CN108474779B - 用于肺癌的诊断和治疗的蛋白质和自体抗体生物标志物 - Google Patents

Abstract

本公开的各方面包括产生受试者的循环分析物分布图的方法。所述方法包括使来自受试者的血液样本与一组探测物接触以便与分析物特异性结合，并检测存在或不存在分析物与一组探测物中的探测物的结合。还提供了包括一组捕获探测物并且例如用于实践本公开的方法的传感器设备。

Description

用于肺癌的诊断和治疗的蛋白质和自体抗体生物标志物

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年3月8日提交的序列号62/305、333的美国临时专利申请的申请日的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

对政府支持的参考

本发明是在国立卫生研究院授予的基金号U54CA151459、U54 CA199075和R44CA165296的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

肺癌是美国第二大流行的癌症-也是最致命的-在美国。对于最常见类型的肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，I期的五年生存率为70-80％，无淋巴结转移或远处转移的疾病，但晚期IV期(远期)疾病仅为5-15％。目前的临床算法和成像方式足以用于后期的诊断，但对于定义良性和恶性疾病，特别是在NSCLC的早期发展中，它们仍不完善。侵入性组织活检可能对初步诊断有风险，因此如果可以开发和验证用于临床使用的用于测量外周血中癌症生物标志物的测定，则“液体活检”方法是更安全且可能更具成本效益的方法。肺癌的早期诊断有可能挽救更多患者的生命。

过去15年来，蛋白质组学一直是生物标志物发现研究的一个热门领域，迄今为止几乎没有商业化的平台。在技术发展的同时，蛋白质肿瘤生物标志物的发现也取得了一些进展。例如，基于酶联免疫吸附测定(ELISA)和质谱(MS)的测定可用于测量抗原生物标志物组和抗肿瘤相关抗原的自身抗体组。

其他癌症标志物已显示出希望，诸如存在于I期NSCLC中的推定的循环肿瘤细胞(CTC)。然而，非癌细胞的循环上皮细胞(CEC)可能会出现假阳性信号。最后，循环肿瘤DNA(ct-DNA)可能在肺癌诊断和治疗监测中有一定用处，尽管该技术限于可能不特定于肺癌的特定体细胞突变，并且在早期疾病中检测的灵敏度可能不是足够。

为了分析血液样本中的蛋白质水平，需要获得肺癌特异性生物标志物的灵敏和准确的测量。例如，在癌症诊断领域需要适用于真实世界样本的超灵敏多重体外诊断。

发明内容

本公开的各方面包括产生受试者的循环分析物分布图的方法。所述方法包括使来自受试者的血液样本与一组探测物接触以便与分析物特异性结合，并检测存在或不存在分析物与一组探测物中的探测物的结合。还提供了包括一组捕获探测物并且例如用于实践本公开的方法的传感器设备。

附图说明

图1(组a)示出了根据本公开的实施例的具有80个传感器的磁性纳米传感器芯片，其中每个传感器可以被功能化以检测具有预固定在传感器表面上的已知捕获抗原11的独特自身抗体分析物10。图1(组b)示出了具有磁纳米传感器的血浆样本的四重自身抗体测定。示出的是在测定过程中观察到的实时结合曲线，误差线表示每个分析物信号的测定内标准偏差。参考中值信号来自BSA包被的传感器，表明测定的特异性。图1(组c)示出了磁性传感器与ELISA测定之间EGFR标准曲线的比较图。本公开的磁性传感器对于检测EGFR具有显著更好的灵敏度。

图2示出了根据本公开的实施例的用于同时分析8或16个样本批次的模块化生化混合站(MR-813Hanno单元)和读取站(MR-813读取器单元)的图像。

图3示出了变异系数(CV)的图。5重蛋白质生物标志物测定具有由三个不同的操作者进行的重现性。每个操作者重复(n＝5)使用多路复用磁-纳米传感器芯片测量生物标志物。为每个标志物指示所有操作者获得的测定间CV范围。

图4示出了根据本公开的实施例的TIMP1分数是用于预测吸烟者中的NSCLC的良好标志物的示意图。

图5示出了根据本公开的实施例的临床模型、临床模型加上一种蛋白质标志物和临床模型加上两种蛋白质标志物的受试者操作者特性(ROC)曲线图。

图6示出了根据本公开的实施例的自举AUC分布的直方图。(模型2和18没有收敛。)

图7示出了根据本公开的实施例的自举AUC分布的平均值和95％置信区间的曲线图。(模型2和18没有收敛。)

图8示出根据本公开的实施例的按AUC等级排序的逻辑回归模型的表(表1)。

图9示出了根据本公开的实施例的逻辑回归预测模型1、6、7和17的系数表(表2)。

具体实施方式

提供了产生受试者的循环分析物分布图的方法。所述方法包括使来自受试者的血液样本与一组探测物接触以便与分析物特异性结合，并检测存在或不存在分析物与一组探测物中的探测物的结合。还提供了包括一组捕获探测物并且例如用于实践本公开的方法的传感器设备。

在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因此当然可以改变。还应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

在提供一定范围的值的情况下，应该理解的是除非上下文另有明确规定，否则每个中间值到下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间，以及该陈述范围中的任何其他陈述值或中间值均包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受到在所陈述范围内的任何特别排除的限制。在所陈述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。

本文给出了某些范围，数值前面加上术语“约”。术语“约”在本文用于为其前面的确切数字提供文字支持，以及数字接近或近似于该术语前面的数字。在确定数字是否接近或近似具体列举的数字时，接近或近似未列举的数字可以是在其呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等同的数字。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了在提交日期之前公开，并且不应该被解释为承认本发明由于先前的发明而无权先于这种出版物。此外，所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。

注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用。进一步指出，可以起草权利要求来排除任何可选元素。因此，该陈述旨在用作与权利要求元素的陈述或“否定”限制的使用有关的“仅”、“只”等等的排他术语的先行基础。

应该认识到，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施例的所有组合都被本发明明确包含，并且在本文公开，正如每个和每个组合被单独和明确地公开一样，只要这样的组合包含可操作的过程和/或设备/系统/套件。此外，描述这些变量的实施例中列出的所有子组合也被本发明具体包含，并且在本文中公开，如同每个和每一个这样的化学基团的子组合在本文中被单独地和明确地公开。

本领域技术人员在阅读本公开后将了解是，本文描述和示出的每个单独的实施例具有分离的部件和特征，其可以容易地与其他几个实施例中的任何特征的特征分离或与其组合，而不脱离本发明的范围或精神。任何所述的方法都可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

方法

本公开的各方面包括产生受试者的循环分析物分布图的方法。所述方法包括使来自受试者的血液样本与一组探测物接触以便与分析物特异性结合，并存在或不存在检测分析物与一组探测物中的探测物的结合。在某些方面，检测包括量化检测到的分析物。

循环分析物分布可以从各种受试者中的任何一个获得的血液样本(例如，全血样本，血浆样本或血清样本)产生。通常，这些受试者是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语广义地用于描述哺乳类动物内的生物体，包括食肉动物(例如狗和猫)、啮齿动物(例如小鼠、天竺鼠和大鼠)和灵长类动物(例如人类、黑猩猩和猴子)。在某些实施例中，循环分析物分布图从获自人受试者的血液样本产生。

一组探测物中的探测物可以是特异性结合感兴趣的分析物的任何分子。感兴趣的分析物包括但不限于蛋白质(包括非抗体蛋白质、抗体蛋白质等)、核酸(例如肿瘤DNA或RNA)和细胞(例如循环肿瘤细胞)。一组探测物中的探测物可以根据待检测的分析物的性质来选择。例如，如果两种或更多种分析物中的一种是蛋白质(例如，非抗体蛋白质或抗体蛋白质)，那么特异性结合该蛋白质的抗体、配体等可以用作一组探测物中的探测物。如果两种或更多种分析物中的一种是抗体，则该抗体的相应抗原可用作一组探测物中的探测物。例如，如果两种或更多种分析物中的一种是核酸，则可以将在所需接触条件下与该核酸的独特区域充分互补以实现特异性结合的核酸可以用作一组探测物中的探测物。蛋白质(例如，核酸结合蛋白，抗体等)也可以用于结合核酸分析物。

术语“结合”是指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键相互作用，两个分子之间的直接关联。一组探测物中的探测物与其相应的分析物特异性结合。非特异性结合(NSB)通常是指抗体与除了其同源抗原以外的某些物质(诸如样本中的各种其他抗原)的结合。在某些测定条件下，NSB将表示以小于约10^-7M的亲和力结合，例如以10^-6M，10^-5M，10^-4M等的亲和力结合。

一组探测物包括合适数量的探测物，用于特异性结合数个感兴趣的独特循环分析物。根据一些实施例，一组探测物包括用于与2至5种分析物、6至10种分析物、10至15种分析物、15至20种分析物、20至25种分析物、25至30种分析物、30至35种分析物、35至40种分析物、40至45种分析物、45至50种分析物、50至60种分析物、60至70种分析物、70至80种分析物、80至90种分析物、90至100分析物、100至200种分析物、200至300种分析物、300至400种分析物、400至500种分析物或500至1000种分析物特异性结合的合适数量的探测物分析物。

在某些方面，一组探测物包括用于与两种或更多种感兴趣的独特循环分析物特异性结合的探测物，一组探测物包括与用于1000种或更少、500种或更少、400种或更少、300种或更少、200种或更少、100种或更少、75种或更少、50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或更少、3种或2种独特的感兴趣的循环分析物特异性结合的探测物。

根据某些实施例，一组探测物包括用于特异性结合选自以下的两种或更多种循环分析物的探测物：金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)，抗血管生成素样蛋白3抗体(抗ANGPTL3)，表皮生长因子受体(EGFR)，前表面蛋白B(ProSB)，抗14-3-3蛋白质θ抗体(抗YWHAQ)，抗层粘连蛋白α1抗体(抗LAMR1)，人附睾蛋白4(HE4)，前梯度蛋白2(AGR2)，嗜铬粒蛋白A(CHGA)，富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(抗UBQLN1)，白细胞介素6(IL6)，白细胞介素8(IL8)，趋化因子(CXC基序)配体2(CXCL2)，防御素，β1(DEFB1)，成纤维细胞生长因子2(FGF2)，分化簇97(CD97)，前血小板碱性蛋白(PPBP)，降钙素原(PCT)，晚期糖基化终产物受体(RAGE)，S100钙结合蛋白A4(S100A4)，S100钙结合蛋白A8/A9复合物(S100A8/A9)，骨桥蛋白(OPN)及其任何组合。

在某些方面，一组探测物包括用于与任何所需组合形式的TIMP1、抗ANGPTL3、EGFR、ProSB、抗YWHAQ、抗LAMR1、HE4、AGR2、CHGA、LRG1、抗ANXA1、抗UBQLN1、IL6、IL8、CXCL2、DEFB1、FGF2、CD97、PPBP、PCT、RAGE、S100A4、S100A8/A9和OPN中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或每种特异性结合的探测物。根据某些实施例，这样的一组探测物包括用于结合至少50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或更少、3种或2种独特分析物的探测物。

