CN109825580A - 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学核酸检测试剂盒技术领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒，包括PCR扩增引物、Taq‑man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照。所述的标记Taq‑man探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测，且价格低廉，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学核酸检测试剂盒技术领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR 基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因的特定位点突变已经成为指导靶向治疗用药的先决条件。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。
EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点，有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子，因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。
EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中90％的突变位于19和21区的外显子，称为经典型突变，外显子 18和20突变约占10％。外显子19的突变主要是第746-750位密码子(ΔE746-E750)缺失突变，导致其相应的氨基酸序列丢失。外显子19缺失突变占约46％，主要是发生9、12、 15、18、24个核苷酸的框内缺失突变。因此EGFR外显子exon19缺失突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
目前基因变异的检测技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法。现分别简介于下：
测序法是目前进行EGFR突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高；聚合酶链式反应－单链构象多态性分析(PCR-SSCP)PCR-SSCP是一种比较经典的基因突变检测的方法，该方法可以对未知的突变进行检测。与测序法相比，PCR-SSCP灵敏性更高，操作简单，无需特殊仪器，还可以对未知的突变进行检测；ARMS法也称扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)、等位基因特性PCR(AlleleSpecific PCR，ASPCR)等，即等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification，ASA，选择性地扩增野生型或突变型基因。
上述现有技术存在以下问题：价格昂贵，操作复杂，且一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。
发明内容
针对现阶段检测EGFR基因外显子19缺失突变的方法中存在的问题，本发明提供了一种价格低廉，操作简单，可一次性测定八种突变的检测试剂盒及其方法，为个体化用药提供参考。
本发明技术方案如下：
一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，包括PCR扩增引物、Taq-man探针、数字 PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照。
所述的PCR扩增引物，包括反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；用于扩增含有EGFR外显子19上c.2204-c.2335序列的片段；所述的EGFR外显子19上c.2204-c.2335 的序列如SEQ No.1所示；
所述的Taq-man探针包括位点探针及参考探针；所述的参考探针序列如SEQ No.2所示:
所述的位点探针序列如SEQ No.3所示；
所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。
所述的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；所述的猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
优选地，所述的反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物包括上游引物及下游引物；所述的上游引物的序列如SEQ No.4所示：
所述的下游引物的序列如SEQ No.5所示：
所述的数字PCR预混液包括TaqMan聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂。
所述的上游引物和下游引物的使用浓度为5μM～15μM，在最终反应体系中的浓度为400nM～1200nM。
优选地，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为800nM。
所述的位点探针和参考探针的使用浓度为5μM～25μM，在最终反应体系中的浓度为100nM～500nM。
优选的所述的位点探针和参考探针的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为200nM。
所述的阴性对照来源于携带EGFR基因19外显子野生型非小细胞肺癌细胞A549。
所述的阳性对照来源于携带EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9。
