KR20230039608A - 혈장 및 타액의 액체 생검 플랫폼 - Google Patents

혈장 및 타액의 액체 생검 플랫폼 Download PDF

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찰스 스트롬
웨이 리아오
제이슨 탕
데이비드 티 웡
팡 웨이
마이클 투
조단 청
데이비드 치아
린린 예
펑 리
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찰스 스트롬
웨이 리아오
제이슨 탕
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Abstract

체액 중의 바이오마커의 검출을 위한 액체 생검 시스템 및 방법이 기술된다. 특히, 시스템은 대상체에서 폐암의 바이오마커를 검출하기에 적합하다.

Description

혈장 및 타액의 액체 생검 플랫폼
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 제 63/021,172호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 허가 번호 DE017790, DE017170, CA206126, CA233370 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 특정 권리를 가진다.
차세대 서열분석(NGS)은 폐, 결장, 유방 및 전립선 암을 포함한 많은 고형 종양과 관련된 특징적인 돌연변이가 포함된 풍부한 새로운 생물학적 정보의 잠금을 해제하였다(Almodovar et al., 2018, J Thorac Oncol, 13:112-123; Schwaederle et al., 2016, Clin Cancer Res, 22:5497-5505; Rolfo et al., 2018, J Thorac Oncol, 13:1248-1268). 지금까지, 생검에 의해 또는 수술시에 얻어진 조직 샘플이 유일한 이용 가능한 표본 공급원이었다. 이와 같이, 이용 가능한 조직의 양은 종종 제한적이었다. 보다 최근에, 우리가 혈액(Wei et al., 2018, J Mol Diagn, 20:738-742) 및 타액(Wei et al., 2014, Am J Respir Crit Care Med, 190:1117-1126; Pu et al., 2016, Thoracic Cancer, 7:428-436; Elazezy et al., 2018, Comput Struct Biotechnol J, 2018, 16:370-378)에서 세포가 없는 DNA(cfDNA)를 검출하고 측정할 수 있게 해준 기술이 표본의 무제한 공급에 대한 쉬운 접근을 제공해주었다. 이런 샘플링 방법은 "액체 생검"으로서 알려져 있다.
액체 생검은 임상 도구로서 아직은 초기 단계에 있지만, 이미 비-소세포 폐암(NSCLC) 환자에서 발현 및 재발 시점에 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 돌연변이를 검출하는 데 가치를 입증하였고, 이것은 Roche Molecular Systems가 2017년도에 Cobas EGFR 돌연변이 테스트를 상업적으로 출시하는 것을 촉진하였다. 더불어, 상업적 실험실은 이제 NSCLC 환자에 대한 액체 생검에 의해 얻어진 cfDNA를 사용하는 단일 또는 패널 돌연변이 테스트를 제공한다.
지금까지, 액체 생검의 광범위한 사용은 검정의 민감성 및 특이성에서의 어려움과 단일 돌연변이에 대해 종종 1000달러를 초과하는 상당한 비용에 의해 부정적으로 영향을 받아왔다. 추가로, CMS-Medicare 및 기타 제3자 지급인은 FDA 승인을 받은 Cobas 검정을 제외하고 그러한 테스트를 다루는 것을 주저하였다.
현재의 액체 생검 테스트의 복잡성은 필요한 다중 PCR 테스트에 대한 표본 수집 및 취급으로부터 발생하는 많은 사전 분석 및 분석 변수를 도입하게 한다. 더불어, 차세대 서열분석(NGS) 기반 테스트에 대한 분석의 복잡성은 검정 총 처리 시간(TAT)이 전형적으로 10-14일이 되는 정도로 많은 시간을 필요로 한다.
그러므로, 기술분야에는 비침습성이고, 언제나 이용 가능하며, 최소 샘플 제제를 포함하거나 샘플 제제를 포함하지 않고, 돌연변이 상태에 대한 즉각적인 정보를 제공하는 고처리량 액체 생검 시스템에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 만족시킨다.
한 구현예에서, 발명은 a) 센서 어레이를 포함하는 다중 웰 플레이트로서, 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 적어도 하나의 유닛의 작업 전극은 전도성 중합체로 코팅되는 다중 웰 플레이트; b) 캡처 및 검출기 프로브 쌍을 포함하는 적어도 하나의 프로브 세트로서, 캡처 프로브는 전도성 중합체에 내재되어 있거나 기능화되며 추가로 검출기 프로브는 말단 3' 뉴클레오타이드에서 표지된 비오틴인, 프로브 세트; c) 다중 웰 플레이트 세척기; 및 d) 어레이 센서 위로 적용된 전기장을 제어하고 전류 측정 전류를 동시에 기록하는 다중 채널 전기화학 판독기를 포함하는, 샘플 중의 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 시스템에 관한 것이다.
한 구현예에서, 캡처 및 검출기 프로브 중 적어도 하나는 폐암의 마커를 포함하는 핵산 분자에 혼성화한다.
한 구현예에서, 캡처 프로브는 폴리A 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 폐암의 마커는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 변이체이다. 한 구현예에서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 또는 c.2239_2248 del11이다.
한 구현예에서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, 또는 L858R이다.
한 구현예에서, 캡처 및 검출 프로브 쌍은 a) 엑손19 결실의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:5 또는 서열 번호:13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:6을 포함하는, 프로브 쌍; b) L858R의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:1 또는 서열 번호:14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:2를 포함하는, 프로브 쌍; 또는 c) T790M의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:9 또는 서열 번호:15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:10을 포함하는, 프로브 쌍이다.
한 구현예에서, 발명은 대상체의 적어도 하나의 샘플을 얻는 단계; 적어도 하나의 샘플의 제1 부분을 표지된 검출기 프로브를 포함하는 용액과 혼합하는 단계; 혼합물을 샘플 중의 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 시스템에서 사용하기 위해 다중 웰 플레이트의 단일 웰에 첨가하는 단계로서, 시스템은 a) 센서 어레이를 포함하는 다중 웰 플레이트로서, 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 적어도 하나의 유닛의 작업 전극은 전도성 중합체로 코팅되는, 다중 웰 플레이트; b) 캡처 및 검출기 프로브 쌍을 포함하는 적어도 하나의 프로브 세트로서, 캡처 프로브는 전도성 중합체에 내재되어 있거나 기능화되며 추가로 검출기 프로브는 말단 3' 뉴클레오타이드에서 표지된 비오틴인, 프로브 세트; c) 다중 웰 플레이트 세척기; 및 d) 어레이 센서 위로 적용된 전기장을 제어하고 전류 측정 전류를 동시에 기록하는 다중 채널 전기화학 판독기를 포함하고, 다중 웰 플레이트의 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 작업 전극은 캡처 프로프가 내재된 전도성 중합체로 코팅되는 것인, 단계; 전극 칩에 순환 방형파(cyclic square wave) 전기장을 적용하는 단계; 및 전극 칩에서 전류를 측정하는 단계로서, 전류의 변화는 샘플 중의 폐암과 관련된 마커의 존재와 상관이 있는 것인, 단계를 포함하는, 대상체에서 폐암을 검출하는 방법에 관한 것이다.
한 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 세척 단계를 추가로 포함하며, 여기서 다중 웰 플레이트는 자동 플레이트 세척기를 사용하여 세척된다.
