：5'AATGACATCAACCGCTCCT 3'。长度：288bp。

S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性90s；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。

S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

S6、Sanger测序：使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

S7、测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型MYPN基因序列(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

S8、基因变异论证：患者检测到MYPN c.3073dupC杂合错义变异，测序结果如图1所示。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。

该插入变异使第1025位极性不带电荷的谷氨酰胺变为非极性的脯氨酸，其后蛋白移码表达，并使其后第61位氨基酸出现一终止密码子，可能会使蛋白截短表达。根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异可能会使蛋白截短表达，但缺乏家系连锁及功能学证据支持，所以该变异为高度可疑致病变异。

实施例2：DSP c.6751delT验证实验

在临床诊断为扩张型心肌病患者(男，4岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

采用实施例1的S1-S6方法检测患者是否携带DSP c.6751delT变异，所用到的正向引物(MYPN-E14F，SEQ ID NO:7)：5'TAAGCACCGAAGAAGCCATC 3'；反向引物(MYPN-E14R，SEQID NO:8)：5'TTAGCACTTCAGACGCACT 3'。长度：614bp。扩增程序为：95℃预变性2min；93℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。

将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型DSP基因序列(SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

先证者携带了DSP基因c.6751delT纯合缺失变异(DSP:p.Phe2251LeufsTer33hom)，测序结果如图2所示。该插入变异使第2251位非极性的苯丙氨酸变为非极性的异亮氨酸，其后蛋白移码表达且终止密码子消失，可能会使蛋白延长表达，增加了11个氨基酸。

检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。

根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为扩张型心肌病的高度可疑致病突变。

实施例3：无关样本验证实验

招募1100名未患有扩张型心肌病的健康人群和500名扩张型心肌病患者，使用实施例1中的方法检测该患者家系的每个成员以及对照人群的是否携带MYPN c.3073dupC和DSP c.6751delT变异。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)扩张型心肌病家系；国别/地区：中国/上海；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：5-50岁；(2)对照人群国别/地区：中国/上海；对照人群男女比例：1﹕1；对照人群年龄分布：5-50岁。

在一个扩张型心肌病的家系(家系图如图3所示)的患病成员中检测到MYPNc.3073dupC杂合错义变异；而家系内非患病成员及1100名未患有扩张型心肌病的健康人群未见该位点的突变。

在一个扩张型心肌病的家系(家系图如图4所示)的患病成员中检测到DSPc.6751delT杂合错义变异，而家系内非患病成员及1100名未患有扩张型心肌病的健康人群未见该位点的突变。

实施例4：扩张型心肌病检测试剂盒

1.组成：

表2.组成

2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取体外诊断检测试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的体外诊断检测试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有MYPN c.3073dupC或DSP c.6751delT杂合错义变异。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (3)

1.用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物SEQID NO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

2.根据权利要求1所述的用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，其特征在于，所述致病基因MYPN编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述致病基因DSP编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。

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