上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)DNA提取：提取含有EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9和EGFR基因野生型细胞A549的基因组DNA；
(2)数字PCR反应液制备；
(3)PCR反应微滴制备；
(4)PCR扩增：退火后，然后扩增反应；
(5)检测及计算突变率。
所述步骤(2)包括：将待检测样品、PCR扩增上下游引物、EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针以及数字PCR预混液混合，无酶水补足加样体系，制备得到数字 PCR混合液。
所述步骤(3)包括：将PCR反应液转移至微滴发生卡，在油孔中加入微滴生成油，制备微滴。
所述的扩增反应过程为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，55℃～63℃退火/延伸60～120秒，，共进行20～60个循环，95℃～100℃酶失活8～16分钟，16℃无限循环。
优选地，所述的扩增反应过程为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60.1℃退火/延伸120秒，共进行40个循环，98℃酶失活10分钟，16℃无限循环。
上述的标记Taq-man探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
本发明以美国伯乐微滴式数字PCR为平台，选择EGFR基因19外显子区域进行探针和引物的设计。所选择的潜在19外显子缺失突变的位点为EGFR基因19外显子E746-P753 位点缺失突变。此潜在的19外显子缺失区域涵盖八种EGFR基因19外显子缺失突变的类型 (如表1)：
表1本发明已检测的EGFR基因19外显子缺失突变的类型
| 突变名称 | 突变类型 | 突变位点 |
| E746_A750del | Deletion-Inframe | p.E746_A750delELREA |
| E746_A750del | Deletion-Inframe | p.E746_A750delELREA |
| L747_P753del | Complex-deletion in frame | p.L747_P753＞S |
| L747_T751del | Deletion-Inframe | p.L747_T751delLREAT |
| L747_A750del | Complex-deletion in frame | p.L747_A750＞P |
| E746_T751del | Complex-deletion in frame | p.E746_T751＞A |
| L747_S752del | Deletion-In frame | p.L747_S752delLREATS |
| L747_T75ldel | Deletion-Inframe | p.L747_T751delLREAT |
本发明的技术原理如图1所示，首先设计与EGFR基因19外显子潜在缺失突变的野生型序列为模板的Taq-man探针，此探针标记以VIC荧光基团，定义为位点探针。
本发明的技术原理如图1所示，在EGFR基因19外显子3’端区域设计，以野生型序列为模板的Taq-man探针，此探针标记以FAM荧光基团，定义为参考探针。
本发明的技术原理如图1所示，若所测样本为野生型，则位点探针与参考探针均可与样本DNA序列结合，探针上的VIC与FAM荧光基团均可被检测到相同或极其相近的信号强度；若样本出现上述任一EGFR基因19外显子缺失的突变，VIC标记的位点探针不能与样本DNA结合，而FAM标记的参考探针可与样本DNA结合，因此可以检测到FAM荧光信号，以及较弱的VIC信号(EGFR基因19外显子杂合缺失)，或检测不到VIC信号 (EGFR基因19外显子纯和缺失)。
本发明有益效果
1.成本低廉
本发明基于微滴式数字PCR技术平台，由于其仅须一次PCR反应即可完成8种位点突变的检测，可明显减少试剂、耗材的消耗，单次检测的成本仅为其他微滴式数字PCR的1/8。
此外，目前肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)也可用于多位点突变的检测。它与 DNA模板结合能力高于普通寡核苷酸，若PNA与模板正确配对时可阻止聚合酶链反应，野生型模板无法扩增；若发生错配，则结合能力迅速下降，此时可用来扩增突变模板。这种检测方法有着难以避免的劣势和局限性。一方面，在此方法中需要加入PNA的探针用以与野生型DNA结合，这就增加了繁琐的操作步骤；且PNA与DNA结合的效率并非100％，这极易造成检测结果偏差，难以避免出现假阴性或假阳性；另一方面，PNA造价比较高，成倍的增加检测成本，难以大范围临床推广应用。
2.一次检测可获得EGFR基因19外显子8种位点缺失信息
本发明选择EGFR基因19外显子区域进行探针和引物的设计，所选择的潜在EGFR基因19外显子缺失突变的位点为E746-P753位点缺失突变，此潜在的19外显子缺失区域涵盖八种EGFR基因19外显子缺失突变的类型，因此一次检测可获得EGFR基因19外显子8种位点缺失信息。这些EGFR基因19外显子缺失突变均是靶向药物酪氨酸激酶抑制剂TKI敏感突变，因此本发明具有极高的临床应用价值。
3.操作简便
本发明的EGFR基因19外显子突变的检测试剂盒，可以同时检测EGFR最常见的多种位点的缺失。而实现这种多重位点缺失一次性检测仅需要一对Taq-man探针和一对PCR引物，与普通数字PCR相同。因此居于操作简单便捷，检测成本低，容错率低等优点。而目前市场上针对EGFR基因19外显子缺失突变PCR试剂盒大多以突变序列为模版设计引物及探针序列，若进行8种突变位点检测需要至少8次PCR反应。本发明操作简便，易于广泛推广。
本发明的EGFR基因19外显子缺失检测技术与一般定量相比，不用设置标准品，也无需设置质控品。一般检测技术是定性检测，突变检出率较低，本发明的技术可以达到真正意义的绝对定量，克服了qPCR等技术无法精确定量的缺点。
4.特异性及灵敏度高
本发明检测灵敏度极高。以前技术方法的灵敏度一般在1％-50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，为0.3％。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。