한 구현예에서, 방법은 신호를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 방법은: a) 적어도 하나의 샘플의 제1 부분을 비오틴 표지된 검출기 프로브를 포함하는 용액과 혼합하는 단계; b) 혼합물을 샘플 중의 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 시스템에서 사용하기 위해 다중 웰 플레이트의 단일 웰에 첨가하는 단계로서, 시스템은 a) 센서 어레이를 포함하는 다중 웰 플레이트로서, 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 적어도 하나의 유닛의 작업 전극은 전도성 중합체로 코팅되는, 다중 웰 플레이트; b) 캡처 및 검출기 프로브 쌍을 포함하는 적어도 하나의 프로브 세트로서, 캡처 프로브는 전도성 중합체에 내재되어 있거나 기능화되며 추가로 검출기 프로브는 말단 3' 뉴클레오타이드에서 표지된 비오틴인, 프로브 세트; c) 다중 웰 플레이트 세척기; 및 d) 어레이 센서 위로 적용된 전기장을 제어하고 전류 측정 전류를 동시에 기록하는 다중 채널 전기화학 판독기를 포함하고, 다중 웰 플레이트의 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 작업 전극은 캡처 프로프가 내재된 전도성 중합체로 코팅되는 것인, 단계; c) 전극 칩에 순환 방형파 전기장을 적용하는 단계; d) 제1 라운드의 스트렙트아비딘 결합 서양고추냉이 과산화효소(HRP)를 웰에 첨가하는 단계, e) 비오틴 표지된 항-HRP 항체를 웰에 첨가하는 단계, f) 제2 라운드의 스트렙트아비딘 결합 HRP를 웰에 첨가하는 단계, 및 g) 전극 칩에서 전류를 측정하는 단계로서, 전류의 변화는 샘플 중의 폐암과 관련된 마커의 존재와 상관이 있는 것인, 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 시약은 사용 전에 4℃에서 유지된다.
한 구현예에서, 캡처 및 검출기 프로브 중 적어도 하나는 폐암의 마커를 포함하는 핵산 분자에 혼성화한다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 순환 종양 DNA(ctDNA) 분자이다.
한 구현예에서, 캡처 프로브는 폴리A 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 폐암의 마커는 EGFR의 변이체이다. 한 구현예에서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 또는 c.2239_2248 del11이다. 한 구현예에서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, 또는 L858R이다.
한 구현예에서, 캡처 및 검출 프로브 쌍은 a) 엑손19 결실의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:5 또는 서열 번호:13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:6을 포함하는, 프로브 쌍; b) L858R의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:1 또는 서열 번호:14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:2를 포함하는, 프로브 쌍; 또는 c) T790M의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:9 또는 서열 번호:15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:10을 포함하는, 프로브 쌍이다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 샘플은 타액 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플 또는 혈청 샘플이다.
한 구현예에서, 대상체로부터의 타액 샘플은 다중 웰 플레이트의 제1 웰에 첨가되고 동일한 대상체로부터의 혈장 샘플은 다중 웰 플레이트의 제2 웰에 첨가된다. 한 구현예에서, 대상체는 폐암의 마커가 대상체로부터의 타액 샘플 및 동일한 대상체로부터의 혈장 샘플에서 모두 검출될 때 폐암을 가졌거나 폐암의 위험이 있는 것으로 진단된다.
한 구현예에서, 상기 방법은 폐암에 대한 마커가 검출될 때 대상체에게 폐암에 대한 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
발명의 예시의 구현예에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독할 때 더 잘 이해될 것이다. 발명을 예시할 목적으로, 현재 바람직한 구현예가 도면에 도시된다. 그러나, 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 도구에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다.
도 1A 및 도 1B는 eLB에 의해 검출된 표적이 DNA 또는 RNA인지를 평가하기 위한 Rnase 치료를 사용한 예시의 eLB 검정 실험을 도시한다. 도 1A: RNA 기반 검정에 적용된 RNAse 치료 실험. 도 1B: 건강한 대조군 및 엑손19 결실을 포함한 대상체(UCLA140)에 적용된 RNAse 치료.
도 2는 eLB에 의해 검출된 표적이 DNA 또는 RNA인지를 평가하기 위한 엑소뉴클레아제 VII 치료를 사용한 예시의 eLB 검정 실험을 도시한다. 엑소뉴클레아제 VII 치료는 건강한 샘플; 합성 이중 가닥 T790M 올리고뉴클레오타이드 스파이크인(spike-in)이 있는 건강한 혈장 샘플; 합성 단일 가닥 T790M 스파이크인이 있는 건강한 혈장; 또는 p.T790M 포함 대상체에 적용되었다.
도 3A 내지 도 3C는 eLB 검정을 사용하여 테스트된 100개의 건강한 타액 샘플에 대한 참조 범위 연구를 입증하는 예시의 실험을 도시한다. 점선에 의해 표시된 2개의 표준 편차 선. 도 3A: 엑손19 결실 돌연변이에 대한 eLB 검정; 도 3B: p.L858R 돌연변이에 대한 eLB 검정 결과; 도 3C: p.T790M 돌연변이에 대한 eLB 검정.
도 4A 내지 도 4C는 eLB 검정을 사용하여 테스트된 100개의 건강한 혈장 샘플에 대한 참조 범위 연구를 입증하는 예시의 실험을 도시한다. 적색 점선에 의해 표시된 2개의 표준 편차 선. 도 4A: 엑손19 결실 돌연변이에 대한 eLB 검정; 도 4B: p.L858R 돌연변이에 대한 eLB 검정 결과; 도 4C: p.T790M 돌연변이에 대한 eLB 검정.
도 5A 내지 도 5H는 상위 4개의 EGFR 엑손19 변이체에 대한 연속 희석된 게놈 DNA의 eLB 검정 결과를 입증하는 예시의 실험을 도시한다. 도 5A 내지 도 5D는 각각 변이체 c.2235_2249 del18, c2236_2250 del18, c2240_2257 del18, 및 c.2239_2248 del11에 대한 측정 결과의 플롯을 도시한다. 도 5E 내지 도 5H는 각각 c.2235_2249 del18, c2236_2250 del18, c2240_2257 del18, 및 c.2239_2248 del11의 선형 범위를 도시한다.
도 6A 및 도 6B는 p.T790M 돌연변이에 대한 연속 희석된 게놈 DNA의 예시의 eLB 검정 결과를 도시한다. 도 6A는 희석된 게놈 DNA 및 EFIRM 측정의 산도를 도시한다. 도 6B는 연속 희석된 게놈 DNA의 하부 범위(300 내지 2개 복사물)의 막대 플롯을 도시한다.
도 7A 및 도 7B는 p.L858R 돌연변이에 대한 연속 희석된 게놈 DNA의 예시의 eLB 검정 결과를 도시한다. 도 7A는 희석된 게놈 DNA 및 EFIRM 측정의 산도를 도시한다. 도 7B는 연속 희석된 게놈 DNA의 하부 범위(300 내지 2개 복사물)의 막대 플롯을 도시한다.
도 8A 내지 도 8C는 수평 진단 참조 표준으로부터의 표준의 예시의 eLB 검정 결과를 도시한다. 도 8A: p.T790M에 대한 eLB; 도 8B: 엑손19 결실에 대한 eLB; 도 8C: p.L858R에 대한 eLB.
도 9는 EFIRM 검정 시스템의 개략도를 도시한다.