根据某些实施例，一组探测物包括用于特异性结合TIMP1、抗ANGPTL3、EGFR、ProSB、抗YWHAQ和抗LAMR1中的2、3、4、5或每种的探测物。这样的组可以包括用于特异性结合一种或多种附加的独特循环分析物(例如，20种或更少的附加的分析物)的一种或多种探测物。附加的分析物可选自HE4、AGR2、CHGA、LRG1、抗ANXAI、抗UBQLM、IL6、IL8、CXCL2、DEFB1、FGF2、CD97、PPBP、PCT、RAGE、S100A4、S100A8/A9、OPN和其任何组合。一组探测物可以包括用于结合附加的分析物中的2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、或每种的探测物。这样一组探测物可以包括用于结合50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或3种独特分析物的探测物。

在某些方面，一组探测物包括与一种或多种类型的循环细胞结合的一种或多种探测物。感兴趣的循环细胞包括但不限于循环肿瘤细胞和循环干细胞。“循环肿瘤细胞”(CTC)是指从受试者的实体瘤中剥离并在受试者的循环(例如受试者的外周血、骨髓等)中发现的癌细胞。探测物可以借助于对由感兴趣的循环细胞表达的已知细胞表面分子(例如，受体、粘附分子等)具有特异性的探测物与循环细胞(例如CTC)结合。当循环细胞是CTC时，探测物(例如抗体探测物)可以特异性结合由CTC表达的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。“肿瘤相关抗原”是指在恶性细胞上表达的细胞表面分子，其在正常组织的细胞上具有有限表达，在恶性细胞比在正常细胞上以更高密度表达的细胞表面分子或发育表达的细胞表面分子。“肿瘤特异性抗原”是存在于恶性细胞表面而不存在于非恶性细胞上的抗原。可以由一组探测物中的探测物结合的CTC的类型可以变化，例如，取决于CTC从其脱落的实体肿瘤的类型。在某些方面，一组探测物可以包括用于特异性结合CTC的探测物，所述探测物特异性结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)和/或任何其他有用的细胞表面CTC分子。

根据某些实施例，一组探测物包括用于与一种或多种类型的循环核酸结合的一种或多种探测物。感兴趣的循环核酸包括循环的双链或单链DNA、循环的双链或单链RNA、循环的DNA-RNA杂合体等。在某些方面，一组探测物包括用于特异性结合一种或多种循环肿瘤DNA(ctDNA)的一种或多种探测物。垂死的肿瘤细胞将它们的小片DNA释放到血液流中，并且随着癌症阶段的增加，血液中ctDNA的数量/浓度通常会增加。根据某些实施例，一组探测物包括用于与ctDNA特异性结合的探测物，其包括已知与感兴趣的肿瘤类型相关联(或特异性)的体细胞突变。临床上相关的ctDNA包括Bettegowda等人(2014)Sci.Transl.Med.6(224)：224ra24。

本公开的方法包括检测存在或不存在两种或更多种分析物的分析物与一组探测物中的探测物的结合，以产生受试者的循环分析物分布。在某些方面，检测包括量化检测到的分析物。可以采用各种合适的测定形式和检测方法中的任何一种。在某些方面，一组探测物中的探测物可以直接或间接附着到固体支持物，诸如珠子(例如，微粒、纳米粒子等)或大致平坦的固体支持物/基底。根据某些实施例，探测物可以作为阵列附着到固体支持物上。例如，一组探测物可以是作为可寻址探测物阵列提供的一组探测物。

在某些方面，使用夹心测定来检测存在或不存在两种或更多种分析物的分析物与一组探测物中的探测物的结合。例如，可以将一组探测物中的探测物附着到固体表面(例如，作为阵列)以捕获两种或更多种分析物的分析物，并且在未被探测物结合的分析物的位点处添加结合(例如，特异性结合)两种或更多分析物的检测试剂(如果存在于血液样本中的话)。在某些方面，检测试剂是与分析物的表位结合的检测抗体，该表位不同于该组探测物中的探测物所结合的结合位点(例如，表位)。结果，分析物被“夹在”探测物和检测试剂之间。检测试剂可以包括可检测标签，使得检测存在或不存在两种或更多种分析物的分析物与该组探测物中的探测物的结合涉及检测检测试剂的标签。根据某些实施例，采用第二检测试剂。合适的第二试剂包括标签的第二抗体(例如荧光标签的抗体、磁性标签的抗体等)、与催化底物转化为可检测产物的酶链接的第二抗体等。用于实践本公开的方法的实施例的夹心和其他测定法的附加细节和设计考虑描述于例如Cox等人(2014)ImmunoassayMethods，Eli Lilly&Company和国家推进转化科学中心。

在某些方面，与探测物结合的分析物结合的检测试剂是抗体。这样的检测试剂可以是修改的抗体。修饰的抗体可以被配置为特异性结合感兴趣的分析物，并且还可以包括特异性结合对的一个或多个附加的成员。特异性结合对的一个或多个成员可以被配置为特异性结合特异性结合对的互补成员。在某些情况下，例如，当采用磁性传感器设备来执行所述方法时，特异性结合对的互补成员与磁性标签结合。抗体检测试剂可以被修改为包括生物素，该生物素将特异性结合链霉抗生物素蛋白，例如修改为包含链霉抗生物素蛋白的磁性标签。这样，在某些方面，检测试剂特异性结合分析物(例如通过抗体-抗原相互作用)并且通过选择的相互作用(例如通过链霉抗生物素蛋白-生物素)特异性结合标签(例如磁性标签)。检测试剂可以被配置为结合分析物和标签(例如，磁性标签)。换句话说，检测试剂可以被配置为使得分析物与检测试剂的特异性结合不显著干扰检测试剂特异性结合标签的能力。类似地，检测试剂可以被配置为使得标签与检测试剂的特异性结合不显著干扰检测试剂与分析物结合的能力。

可以定性或定量确定血样中两种或多种分析物的存在。定性确定包括向用户提供确定关于样本中分析物的存在的简单的是/否结果。定量确定包括向用户提供关于样本中分析物的量的粗略等级结果(例如，低、中等、高)的半定量确定，以及向用户提供分析物浓度的精确测量的精细结果。

基于磁性传感器的方法

根据某些实施例，使用磁性传感器设备来执行本公开的方法。例如，一组探测物可以在磁性传感器设备的磁性传感器芯片上阵列排列(例如，设置为可寻址探测物阵列)。磁性传感器设备可以具有两个或更多个磁性传感器，所述磁性传感器具有附着到其表面的多组探测物(例如，相同或不同阵列的捕获探测物)。可以采用上述任何一组探测物。在某些方面，具有附着于其表面的多组捕获探测物的两个或更多个磁性传感器中的每个包括用于结合相同的两种或更多种循环分析物的捕获探测物。

采用磁性传感器设备的本公开的方法可以包括使具有附着于其表面(例如，阵列排列)的一组捕获探测物的磁性传感器设备与血液样本接触，并检测指示两种或更多种分析物(如果存在于血液样本中的话)与该组捕获探测物结合的信息。在一些情况下，磁性传感器设备包括配置为在磁性传感器和磁性标签之间没有任何直接的物理接触的情况下检测附近的磁性标签的存在的传感器。磁性标签可以直接或间接地结合到分析物上，分析物又可以直接或间接地结合到磁性传感器。如果结合的磁性标签位于磁性传感器的检测范围内，则磁性传感器可以提供指示存在结合的磁性标签并因此指示存在分析物的信号。

在某些方面中，本公开的方法使用夹层测定来执行，其中一组探测物附着到磁性传感器设备的感测区域的表面。在两种或更多种分析物(如果存在于血液样本中的话)的分析物结合其各自探测物的条件下，将血液样本分配在感测区域上以使血液样本与该组探测物接触。在有或没有清洗的情况下，均可以加入检测试剂，其结合两种或更多种分析物的分析物，所述分析物结合到该组探测物中的探测物上。在某些情况下，检测试剂直接与磁性标签结合。在其他方面，检测试剂不直接结合于磁性标签，而是采用结合检测试剂的第二磁性标签的检测试剂。例如，检测试剂可以与分析物特异性结合(例如通过抗体-抗原相互作用)并且通过选择的相互作用(例如，通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用)特异性结合磁性标签。检测试剂与表面结合的分析物的结合将磁性标签定位在磁性传感器的检测范围内，使得在磁性传感器中诱导指示存在分析物的可检测信号。

在某些实施例中，响应于磁性传感器的表面附近的磁性标签而生成电信号。例如，磁性传感器可以被配置为检测由局部磁场的变化引起的磁性传感器的电阻的变化。在一些情况下，靠近磁性传感器的磁性标签(例如，磁性纳米粒子标签)的结合引起磁性传感器的电阻的可检测变化。例如，在存在施加的外部磁场的情况下，磁性传感器附近的磁性标签可能被磁化。磁化的磁性标签的局部磁场可以引起下面的磁性传感器的电阻的可检测变化。因此，可以通过检测磁性传感器的电阻的变化来检测磁性标签的存在。如将在下面进一步详细描述的，在实践本公开的方法中可使用的磁性传感器设备可以包括磁阻元件。可以使用的磁阻元件的非限制性示例包括自旋阀磁阻元件和磁隧道结(MTJ)磁阻元件。

在一些情况下，所述方法是评估血液样本中两种或更多种分析物的存在的免洗方法。“免洗”是指在试剂和/或血液样本与磁性传感器接触之后不执行清洗步骤。因此，在这些测定过程中不执行从磁性传感器表面去除未结合的试剂(例如，未结合的磁性标签)或未结合的样本的任何步骤。因此，尽管所述方法可包括将一种或多种不同的试剂和/或样本依次接触磁性传感器表面，但在测定过程中的任何时刻，样本表面都与流体接触，从而将未结合的试剂或样本从磁性传感器表面去除。例如，在某些实施例中，在磁性传感器表面与血液样本接触之后不执行清洗步骤。在一些情况下，所述方法在磁性传感器表面与磁性标签接触之后不包括清洗步骤。在某些情况下，在磁性传感器表面与检测试剂接触之后不执行清洗步骤。

在执行清洗步骤的某些实施例中，清洗步骤大致不改变来自磁性传感器的信号。清洗步骤可能不会导致来自磁性传感器的信号的实质性改变，因为在一些情况下，未结合的磁性标签不具有如本文所述的大致可检测的信号。例如，如果执行清洗步骤，则在一些情况下，与在清洗步骤之前获得的信号相比较，清洗步骤导致25％或更少，诸如20％或更少、或15％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或4％或更少、或3％或更少、或2％或更少、或1％或更少的信号变化。在一些实施例中，清洗步骤导致来自磁性传感器的信号减少25％或更少，例如20％或更少、或15％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或4％或更少、或3％或更少、或2％或更少、或1％或更少。

