CN117487904A - Gabrb3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

Gabrb3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用；其中，所述基因突变体相较于野生型GABRB3基因，在所述野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基发生碱基T突变为碱基C。本发明提供的基因突变体能够用于筛查或诊断Ohtahara综合征的致病基因突变携带者或患者，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为Ohtahara综合征患者的治疗提供全新的理论依据。

Description

GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及医学诊断技术领域，尤其涉及一种GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
Ohtahara综合征，又称为大田原综合征(MIM 617113)或早期婴儿癫痫性脑病（EIEE），该病是一种以癫痫发作为特征的神经系统罕见疾病，由日本神经学家大田原（Ohtahara）于1976年首次报道，其主要临床特征和电生理特征为婴儿早期或新生儿期起病、频繁及难以控制的强直痉挛发作、典型暴发-抑制脑电图及精神运动发育落后。该病可能的病因包括脑畸形、代谢紊乱和某些基因突变。迄今为止，已发现多个基因与该病有关，其中GABRB3、ARX、STXBP1、KCNQ2等基因已经被证实是该病的致病基因。
Ohtahara综合征致病基因GABRB3（MIM 137192）定位于染色体15q12，基因全长230.2kb，包含9个外显子和8个内含子，编码含473个氨基酸的GABAa受体β3亚单位。GABAa受体是配体门控的氯离子通道，在脑内调节快速抑制性神经传递。GABAa受体是由结构相当的同源亚单位组成的五聚体，这些亚单位包括：αl-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、π、θ以及ρl-3。GABAa受体能被γ一氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid, GABA)激活，同时是几种抗癫痫药物作用的靶点。任何增加GABAa受体抑制作用的因素即可产生抗惊厥的作用，反之，GABAa受体功能下降可导致惊厥的发生。目前，已报道4个GABAa受体亚单位基因GABRA1、GABRB3、GABRD及GABRG2与特发性癫痫有关，其中GABRB3蛋白编码GABAa受体的β3亚单位，GABRB3的变异与多种癫痫亚型共有的一种惊厥表现有关。
基因突变是导致Ohtahara综合征发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Ohtahara综合征的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，研发检测方法，确定突变位点，助力Ohtahara综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗，具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用，以解决Ohtahara综合征的筛查和诊断的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种GABRB3基因突变体，所述GABRB3基因突变体相较于野生型GABRB3基因，在所述野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基发生碱基T突变为碱基C。
本发明还提供了一种GABRB3突变体蛋白，所述GABRB3突变体蛋白相较于野生型GABRB3基因编码的蛋白，第149位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了一种如上述任意所述的GABRB3基因突变体作为检测靶点在制备Ohtahara综合征的检测试剂和/或制备Ohtahara综合征的检测试剂盒中的应用。
进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物GABRB3-1F和下游引物GABRB3-1R；所述上游引物GABRB3-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物GABRB3-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物GABRB3-Seq1F和下游引物GABRB3-Seq1R；所述上游引物GABRB3-Seq1F包括如SEQID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物GABRB3-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种如上述任意所述的GABRB3突变体蛋白作为检测靶点在制备Ohtahara综合征的检测试剂和/或制备Ohtahara综合征的检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种Ohtahara综合征的检测试剂，所述检测试剂的检测靶点包括如上述任意所述的GABRB3基因突变体或如上述任意所述的GABRB3突变体蛋白。
本发明还提供了一种Ohtahara综合征的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上述任意所述的检测试剂。
本发明的有益效果至少包括：
本发明提供了一种GABRB3基因突变体，其相较于野生型GABRB3基因，在野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基由碱基T突变为碱基C；并且，本发明发现该GABRB3基因突变体可以导致Ohtahara综合征。
本发明提供的GABRB3基因突变体丰富了Ohtahara综合征的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述GABRB3基因突变体，能够筛查或诊断Ohtahara综合征的致病基因突变携带者或患者，用于Ohtahara综合征的遗传学诊断，以提供产前诊断、优生优育和治疗干预指导，为Ohtahara综合征患者的治疗提供全新的理论依据，为治疗Ohtahara综合征提供可能的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为Ohtahara综合征1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，↗表示先证者；