본 발명의 도면 및 설명은, 명료성을 목적으로, 전형적인 바이오마커 검출 시스템 및 방법에서 찾아볼 수 있는 많은 다른 요소를 제거하면서 본 발명의 명확한 이해를 위해 관련된 요소를 예시하기 위하여 단순화된 것이 이해되어야 한다.
기술분야에 통상의 지식을 가진 사람들은 다른 요소 및/또는 단계가 본 발명의 실행하는데 바람직하고/거나 필요한 것을 인식할 수 있다. 그러나, 그러한 요소 및 단계는 기술분야에 잘 알려져 있고, 그것들은 본 발명의 더 나은 이해를 촉진하지 않기 때문에, 그러한 요소 및 단계에 대한 논의는 본원에서 제공되지 않는다. 본원의 개시내용은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 그러한 요소 및 방법에 대한 모든 그러한 변화 및 변형에 관한 것이다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시의 방법 및 물질이 기술된다.
본원에서 사용되는 바, 각각의 다음 용어는 이 섹션에서 관련된 의미를 가진다.
"단수"를 나타내는 관사("a" 및 "an")는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들자면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 "약"은 양, 기간, 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때, 변동이 적절하기 때문에 명시된 값으로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, 및 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "비정상"은 유기체, 조직, 세포 또는 그것의 구성요소의 맥락에서 사용될 때, 적어도 하나의 관찰 가능한 또는 검출 가능한 특징(예컨대, 연령, 치료, 경과일, 등)이 "정상적인"(예상된) 각각의 특징을 나타내는 그런 유기체, 조직, 세포 또는 그것의 구성요소와 상이한 그런 유기체, 조직, 세포 또는 그것의 구성요소를 지칭한다. 하나의 세포 또는 조직 유형에 대해 정상적인 또는 예상된 특징은 상이한 세포 또는 조직 유형에 대해서는 비정상일 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "변경", "결핍", "변이", 또는 "돌연변이"는 암호화하는 폴리펩타이드의 기능, 활성, 발현(전사 또는 번역) 또는 입체형태에 영향을 미치는 세포의 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 돌연변이는 암호화된 단백질의 발현의 완전한 부재를 포함한, 암호화된 폴리펩타이드의 기능, 활성, 발현 또는 입체형태의 향상 또는 파괴를 초래하는 세포의 유전자의 임의의 돌연변이일 수 있고 예를 들어, 미스센스 및 넌센스 돌연변이, 삽입, 결실, 프레임시프트 및 미성숙 종결을 포함할 수 있다. 그렇게 제한되지 않으면서, 본 발명에 의해 포함되는 돌연변이는 mRNA의 스플라이싱을 변경시키거나(스플라이스 부위 돌연변이) 또는 리딩 프레임에서 시프트를 유발할 수 있다(프레임시프트).
용어 "증폭"은 샘플에 존재하는 표적 뉴클레오타이드 서열의 많은 복사물이 증폭되게 하는 작동을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 자연적인 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 테트라머이다. 본 발명에서 항체는 예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
본원에서 사용되는 바, "항체 중쇄"는 모든 항체 분자에서 자연적으로 발생하는 입체형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 긴 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "항체 경쇄"는 모든 항체 분자에서 자연적으로 발생하는 입체형태로 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. κ 및 λ 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "합성 항체"는 예를 들어, 본원에 기술된 박테리오파지에 의해 발현된 항체와 같은, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체 및 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 명시하는 아미노산 서열을 발현하는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 하며, DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 기술분야에서 잘 알려져 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 얻어졌다.
항체와 관련하여 본원에서 사용되는 바 용어 "특이적으로 결합하는"은 특정 항원을 인식하지만 샘플 중의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 종-교차 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 못한다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 교차 반응성은 그 자체로는 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경하지 못한다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 화학 종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존적인 상호작용을 의미하기 위해 항체, 단백질, 또는 펩타이드와 제2 화학 종과의 상호작용을 언급하는 데 사용될 수 있다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 만약 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적이라면, 에피토프 A(또는 자유로운, 미표지 A)를 함유한 분자의 존재는 표지된 "A" 및 항체를 함유한 반응에서 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 폐암의 존재 및/또는 중증도를 측정하기 위한 본 발명에 따르는 유용한 파라미터를 포함하는 것을 의미한다.
마커 또는 바이오마커의 수준은 만약 환자로부터의 샘플 중의 마커 수준이 참조 대상체로부터의 샘플 중의 수준과, 마커를 평가하기 위해 사용된 검정의 표준 오차보다 큰 양만큼, 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 만큼 상이하다면 "유의적으로" 상이하다.
용어 "대조군 또는 참조 표준"은 발명의 하나 이상의 마커(또는 바이오마커)의 하나 이상의 마커(또는 바이오마커) 발현 생성물이 없거나, 또는 정상, 낮은, 또는 높은 수준으로 포함하는 물질을 기술하며, 그로써 대조군 또는 참조 표준은 샘플이 비교될 수 있는 비교기로서 작용할 수 있다.
구절 "마커(또는 바이오마커) 발현의 수준을 측정"하는 것은 핵산 또는 단백질 수준에서 샘플 중의 마커의 발현 정도를 숙련된 기술자가 임의의 마커 발현 생성물의 충분한 부분을 검출하기 위해 이용할 수 있는 기술을 사용하여 평가하는 것을 의미한다.
"차등적으로 증가된 발현" 또는 "상향 조절"은 대조군보다 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높거나 그 이상이고/거나, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배, 2.0배 이상이거나 그 이상, 및 그 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적인 증분인 바이오마커 생성물 수준을 지칭한다.
"차등적으로 감소된 발현" 또는 "하향 조절"은 대조군보다 적어도 10% 이상, 예를 들어, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 낮거나 그 미만이고/거나, 2.0배, 1.8배, 1.6배, 1.4배, 1.2배, 1.1배 이하, 및 그 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분적인 증분인 바이오마커 생성물 수준을 지칭한다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 만약 질환이 개선되지 않는다면 동물의 건강이 계속해서 악화되는 동물의 건강 상태이다.
본원에서 사용되는 바, "교육 자료"는 본원에 개시된 바이오마커를 검출하기 위한 키트에서 발명의 구성요소의 유용성을 전달하기 위해 사용될 수 있는 표현의 간행물, 다이아그램, 또는 임의의 다른 매체를 포함한다. 발명의 키트의 교육 자료는, 예를 들어, 발명의 구성요소를 함유하는 용기에 부착되거나 또는 구성요소를 함유하는 용기와 함께 배송된다. 대안으로, 교육 자료는 교육 자료 및 구성요소가 수령체에 의해 함께 사용될 수 있는 의도로 용기와 별도로 배송될 수 있다.
용어 "표지"는 본원에서 사용될 때 "표지된" 프로브를 생성하기 위해 프로브에 직접 또는 간접적으로 콘쥬게이션되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체적으로 검출 가능하거나(예컨대 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경(예컨대, 아비딘-비오틴)을 촉매할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머가 PCR 생성물을 검출하기 위해 표지될 수 있다.
하나 이상의 바이오마커의 "수준"은 샘플 중의 바이오마커의 절대 또는 상대적인 양 또는 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "마커(또는 바이오마커) 발현"은 유전자에 암호화된 정보의 RNA 또는 단백질로의 변환의 모든 측면을 포함한 유전자의 전사, 번역, 번역후 변형, 및 표현형 표시를 포함한다. 비제한적인 예를 들자면, 마커 발현은 메신저 RNA(mRNA)로의 전사 및 단백질로의 번역, 뿐만 아니라 단백질로 번역되지 않는 트랜스퍼 RNA(tRNA) 및 리보솜 RNA(rRNA)와 같은 RNA 유형으로의 전사를 포함한다.