所述方法的各方面还可以包括从磁性传感器设备获得实时信号。“实时”是指信号在产生时即被观察到。例如，实时信号从其初始时刻获得，并在给定时间段内连续获得。因此，某些实施例包括观察与感兴趣的结合相互作用(例如，两种或更多种感兴趣分析物的分析物与磁性传感器的结合和/或磁性标签与分析物的结合)的发生相关联的信号的实时演变。实时信号可以包括在给定时间段内获得的两个或更多个数据点，其中在某些实施例中，获得的信号是在给定的感兴趣的时间段内连续获得的连续数据点集合(例如，以迹线形式)。感兴趣的时间段可以变化，在一些情况下从0.5分钟到60分钟，诸如1分钟到30分钟，包括1分钟到15分钟或1分钟到10分钟。例如，时间段可以在实时信号开始的时刻开始并且可以继续，直到传感器达到最大或饱和水平(例如，传感器上的所有分析物结合位点被占据)。例如，在一些情况下，当血液样本与传感器接触时，时间段开始。在一些情况下，时间段可以在血液样本与传感器接触之前开始，例如以在样本接触到传感器之前记录基线信号。信号中的数据点的数量也可以变化，其中在一些情况下，数据点的数量足以在实时信号的时间过程中提供连续的数据段。“连续”是指以每分钟1个数据点或更多的重复率重复获得数据点，诸如每分钟2个数据点或更多，包括每分钟5个数据点或更多、或每分钟10个数据点或更多、或每分钟30个数据点或更多或每分钟60个数据点或更多(例如每秒1个数据点或更多)、或每秒2个数据点或更多、或每秒5个数据点或更多，或每秒10个数据点或更多、或每秒20个数据点或更多、或每秒50个数据点更多、或每秒75个数据点或更多、或每秒100个数据点或更多。

实时信号可能是实时分析物特异性信号。实时分析物特异性信号是如上所述的实时信号，其仅从两种或更多种感兴趣分析物的特异性分析物获得。在这些实施例中，未结合的分析物和未结合的磁性标签不产生可检测的信号。因此，获得的实时信号仅来自与磁性传感器结合的特异性磁性标签的分析物，并且大致无信号从未结合的磁性标签或其他试剂上获得(例如未特异性结合到传感器的分析物)。

在一些实施例中，当测定设备处于湿状态时观察到信号。“湿”或“湿状态”是指测定组合物(例如，包括血液样本、磁性标签和一种或多种检测试剂的测定组合物)仍然与磁性传感器的表面接触。因此，不需要执行任何清洗步骤来去除不感兴趣的非结合部分或过量的未结合的磁性标签或捕获探测物。在某些实施例中，如上所述，使用磁性标签和磁性传感器有利于“湿”检测，这是因为磁性标签与磁性传感器表面之间的距离增加时，磁性标签在磁性传感器中感应的信号减少。例如，如上所述，使用磁性标签和磁性传感器可以有利于“湿”检测，这是因为由磁性标签产生的磁场随着磁性标签与磁性传感器表面之间的距离增加而减小。在一些情况下，与表面结合的分析物结合的磁性标签的磁场明显超过来自分散在溶液中的未结合的磁性标签的磁场。例如，如上所述，实时分析物特异性信号可以仅从与磁性传感器结合的特异性磁性标签的分析物中获得，并且大致无信号可以从分散在溶液中的未结合的磁性标签获得(例如，不特异性结合到传感器)。分散在溶液中的未结合的磁性标签可能距离磁性传感器表面更远，并且可能处于布朗运动，这可能降低未结合的磁性标签引起磁性传感器的电阻的可检测变化的能力。未结合的磁性标签也可以悬浮在溶液中，例如作为胶体悬浮液(例如由于具有纳米级尺寸)，这可能降低未结合的磁性标签引起磁性传感器的电阻的可检测变化的能力。

各种方法(例如，如本文所述)中采用的磁性标签可以变化，并且包括当磁性标签位于磁性传感器的表面附近时在磁性传感器中引起可检测信号的任何类型的标签。磁性标签是当与磁性传感器充分关联时，可被磁性传感器检测到并使磁性传感器输出信号的标签部分。例如，磁性传感器表面附近的磁性标签的存在可以引起磁性传感器中的可检测变化，例如但不限于电阻、电导、电感、阻抗等的变化。在一些情况下，在磁性传感器表面附近存在磁性标签会引起磁性传感器电阻的可检测变化。如果磁性标签的中心与传感器表面之间的距离为1000nm或更小，诸如800nm或更小、诸如400nm或更小，包括100nm或更小、或75nm或更小、或50nm或更小、或25nm或更小、或10nm或更小，则感兴趣的磁性标签可与磁性传感器充分相关联。

在某些情况下，磁性标签包括从顺磁性、超顺磁性、铁磁性、亚铁磁性、反铁磁性材料、它们的组合等中选择的一种或多种材料。例如，磁性标签可以包括超顺磁性材料。在某些实施例中，磁性标签被配置为在没有外部磁场的情况下是非磁性的。“非磁性”是指磁性标签的磁化在一段时间内为零或平均为零。在一些情况下，由于磁性标签的磁化随着时间的随机翻转，磁性标签可能是非磁性的。在没有外部磁场的情况下被配置为非磁性的磁性标签可以有利于磁性标签在溶液中的分散，这是因为非磁性标签在没有外部磁场或者甚至存在热能仍占主导地位的小磁场时通常不会聚集。在某些实施例中，磁性标签包括超顺磁材料或合成反铁磁材料。例如，磁性标签可以包括两层或更多层的反铁磁耦合铁磁体。

在某些实施例中，磁性标签是高磁矩磁性标签。磁性标签的磁矩是测量其与外部磁场对齐的趋势的度量。“高磁矩”意味着磁性标签具有与外部磁场对齐的更大趋势。具有高磁矩的磁性标签可以有助于检测磁性传感器表面附近的磁性标签的存在，这是因为更容易用外部磁场来感应磁性标签的磁化。

在某些实施例中，磁性标签包括但不限于Co、Co合金、铁氧体、氮化钴、氧化钴、Co-Pd、Co-Pt、铁、铁氧化物、铁合金、Fe-Au、Fe-Cr、Fe-N、Fe₃O₄、Fe-Pd、Fe-Pt、Fe-Zr-Nb-B、Mn-N、Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni、Ni合金、其组合等等。高磁矩磁性标签的示例包括但不限于Co、Fe或CoFe纳米晶体(其可以在室温下是超顺磁性的)和合成的反铁磁纳米颗粒。

在一些实施例中，磁性标签的表面被修改。在某些情况下，如上所述，磁性标签可以被涂覆有被配置为便于磁性标签与结合对的一个成员稳定关联的层。例如，磁性标签可以涂有一层金、一层聚-L-赖氨酸修改的玻璃、葡聚糖等等。在某些实施例中，磁性标签包括嵌入葡聚糖聚合物中的一种或多种氧化铁核。此外，磁性标签的表面可以用一种或多种表面活性剂修改。在一些情况下，表面活性剂有利于磁性标签的水溶性增加。在某些实施例中，磁性标签的表面用钝化层修改。钝化层可有利于测定条件下磁性标签的化学稳定性。例如，磁性标签可以涂覆有包括金、氧化铁、聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯膜)等的钝化层。

在某些实施例中，磁性标签具有球形形状。或者，磁性标签可以是盘、棒、线圈或纤维。在一些情况下，磁性标签的大小为使得磁性标签不会干扰感兴趣的结合相互作用。例如，磁性标签可以与分析物和捕获探测物的大小相当，使得磁性标签不干扰捕获探测物与分析物的结合。在一些情况下，磁性标签是磁性纳米颗粒，或者包含通过合适的结合剂保持在一起的多个磁性纳米颗粒。在一些实施例中，磁性标签的平均直径为5nm至250nm，诸如5nm至150nm，包括10nm至100nm，例如25nm至75nm。例如，平均直径为5nm、10nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm以及平均直径在这些值中任何两个之间的范围内的磁性标签可以用于本发明的方法。在一些情况下，磁性标签的平均直径为50nm。

磁性标签及其与生物分子的缀合进一步描述于2008年9月19日提交的标题为“Analyte Detection with Magnetic Sensors(磁性传感器检测分析物)”的美国序列号12/234,506中，其公开内容通过引用整体并入本文。

诊断

本公开的方法可以进一步包括基于循环分析物分布图将受试者诊断为患有疾病或病症。诊断可包括诊断疾病或病症的严重程度(例如阶段)、监测疾病或病症、监测疾病或病症对治疗的响应等。

根据某些实施例，疾病或病症是癌症。具有“癌症”的受试者是指受试者包括表现出瘤形成细胞表型的细胞，其可以表征为例如异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制丧失、锚定非依赖性生长潜力、在免疫受损的非人动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力、和/或任何适当的细胞转化指标。本文中“癌细胞”可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌性细胞”互换使用，并且包括实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。可基于循环分析物分布图诊断的癌症包括但不限于结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、淋巴系统癌症和血癌。

在某些方面，所述方法包括基于循环分析物分布图将受试者诊断为患有I期、II期、III期或IV期癌症。例如，所述方法可以包括诊断受试者患有I期癌症或将受试者诊断为患有II期癌症。癌症分期是确定癌在身体内有多少和所处位置的过程。分期描述受试者癌症的严重程度，其严重程度可能与例如原始(原发性)肿瘤的大小以及癌在体内扩散的程度有关。了解癌症的阶段有助于为该受试者制定预后和治疗计划。

癌症的分期可以根据TNM分期系统，TNM分期系统被开发为医生根据某些标准化标准对不同类型的癌症进行分期的工具。TNM分期系统的“T”类别涉及原始(主要)肿瘤。“N”类别描述了癌症是否已经到达淋巴结附近。“M”类与是否存在远处转移有关。由于每种癌症类型都有自己的分类系统，对于每种癌症，字母和数字并不总是意味着相同的东西。一旦确定了T、N和M，将它们组合起来，并且分配总体阶段0、I、II、III、IV。有时这些阶段也会细分，使用诸如IIIA和IIIB这样的字母。

诊断可以仅基于循环分析物分布图，或可以部分基于循环分析物分布图。在诊断部分基于循环分析物分布图的情况下，诊断可以进一步根据从以下中选择的临床评估：临床显像，年龄，性别，癌症病史，结节位置，结节大小，结节边界，SUVmax，吸烟状况及其任何组合。

在某些方面，所述方法包括诊断患有肺癌的受试者。根据一些实施例，所述方法包括将受试者诊断为患有非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状细胞癌、腺癌(例如腺泡、乳头状和支气管肺泡)、大细胞癌(例如巨细胞和透明细胞细胞)、腺鳞癌和未分化癌。在0期NSCLC中，癌症尚未扩散至肺的内层。在I期非小细胞肺癌中，癌很小，并没有扩散到淋巴结。II期NSCLC的特征在于癌扩散至原始(原发性)肿瘤附近的淋巴结。在III期非小细胞肺癌中，癌症已蔓延至附近组织或远处淋巴结。IV期NSCLC的特征在于癌症扩散至身体的其他器官，例如其他肺、脑或肝。

根据某些实施例，产生循环分析物分布图的受试者来自具有肺癌高风险的群体。由于各种遗传、行为和/或环境因素，受试者可能处于肺癌的高风险中。根据某些实施例，受试者来自具有肺癌高风险的人群，因为受试者是当前吸烟者、过去吸烟者(例如，过去大量吸烟者)或两者兼具。根据某些实施例，来自具有肺癌高风险的人群的受试者意味着受试者年龄为55至74岁，具有30包年或更多(其中“包年”等于每天吸烟的烟盒数×吸烟年数)的最小吸烟史，当前吸烟或在过去15年内戒烟，并且在产生循环分析物分布图时无明显疾病。例如，过去的大量吸烟者可能有30包年或更多的吸烟史。