图2为利用Sanger测序检测1号家系GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型的结果图，其中，C层：1号家系中杂合子突变者；A和B层：1号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）；
图3为Ohtahara综合征2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，●表示女性患者，↗表示先证者；
图4为利用试剂盒检测2号家系先证者GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型的结果图；其中，C层：2号家系中杂合子突变者；A和B层：2号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，术语“常染色体显性遗传”是指只要父母一方常染色体上存在致病基因，并将其传给孩子，无论孩子的另一个基因是否正常，都可能导致疾病，与性别无关。有遗传病家族史者需进行孕前产前检查，避免遗传病影响下一代。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生同样突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
在本发明中，术语“错义突变”是指是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
为了丰富Ohtahara综合征的致病突变谱，精准判断Ohtahara综合征，用于Ohtahara综合征的遗传学诊断以指导治疗，以及胚胎植入前遗传学诊断和优生优育，本发明提供了GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用。
需了解的是，本发明中，野生型GABRB3基因的Genbank登录号为NM_000814.6，具体序列如SEQ ID NO.42所示。野生型GABRB3基因编码的蛋白，其ID号为NP_000805.1，具体序列如SEQ ID NO.43所示。
本发明提供了一种GABRB3基因突变体，所述GABRB3基因突变体包括c.446T>C，具体序列如SEQ ID NO.44所示。在本发明中，c.446T>C表示野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基T突变为C，产生包括SEQ ID NO.5（5’-GGACAGGCTGTA-3’）所示的核苷酸片段（方框内字母为点突变发生处）。
即，本发明提供的所述GABRB3基因突变体相较于野生型GABRB3基因，在所述野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基发生碱基T突变为碱基C；其中，
需说明的是，c.446T>C导致编码的GABRB3蛋白与野生型GABRB3基因编码的蛋白相比，第149位氨基酸由缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A），即错义突变，记为GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A，具体序列如SEQ ID NO.45所示；其中，突变产生的核心氨基酸的序列如SEQ ID NO.6所示（DGTLYG）（方框内字母为错义突变后的氨基酸），影响正常GABRB3功能，引起Ohtahara综合征，具有致病性。
本发明提供的所述GABRB3基因突变体可以将Ohtahara综合征患者和正常人群区分开，是一种诊断Ohtahara综合征的生物标志物，有助于Ohtahara综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。需指出的是，本发明首次发现了c.446T>C可以导致Ohtahara综合征，家系中未患病成员检测该突变结果为阴性。
本发明中，由于所述GABRB3基因突变体相较于所述野生型GABRB3基因，第4号外显子的第446位碱基T突变为C，导致编码的蛋白与野生型GABRB3基因编码的蛋白相比，第149位氨基酸由缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A）。因此，本发明还提供了一种GABRB3突变体蛋白，所述GABRB3突变体蛋白相较于野生型GABRB3基因编码的蛋白，第149位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了一种如上述任意所述的GABRB3基因突变体或如上述任意所述的GABRB3突变体蛋白作为检测靶点在制备Ohtahara综合征检测试剂和/或制备Ohtahara综合征检测试剂盒中的应用。
其中，所述Ohtahara综合征检测试剂盒可以包括或为Ohtahara综合征预防试剂盒、Ohtahara综合征诊断试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、Ohtahara综合征辅助治疗试剂盒中的一种或多种。
本发明还提供了一种检测Ohtahara综合征的扩增引物（引物对），所述扩增引物包括上游引物GABRB3-1F和下游引物GABRB3-1R；所述上游引物GABRB3-1F的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物GABRB3-1R的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.1：5’- ATGGCATCCGTTTCTCC -3’；
SEQ ID NO.2：5’- TCGTGGCACTACCTCAAT -3’。
需说明的是，所述扩增引物能够特异性扩增GABRB3基因突变体，用于检测GABRB3基因上是否存在c.446T>C的突变位点；具体而言，所述扩增引物可以特异性扩增含有c.446T>C突变位点的GABRB3基因突变体片段或野生型GABRB3基因片段；然后，通过测序引物进行测序后即可区分GABRB3基因突变体和野生型GABRB3基因。
本发明还提供了一种检测Ohtahara综合征的测序引物（引物对），所述测序引物包括上游引物GABRB3-Seq1F和下游引物GABRB3-Seq1R；所述上游引物GABRB3-Seq1F的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物GABRB3-Seq1R的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明中，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.3：5’-ATTTGGCTGGTCGTGGAG-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GCAGTGTCAGGGCGATAT-3’。
所述测序引物可以对所述扩增引物的扩增产物进行测序，以区分GABRB3基因突变体和野生型GABRB3基因；本发明利用所述测序引物对所述扩增引物扩增的片段进行测序，能够快速精准诊断Ohtahara综合征。
本发明还提供了一种检测Ohtahara综合征的引物组合，包括如上述任意所述的扩增引物和/或如上述任意所述的测序引物。