"측정하는" 또는 "측정", 또는 대안으로 "검출하는" 또는 "검출"은 임상 또는 대상체 유래 샘플 내에서 주어진 물질의 존재, 부재, 정량 또는 양(유효량일 수 있음)을 평가하는 것을 의미하며, 그러한 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 도출, 또는 그렇지 않으면 대상체의 임상 파라미터의 값 또는 범주의 평가를 포함한다.
용어 "환자", "대상체", "개체", 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 시험관내에서든 또는 제자리에서든 본원에 기술된 방법이 적용될 수 있는 임의의 동물, 또는 그것의 세포를 지칭한다. 특정한 비제한적 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "예후의 제공"은 중증도, 기간, 회복 가능성, 등의 예측을 포함한, 폐암의 가능한 과정 및 결과의 예측을 제공하는 것을 지칭한다. 방법은, 예컨대, 병태가 여전히 초기 단계에 있는지의 여부 또는 병태가 공격적인 치료법이 비효과적일 단계로 진행했는지를 나타냄으로써 적합한 치료 계획을 고안하기 위해 사용된다.
바이오마커의 "참조 수준"은 특정 질환 상태, 표현형, 또는 그것의 결여, 뿐만 아니라 질환 상태, 표현형, 또는 그것의 결여의 조합을 나타내는 바이오마커의 수준을 의미한다. 바이오마커의 "양성" 참조 수준은 특정 질환 상태 또는 표현형을 나타내는 수준을 의미한다. 바이오마커의 "음성" 참조 수준은 특정 질환 상태 또는 표현형의 결여를 나타내는 수준을 의미한다.
본원에서 사용되는 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 개체로부터 분리된 생물학적 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 원하는 바이오마커를 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 물질을 함유할 수 있고, 개체로부터 얻어진 세포 및/또는 비세포 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "표준 대조군 값"은 샘플, 예컨대 타액 샘플, 전체 타액 또는 타액 상층액 중에서 검출 가능한 특정 단백질 또는 핵산의 미리 결정된 양을 지칭한다. 표준 대조군 값은 타액 샘플에 존재하는 관심 있는 단백질 또는 핵산의 양을 비교하기 위한, 본 발명의 방법의 용도에 적합하다. 표준 대조군으로서 작용하는 확립된 샘플은 합당하게 매칭된 배경, 즉 성별, 연령, 민족, 및 병력의 평균적인, 건강한 사람에게 전형적인 타액 중의 관심 있는 단백질 또는 핵산의 평균적인 양을 제공한다. 표준 대조군 값은 관심 있는 단백질 또는 핵산 및 샘플(예컨대, 전체 타액 또는 상층액)의 본질에 따라 달라질 수 있다.
본 개시 전체에서, 발명의 다양한 측면은 광범위한 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단순히 편리성 및 간결성을 위한 것임이 이해되어야 하고 발명의 범주에 대한 경직된 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기술은 그 범위 내의 개별적인 수치뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6, 등과 같은 하위범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 6 및 그 사이의 임의의 전체 및 부분적인 증분을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 질환 또는 장애, 예를 들어, 폐암을 나타내는, 적어도 하나의 생물학적 샘플, 예컨대 타액 샘플 또는 혈액 샘플로부터 단일 또는 다중 바이오마커 검출을 위한 신속하고 정확한 중합체 기반 전기화학 플랫폼 배열에 관한 것이다. 본 발명이 일반적으로 타액 샘플 또는 혈액 샘플의 테스트에 대해 기술되지만, 임의의 생물학적 유체 샘플이 사용될 수 있거나, 또는 다른 조직 유형이 그러한 대체 샘플 유형이 분석될 표적화된 마커를 운반한다면 사용될 수 있는 것이 인정되어야 한다. 그러한 마커의 비제한적인 예에는 질환 또는 장애의 모든 타액 및 혈청 기반 마커가 포함된다. 일부 구현예에서, 마커는 한정하는 것은 아니지만, 유전자 돌연변이, 예컨대 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 하나 이상의 돌연변이를 운반하는 핵산 분자를 포함한 폐암의 마커, 또는 폐암과 관련되거나 폐암을 나타내는 임의의 다른 마커이다. 예를 들어, 폐암, 또는 유전자의 검출 가능한 돌연변이를 나타내는 마커에는, 한정하는 것은 아니지만 EGFR의 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 및 c.2239_2248 del11 변이체가 포함된다. 임의의 수의 바이오마커는 제한 없이, 어레이당 1, 2, 4, 8, 16, 32 또는 64개의 바이오마커를 포함하는 검정 플랫폼에 통합될 수 있는 것이 인정되어야 한다.
대상체에서 본 발명을 통한 폐암의 비침습성 검출은 임상의가 빠르고, 경제적이며 비침습성 방식으로 폐암의 존재를 확인하는 것을 가능하게 한다.
본원에서 고려되는 것과 같이, 본 발명은 바이오마커를 검출하기 위한 다중화(multiplexing) 전기화학 센서를 포함한다. 장치는 작은 샘플 부피를 높은 정확도로 사용한다. 더불어, 다중 마커가 단일 샘플 로딩으로 장치 상에서 동시에 측정될 수 있다. 장치는 임상의 및 실험실에게 돌아가는 환자의 부담을 감소시킴으로써 건강 관리 시스템에 대한 비용을 상당히 감소시킬 수 있다.
한 구현예에서, 전기화학 센서는 전극 칩의 어레이이다(EZ Life Bio, USA). 한 구현예에서, 어레이의 각 유닛은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 가진다. 3개의 전극은 반응 전에 베어 골드(bare gold) 또는 다른 전도성 물질로 구성될 수 있어서, 표본이 작업 전극 상에 고정될 수 있다. 전기화학 전류는 작업 전극과 상대 전극 사이에서 작업 전극과 기준 전극 사이의 전위 하에서 측정될 수 있다. 전위 프로파일은 예를 들어 상수 값, 선형 스위프, 또는 순환 방형파일 수 있다. 각각의 3-전극 세트를 분리하기 위하여 플라스틱 웰의 어레이가 사용될 수 있고, 이것은 상이한 센서 사이의 교차 오염을 피하는 것을 돕는다. 한 구현예에서, 3-전극 세트는 96 웰 금 전극판의 각 웰에 있다. 전도성 중합체가 또한 작업 전극 상에 지지 필름으로서, 일부 구현예에서는 작업 전극을 기능화하기 위한 표면으로서 배치될 수 있다. 본원에서 고려되는 것과 같이, 임의의 전도성 중합체, 예컨대 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리아세틸렌, 폴리페닐렌비닐렌, 폴리티오펜 등이 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 순환 방형파 전기장이 샘플 웰 내에서 전극을 가로질러 생성된다. 특정 구현예에서, 방형파 전기장은 센서의 중합체에 하나 이상의 캡처 프로브의 혼성화를 돕기 위해 생성된다. 특정 구현예에서, 방형파 전기장은 캡처 프로브의 마커 및/또는 검출기 프로브와의 중합을 돕기 위해 생성된다. csw 전기장의 양전위는 작업 전극 위에 분자가 축적되는 것을 돕는 한편, 음전위는 약한 비특이적 결합을 제거하여 향상된 특이성을 생성한다. 추가로, 순환 방형파를 가로지르는 양전위와 음전위 사이의 플래핑(flapping)은 또한 인큐베이션 동안, 원하는 특이적 결합의 파괴 없이 우월한 혼합을 제공하고, 이것은 결합 과정을 가속화하여 더 빠른 테스트 또는 검정 시간을 초래한다. 한 구현예에서, 방형파 주기는 더 긴 저전압 기간과 더 짧은 고전압 기간으로 이루어질 수 있어서, 샘플 내에서 결합 파트너 혼성화를 향상시킨다. 선택된 실제 시간에 제한은 없지만, 예로 0.15 내지 60초의 저전압 기간 및 0.1 내지 60초의 고전압 기간을 들 수 있다. 한 구현예에서, 각각의 방형파 주기는 저전압에서 1초 및 고전압에서 1초로 이루어진다. 혼성화를 위해, 저전압은 -200 mV이고 고전압은 약 +500 mV일 수 있다. 일부 구현예에서, 방형파 주기의 총 횟수는 2-50일 수 있다. 한 구현예에서, 5 주기의 방형파가 각각의 표면 반응을 위해 적용된다. csw 전기장으로, 동일한 칩 상에서 수분 내에 중합 및 혼성화가 모두 완료된다. 일부 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 30분 미만이다. 다른 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 20분 미만이다. 다른 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 10분 미만이다. 다른 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 5분 미만이다. 다른 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 2분 미만이다. 다른 구현예에서, 샘플 로딩으로부터의 총 검출 시간은 1분 미만이다.