在某些方面，产生循环分析物分布图的受试者具有不确定的肺病变(或“结节”)。在一些情况下，通过胸部X光、胸部CT扫描、胸部MRI、胸部正电子发射断层扫描(PET)扫描或其他合适的成像方法来识别不确定的肺损伤。不确定的病变可能是良性的(非癌症)并且由瘢痕、炎症、感染等引起。在其他情况下，病变可以是肺癌(例如早期肺癌)或已经从体内另一种癌症扩散至肺部的癌症。

根据某些实施例，产生循环分析物分布图的受试者正在接受肺癌治疗。根据这样的实施例，所述方法可以进一步包括基于循环分析物分布图预测、监测所述受试者对肺癌疗法的治疗反应，或两者兼具。

治疗

本公开的方法可以进一步包括治疗产生循环分析物分布图的受试者。在某些方面，这样的方法包括基于循环分析物分布图将受试者诊断为患有疾病或病症，并且例如基于诊断，在诊断之后执行治疗步骤。治疗可以包括例如向受试者施用治疗有效量的药剂(例如化学治疗剂、小分子、生物制剂(例如抗体)、工程化细胞等)、辐射治疗和/或类似物。可替代地或另外地，治疗可以包括从受试者去除全部或部分组织(例如，肿瘤组织)或导致(例如造成)疾病或病症的器官。

根据一个实施例，基于循环分析物分布图将受试者诊断为患有肺癌(例如，非小细胞肺癌)，并且所述方法包括治疗受试者肺癌。治疗可以包括手术去除全部或部分癌(例如，通过全肺切除术、肺叶切除术、肺段切除术或楔形切除术、套管切除术等)；全部或部分肿瘤的射频消融(RFA)；放射疗法(例如，外部束放射疗法、近距离放射疗法(内部放射疗法))；化疗(例如通过施用治疗有效量的顺铂、卡铂、紫杉醇、结合白蛋白的紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春碱、培美曲塞或其任何组合)；靶向治疗(例如，基于抗体的疗法，例如贝伐单抗和/或雷莫单抗的施用)；免疫疗法(例如，通过施用一种或多种免疫检查点抑制剂，例如nivolumab和/或pembrolizumab)；及其任何组合。姑息治疗也可用于治疗肺癌症状。

传感器设备和系统

如上所概述，本公开的各方面包括传感器设备(例如，磁性传感器设备)。传感器设备包括用于特异性结合两种或更多种分析物的一组探测物。本发明的传感器设备可以包括上文在本公开的方法部分中描述的任何一组探测物。根据一些实施例，传感器设备包括作为可寻址探测物阵列(例如，在传感器设备的感测区域中)提供的一组捕获探测物。

根据某些实施例，本发明的传感器设备(例如磁性传感器设备)包括一组探测物，其包括用于特异性结合选自以下中的两种或更多种的探测物：金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)，抗血管生成素样蛋白3抗体(抗ANGPTL3)，表皮生长因子受体(EGFR)，前表面蛋白B(ProSB)，抗14-3-3蛋白质θ抗体(抗YWHAQ)，抗层粘连蛋白α1抗体(抗LAMR1)，人附睾蛋白4(HE4)，前梯度蛋白2(AGR2)，嗜铬粒蛋白A(CHGA)，富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(抗UBQLN1)，白细胞介素6(IL6)，白细胞介素8(IL8)，趋化因子(CXC基序)配体2(CXCL2)，防御素，β1(DEFB1)，成纤维细胞生长因子2(FGF2)，分化簇97(CD97)，前血小板碱性蛋白(PPBP)，降钙素原(PCT)，晚期糖基化终产物受体(RAGE)，S100钙结合蛋白A4(S100A4)，S100钙结合蛋白A8/A9复合物(S100A8/A9)，骨桥蛋白(OPN)或其任何组合。在某些方面，这样的一组探测物包括用于结合至少50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或更少、3种或2种分析物的探测物。

在某些方面，本公开的传感器设备(例如，磁性传感器设备)包括一组探测物，该组探测物包括用于与任何所需组合形式的TIMP1、抗ANGPTL3、EGFR、ProSB、抗YWHAQ、抗LAMR1、HE4、AGR2、CHGA、LRG1、抗ANXA1、抗UBQLN1、IL6、IL8、CXCL2、DEFB1、FGF2、CD97、PPBP、PCT、RAGE、S100A4、S100A8/A9和OPN中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或每种特异性结合的探测物。根据某些实施例，这样的一组探测物包括用于结合至少50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或更少、3种或2种分析物的探测物。

根据某些实施例，本公开的传感器设备(例如磁性传感器设备)包括一组探测物，其包括用于特异性结合TIMP1、抗ANGPTL3、EGFR、ProSB、抗YWHAQ和抗LAMR1中的2、3、4、5或每种的探测物。这样的组可以包括用于特异性结合一种或多种附加的独特循环分析物(例如，20种或更少的附加的分析物)的一种或多种探测物。附加的分析物可选自HE4、AGR2、CHGA、LRG1、抗ANXAI、抗UBQLM、IL6、IL8、CXCL2、DEFB1、FGF2、CD97、PPBP、PCT、RAGE、S100A4、S100A8/A9、OPN和其任何组合。一组探测物可以包括用于结合附加的分析物中的2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、或每种的探测物。这样一组探测物可以包括用于结合50种或更少、40种或更少、30种或更少、25种或更少、20种或更少、15种或更少、10种或更少、9种或更少、8种或更少、7种或更少、6种或更少、5种或更少、4种或3种分析物的探测物。

包括在本公开的传感器设备中的一组探测物还可以包括用于与循环细胞(诸如循环肿瘤细胞(CTC)、循环干细胞和/或类似物)和/或循环核酸(和/或循环DNA(例如循环肿瘤DNA)和/或循环RNA)结合的探测物，如上所述。

磁性传感器设备

根据某些实施例，本公开的传感器设备是磁性传感器设备。本公开的磁性传感器设备可以包括磁性传感器芯片，该磁性传感器芯片包括一组探测物(例如，附着到磁性传感器芯片的表面)，包括本文其他地方描述的任何一组探测物。在某些方面，磁性传感器芯片包括两个或更多个磁性传感器，所述磁性传感器具有附着到其表面的捕获探测物(例如，作为可寻址捕获探测物阵列)。具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器中的每个可以包括用于结合相同的两种或更多种循环分析物的捕获探测物。

现在将描述磁性传感器设备和系统的各个方面。

磁性传感器

在某些方面，本公开的磁性传感器设备包括一个或多个磁性传感器。在一些情况下，一个或多个磁性传感器被配置为检测存在附近的磁性标签而磁性传感器和磁性标签之间没有任何直接的物理接触的传感器。在某些实施例中，磁性传感器被配置为在磁性传感器和磁性标签之间没有任何直接的物理接触的情况下检测附近的磁性标签的存在的传感器。例如，磁性标签可以直接或间接地结合到分析物上，分析物又可以直接或间接地结合到磁性传感器。如果结合的磁性标签位于磁性传感器的检测范围内，则磁性传感器可以提供指示存在结合的磁性标签并因此指示存在分析物的信号。

在一些情况下，磁性传感器具有距磁性传感器表面的1nm至1000nm的检测范围，诸如从1nm至800nm，包括从1nm至500nm，诸如从1nm至300nm，包括距磁性传感器表面的1nm至100nm，或1nm至75nm，或1nm至50nm，或1nm至25nm，或1nm至10nm。在一些情况下，传感器的检测范围的最小化可以有利于特异性结合的分析物的检测，同时使来自不感兴趣的分析物的可检测信号最小化。“检测范围”是指距离磁性传感器表面的距离，其中存在磁性标签将在磁性传感器中感应出可检测信号。在一些情况下，位于磁性传感器表面附近足够靠近以在磁性传感器的检测范围内的磁性标签将在磁性传感器中感应出可检测信号。在一些情况下，位于距磁性传感器表面大于磁性传感器的检测范围的距离处的磁性标签将不会在磁性传感器中引起可检测或不可忽略的信号。例如，磁性标签可具有比例为1/r³的磁通量，其中r是磁性传感器与磁性标签之间的距离。因此，只有靠近(例如，在磁性传感器的检测范围内)定位的那些磁性标签才会在磁性传感器中感应出可检测的信号。

如上所述，一组探测物中的探测物可以被结合到磁性传感器的表面。例如，诸如聚乙烯亚胺(PEI)的阳离子聚合物可用于通过物理吸附(物理吸收)将带电探测物(例如抗体、抗原、配体、核酸等)非特异性地结合到传感器表面。或者，可以使用共价化学，利用分析物特异性探测物上的游离胺或游离硫醇基团将分析物特异性探测物共价结合到磁性传感器的表面。例如，可使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)偶联系统将分析物-特异性探测物共价结合到磁性传感器的表面。

在某些实施例中，磁性传感器被配置为响应于磁性传感器的表面附近的磁性标签而产生电信号。例如，磁性传感器可以被配置为检测由局部磁场的变化引起的磁性传感器的电阻的变化。在一些情况下，如上所述，与磁性传感器非常接近的磁性标签(例如，磁性纳米粒子标签)的结合引起磁性传感器的电阻的可检测变化。例如，在存在施加的外部磁场的情况下，磁性传感器附近的磁性标签可能被磁化。磁化的磁性标签的局部磁场可以引起下面的磁性传感器的电阻的可检测变化。因此，可以通过检测磁性传感器的电阻的变化来检测磁性标签的存在。在某些实施例中，磁性传感器被配置为检测1Ohm或更小，例如500mOhm或更小，包括100mOhm或更小，或50mOhm或更小，或25mOhm或更小，或10mOhm或更小，或5mOhm或更小，或1mOhm或更小的电阻变化。在某些实施例中，电阻变化可以相对于原始传感器电阻以百万分率(PPM)表示，诸如电阻变化为2PPM或更多，或20PPM或更多，或200PPM或更多，或400PPM或更多，或600PPM或更多，或1000PPM或更多，或2000PPM或更多，或4000PPM或更多，或6000PPM或更多，或10000PPM或更多，或20000PPM或以上，或40000PPM或更多，或60000PPM或更多，或100000PPM或更多，或200000PPM或更多。

磁性传感器可以包括磁阻元件。合适的磁阻元件包括但不限于自旋阀磁阻元件和磁隧道结(MTJ)磁阻元件。

在某些实施例中，磁性传感器元件是自旋阀磁阻元件。在某些情况下，自旋阀元件是包括第一铁磁层、设置在第一铁磁层上的非磁性层和设置在非磁性层上的第二铁磁层的多层结构。第一铁磁层可以被配置为具有固定在某个方向上的磁化矢量。在一些情况下，第一铁磁层称为“钉扎层”。在某些实施例中，自旋阀元件包括具有大致平行于磁性传感器元件的宽度的磁化的钉扎层。第二铁磁层可以被配置为使得其磁化矢量可以在施加的磁场下自由旋转。在一些情况下，第二铁磁层称为“自由层”。在一些情况下，第一铁磁层(其可以被称为“钉扎层”)被合成或人造反铁磁体所取代，所述合成或人造反铁磁体由被非磁间隔物分开的两个反平行铁磁层构成：一个铁磁层(可称为“参考层”)位于“自由层”下方的非磁性层下面；另一个铁磁层(另一个“钉扎层”)通常由诸如IrMn、PtMn、FeMn或NiO的天然反铁磁体“钉扎”。