5.可用于体液样本的检测
本发明提供的试剂盒不仅可以用于组织样本中EGFR基因19外显子缺失突变的检测，还可以用于体液样本的检测，如血清、血浆、唾液、尿液以及胸腹水等中EGFR基因19外显子缺失突变的检测，因此可以无创、快捷、动态以及精准定量的监测病人突变的变化情况，显示了良好的临床应用前景。
6.临床应用前景广泛
本发明立足于临床应用需求，所应用材料、方法等均进行了临床样本验证，甚至在DNA含量极低的唾液中也得到了极好的论证。本发明操作简便，成本低廉，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1基于数字PCR法检测EGFR基因19外显子缺失原理示意图；
图2不同温度下，EGFR基因19外显子缺失数字PCR的扩增效率及特异性检测；
图3在60.1℃EGFR基因19外显子缺失数字PCR的扩增效率及特异性检测；
图4特异性检测：加入不同拷贝数的外源性DNA，检测特异性；
图5特异性检测：加入53,000拷贝数的外源性DNA，检测特异性；
图6灵敏度检测：4％突变率DNA荧光检测结果；
图7灵敏度检测：2％突变率DNA荧光检测结果；
图8灵敏度检测：0.3％突变率DNA荧光检测结果；
图9灵敏度检测：0.2％突变率DNA荧光检测结果；
图10实例分析：同一病人血浆及唾液中检测EGFR-19外显子缺失。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J·萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的序列均来自NCBI，根据NCBI公布的EGFR基因19外显子野生型及缺失突变型序列设计及合成高特异性、高灵敏性的探针、引物。DNA来源主要有人非小细胞肺癌细胞系HCC827的基因组DNA，此细胞为EGFR基因19外显子缺失，可作为阳性对照；人非小细胞肺癌细胞系A549的基因组DNA，此细胞为EGFR野生型，可作为阴性对照；诊断为非小细胞肺癌患者的血浆及唾液，可用于实例分析，在此之前组织检测已确认其为 EGFR基因19外显子缺失突变。
(一)试剂盒构成：
本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒，包括数字PCR预混液、微滴生成油、Taq-man探针、PCR引物、阴性对照和阳性对照。
表2试剂盒成分表
| 成分 | 分装 | 试剂公司 |
| 数字PCR预混液 | 1管 | Bio-Rad公司 |
| 微滴生成油 | 1管 | Bio-Rad公司 |
| Taq-man探针 | 1管 | Life technologies公司 |
| PCR引物 | 1管 | Life technologies公司 |
| 阴性对照 | 1管 | —— |
| 阳性对照 | 1管 | —— |
上述表2试剂盒成分说明如下：
数字PCR预混液主要成分包含Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂等(由Bio-Rad公司提供，货号：1863023)
微滴生成油主要成分是矿物油，(由Bio-Rad公司提供，货号：1863005)，主要作用是微滴化处理过程中将PCR产物形成油包水微液滴。
Taq-man探针：用于识别EGFR外显子19缺失突变的Taq-man探针，分别为上述位点探针和参考探针，是连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，序列见表3
PCR引物：为反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物，可扩增含有EGFR外显子19上c.2204-c.2335(132-bp amplicon)序列的片段，序列见表3。
表3：引物探针序列
| 上游引物 | 5’-GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’ |
| 下游引物 | 5’-TGGGCCTGAGGTTCAGA-3’ |
| 参考探针 | 5’-(FAM)-TGAGTTTCTGCTTTGCTGTGT-(MGB NFQ)-3’ |
| 位点探针 | 5’-(VIC)-AGGAATTAAGAGAAGCAACAT-(MGB NFQ)-3’ |
EGFR基因19外显子缺失上游引物和下游引物的使用浓度为5μM～15μM，在最终反应体系中的浓度为400nM～1200nM，优选的EGFR基因19外显子缺失上游引物和下游引物的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为800nM，
EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针的使用浓度为5μM～25μM，在最终反应体系中的浓度为100nM～500nM，优选的EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针的使用浓度为10μM，在最终反应体系中的浓度为200nM，
阴性对照来源于携带EGFR基因19外显子野生型非小细胞肺癌细胞A549。阳性对照来源于携带EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或 PC9。
(二)试剂盒的使用方法：
本实施例的EGFR基因19外显子缺失突变的具体检测步如下：
1.DNA提取
细胞基因组DNA的提取：培养含有EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9和EGFR基因野生型细胞A549。用TIANGEN公司提供的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)，按照实际说明书提取基因组DNA. 然后通过KSP-3700测定其DNA浓度，确定加样量。