다중 채널 전기화학 판독기(EZ Life Bio)는 어레이 센서 상에 적용된 전기장을 제어하고 전류 측정 전류를 동시에 기록한다. 실제로, 용액은 플라스틱 웰의 어레이에 의해 정의되고 분리되는 작업, 상대, 및 기준 전극을 포함한 3-전극 영역의 전체 면적에 로딩될 수 있다. 각 단계 후에, 전기화학 센서는 초순수 물 또는 다른 세척 용액으로 세정된 후, 예컨대 순수한 N2 하에서 건조된다. 일부 구현예에서, 센서는 단일 사용, 1회용 센서이다. 다른 구현예에서, 센서는 재사용이 가능하다.
한 구현예에서, 본 발명은 도 9에서 도시된 것과 같이, 캡처 프로브와 검출기 프로브 사이의 친화성을 토대로 한다. 본원에서 고려되는 바, 검정 플랫폼은 기술분야에 숙련된 사람들에게 이해되는 것과 같이 친화성 결합 검정 또는 면역검정의 임의의 유형으로서 조직될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 단일 마커 대신, 다중 폐암 바이오마커 측정을 위한 단일 플랫폼을 포함한다. 현재, 이 목적을 위해 이용할 수 있는 그러한 기술 또는 장치는 없다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 간단하고, 신속하며 강력하다는 점에서 엄청난 효율성을 생성한다. 예를 들어, 작은 샘플 부피(예컨대, 10 μl)만이 필요하며 10분 미만의 시간이 필요하다. 다중 마커 수준은 장치에 의해 제공될 수 있다. 통계적 분석을 제공함으로써 사용자는 위험을 추정할 수 있고, 이용 가능한 네트워크 시스템을 활용함으로써, 결과는 추가 평가를 위한 임상의의 리뷰를 위해 빠르게 전송될 수 있다.
예를 들어, 돌연변이에 특이적인, 예컨대 결실 돌연변이에 대한, 또는 점 돌연변이에 대한 한 쌍의 프로브(캡처 및 검출기)가 설계될 수 있다. 한 구현예에서, 엑손 19del EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:13을 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:6을 포함하는 검출기 프로브를 포함한다. 한 구현예에서, L858R EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:14를 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:2를 포함하는 검출기 프로브를 포함한다. 한 구현예에서, T790M EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:15를 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:10을 포함하는 검출기 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 캡처 및 검출기 프로브 중 적어도 하나는 폴리A 꼬리를 포함한다. 다양한 구현예에서, 폴리A 꼬리는 프로브의 5' 또는 3' 단부에서 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개, 또는 80개 이상의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리는 적어도 65개의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드의 적어도 80%는 아데닌이며, 폴리A 서열은 비-아데닌 뉴클레오타이드에 의해 중단된다. 한 구현예에서, L858R EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:1을 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:2를 포함하는 검출기 프로브를 포함한다. 한 구현예에서, 엑손 19del EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:5를 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:6을 포함하는 검출기 프로브를 포함한다. 한 구현예에서, T790M EGFR 변이체의 검출을 위한 발명의 한 쌍의 프로브 세트는 서열 번호:9를 포함하는 캡처 프로브 및 서열 번호:10을 포함하는 검출기 프로브를 포함한다.
검출기 프로브는, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 표지로 표지될 수 있다. 한 구현예에서, 검출기 프로브는 스트렙트아비딘 결합을 허용하기 위해 비오티닐화된 뉴클레오타이드를 함유한다. 캡처 프로브는 먼저 순환 방형파 전기장을 적용함으로써 베어 골드 전극 위로 공중합된다. 예를 들어, 공중합되는 동안 각 주기에 대해, 전기장은 +350 mV로 1초 및 +950 mV에서 1초 동안으로 설정될 수 있다. 전체적으로, 중합은 10초씩의 5 주기 동안 진행될 수 있지만, 더 긴 시간이 필요할 수도 있다.
중합 후에, 센서 칩은 후속 샘플 측정을 위해 세정되고 건조될 수 있다. 샘플, 예컨대 세포 배양 배지, 혈액 샘플 또는 타액 샘플은 검출기 프로브와 혼합되어 전극 위로 전달될 수 있다. 그런 후 저 및 고 전압 주기에서, 예컨대 -200 mV에서 1초 동안 및 +500 mV에서 1초 동안 혼성화가 수행된다. 예를 들어, 총 혼성화 시간은 10초 동안 5 주기일 수 있다. 다음에, 표지는 표지 유형을 토대로 검출된다. 예를 들어, 카세인-포스페이트 완충 식염수에서 서양고추냉이 과산화효소에 콘쥬게이션된 항-플루오레세인 항체가 사용될 수 있고, 서양고추냉이 과산화효소에 대한 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질이 로딩될 수 있으며, 전류 측정 신호가 측정된다.
전도성 중합체에 내재된 또는 그렇지 않으면 작업 전극 표면을 기능화하기 위해 사용된 캡처 프로브, 및 샘플과 혼합된 검출기 프로브는 프로브 생성을 위해 기술분야에 알려져 있는 임의의 프로토콜을 따라 구성될 수 있다.
한 구현예에서, 캡처 프로브는 96 웰 금 전극판의 바닥에서 전도성 중합체 겔에 고정된다.
센서의 캡처 프로브 또는 검출기 프로브는 관심 있는 마커의 하나 이상에 특이적으로 결합하는 핵산, 단백질, 소분자, 등 중 임의의 하나일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 캡처 프로브 및 검출기 프로브는 발명의 하나 이상의 핵산 마커에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 한 구현예에서, 캡처 프로브 및 검출기 프로브는 서로 실질적으로 상보하는 영역을 포함한다. 즉, 한 구현예에서, 캡처 프로브는 검출기 프로브의 영역에 실질적으로 상보하는 영역을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계 및 제형화하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다.