在某些情况下，自旋阀元件的电阻取决于自由层的磁化矢量相对于钉扎层的磁化矢量的相对取向。当两个磁化矢量平行时，电阻最低；当两个磁化矢量反平行时，电阻最高。电阻的相对变化称为磁阻(MR)比率。在某些实施例中，自旋阀元件具有1％至20％，诸如3％至15％，包括5％至12％的MR比率。在一些情况下，在小磁场例如100Oe中，自旋阀元件的MR比率为10％或更高。如上所述，可以检测由于在自旋阀元件的表面附近存在磁性标签而导致的自旋阀元件的电阻的变化。

在某些实施例中，由于磁性标签而来自旋阀元件的信号取决于磁性标签与自旋阀元件的自由层之间的距离。在一些情况下，磁性标签的电压信号随着从磁性标签中心到自由层的中平面的距离的增加而减小。因此，在某些情况下，自旋阀元件中的自由层位于自旋阀元件的表面处。将自由层定位在自旋阀元件的表面处可以使自由层和任何结合的磁性标签之间的距离最小化，这可以便于检测磁性标签。

在某些实施例中，自旋阀元件可以包括设置在一个或多个自旋阀元件表面上的钝化层。在一些情况下，钝化层具有60nm或更小，诸如50nm或更小，包括40nm或更小，30nm或更小，20nm或更小，10nm或更小的厚度。例如，钝化层可以具有1nm至10nm的厚度，诸如1nm至5nm，包括1nm至3nm。在某些实施例中，钝化层包括金、钽、SiO₂、Si₃N₄及其组合等。

在某些实施例中，磁性传感器元件是磁性隧道结(MTJ)磁阻元件(在本文中也被称为MTJ元件)。在一些情况下，MTJ元件包括多层结构，该多层结构包括第一铁磁层、设置在第一铁磁层上的绝缘层以及设置在绝缘层上的第二铁磁层。绝缘层可以是薄绝缘隧道阻挡层，并且可以包括氧化铝、MgO等。在一些情况下，第一和第二铁磁层之间的电子隧穿取决于两个铁磁层的相对磁化。例如，在某些实施例中，当第一和第二铁磁层的磁化矢量平行时隧穿电流高并且当第一和第二铁磁层的磁化矢量反平行时隧穿电流低。在一些情况下，第一铁磁层可以由由非磁性间隔物分隔的两个反平行铁磁层组成的合成或人造反铁磁体代替：一个铁磁层可以位于隧道势垒下方；另一个铁磁层可以被诸如IrMn、PtMn或FeMn的天然反铁磁体“钉扎”。

在一些情况下，MTJ元件具有1％至300％的磁阻比(MR)，诸如10％至250％，包括25％至200％。如上所述，可以检测由于在MTJ元件的表面附近存在磁性标签而导致的MTJ元件的电阻的变化。在一些情况下，MTJ元件具有50％或更多、或75％或更多、或100％或更多、或125％或更多、或150％或更多、或175％或更多、或200％的更多、或225％或更多、或250％或更多、或275％或更多、或200％或更多的MR。例如，MTJ元件可以具有225％或更多的MR。

在某些实施例中，第二铁磁层(例如，位于MTJ元件的表面处的MTJ元件的层)包括两个或更多层。例如，第二铁磁层可以包括第一层、设置在第一层上的第二层和设置在第二层上的第三层。在一些情况下，第一层是薄铁磁层(例如，NiFe、CoFe、CoFeB等)。薄金属层可以具有6nm或更小的厚度，诸如5nm或更小，包括4nm或更小，3nm或更小，2nm或更小，或1nm或更小，或0.5nm或更小。第二层可以包括导电金属，例如铜、铝、钯、钯合金、氧化钯、铂、铂合金、氧化铂、钌、钌合金、氧化钌、银、银合金、氧化银、锡、锡合金、氧化锡、钛、钛合金、氧化钛、钽、钽合金、氧化钽以及它们的组合等。第二层可以具有2nm或更小的厚度，诸如0.5nm或更小，包括0.4nm或更小，0.3nm或更小，0.2nm或更小，或0.1nm或更小。第三层可以包括铁磁材料，诸如但不限于NiFe、CoFe、CoFeB等。第三层可以具有6nm或更小的厚度，诸如5nm或更小，包括4nm或更小，3nm或更小，2nm或更小，或1nm或更小，或0.5nm或更小。

在一些情况下，MTJ元件被配置为使得相关联的磁性标签与自由层的顶表面之间的距离在5nm至1000nm或10nm至800nm，诸如20nm至600nm的范围内，包括从40nm到400nm，诸如从60nm到300nm，包括从80nm到250nm。

MTJ元件可以包括设置在MTJ元件表面上的一个或多个钝化层。在一些情况下，钝化层具有60nm或更小的厚度，诸如50nm或更小，包括40nm或更小，30nm或更小，20nm或更小，10nm或更小。例如，钝化层可以具有1nm至50nm的厚度，诸如1nm至40nm，包括1nm至30nm，或1nm至20nm。在一些情况下，钝化层具有30nm的厚度。在一些情况下，钝化层包括金、钽、钽合金、钽氧化物、铝、铝合金、氧化铝、SiO₂、Si₃N₄、ZrO₂及其组合等。在某些实施例中，具有如上所述的厚度的钝化层有助于最大化从特异性结合到传感器表面的磁性标签检测到的信号，同时最小化来自没有特别结合的磁性标签的信号。

在某些实施例中，MTJ元件的尺寸范围1μm×1μm至200μm×200μm，包括1μm×200μm或更小，诸如200μm×1μm或更小，例如150μm×10μm或更小，或120μm×5μm或更小，或120μm×0.8μm或更小，或0.8μm×120μm或更小，或100μm×0.7μm或更小，或100μm×0.6μm或更小，或100μm×0.5μm或更小，或10μm×0.6μm或更小，或10μm×0.5μm或更小的尺寸。在一些情况下，MTJ元件具有120μm×0.8μm或更小的尺寸，诸如2.0μm×0.8μm。

磁隧道结(MTJ)探测器进一步描述于2008年9月19日提交的美国申请公开号2009/0104707，其公开内容通过引用整体并入本文。检测器进一步描述于2004年4月22日提交的第7、906、345号美国专利中，其公开内容通过引用整体并入本文。

在一些情况下，磁性传感器是多层薄膜结构。传感器可以包括铁磁材料和非磁性材料的交替层。铁磁材料可以包括但不限于坡莫合金(NiFe)、铁钴(FeCo)、镍铁钴(NiFeCo)、CoFeB及其组合等。在一些情况下，非磁性材料是贵金属，诸如但不限于Cu、Au、Ag等。在某些实施例中，铁磁层具有1nm至10nm的厚度，诸如2nm至8nm，包括3nm至4nm。在一些情况下，非磁性层具有0.2nm至5nm的厚度，诸如1nm至3nm，包括1.5nm至2.5nm或者1.8nm至2.2nm。

在某些实施例中，磁性传感器设备可以被配置为包括一个或多个磁性感测区域。磁性感测区域可对应于磁性传感器阵列(例如，生物传感器阵列)所在的设备的区域。例如，磁性感测区域可以是在使用期间暴露于血液样本的设备表面上的区域，并且其具有如上所述的磁性传感器阵列。

磁性感测区域可以被配置为包括流体贮存器。流体贮存器可以是多种配置中的任何配置，其中流体贮存器被配置为将血液样本保持与磁性传感器阵列接触。因此，流体贮存器的配置可以包括但不限于：圆柱形井配置、方井配置、矩形井配置、圆底井配置等。例如，流体贮存器可以包括将一个流体贮存器与相邻流体贮存器分开的壁。壁可相对于贮存器板的表面大致垂直。在一些情况下，每个流体贮存器的壁限定一定容积的空间，其可以接收等于或小于由流体贮存器限定的空间容积的一定容积的样本。

在某些实施例中，流体贮存器具有10mL或更少，或5mL或更少，或3mL或更少，或1mL或更少，诸如500μL或更少，包括100μL或更少，例如50μL或更少，或25μL或更少，或10μL或更少，其足以包含相等或更小容积的样本容积。

磁性传感器系统

本公开的各方面包括磁性传感器系统。在一些实施例中，磁性传感器系统包括磁性传感器设备和磁场源。磁性传感器设备包括具有位于其上的一个或多个磁性传感器阵列(例如，生物传感器阵列)的支撑件。该系统可以被配置为从一个或多个磁性传感器阵列获得信号，该信号指示两种或更多种循环分析物的分析物是否存在于一种或多种相应的血液样本中。

在某些实施例中，该系统包括磁场源。所述磁场源可以被配置为将磁场施加到所述磁性传感器设备(例如，所述磁性传感器阵列)，所述磁场足以在所述测定感测区域(例如，在信号采集期间所述磁性传感器阵列所位于的区域)中产生DC和/或AC场。在一些情况下，磁场源被配置为产生具有1Oe或更多、或5Oe或更多、或10Oe或更多、或20Oe或更多、或30Oe或更多、或40Oe或更多、或50Oe或更多、或60Oe或更多、或70Oe或更多、或80Oe或更多、或90Oe或更多、或100Oe或更多的磁场强度的磁场。

磁场源可以被定位成使得当磁性传感器设备在使用中时在磁性传感器阵列所位于的区域中产生磁场。在一些情况下，磁场源被配置为在执行测定的贮存器板上的流体贮存器组周围产生均匀的可控磁场。磁场源可以包括一个或多个，诸如两个或更多、三个或更多、四个或更多个磁场产生组件。在一些情况下，磁场源可以包括一个或多个电磁体，诸如线圈电磁体。线圈电磁体可以包括绕线线圈。例如，磁场源可以包括布置成亥姆霍兹线圈几何形状的两个电磁体。

系统的实施例还包括基于计算机的系统。如上所述，系统可以被配置为定性和/或定量评估结合相互作用。“基于计算机的系统”是指用于分析来自磁性传感器的信号的硬件、软件和数据存储组件。基于计算机的系统的硬件可以包括中央处理单元(CPU)、输入、输出和数据存储组件。任何一种基于计算机的系统都适用于本系统。数据存储组件可以包括用于记录来自磁性传感器阵列的信号的任何计算机可读介质，或者可以存储来自磁性传感器阵列的信号的可存取存储器组件。

为了“记录”数据，计算机可读介质上的编程或其他信息是指使用本领域已知的任何此类方法来存储信息的过程。取决于用于访问存储的信息的方法，可以选择任何方便的数据存储结构。各种数据处理器程序和格式可以用于存储，例如，文字处理文本文件，数据库格式等。

在某些实施例中，该系统包括激活和信号处理单元。激活和信号处理单元可以被配置为可操作地耦合到磁性传感器设备。在一些情况下，激活和信号处理单元电耦合到磁性传感器设备。激活和信号处理单元可以电耦合以提供与磁性传感器设备之间的双向通信。例如，激活和信号处理单元可以被配置为向磁性传感器设备的组件(诸如但不限于磁性传感器阵列)提供电力、激活信号等。这样，激活和信号处理单元可以包括激活信号发生器。激活信号发生器可以被配置为向分析物检测设备的组件(诸如但不限于磁性传感器阵列)提供电力、激活信号等。在一些情况下，激活和信号处理单元被配置为跨越磁性传感器阵列施加1mV至10V范围内的电压，诸如100mV至5V，包括200mV至1V，例如300mV至500mV。在一些情况下，激活和信号处理单元被配置为在500mV的磁性传感器阵列上施加电压。