本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合在制备Ohtahara综合征检测试剂中的应用；所述试剂包括或为检测所述GABRB3基因突变体的试剂。
需说明的是，本发明中，所述Ohtahara综合征的检测靶点可以包括或为如上述任意所述的GABRB3基因突变体和/或如上述任意所述的GABRB3突变体蛋白，优选可以为所述GABRB3基因突变体。所述GABRB3基因突变体包括或为c.446T>C；即，所述GABRB3基因突变体相较于野生型GABRB3基因，在所述野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基由碱基T突变为碱基C。
本发明利用外显子测序筛选与Ohtahara综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，首次发现GABRB3基因存在c.446T>C时，与Ohtahara综合征相关；因此，通过检测GABRB3基因是否存在c.446T>C，能够检测Ohtahara综合征。
本发明还提供了一种Ohtahara综合征检测试剂，所述检测试剂的检测靶点包括如上述任意所述的GABRB3基因突变体或如上述任意所述的GABRB3突变体蛋白。
所述Ohtahara综合征检测试剂可以包括如上述任意所述的引物组合；所述Ohtahara综合征检测试剂还可以包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子、Tap聚合酶中的一种或多种。
本发明还提供了一种如上述任意所述的Ohtahara综合征检测试剂在Ohtahara综合征检测试剂盒及其制备中的应用。即，本发明还提供了一种Ohtahara综合征检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上述任意所述的检测试剂。
所述Ohtahara综合征检测试剂盒可以包括或为Ohtahara综合征预防试剂盒、Ohtahara综合征诊断试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、Ohtahara综合征辅助治疗试剂盒中的一种或多种。
本发明通过所述扩增引物能够扩增野生型GABRB3基因和Ohtahara综合征患者GABRB3基因，再利用所述测序引物进行测序，能够区分野生型GABRB3基因和Ohtahara综合征患者GABRB3基因，诊断Ohtahara综合征。
以所述Ohtahara综合征诊断试剂盒为例，本发明提供的所述Ohtahara综合征诊断试剂盒包括如上述任意所述的Ohtahara综合征检测试剂，所述Ohtahara综合征诊断试剂盒通过男性个体和/或女性个体的检测样品中GABRB3基因突变体的基因型，诊断个体是否患有Ohtahara综合征；所述检测样品优选包括或为血液。
本发明中，通过基因型诊断个体是否患有Ohtahara综合征的标准具体为：
当个体c.446T>C位点的基因型是“c.446T>C杂合子突变，则为患者；
当个体c.446T>C位点的基因型是“c.446T>C纯合子突变”，则为患者；
当个体c.446T>C位点的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
在本发明中，术语“杂合子突变””是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中；术语“纯合子突变”是突变存在于一对等位基因中的二个基因中，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的GABRB3基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版；
早期婴儿型癫痫性脑病是一种恶性癫痫。本病征以发病年龄早、脑电图具有暴发-抑制波型、惊厥难以控制、预后差、可转变成婴儿痉挛症等特点。3个月内起病，强直和/或强直阵挛发作，每天可发作2～40次不等，每次发作短暂，短则10秒，长则只有5分钟。可以成串发作，部分病儿以后转为婴儿痉挛症。智力及体格发育显著落后，严重者从不会哭笑和注视，病后竖头功能丧失。存活者常不会抬头，语言障碍、肢体偏瘫等。头部CT大多有不同程度的皮质萎缩，部分出现左额叶低密度影、中线结构左移，脑室扩张等。脑电图具有特征性暴发-抑制型脑电图，根据脑电图的特点及演变，可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型脑电图可从连续暴发抑制演变呈高峰节律紊乱，然后转变成广泛的慢棘-慢波；Ⅱ型是从暴发抑制波演变呈病灶性棘波。
诊断：
1、诊断必备条件
（1）发病年龄为新生儿及小婴儿（主要在生后3个月内起病）。
（2）频繁而难以控制的强直和（或）强直阵挛发作。
（3）特征性暴发抑制型脑电图。
（4）严重的精神运动障碍。
2、诊断参考条件
（1）家族史、多种病因。
（2）可转变为婴儿痉挛症。
2.检测对象
以2个Ohtahara综合征家系（简称1号家系）为受试对象，进行检测，该1号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1。
表1 Ohtahara综合征1号家系成员的临床信息
注：Ⅰ和Ⅱ依次表示第一代和第二代，1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA用于测序。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2 仪器设备
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒（Agilent）、DNA 1000试剂盒（Agilent）、96孔板（Axygen）、不同型号枪头（Axygen）、200μL离心管（Eppendorf）、1.5mL离心管（Eppendorf）、毛细管电泳缓冲液（Thermo）、测序标准物（Thermo）、无水乙醇 （Thermo）、BigDyeTerminator V3.1（Thermo）、外周血gDNA提取试剂盒（TIANGEN）、琼脂糖（TIANGEN）和EB染液（Amresco）。
3.试剂配方
1）5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
2）0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。
3）10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
4）1×细胞核裂解液配方按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员外周血3~5mL为研究样品。
4.1样本DNA提取
1）样本3~5mL装入15mL离心管中，加2~3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如为羊水则直接进行步骤2）。