한 구현예에서, 마커는 가변 영역을 포함하며, 가변 영역은 질환과 관련된 돌연변이, 예컨대 결실, 치환, 점 돌연변이 등을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 캡처 프로브는 핵산 마커의 보존된(즉 야생형 및 돌연변이체 동형에 존재하는) 영역에 혼성화하도록 설계된다. 한 구현예에서, 검출기 프로브는 마커의 질환 관련 돌연변이를 갖는 가변 영역의 핵산 서열에 혼성화하도록 설계됨으로써 샘플 중의 돌연변이를 검출할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 검출기 프로브는 야생형 또는 비-돌연변이 서열을 갖는 가변 영역의 핵산 서열에 혼성화하도록 설계됨으로써, 샘플 중의 야생형 마커의 존재를 검출할 수 있다. 한 구현예에서, 캡처 프로브는 야생형 또는 돌연변이된 가변 영역에 혼성화하도록 설계된 한편, 검출기 프로브는 보존된 영역에 혼성화하도록 설계된다.
예를 들어, 한 구현예에서, 캡처 프로브는 EGFR을 암호화하는 핵산의 보존된 영역에 실질적으로 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 검출기 프로브는 EGFR을 암호화하는 핵산의 가변 영역에 실질적으로 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 가변 영역은 EGFR의 야생형 아미노산 서열을 암호화한다. 한 구현예에서, 검출기 프로브는 EGFR을 암호화하는 핵산의 가변 영역에 실질적으로 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 가변 영역은 EGFR의 질환 관련 돌연변이체 서열을 암호화한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 검출기 프로브는 EGFR을 암호화하는 핵산의 가변 영역에 실질적으로 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 가변 영역은 EGFR의 질환 관련 결실 돌연변이체 또는 점 돌연변이를 암호화한다.
한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 L858R 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 캡처 프로브는 서열 번호: 1 또는 서열 번호:14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 L858R 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 검출기 프로브는 서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 엑손19 del 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 캡처 프로브는 서열 번호: 5 또는 서열 번호:13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 엑손19 del 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 검출기 프로브는 서열 번호: 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 T790M 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 캡처 프로브는 서열 번호: 9 또는 서열 번호:15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명이 EGFR의 T790M 돌연변이체를 암호화하는 핵산을 검출하는데 사용되는 경우, 검출기 프로브는 서열 번호: 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 검출기 프로브는 센서의 전류 변화를 유도하는 검출 가능한 표지를 포함함으로써, 검출기 프로브, 및 관련된 마커의 캡처 프로브와의 혼성화를 나타낸다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 표지 자체는 센서의 전류를 변경시키기에 충분할 수 있다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 표지는 외인성 반응물과 접촉하게 되는 경우 전류의 변화를 유도한다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 반응물과 반응하여 전류 측정 신호를 발생하기 위해 센서의 전극에 의해 감지된 국지적 변화를 발생시킨다. 그러므로, 특정 구현예에서, 반응물은 샘플이 센서에 적용되기 전에, 중에, 또는 후에 센서에 첨가된다.
특정 구현예에서, 검출 가능한 표지는 검출기 프로브에 직접 콘쥬게이션된다. 또 다른 구현예에서, 검출 가능한 표지는 중간 태그 또는 프로브의 표지를 통해 검출기 프로브에 결합된다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는 합성 중에 검출기 프로브로 통합된 비오틴을 함유하는 변형 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 한 구현예에서, 검출기 프로브는 항체 또는 위에서 기술된 검출 가능한 표지를 포함하고 있는 다른 결합 화합물에 결합하는 데 사용될 수 있는 태그, 표지, 또는 에피토프를 포함한다.
검출 가능한 표지 및 전기화학 센서에서 국지적 변화를 발생하기 위한 반응물의 예는 기술분야에 잘 알려져 있다. 한 구현예에서, 검출 가능한 표지는 HRP를 포함하고 반응물은 TMB이며, 전류 측정 신호를 생성하기 위해 반응한다. 또 다른 구현예에서, 검출 가능한 표지는 우레아제를 포함하는 한편, 반응물은 우레아를 포함한다.
한 구현예에서, 신호는 다중 라운드의 HRP를 사용하여 증폭된다. 한 구현예에서, 1) 비오틴 표지된 검출기 분자는 스트렙트아비딘 결합 HRP의 형태로 제1 라운드의 HRP와 접촉하고, 2) 복합체화된 HRP 분자는 비오틴 표지된 항-HRP 항체와 접촉되며, 3) 제2 라운드의 스트렙트아비딘 결합 HRP가 첨가되어 신호가 증폭된다. 한 예시의 구현예에서, 검출기 프로브는 카세인-포스페이트 완충 식염수와 1:100 희석으로 혼합되어 전극 위로 전달된다. 혼성화는 300 mV에서 1초 동안 및 500 mV에서 1초 동안 150 주기 동안 실온에서 수행된다. 후속해서, 스트렙트아비딘 폴리-HRP가 카세인-포스페이트 완충 식염수와 1:1000 비율로 혼합되고 전극에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션된다. HRP가 첨가된 후, 항-HRP 항체가 카세인-포스페이트 완충 식염수와 함께 첨가되고, 이어서 30분 동안 실온에서 인큐베이션되고 PBS-T 완충액으로 세척된다. 후속해서, 카세인-포스페이트 완충 식염수와 혼합된 스트렙트아비딘 폴리-HRP80 콘쥬게이트가 첨가되고 30분 동안 인큐베이션되어 이용 가능한 HRP 분자의 양이 증가된다. 이 방법은 증가된 신호 증폭을 초래하여 eLB 시스템의 증가된 민감성 및 특이성을 허용한다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 플레이트는 자동 96 웰 플레이트 세척기에서 세척되며, 여기서 기존의 액체는 미세역가 플레이트의 각 웰로부터 흡인된 후, 세척 완충액이 각 웰에 분배된다. 한 구현예에서, 세척 완충액은 그런 후 흡인되고 이것이 적어도 1회의 추가 사이클 동안 반복된다.
본 발명의 향상된 민감성으로 인해, 매우 작은 부피가 원하는 검정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 크기는 5-100 마이크로리터일 수 있다. 한 구현예에서, 샘플 크기는 약 40 마이크로리터만을 필요로 한다. 테스트될 실제 또는 최종 샘플 크기에 대한 제한은 없다.
본 발명은 또한 대상체의 폐암과 관련된 또는 폐암을 나타내는 하나 이상의 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 방법은 혼성화 검정으로서 수행될 수 있고 대상체로부터 샘플을 얻는 단계, 표적화된 폐암의 마커에 대해 지정된 검출 가능한 모이어티로 표지된 검출기 프로브를 샘플에 첨가하는 단계, 샘플을 이전에 캡처 프로브가 내재된 또는 기능화된 전도성 중합체로 코팅된 전극 칩에 적용하는 단계, 및 전극 칩의 전류를 측정하는 단계를 포함한다. 검출 가능한 모이어티가 측정되거나, 또는 샘플의 전류의 크기가 측정되어, 샘플 중의 마커의 존재 또는 부재가 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 센서 전극에 대한 마커의 혼성화는 전류 또는 음전류의 증가를 초래한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 혼성화는 약 -10 nA 내지 약 -1000 nA 범위의 전류를 초래한다.