另外，激活和信号处理单元可以被配置为从磁性传感器设备接收信号，诸如从磁性传感器设备的磁性传感器阵列接收信号。来自磁性传感器设备的(一个或多个)磁性传感器的信号可用于检测血液样本中两种或更多种循环分析物的分析物的存在。在一些情况下，激活和信号处理单元可以包括配置为响应于从磁性传感器阵列接收信号而输出分析物检测结果的处理器。因此，激活和信号处理单元的处理器可以被配置为从磁性传感器设备接收信号，根据预定算法处理信号，获得与样本中一种或多种分析物的存在相关的结果，并以人可读或可听格式将结果输出给用户。可用于例如将受试者诊断为患有癌症(例如，肺癌，诸如非小细胞肺癌)的模型包括本文在示例部分和图8和9中描述的那些。

“处理器”指将执行一个或多个编程功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文中的任何处理器可以是可编程数字微处理器，诸如以电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(例如桌面或便携式)的形式可用的。在处理器可编程的情况下，合适的编程可以从远程位置传送到处理器，或者先前保存在计算机程序产品(诸如便携式或固定式计算机可读存储介质中，基于磁性、光学或固态设备的)。例如，磁介质、光盘或固态存储器设备可以承载编程，并且可以由与处理器通信的合适的读取器读取。

在一些情况下，本系统被配置为调制施加到磁性传感器阵列的电流(例如，感测电流)。本系统也可以被配置为调制由磁场源产生的磁场。调制感测电流和磁场可以有利于信号噪声最小化，因此信噪比最大化。调制感测电流和磁场的其他方面在2010年4月13日提交的标题为“Methods and Devices for Detecting the Presence of a Analyte in aSample(用于检测样品中分析物存在的方法和设备)”的第12/759,584号美国申请中更详细地描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

本系统的实施例还可以包括以下组件：(a)有线或无线通信模块，被配置为例如经由用户计算机在系统与一个或多个用户之间传输信息，如下所述；以及(b)处理器，用于执行涉及来自磁性传感器的信号的定性和/或定量分析的一个或多个任务。在某些实施例中，提供了一种计算机程序产品，包括其中存储有控制逻辑(例如，包括程序代码的计算机软件程序)的计算机可用介质。控制逻辑在由计算机的处理器执行时使处理器执行本文所述的功能。在其他实施例中，一些功能主要在使用例如硬件状态机的硬件中实现。执行硬件状态机以执行本文描述的功能可以使用任何方便的方法和技术来完成。

除了磁性传感器设备和激活和信号处理单元之外，系统还可以包括许多附加组件，诸如但不限于：数据输出设备，例如监视器，扬声器等；数据输入设备，例如接口端口，按钮，开关，键盘等；流体处理组件，例如微流体组件；电源；功率放大器；有线或无线通信组件；等。例如，系统可以包括流体处理组件，诸如微流体流体处理组件。在某些实施例中，微流体流体处理组件被配置为将流体输送到贮存器板的流体贮存器。在一些情况下，所述流体包括以下中的一种或多种：测定组合物，血液样本，一种或多种检测试剂(例如，检测抗体、磁性标签物和/或类似物)。在一些情况下，微流体流体处理组件被配置为输送少量流体，诸如1mL或更少，诸如500μL或更少，包括100μL或更少，例如50μL或更少，或25μL或更少，或10μL或更少。

在某些实施例中，系统是高灵敏度分析物检测器。“高灵敏度”是指系统被配置为检测样本中的分析物，其中样本中分析物的浓度低。在一些情况下，系统被配置为产生指示样本中感兴趣分析物的存在的可检测信号，其中样本中分析物的浓度为1μM或更少，诸如100nM或更少，或10nM或更少，或1nM或更少，包括100pM或更少，或10pM或更少，或1pM或更少，例如500fM或更少，或250fM或更少，或100fM或更少，或50fM或更少，或25fM或更少，诸如10fM或更少，或5fM或更少，或1fM或更少。换句话说，系统可以被配置为具有1μM或更少，诸如100nM或更少，或10nM或更少，或1nM或更少，包括100pM或更少，或10pM或更少，或1pM或更少，例如500fM或更少，或250fM或更少，或100fM或更少，或50fM或更少，或25fM或更少，诸如10fM或更少，或5fM或更少，或1fM或更少的检测极限，例如定量下限(LLOQ)。

在某些实施例中，该系统包括显示器。如上所述，显示器可以被配置为提供从激活和信号处理单元获得的分析物检测结果的视觉指示。显示器可以被配置为显示定性分析物检测结果。例如，定性显示可以被配置为向用户显示样本包括或不包括特定感兴趣分析物的定性指标。在某些实施例中，显示器可以被配置为显示分析物检测结果，其中分析物检测结果是定量结果，例如样本中分析物浓度的定量测量。例如，在系统被配置为输出定量分析物检测结果的实施例中，系统可以包括被配置为显示定量分析物检测结果的显示器。

磁性传感器设备可选地包括可编程存储器，其可以在使用磁性传感器设备之前和期间用相关信息来编程，诸如：用于每个单独传感器的校准数据；在测定之前如何用表面功能化分子制备生物芯片的记录；所有完成的测定步骤的记录；关于哪个样本被测量的记录；测量结果的记录；等等。

磁性传感器系统的其他方面更详细地描述于第9,151,763号和第9,164,100号美国专利以及公开号为2015/0377893的美国申请中，其每个的公开内容通过引用并入本文。示例性实施例

本公开的方面包括用于NSCLC的基于血液的诊断和管理的磁性纳米传感器技术。目前进入临床的蛋白质技术是基于ELISA的或依赖于昂贵的质谱(MS)方法。磁纳米传感器克服了基于ELISA的化学检测限制以及MS技术的高成本和低通量。此外，磁-纳米传感器能够一次多路复用多达80个独立检测器，用于在配置为同时读取数十个患者样品的仪器上高通量读出生物标志物。本文所述的血液测试被开发用于使用高灵敏度、廉价且高通量的磁纳米传感器来识别患有肺癌的患者以测量包括两种或更多种生物标志物的蛋白质组。鉴于在医学成像过程中发现的肺癌筛查和偶然检测到的肺结节的增加，本文所述的方法和设备将提供关键数据以填补临床医生信息的空白，并满足肺癌护理的关键需求。

本公开内容的方面还包括将作为辅助血液测试的磁纳米传感器技术与临床成像和临床参数的集成以检测NSCLC。预测肺癌的模型超过15年来依赖于年龄和吸烟史等不精确的人口统计数据以及计算机断层扫描图像的结节特征。这些模型虽然有用，但过于简单并且只有70％到80％的时间准确。发明人利用成像和临床参数以及使用磁-纳米传感器技术测量的循环分析物开发了多变量模型，以改善其早期阶段的肺癌预测。该模型对于接受肺癌评估的大量患者具有临床实用性，可作为独立评估，或与标准临床评估和其他癌症生物标志物结合使用。该模型还可以用于筛查肺癌的高危人群以及诊断后的肺癌患者的治疗预测和监测。

定量循环蛋白和自身抗体的较低浓度(fM或pg/mL水平)的能力具有良好的精密度和重现性，可以检测到早期癌症，并且是下一代诊断的要求。MagArray公司的磁性纳米传感器免疫测定平台满足这种要求，并且能够以多重格式检测多达80种不同的循环分析物。该测试非常适用于可能需要高灵敏度和特异性同时测量多种循环分析物的应用，以用于复杂疾病，诸如早期NSCLC。

图1示出了采用巨磁阻(GMR)传感器的MagArray磁-纳米传感器芯片的原理。GMR传感器表面涂有固定化抗原或抗体，以夹心式免疫测定形式捕获分析物(自身抗体或抗原)。生物素化检测抗体形成免疫测定的第二半部分，并允许链霉抗生物素蛋白缀合的磁性纳米颗粒(50-nm，MNP)结合并干扰局部磁场并改变传感器电阻。因此，通过监测GMR传感器中的电阻变化来实时检测MNP。传感器电阻信号(表示为百万分之一，ppm)与分析物浓度相关(单位为pg/mL或飞摩尔/升，fM)。磁-纳米传感器可用于检测血浆生物标志物，诸如CEA，低至5飞摩尔(或1pg/mL)，动态范围为-4-6log，并且允许血液生物标志物的多路复用以及可忽略的交叉反应性。基于抗原的捕获用于自身抗体的灵敏检测也已被证明。

如图2所示的MagArray仪器系统(“MR-813”)能够同时测定16个或更多样本。与仅为单样品处理设计的另一种MagArray仪器(“MC-113”)相比较，MR-813代表第二代设备。

磁性纳米传感器的一个重要特征是低的测定间CV，对于感兴趣的生理浓度的所有分析物，其通常<15％。图3示出5种循环抗原用于NSCLC诊断的0％至14％的CV：AGR2，CHGA，EGFR，HE4和pro-SFTPB。

早期NSCLC不大可能产生大量循环分析物用于检测。MagArray技术能够在飞摩尔水平上检测多种蛋白质生物标志物，远远超过当前的商业方法。对具有高靶特异性的循环蛋白和自身抗体的敏感和多重检测将允许更早地单独或结合临床参数和成像方法来准确检测NSCLC。为此，根据严格的分析物研究设计原则，在201名患者的训练队列中，在MR-813仪器上测试循环蛋白和自身抗体组。该队列由最终具有良性或恶性诊断(NSCLC或其他非NSCLC恶性肿瘤，诸如来自身体其他区域的转移)的患者组成。通过病理诊断，有82例患有I期NSCLC的患者，36例患有II-IV期癌症以及83例患有非癌症的肺部病变。良性诊断由2年结节稳定性，结节消退或基于培养或活检数据的替代性非恶性诊断的临床诊断定义。这些患者失访或根据病历保持不确定的诊断，或者患有胸部非NSCLC恶性肿瘤的患者也被排除在外。分配给诊断组的患者接受了所需的临床和影像数据进行分析。受试者进入研究时获得的血浆储存在-80℃，直到所有样本可以一次处理以避免批次效应。这些样本由不知道受试者的临床诊断的技术人员在MagArray系统上的多路复用蛋白和自身抗体测定组中进行。蛋白质测定组测量表皮生长因子受体(EGFR)、人附睾蛋白4(HE4)、前表面蛋白B(pro-SFTPB；本文也称为“pro-SB”)、前部梯度蛋白2(AGR2)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(LRG1)和组织蛋白酶抑制剂1(TIMP1)。第二个多路复用测定组测量针对ANXA1(膜联蛋白1)，层粘连蛋白α1(LAMR1)，14-3-3蛋白θ(又名YWHAQ)和血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)和泛素1(UBQLN1)的血浆自身抗体。循环蛋白和自身抗体已示出NSCLC早期诊断的前景。例如，TIMP-1是肺中具有广泛诱导性的内源性金属蛋白酶抑制剂，具有细胞增殖和抗凋亡作用。它与多种疾病部位的癌症有关，包括皮肤和肺癌。TIMP-1是一种假定的肺癌诊断生物标志物，因为它是一种分泌蛋白。血液中针对UBQLN1的自身抗体是肺癌的诊断标记(Chinnaiyan等，美国专利7,597,890)。