血清/血浆和唾液标本游离DNA的提取：采集非小细胞患者的血清/血浆和唾液标本，高速离心，分离上清，得到血清/血浆和唾液。用Qiagen公司提供的血清/血浆游离核酸提取试剂盒(货号：55114)，按照试剂说明书提取游离DNA。然后通过ThermoFisher公司Qubit3.0核酸蛋白荧光定量仪，测定其游离DNA的浓度和纯度，控制加样量。
数字PCR反应液制备
将待检测样品、PCR扩增上下游引物、EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针以及数字PCR预混液混合，不足22ul反应体系的用无酶水补齐，制备得到数字PCR混合液。
表4：检测EGFR基因19外显子缺失突变的ddPCR
| 数字PCR预混液 | 10ul |
| Taq-man探针 | 0.4ul×2 |
| PCR引物 | 1.6ul×2 |
| DNA模板 | 小于等于8ul |
| 无酶水 | 补足至22ul |
| 反应总体系 | 22ul |
3.PCR反应微滴制备
将配制好并混合均匀的22μl ddPCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8cartridge)中间一排样本孔中，避免孔底部产生气泡；随后在油孔中加入70μl微滴生成油(dropletgeneration oil)，安装胶垫；将装载好的微滴发生卡放入QX200TM微滴生成器制备微滴。每个微滴发生卡一次可同时完成8个样品的微滴制备，一般在2分钟内完成。本实验反应体系通过。微滴成器形成上百万油包水微滴在进行PCR反应，每个微滴至少含有一个或者不含待检核酸靶分子。
退火温度设定
温度梯度设定依次为63℃，62.6℃，61.7℃，60.1℃，58.2℃，56.6℃，55.5℃，55℃。退火时间2min(见图3)。各孔加入同等量的A549DNA(EGFR野生型)。观察不同温度下， EGFR基因19外显子缺失数字PCR的扩增效率及特异性比较。60.1℃时数字PCR的扩增效率及特异性最好。故确定最佳Tm 60.1℃(见图4)。
PCR扩增
将制得的每个样品的微滴分别转移至96孔PCR板中对应的反应孔中。用铝膜热封 (180℃，5sec)，于普通PCR仪上进行扩增。PCR反应程序为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，55℃～63℃退火/延伸60～120秒，，共进行20～60个循环， 95℃～100℃酶失活8～16分钟，16℃无限循环。
优选地，数字PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，60.1℃退火/ 延伸120秒，共进行40个循环，98℃酶失活10分钟，16℃无限循环。
表5：PCR扩增程序设定
6.微滴检测
将PCR扩增后的96孔板放入QX200TM微滴式数字PCR仪的微滴读取仪中，并在软件QuantaSoft上正确选择试剂种类，并设定实验类型为RED，同时检测FAM和VIC的荧光信号。仪器自动分析每个样品的每个微滴的荧光信号，含有荧光信号的标记为1，不含荧光信号的标记为0。然后，通过泊松分布公式自动分析，QuantaSoft软件会根据阳性微滴的比例获得PCR反应体系中的起始模板DNA拷贝数浓度，并给出突变百分比。
PCR结果判定
对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号确定待测样品EGFR基因19外显子位点是否缺失，含未发生突变的野生型DNA模板的微反应微滴中，同时出现FAM和VIC 荧光信号，记为一个信号数；含突变的DNA模板的微反应微滴中，仅出现FAM荧光信号。
突变率计算
19外显子的E19-del位点缺失突变率的计算公式如下：
(三)试剂盒的灵敏度和特异性：
特异性检测：将HCC827-DNA(EGFR基因19外显子缺失型)按照不同拷贝数稀释，拷贝数依次为1000拷贝，2700拷贝，6800拷贝，11000拷贝，23000拷贝，33000拷贝，53000拷贝(见图5)，当拷贝数为53000拷贝时，仍能明显检测其突变(见图6)，证实此发明具有极好的特异性。
灵敏度检测：将HCC827DNA(EGFR基因19外显子缺失型)和A549DNA(EGFR 基因野生型)按照不同拷贝数进行稀释互掺。当突变率为0.3％时，仍能检测其阳性突变，继续稀释，未能检测其阳性突变(见图7～9)，证实此发明具有极好的敏感性。
(四)应用例：
1.血样中ctDNA检测
(1)收集患者保存在EDTA抗凝管中的全血，并转移到2ml EP管中，1900g，4℃离心10min，取上清。
(2)将上清转入1.5ml EP管中，16000g，4℃离心10min，取上清。
(3)用血浆/血清游离核酸提取试剂盒，将1ml血浆按说明书操作提取ctDNA，用30ul水溶。
(4)ctDNA经Qubit3.0测定其浓度和纯度后，确定加样量8ul。
唾液中ctDNA检测
(1)收集患者唾液入痰盒，将其分装到1.5ml EP管中。300g，4℃离心20min，取上清。
(2)将上清转入到新1.5ml EP管中，10000g，4℃离心20min，取上清。
(3)用游离核酸提取试剂盒，将1ml唾液按照说明书操作提取ctDNA，用30ul水溶。
(4)ctDNA经Qubit3.0测定其浓度和纯度后，确定加样量8ul。
组织样本中基因组DNA检测
该患者已经采用病理组织标本进行EGFR基因突变检测，结果为EGFR19外显子缺失。结果如图10所示。同一非小细胞肺癌患者血浆中游离DNA拷贝数为：7660拷贝；EGFR基因 19外显子缺失突变比率为：0.5％。唾液中游离DNA拷贝数为：454拷贝；EGFR基因19外显子缺失突变比率为：1.49％。
序列表
<110> 宋兴国
<120> 一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gtgagaaagt taaaattccc gtcgctatca aggaattaag agaagcaaca tctccgaaag 60
ccaacaagga aatcctcgat gtgagtttct gctttgctgt gtgggggtcc atggctctga 120
acctcaggcc ca 132
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