한 구현예에서, 발명의 방법에서 사용된 액체 및 효소적 시약은 사용하지 않을 때 4℃에서 냉장된다. 한 구현예에서, 발명의 방법에 사용된 샘플 및 시약은 사용 전에 얼음에서 유지된다. 한 구현예에서, 샘플은 수집 후 30분 내에 처리된다. 본 발명은 대상체에서 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 무증상이거나 본원에 개시된 바이오마커의 검출에 의해 폐암의 비특이적 지표만을 나타내는 그런 대상체를 포함하여, 폐암이 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 이들 바이오마커는 또한 폐암의 치료 및 치료법을 받고 있는 대상체를 모니터링하고, 폐암을 가진 대상체에서 효과적일 치료법 및 치료를 선택 또는 변형시키는 데 유용하며, 여기서 그러한 치료 및 치료법의 선택 및 사용으로 폐암의 진행이 둔화되거나, 발병이 방지된다.
특정 구현예에서, 발명의 시스템 및 방법에 의해 검출된 바이오마커에는, 한정하는 것은 아니지만 핵산, 또는 EGFR, KRAS, BRAF, CCNI, FGF19, FRS2, GREB1 및 LZTS1과 관련된 것들을 포함하여 유전자의 검출 가능한 돌연변이가 포함된다. 특정 구현예에서, 핵산 바이오마커는 삽입, 결실, 치환, 전위, 점 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV), 등을 포함한 하나 이상의 질환 관련 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 기술분야에 알려져 있거나 미래에 발견될 임의의 질환 관련 바이오마커 또는 질환 관련 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 형태의 암에 존재하는 예시의 돌연변이는, 예를 들어, Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC)(Wellcome Trust Sanger Institute)에서 찾아볼 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 시스템 및 방법에 의해 검출된 바이오마커는 돌연변이체 EGFR 및 돌연변이체 EGFR을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, EGFR의 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 및 c.2239_2248 del11 변이체를 포함한, 다양한 EGFR 돌연변이체가 폐암과 관련된다.
본 발명은 캡처 프로브 및/또는 검출기 프로브가 관심 있는 돌연변이 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 혼성화하도록 구체적으로 설계될 수 있기 때문에, 임의의 그러한 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
발명은 폐암의 개선된 진단, 치료 모니터링, 재발의 검출, 및 예후를 제공한다. 폐암이 발병할 위험은 본원에 기술된 바이오마커의 하나 이상을 측정하고, 측정된 값을 참고 또는 지수 값과 비교함으로써 평가될 수 있다. 그러한 비교는 다수의 개별 바이오마커 및 기타 파라미터의 결과로부터 얻은 정보를 단일 측정 또는 지수로 결합하기 위해 수학적 알고리즘 또는 공식으로 수행될 수 있다. 폐암의 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체는 선택적으로 치료 요법, 예컨대 폐암의 개시를 예방, 치료 또는 지연시키기 위한 예방적 또는 치료적 화합물 또는 치료의 투여를 수용하도록 선택될 수 있다.
대상체가 폐암을 발병하기 전에 대상체를 확인하는 단계는 암의 발생 또는 중증도를 지연, 감소 또는 예방하기 위한 다양한 치료적 개입 또는 치료 요법의 선택 및 개시를 가능하게 한다. 특정 경우에, 적어도 하나의 바이오마커의 수준을 모니터링하는 것은 또한 폐암의 치료 과정이 모니터링되는 것을 허용한다. 예를 들어, 샘플은 폐암에 대한 치료 요법 또는 치료적 개입, 예컨대, 약물 치료, 방사선 요법, 화학요법, 등이 진행 중인 대상체로부터 제공될 수 있다. 샘플은 치료 전, 중, 또는 후의 다양한 시점에서 대상체로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 바이오마커는 그러므로 (i) 폐암을 갖지 않은 및 폐암이 발생될 것으로 예상되지 않는 대상체 및/또는 (ii) 폐암이 있거나 폐암이 발생된 것으로 예상된 대상체의 바이오마커 프로파일 또는 시그니처를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 대상체의 바이오마커 프로파일은 폐암이 발병할 위험이 있는 대상체를 진단 또는 확인하기 위하여, 질환의 진행, 뿐만 아니라 질환의 진행 속도를 모니터링하기 위하여, 그리고 폐암 치료의 유효성을 모니터링하기 위하여 미리 결정된 또는 참조 바이오마커 프로파일과 비교될 수 있다. 본 발명의 바이오마커에 관련된 데이터는 또한 한정하는 것은 아니지만 이미징 데이터, 병력, 흡연 상태 및 임의의 관련된 가족력을 포함한 폐암에 대한 다른 데이터 또는 테스트 결과와 조합되거나 연관지어질 수 있다.
본 발명은 또한 특정 대상체에 적절한 또는 그렇지 않으면 맞추어진 폐암 치료를 위한 작용제를 확인하는 방법을 제공한다. 이런 관점에서, 치료제, 치료 약물, 또는 다른 치료 요법에 노출된 대상체로부터의 테스트 샘플이 채취될 수 있고 하나 이상의 바이오마커의 수준이 측정될 수 있다. 하나 이상의 바이오마커의 수준은 치료 전후의 대상체로부터 유래된 샘플과 비교되거나, 또는 그러한 치료 또는 노출의 결과로서 위험 인자에서 개선을 보인 한 명 이상의 대상체로부터 유래된 샘플과 비교될 수 있다.
한 구현예에서, 발명은 폐암의 진단 방법이다. 한 구현예에서, 방법은 폐암의 단계 또는 중증도를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 샘플 중의 발명의 하나 이상의 마커의 검출을 위해 적어도 하나의 생물학적 샘플(예컨대 소변, 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 양수, 또는 눈물)을 활용할 수 있다. 빈번하게 샘플은 환자로부터 유래된 샘플인 "임상 샘플"이다. 한 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상체의 혈액 샘플로부터 유래된 혈청 샘플 또는 혈장 샘플이다.
일부 구현예에서, 샘플은 적어도 하나의 초소형 단일 가닥 DNA 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 샘플은 적어도 하나의 순환 종양 DNA(ctDNA) 분자를 포함한다. 한 구현예에서, ctDNA는 암과 관련된 바이오마커를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 대상체의 적어도 하나의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 대상체의 생물학적 샘플 중의 발명의 마커의 하나 이상의 수준은 비교기의 상응하는 바이오마커의 수준과 비교된다. 비교기의 비제한적인 예에는, 한정하는 것은 아니지만, 음성 대조군, 양성 대조군, 대상체의 예상된 정상 배경 값, 대상체의 과거 정상 배경 값, 대상체가 구성원인 집단의 예상된 정상 배경 값, 또는 대상체가 구성원인 집단의 과거 정상 배경 값이 포함된다.