除了循环蛋白质之外，许多基因组生物标志物可用于肺癌诊断。然而，只有一小部分基因组生物标志物可能导致血液中的循环蛋白质。如文献报道，本发明人发现了与肺癌的基因生物标志物相关或与炎症相关联的循环蛋白质的列表。这些蛋白质可以与早先公开的蛋白质生物标志物结合，以进一步提高肺癌早期检测的准确性，因为与单独的基因组信息相比，蛋白质生物标志物的表达可以为肺癌的早期发展提供更可靠的临床信息。附加蛋白质包括：IL6(白细胞介素6)；IL8(白细胞介素8)；CXCL2(趋化因子(C-X-C基序)配体2)；DEFB1(防御素，β1)；FGF2(成纤维细胞生长因子2)；CD97(分化簇97)；PPBP(前血小板碱性蛋白，又名趋化因子(C-X-C基序)配体7或CXCL7)；PCT(降钙素原)；RAGE(晚期糖基化终产物受体)；S100A4(S100钙结合蛋白A4)；S100A8/A9(S100钙结合蛋白A8/A9复合物)；OPN(骨桥蛋白，又名骨涎蛋白I(BSP-1或BNSP)，早期T淋巴细胞活化(ETA-1)，分泌的磷蛋白1(SPP1)，2ar和立克次体抗性(Ric))。

本文公开的测定可以应用于患有肺病或其他疾病的受试者以辨别其是否患有肺癌。这些测定方法也适用于筛查无症状但有高度肺癌风险的人群。例如，后者包括年龄在55岁至74岁之间且最低吸烟史为30包年或更多(包年＝每天吸烟的烟包数量×吸烟年数)，当前吸烟或者在过去15年戒烟，并且在筛查时无疾病的人。

在患者表型在决策制定中起重要作用的临床中，隔离的循环分析测试的意义不大。因此，对血浆蛋白和自身抗体测定的结果进行了几项预先特异分析。首先，使用逻辑回归模型生成灵敏度、特异性、NPV和PPV度量，确定仅用于区分恶性和良性疾病的组的诊断准确性。其次，确定了生物标志物组在具有更多变量的模型中对传统临床癌症风险测量值的附加价值。临床和影像学变量包括确定的风险标志物，包括年龄、吸烟史、癌症史、肺部病变大小最大直径、肺部病变部位(上/下肺)和原发病灶SUV_max强度。SUV_max是感兴趣病变的葡萄糖代谢的最大标准摄取值。已显示SUV_max与病变的增殖活性相关，并且对于一般的癌症诊断和特别是肺癌患者的预后是有用的。一个显著的结果被定义为使用逻辑回归预测癌症与良性病例的模型准确度在p<0.05时的增加。Bootstrapping技术被用来确保结果的稳定性，并减少从逻辑回归模型的系数中发现癌症风险分数的错误发现率。

实用性

本发明的方法和系统可用于需要确定样本(例如血液样本)中一种或多种分析物(例如，循环分析物)的存在或不存在和/或定量的各种不同应用。本发明的系统和方法也可用于需要筛选多个样本的应用中。在某些实施例中，所述方法涉及在一个或多个样本中检测一组分析物，例如两种或更多种不同的循环分析物。例如，所述方法可以用于快速检测一组全血、血浆或血清样本中的两种或更多种循环分析物，例如可用于诊断受试者的疾病状况(例如，癌症，诸如非小细胞肺癌)，正在进行的受试者的疾病状况的管理或治疗等中。

在某些实施例中，本方法和系统可用于检测特定循环分析物的存在或不存在，以及全血、血浆、血清或其他体液中特定分析物浓度的增加或减少。

特定循环分析物的存在或不存在或特定循环分析物浓度的显著变化可以用于诊断疾病风险，受试者疾病的存在或者为个体调整疾病的治疗。例如，特定循环分析物的存在、不存在和/或浓度可影响给予个体的药物治疗或给药方案的选择。在评估可能的药物疗法中，循环分析物可以用作自然终点的替代物，诸如存活率或不可逆转的发病率。如果治疗改变了与改善健康有直接关系的循环分析物，则循环分析物可以作为评估特定治疗或给药方案的临床益处的替代终点。因此，本方法和系统有利于基于受试者中循环分析物分布图的个性化诊断和治疗。此外，本发明方法和系统(例如，基于磁性传感器的方法和系统)的皮摩尔和/或飞摩尔灵敏度促进了与疾病相关的循环分析物的早期检测。由于能够在单个传感器设备(例如，磁性传感器设备)上检测多个循环分析物，因此目前公开的测定系统和方法可用于筛选多路复用分子诊断中的多个样本。

在某些实施例中，本系统和方法可用于检测循环分析物的疾病或疾病状态。在一些情况下，疾病是细胞增殖性疾病，诸如但不限于癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤或癌等。因此，本发明的系统和方法可用于检测诸如癌症、肿瘤、乳头状瘤、肉瘤、癌等细胞增殖性疾病的疾病的存在。

套件

还提供了用于实践上述方法的一个或多个实施例的套件。本套件可以变化，并且可以包括各种设备(例如，本公开的任何传感器设备(例如，磁性传感器设备))和试剂。试剂和设备包括本文关于磁性传感器设备或其组件(诸如磁性传感器阵列)、磁性标签、一组或多组探测物、检测试剂、缓冲液等所提及的那些试剂和设备。试剂可以在分开的容器中提供，使得试剂、磁性标签、探测物等可以根据需要单独使用。或者，可以在同一容器中提供一种或多种试剂、磁性标签、探测物等，使得一种或多种试剂、磁性标签、捕获探测物等以预先组合的形式提供给用户。

在某些实施例中，套件包括如上所述的磁性传感器设备和磁性标签。例如，如上所述，磁性标签可以是磁性纳米粒子。在一些情况下，套件至少包括在方法(例如，如上所述)中使用的试剂；以及其上存储有计算机程序的计算机可读介质，其中该计算机程序在被加载到计算机中时操作计算机以从传感器(例如，磁性传感器)获得的信号(例如，实时信号)定性和/或定量地确定感兴趣的结合相互作用；以及具有从中获得计算机程序的地址的物理基板。

除了上述组件之外，本套件还可以包括用于实践本方法的指令。这些指令可以以各种形式存在于本套件中，其中套件中可以存在一种或多种形式。这些指令可能存在的一种形式是在合适的介质或基板上的印刷信息，例如在其上打印信息的一张或多张纸，在套件的包装中，在包装说明书中等。又一种手段是计算机可读介质，例如CD、DVD、蓝光、计算机可读存储器设备(例如，闪存驱动器)等，其上记录了信息。另一种可能存在的方式是可通过互联网使用的网站地址，以访问被去除的网站上的信息。任何方便的方式都可能存在于套件中。

从以上提供的公开可以理解，本公开具有广泛的应用。因此，提供以下示例用于说明目的，并不意图以任何方式解释为对本发明的限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似的结果的各种非关键参数。因此，提出以下示例以便为本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的完整公开和描述，并且并非旨在限制本发明人认为其发明的范围，也不意图表示以下实验是全部或仅进行的实验。已经努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压或接近大气压。

示例

示例1：用临床模型加两种蛋白质生物标志物检测肺癌

研究的是在三个医疗中心进行PET-CT扫描以诊断肺部病变或对肺癌进行观察性研究用于癌症分期的患者。使用斯坦福大学和MagArray公司开发的磁纳米传感器和夹心免疫测定法测量患有肺癌和非癌症对照的患者的血浆中的ANGPTL3的TIMP-1和自身抗体。然后分析通过诊断和吸烟状态分层的那些患者群组中生物标志物的水平，以使用ANOVA和逻辑回归分析来理解生物标志物与诊断和患者吸烟状态之间的关系。

如图2所示的“MR-813”系统能够同时测定8、16或更多GMR传感器芯片，用于测定血液样本。将每个GMR芯片与患者样本、对照样本或标准样本一起温育。使用模块化生化混合站(MR-813 Hanno单元)进行样本或对照或标准品与GMR芯片的孵育，检测试剂的孵育以及根据需要在期间的清洗步骤。通过将磁性纳米颗粒溶液与从Hanno单元转移的GMR芯片一起温育，并实时地在反馈的磁场下询问传感器信号，来使用阅读器工作站(MR-813读取器单元)同时分析8、16或更多个GMR芯片。

测定201例患者的20μL血浆—82例患有I期NSCLC的患者，36例患有II-IV期癌症，83例患有非癌症肺部病变(良性对照)。其中一百名患者是过去吸烟者，五十名是当前吸烟者，五十一名是非吸烟者。过去的吸烟被定义为在报名时不吸烟。所有201名患者的平均TIMP-1水平为102±5ng/mL。所有癌症病例与对照组(p＝0.03)相比，TIMP-1水平显著不同，但是对于I期亚组，或者通过对年龄和病变直径的匹配分析，TIMP-1水平未显著不同。然而，随着吸烟状况的分层，增加TIMP-1水平与所有阶段(p＝0.001)，仅I阶段(p＝0.005)和年龄和病变直径(p＝0.03)匹配的癌症诊断相关联，如图4所示。

使用包括年龄、癌症病史、结节直径(cm)、结节肺部位置和结节边界在内的临床相关数据，NSCLC患者能够与AUC为0.741的良性对照区分开(参见图5中的“步骤0”ROC曲线，这对应于没有任何蛋白质生物标志物的益处的所谓的临床模型)。将TIMP-1蛋白数据添加至临床模型(参见“步骤1”ROC曲线)将AUC提高至0.8466。将另一种蛋白质生物标志物(ANGPTL3的抗体)加入逻辑回归模型得到AUC为0.9069(参见图5中的“Model”ROC)。

示例2：使用包含许多蛋白质生物标志物的Logistic回归模型检测肺癌

在逻辑回归分析之前，使用自然对数转换11个生物标志物水平。我们评估了28种预定义预测模型的区分能力。这些模型是通过根据表1中的说明拟合逻辑回归模型构建的，其中x表示包含在给定模型中的参数。由模型拟合得到的系数用于构建预测模型，然后使用1000个自举数据集对其进行评估。性能的最终指标是每个模型应用于每个自举数据集时确定的平均ROC曲线AUC。

模型11-16通过首先使用构建为模型10、9和8的吸烟分数变量来构建，所述模型包括具有和不具有年龄和/或性别的生物标志物P3和P6。选择这些生物标志物是因为它们产生了用于预测吸烟状态的最佳拟合模型。

增加模型25以允许比较性能最好的吸烟分数模型(模型14)和使用相同变量而没有吸烟分数(模型25)的模型。模型25包含与模型14相同的变量，但独立使用所有变量，而不是将某些变量组合到吸烟分数中。

十二个模型产生AUC分布，平均AUC大于或等于0.8(图8中的表1)。通过先前应用的套索方法选择的模型，模型1，比所有其他模型表现更好。下一个表现最好的模型是模型17，其中包括年龄、性别、癌症诊断史、结节位置以及P3、P6、P7、A1、A2和A4。