tgagtttctg ctttgctgtg t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
aggaattaag agaagcaaca t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
gtgagaaagt taaaattccc gtc 23
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
tgggcctgag gttcaga 17
Claims (11)
1.一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增引物、Taq-man探针、数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照；
所述的PCR扩增引物，包括反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；用于扩增含有EGFR外显子19上c.2204-c.2335序列的片段；所述的EGFR外显子19上c.2204-c.2335的序列如SEQNo.1所示；
所述的Taq-man探针包括位点探针及参考探针；
所述的参考探针序列如SEQ No.2所示；
所述的位点探针序列如SEQ No.3所示；
所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；所述的猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物包括上游引物及下游引物，所述的上游引物序列如SEQ No.4所示：
所述的下游引物序列如SEQ No.5所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的数字PCR预混液包括Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为5 μM~15 μM，在最终反应体系中的浓度为400 nM~1200 nM。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的位点探针和参考探针的使用浓度为5 μM~25 μM，在最终反应体系中的浓度为100 nM~500 nM。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照来源于携带EGFR基因19外显子野生型非小细胞肺癌细胞A549；所述的阳性对照来源于携带EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9。
8.一种权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA提取：提取含有EGFR基因19外显子缺失突变的阳性细胞非小细胞肺癌细胞HCC827、H1650或PC9和EGFR基因野生型细胞A549的基因组DNA；
（2）数字PCR反应液制备；
（3）PCR反应微滴制备：将PCR反应液转移至微滴发生卡，在油孔中加入微滴生成油，制备微滴；
（4）PCR扩增：退火后，然后扩增反应；
（5）检测及计算突变率。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）包括：将待检测样品、PCR扩增上下游引物、无酶水、EGFR基因19外显子缺失的位点探针和参考探针以及数字PCR预混液混合制备得到数字PCR混合液。
10.一种权利要求1所述的试剂盒在血浆、血清中检测EGFR-19外显子缺失的应用。
11.一种权利要求1所述的试剂盒在唾液中检测EGFR-19外显子缺失的应用。
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| CN201910065447.XA Pending CN109825580A (zh) | 2019-01-24 | 2019-01-24 | 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105624309A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-06-01 | 深圳华大基因研究院 | 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 |
| CN106801091A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-06 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 |
-
2019
- 2019-01-24 CN CN201910065447.XA patent/CN109825580A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105624309A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-06-01 | 深圳华大基因研究院 | 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 |
| CN106801091A (zh) * | 2017-01-20 | 2017-06-06 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHARLES DECRAENE等: "Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR", 《CLINICAL CHEMISTRY》 * |
| KENNETH S THRESS等: "Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non–small cell lung cancer harboring EGFR T790M", 《NATURE MEDICINE》 * |
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