2）4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3）加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。
4）小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液（酚和氯仿的体积比为1:1）混匀，室温3000rpm离心10分钟。
5）小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6）将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7）TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1）取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150~250bp片段；
2）DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3）连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4）Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5）NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A；该突变为位于第4号外显子的第446位碱基T突变为C，导致第149位氨基酸由缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A），即错义突变。
在1号家系患者个体中GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点的基因型是“c.446T>C杂合子突变”，在1号家系正常个体中该位点基因型为“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对该家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员（先证者、先证者父亲、先证者母亲）和100名家系外正常人进行GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1.DNA提取
按照实施例2的方法提基因组DNA。
2.候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）。
2.2针对突变位点c.446T>C设计18对候选引物（见表6），并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6 针对c.446T>C位点候选引物基本情况和验证实验结果
/>
/>
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类引物。
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管（表7中序号1至8）。
表7 引物检测PCR反应体系
/>
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃预变性5min；
第二步：30个循环（95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec）；（根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数）；
第三步：72℃延伸7min；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1）用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2）称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上（加石棉网）加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3）待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4）凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5）加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1~2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6）盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7）切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10~15分钟。
8）将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1）如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和反应体系有效性好和特异性强；
2）如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4）如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点的扩增引物。
GABRB3-1F：5’- ATGGCATCCGTTTCTCC-3’（SEQ ID NO.1）；
GABRB3-1R：5’- TCGTGGCACTACCTCAAT-3’（SEQ ID NO.2）。
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8 突变点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，针对c.446T>C位点执行以下反应程序：
第一步：95℃预变性5min；
第二步：30个循环（95℃变性30sec→52℃退火30sec→72℃延伸60sec）；
第三步：72℃延伸7min；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I（Exo I），1μL碱性磷酸酶（AIP），37℃消化15min，85℃使酶失活15min。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
测序PCR循环条件：
第一步：96℃预变性1min；
第二步：33个循环（96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min）；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1）每管加入1μL 125mM EDTA（pH8.0），加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc（pH5.2）；