图6示出了每个模型的自举AUC分布的直方图。图7示出了这些AUC分布的平均值以及每个分布的95％置信区间的上限和下限。

图9中的表2示出模型1、6、7和17的模型系数。

尽管附有条款，但本文所述的公开内容也由以下条款定义：

1.一种产生受试者的循环分析物分布图的方法，包括：

使来自受试者的血液样本与一组探测物接触，以特异性结合选自由以下构成的群组的两种或更多种分析物：金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)，抗血管生成素样蛋白质3抗体(抗ANGPTL3)，表皮生长因子受体(EGFR)，前表面蛋白B(ProSB)，抗14-3-3蛋白θ抗体(抗YWHAQ)和抗层粘连蛋白α1抗体(抗LAMR1)；以及

检测两种或更多种分析物的分析物存在或不存在与所述一组探测物中的探测物的结合，以产生所述受试者的循环分析物分布图。

2.根据条款1所述的方法，其中使所述血液样本与一组探测物接触，以特异性结合选自由以下构成的群组中的三种或更多种分析物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

3.根据条款1所述的方法，其中使所述血液样本与一组探测物接触，以特异性结合选自由以下构成的群组中的四种或更多种分析物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

4.根据条款1所述的方法，其中使所述血液样本与一组探测物接触，以特异性结合选自由以下构成的群组中的五种或更多种分析物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

5.根据条款1所述的方法，其中使所述血液样本与一组探测物接触，以特异性结合TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

6.根据条款1至5中任一项所述的方法，其中检测存在或不存在所述两种或更多种分析物的分析物的结合包括对检测到的分析物进行定量。

7.根据条款1至6中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于结合选自由以下构成的群组中的一种或多种附加的分析物的探测物：HE4，AGR2，CHGA，LRG1，抗ANXA1，抗UBQLN1，IL6，IL8，CXCL2，DEFB1，FGF2，CD97，PPBP，PCT，RAGE，S100A4，S100A8/A9，OPN及其任何组合，

其中所述方法还包括检测存在或不存在所述一种或多种附加的分析物与所述一组探测物中的探测物的结合，以产生所述受试者的循环分析物分布图。

8.根据条款7所述的方法，其中所述一组探测物包括用于结合所述附加的分析物中的2种或更多、3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多、11种或更多、12种或更多、13种或更多、14种或更多、15种或更多、16种或更多、17种或更多或每种。

9.根据条款7或条款8所述的方法，其中检测存在或不存在所述一种或多种附加的分析物的结合包括对检测到的一种或多种附加的分析物进行定量。

10.根据条款1至9中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于与循环肿瘤细胞结合的探测物，其中所述方法还包括检测存在或不存在循环肿瘤细胞与一组探测物中的探测物的结合，以产生所述受试者的循环分析物分布图。

11.根据条款10所述的方法，其中检测存在或不存在循环肿瘤细胞的结合包括对检测到的循环肿瘤细胞进行定量。

12.根据条款1至11中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于与肿瘤DNA结合的探测物，其中所述方法还包括检测存在或不存在肿瘤DNA与所述一组探测物中的探测物的结合，以产生所述受试者的循环分析物分布图。

13.根据条款12所述的方法，其中检测存在或不存在肿瘤DNA的结合包括对检测到的肿瘤DNA进行定量。

14.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于特异性结合50种或更少分析物的探测物。

15.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于特异性结合40种或更少分析物的探测物。

16.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于特异性结合30种或更少分析物的探测物。

17.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述一组探测物包括用于特异性结合25种或更少分析物的探测物。

18.根据条款1至17中任一项所述的方法，还包括基于所述循环分析物分布图诊断所述受试者患有癌症。

19.根据条款18所述的方法，其中所述诊断包括诊断所述受试者患有I期、II期、III期或IV期癌症。

20.根据条款19所述的方法，其中所述诊断包括诊断所述受试者患有I期或II期癌症。

21.根据条款20所述的方法，其中所述诊断包括诊断所述受试者患有I期癌症。

22.根据条款18至21中任一项所述的方法，其中所述诊断还基于选自由以下构成的群组的临床评估：临床显像，年龄，性别，癌症病史，结节位置，结节大小，结节边界，SUVmax，吸烟状况及其任何组合。

23.根据条款18至22中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

24.根据条款23所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

25.根据条款1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者来自具有肺癌高风险的群体。

26.根据条款25所述的方法，其中具有高风险肺癌的人群由当前正在吸烟的受试者组成。

27.根据条款25或条款26所述的方法，其中具有高度肺癌风险的人群由过去的大量吸烟者组成。

28.根据条款1至27中任一项所述的方法，其中所述受试者具有不确定的肺部病变。

29.根据条款1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受肺癌治疗，并且其中所述方法还包括基于所述循环分析物分布图预测、监测所述受试者对所述肺癌治疗的治疗反应或两者兼具。

30.根据条款1至29中任一项所述的方法，其中血液样本是全血样本、血浆样本或血清样本。

31.根据条款1至30中任一项所述的方法，其中所述一组探测物是作为可寻址探测物阵列提供的一组捕获探测物。

32.根据条款31所述的方法，其中可寻址探测物阵列存在于磁性传感器设备的磁性传感器芯片上。

33.根据条款32所述的方法，其中所述磁性传感器芯片包括具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器。

34.根据条款33所述的方法，其中具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器中的每个包括用于结合到相同的两种或更多种分析物的捕获探测物。

35.根据条款33或条款34所述的方法，其中每个磁性传感器包括磁阻元件。

36.根据条款35所述的方法，其中所述磁阻元件是自旋阀磁阻元件或者磁隧道结(MTJ)磁阻元件。

37.根据条款32至36中任一项所述的方法，其中检测存在所述两种或更多种分析物与所述一组探测物中的探测物的结合包括检测与捕获的分析物结合的磁性标签式检测试剂。

38.根据条款37所述的方法，其中所述磁性标签式检测试剂与捕获的分析物间接地结合。

39.根据条款38所述的方法，其中所述磁性标签式检测试剂是包括捕获探测物、分析物、与分析物特异性结合的初级检测试剂和与初级检测试剂结合的磁性标签式检测试剂的复合物的一部分。

40.根据条款35至39中任一项所述的方法，其中检测存在所述两种或更多种分析物与所述一组探测物中的探测物的结合包括检测由所述磁性标签式检测试剂引起的所述磁阻元件中的电阻变化。

41.一种传感器设备，包括：

作为可寻址探测物阵列提供的一组捕获探测物，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合选自以下构成的群组中的两种或更多种分析物的探测物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

42.根据条款41所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合选自以下构成的群组中的三种或更多种分析物的探测物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

43.根据条款41所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合选自以下构成的群组中的四种或更多种分析物的探测物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

44.根据条款41所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合选自以下构成的群组中的五种分析物的探测物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

45.根据条款41所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合TIMP1、抗ANGPTL3、EGFR、ProSB、抗YWHAQ和抗LAMR1的探测物。

46.根据条款41至45中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合选自由以下构成的群组中的一种或多种附加的分析物的探测物：HE4，AGR2，CHGA，LRG1，抗ANXA1，抗UBQLN1，IL6，IL8，CXCL2，DEFB1，FGF2，CD97，PPBP，PCT，RAGE，S100A4，S100A8/A9，OPN及其任何组合。

47.根据条款41至45中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合所述附加的分析物中的2种或更多、3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多、11种或更多、12种或更多、13种或更多、14种或更多、15种或更多、16种或更多、17种或更多或每种。

48.根据条款41至47中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于与循环肿瘤细胞结合的探测物。

49.根据条款41至48中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于与肿瘤DNA结合的探测物。

50.根据条款41至49中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合50种或更少分析物的探测物。

51.根据条款41至49中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合至40种或更少分析物的探测物。

52.根据条款41至49中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合30种或更少分析物的探测物。

53.根据条款41至49中任一项所述的传感器设备，其中所述一组探测物包括用于结合25种或更少分析物的探测物。

54.根据条款41至53中任一项所述的传感器设备，其中所述传感器设备是磁性传感器设备。

55.根据条款54所述的传感器设备，其中所述磁性传感器设备包括包括一组捕获探测物的磁性传感器芯片。

56.根据条款55所述的传感器设备，其中磁性传感器芯片包括具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器。

57.根据条款56所述的传感器设备，其中具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器中的每个包括用于结合到相同分析物的捕获探测物。

58.根据条款56或57所述的传感器设备，其中每个磁性传感器包括磁阻元件。

59.根据条款58所述的传感器设备，其中所述磁阻元件是自旋阀磁阻元件或者磁隧道结(MTJ)磁阻元件。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和示例详细描述了前述实施例，但根据本公开的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下进行可以某些改变和修改。

因此，前面仅仅示出了本公开的实施例的原理。应该理解，本领域的技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文没有明确地描述或示出，但它们体现了本实施例的原理并且被包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本公开的实施例的原理以及发明人为促进现有技术而贡献的概念，并且应被解释为不限于这种具体列举的示例和条件。此外，本文中引用本公开的原理、方面和实施例以及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，意图是这样的等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，开发的任何执行相同功能的元件，而不管结构如何。因此，本公开的范围不旨在限于本文示出和描述的示例性实施例。相反，本公开的范围和精神由所附权利要求来体现。

Claims (15)

1.一种传感器设备，包括：

作为可寻址探测物阵列提供的一组捕获探测物，其中所述一组捕获探测物包括用于特异性结合包括以下的分析物的探测物：TIMP1，抗ANGPTL3，EGFR，ProSB，抗YWHAQ和抗LAMR1。

2.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物还包括用于结合选自由以下构成的群组中的一种或多种附加的分析物的探测物：HE4，AGR2，CHGA，LRG1，抗ANXA1，抗UBQLN1，IL6，IL8，CXCL2，DEFB1，FGF2，CD97，PPBP，PCT，RAGE，S100A4，S100A8/A9，OPN及其任何组合。

3.根据权利要求2所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于结合所述附加的分析物中的2种或更多、3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多、11种或更多、12种或更多、13种或更多、14种或更多、15种或更多、16种或更多、17种或更多或每种。

4.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于与循环肿瘤细胞结合的探测物。

5.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于与肿瘤DNA结合的探测物。

6.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于结合50种或更少分析物的探测物。

7.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于结合至40种或更少分析物的探测物。

8.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于结合30种或更少分析物的探测物。

9.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述一组捕获探测物包括用于结合25种或更少分析物的探测物。

10.根据权利要求1所述的传感器设备，其中所述传感器设备是磁性传感器设备。

11.根据权利要求10所述的传感器设备，其中所述磁性传感器设备包括一组捕获探测物的磁性传感器芯片。

12.根据权利要求11所述的传感器设备，其中磁性传感器芯片包括具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器。

13.根据权利要求12所述的传感器设备，其中具有附着到其表面的捕获探测物的两个或更多个磁性传感器中的每个包括用于结合到相同分析物的捕获探测物。

14.根据权利要求12或13所述的传感器设备，其中每个磁性传感器包括磁阻元件。

15.根据权利要求14所述的传感器设备，其中所述磁阻元件是自旋阀磁阻元件或者磁隧道结(MTJ)磁阻元件。

Images