2）加入70μL 70％酒精，振荡混匀4次，室温放置15min；
3）3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；
4）室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2基础上设计巢式引物（第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的）作为测序引物，引物序列如下所示。
针对GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点的测序引物序列如下所示：
GABRB3-Seq1F：5’-ATTTGGCTGGTCGTGGAG-3’（SEQ ID NO.3）；
GABRB3-Seq1R：5’-GCAGTGTCAGGGCGATAT-3’（SEQ ID NO.4）。
9、结果分析
针对GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点的测序结果如图2所示。根据图2可以看出1号家系中1名患者GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型是“c.446T>C”杂合子突变；1号家系中2名正常个体及100个无血缘关系的正常对照的GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型是“野生型”。
实施例4
Ohtahara综合征诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
试剂盒1：1）扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；2）PCR缓冲液（10×PCR缓冲液，由KCl 500mmol/L、Tris-HCl（pH8.3）100mmol/L和MgCl215mmol/L组成）；3）Taq酶（20U）；4）dNTPs（四种dNTP各4mM）；5）c.446T>C阳性参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.446T>C突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.7所示，具体的：5’-TGGCATCC GTTTCTCCTGGTTATTCACTGTAGAGCCTAGATTGCAACCTGAA TTTGGCTGGTCGTGG AGGAAATACACCTGTGGCTGGGTACAAACTAACTTTCTTTCTTTTCTTTTCCCCCCAGGATTATACCTTAACCATGTATTTTCAACAATATTGGAGAGATAAAAGGCTCGCCTATTCTGGGATCCCTCTCAACCTCACGCTTGACAATCGAGTGGCTGACCAGCTATGGGTGCCCGACACATATTTCTTAAATGACAAAAAGTCATTTGTGCATGGAGTGACAGTGAAAAACCGCATGATCCGTCTTCACCCTGATGGGACAGGCTGTATGGGCTCAGGTCTGTGTGCCTCTTCAGGACCAATTTTGCTGTTGCATGGTGCATGGGTGTTGAATATCTCACTTGAGATGATTATTGTAAGTGAGGCAATGACCTCAGATAAATTAGGAAGCATCTATGAAGCACTAAAGCTTTGCAGAAAAAAAAATCTCATAACCATAAAATTTGGGGCATTACTGTTACTGTAAATAGTCACAAGCAGTTGAAAAACAGCCACCTTTGGATCAATTGTATATAATTGGATTGCCATGTCTAAGAACACAGATTCCCTCAGGATGGATTTTCCATATCATAGCCACAGAGGCCTGTAATTA ATATCGCCCTGACACTGC AGTGGCTTCAGTGAAGTTTTTTTCAAAGCTGTCTGCACAGTTGAAAAAAAAATGTCTGTTGCGCAGATTGTAGGGTTTACTCTCTACGGAGCTTTATTGAGGTAGTGCCACGA-3’，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框为突变位点，单下划线加粗斜体碱基为上下游测序引物位置；6）测序引物：如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
2、使用方法：
共筛查和检测43个癫痫家系中128位个体，并再次发现如下契合本发明的7个家系7位患者（见表10）；现以2号家系为实施例阐述该基因突变检测试剂盒的应用。2号家系临床信息如表11所示，2号家系图谱如图3。
表10 Ohtahara综合征筛查情况一览表
#：该患者出生时有缺氧窒息抢救史。
：该家系1例孕妇后再次妊娠，经羊水穿刺和产前诊断明确为其他患病胎儿，后因失访该患病胎儿未计入统计。
表11 Ohtahara综合征2号家系成员的临床信息
注：Ⅰ、Ⅱ依次表示第一代、第二代。
2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员外周血DNA用于该试剂盒1检测；步骤如下：
1）基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA；
2）先采用试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，具体如实施例3步骤3；
3）对PCR扩增产物进行纯化，具体如实施例3步骤5；
4）采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应，具体如实施例3步骤6；
5）对BiyDye反应产物纯化，具体如实施例3步骤7；
6）对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较，具体如实施例3步骤8。
利用试剂盒对2号家系人员检测结果如图4所示，其中C层箭头所指位置显示家系中先证者GABRB3:NM_000814.6:exon4:c.446T>C:p.V149A位点基因型是“c.446T>C”杂合子突变；A和B层先证者父母不存在突变；检测结果确认先证者为Ohtahara综合征患者，先证者父母基因型为野生型，为正常个体。该突变为新发突变可能，先证者父母以后生育Ohtahara综合征患者后代的概率低，但建议以后如需继续生育，需来医院行产前诊断。
根据上述实施例可以看出，本发明GABRB3基因突变体可以作为诊断Ohtahara综合征的生物标志物，为治疗Ohtahara综合征提供可能的药物靶点。
实施例5
基因突变评级与解读（突变的致病性）
突变解读基于我们目前对Ohtahara综合征与致病基因GABRB3的了解认识(https://www.omim.org/entry/137192)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南（http://www.hgvs.org/），并根据 GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南：Richards,S，et al., Standards and guidelines for the interpretation ofsequence variants:a joint consensus recommendation of the American College ofMedical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med, advance online publication 5 March 2015. doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等. 遗传变异分类标准与指南. 中国科学：生命科学，2017，47：668–688。
《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的（pathogenic，P）”、“可能致病的（likely pathogenic，LP）”、“意义不明确的（variant of uncertainsignificance，VUS）”、“可能良性的（likely benign，LB）”和“良性的（benign，B）”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分（表12）。
表12 变异致病性判定准则
五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1~4)、中等(moderate，PM1~6)、或辅助证据(supporting，PP1~5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1~4)、或辅助证据(BP1~6) (见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1~4/PM1~6/PP1~5/BA1/BS1~4/BP1~6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病（P）”中 (i)+(b)的准则 ]。
表13 变异判读标准及变异致病性判定准则
/>
突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具（见表15）和众多可用的数据（库）（见表16），包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据（库）对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。
表14 程度判断评价标准
/>
表15 生物信息分析工具
/>
表16 人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库
/>
根据上述标准或准则，本发明中GABRB3基因c.446T>C突变评定为“致病”，判断标准及具体证据如下表17：
表17 GABRB3基因c.446T>C突变致病性解读
AD：指常染色体显性遗传。
GABRB3:NM_000814.6:Exon4:c.446T>C:p.V149A变异评级证据如下：
1、PS2 ：该变异为8个家系分析验证的新发变异；
2、PS4：结合文献和本病例，在8名患者中检测到该变异；
3、PM2：GABRB3基因c.446T>C变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；
4、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；
因此，该突变/变异的综合性证据（PS2+PS4+PM2+PP3）符合表12中“致病（P）”评判标准(ii)，在此综合判定GABRB3基因c.446T>C变异为“致病”。
实施例6
随访及诊断试剂盒检测性能分析
对于经过产前诊断的胎儿，对其出生后情况进行了随访。并对所有个体的GABRB3基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证（见表18）。
表18 c.446T>C位点检测的性能分析结果
注：本表包含家系1的随访数据。
根据家系1和表10的数据可以看出，在对8个家系进行检测时发现阳性患者。上述阳性位点检测结果均通过GABRB3基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现8例真阳性病例、29例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。c.446T>C变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种GABRB3基因突变体，其特征在于，所述GABRB3基因突变体相较于野生型GABRB3基因，在所述野生型GABRB3基因的第4号外显子的第446位碱基发生碱基T突变为碱基C。
2.一种GABRB3突变体蛋白，其特征在于，所述GABRB3突变体蛋白相较于野生型GABRB3基因编码的蛋白，第149位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。
3.一种如权利要求1所述的GABRB3基因突变体作为检测靶点在制备Ohtahara综合征的检测试剂和/或制备Ohtahara综合征的检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物GABRB3-1F和下游引物GABRB3-1R；所述上游引物GABRB3-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物GABRB3-1R包括如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物GABRB3-Seq1F和下游引物GABRB3-Seq1R；所述上游引物GABRB3-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物GABRB3-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
6.一种如权利要求2所述的GABRB3突变体蛋白作为检测靶点在制备Ohtahara综合征的检测试剂和/或制备Ohtahara综合征的检测试剂盒中的应用。
7.一种Ohtahara综合征的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的检测靶点包括如权利要求1所述的GABRB3基因突变体或如权利要求2所述的GABRB3突变体蛋白。
8.一种Ohtahara综合征的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求7所述的检测试剂。
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