한 구현예에서, 방법은 대상체의 둘 이상의 상이한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커를 동시에 검출하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 대상체의 타액 샘플 및 대상체의 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서 하나 이상의 마커를 동시에 검출하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 대상체의 둘 이상의 상이한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커를 순차적으로 검출하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 대상체의 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서 하나 이상의 마커를 검출하기 전에 또는 후속해서 대상체의 타액 샘플에서 하나 이상의 마커를 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 대상체의 각각의 생물학적 샘플에서 발명의 마커의 하나 이상의 수준은 적절한 비교기에서 상응하는 바이오마커의 수준과 비교된다. 한 구현예에서, 대상체는 둘 이상의 생물학적 샘플의 각각에서 바이오마커의 수준이 적절한 비교기와 관련하여 증가되거나 감소된 때 질환 또는 장애를 가졌거나 발병의 위험이 있는 것으로 진단된다. 예를 들어, 한 구현예에서, 대상체는 1) 폐암과 관련된 돌연변이를 함유한 적어도 하나의 DNA 분자의 수준이 건강한 대상체 또는 건강한 집단의 타액 중의 바이오마커의 예상된 정상 배경 값에 비교하여 대상체의 타액 샘플에서 증가된 때, 그리고 2) 폐암과 관련된 돌연변이를 함유한 적어도 하나의 DNA 분자의 수준이 건강한 대상체 또는 건강한 집단의 혈청 중의 바이오마커의 예상된 정상 배경 값에 비교하여 대상체의 혈장 샘플에서 증가된 때 폐암을 가졌거나 발병의 위험이 있는 것으로 진단된다.
또 다른 구현예에서, 발명은 대상체의 적어도 하나의 생물학적 샘플에서 발명의 마커의 하나 이상의 수준을 평가함으로써 대상체에서 폐암의 진행을 모니터링하는 방법이다.
다양한 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이고, 임의의 인종, 성별 및 연령일 수 있다.
본원에 기술된 발명의 방법으로부터 얻어진 정보는 단독으로, 또는 대상체로부터 또는 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터의 다른 정보(예컨대, 질환 상태, 질환 이력, 바이탈 사인, 혈액 화학, 등)와 조합되어 사용될 수 있다.
발명의 방법의 다른 다양한 구현예에서, 발명의 하나 이상의 마커의 수준은 발명의 마커의 하나 이상의 수준이 비교기 대조군과 비교할 때 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 또는 적어도 100% 만큼 증가되는 경우 증가된 것으로 측정된다.
발명의 방법에서, 대상체로부터의 적어도 하나의 생물학적 샘플은 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 발명의 마커의 하나 이상의 수준에 대해 평가된다. 생물학적 샘플 중의 발명의 마커의 하나 이상의 수준은 생물학적 샘플 중의 발명의 바이오마커의 하나 이상의 폴리펩타이드의 양, 생물학적 샘플 중의 발명의 바이오마커의 하나 이상의 mRNA의 양, 생물학적 샘플 중의 발명의 바이오마커의 하나 이상의 DNA의 양, 생물학적 샘플 중의 발명의 바이오마커의 하나 이상의 효소 활성의 양, 또는 이것들의 조합을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본 발명은 전기화학 센서 어레이 및 본 발명의 검정의 설정, 성능, 모니터링, 및 해석에 대한 지침을 포함한 검정 키트를 추가로 포함한다. 선택적으로, 키트는 바이오마커의 적어도 하나의 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 센서 판독기를 선택적으로 포함할 수 있다.
실험예
발명은 다음의 실험예를 참조로 상세하게 한층 더 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그러므로, 발명은 어떤 방식으로든 다음의 실시예에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려, 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변동을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 선행 설명과 다음의 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 그러므로 다음의 작업 실시예는 본 발명의 예시의 구현예를 구체적으로 지적하며, 어떠한 방식으로든 개시의 나머지를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 폐암 환자에서 비침습성 EGFR 유전자 돌연변이 검출
현재 2가지의 대중적인 액체 생검 플랫폼, 차세대 서열분석 기반(NGS) 및 액적 디지털 PCR(ddPCR) 기반의 플랫폼이 있다(Zhang et al., 2017, J Hematol Oncol, 10:167; Olmedillas-Lopez et al., 2017, Mol Diagn Ther, 21:493-510). 이들 플랫폼은 둘 다 분석을 수행하기 위해 10 - 20 mL의 혈액을 필요로 한다. 이 보고는 액체 생검의 목적에 대해, 본원에서 eLB로 언급되는, 신규한, 플레이트 기반, 전기화학적 신호 증폭 방법을 사용하여 4개의 별도의 검정의 기술적 검증을 기술한다. 초기에 보고된 데이터는 eLB가 초기 단기 폐암 환자에서 순환 EGFR 변이체 DNA를 검출할 수 있는 것을 입증하였다. 이것은 1기 및 2기 NSCLC 환자에서 이 수준의 차별이 가능한 유일한 플랫폼이다. eLB는 각 변이체에 대해 20 μL의 혈장만을 사용하여 수행된다. 이것은 NGS나 ddPCR 기반 액체 생검에 대해 필요한 것보다 100배 이상 더 적은 샘플이다.
eLB를 미처리, 미정제 혈장 또는 타액에 대해 수행한다. ddPCR 및 NGS는 둘 다 검정 전에 DNA 분리 단계를 필요로 한다. 대부분의 순환 종양 DNA 단편은 DNA 분리 과정 또는 후속 조작 중에 소실될 가능성이 있다. NGS는 단계 사이에 여러 효소적 처치 및 정제를 필요로 하며 DNA의 작은 단편은 이들 절차적인 단계 중에 소실될 가능성이 있다. 더불어, 라이브러리 형성 전 효소적 단계는 100% 효율적이지 않아서 물질이 불완전한 반응으로 인해 각 단계에서 소실된다.
일반적인 가정은 ctDNA 단편이 비침습적 산전 선별 과정에서 모체 순환계에서 순환하는 것으로 밝혀진 태아 서열과 크기가 비슷하다는 것이다. 이들 150 bp 이중 가닥 단편은 세포자멸성 DNA의 뉴클레오좀 보호의 결과이다. ctDNA가 규칙적인 세포자멸사로부터 발생하지 않는 것이 가능하거나, 심지어 그럴 가능성이 있다. 실제로, 대부분의 암세포는 세포자멸성 DNA 단편을 초래하는 프로그래밍된 세포 사멸이 결여되어 있다. 모체 순환계에서의 태아 DNA와 달리, ctDNA는 혈액 공급의 이상 성장 또는 면역 용해로부터 괴사의 결과일 가능성이 더 크다. 이것은 더 작은 단편 및 잠재적으로 단일 가닥 DNA 단편을 초래할 가능성이 있다.
실제로, 초기 단계 암에서 실행 가능한 돌연변이를 함유한 ctDNA는 야생형 DNA 및 진행성 암에 존재하는 ctDNA 두 가지보다 크기가 더 작다는 증거가 있다(Liu et al., 2019, EBioMedicine, 41:345-56). 이 보고는 초기 단계 췌장암 환자로부터의 ctDNA가 100 bp보다 상당히 작은 단편 크기를 가진 것을 입증하였다. 이 연구는 단일 가닥 DNA 서열분석 전략을 사용하여서 관찰된 초소형 ctDNA 단편이 100 염기쌍보다 작았을뿐만 아니라, 또한 단일 가닥이었던 것이 가능한다. 단일 가닥 서열분석을 사용하는 다른 연구는 또한 ctDNA가 다른 기원으로부터의 순환 DNA의 크기보다 더 작은 것을 입증하였다(Burnham et al., 2016, Sci Rep, 2016, 6:27859; Underhill et al., 2016, PLOS Genet, 12:e1006162). 본 발명자들의 실험실에서의 예비 작업은 NSCLC 환자에서 검출된 돌연변이 ctDNA 서열이 실제로 35 - 44 bp 길이인 것을 나타낸다. ddPCR과 같은 다른 양식은 이런 작은 단편을 검출할 수 없다. eLB 플랫폼의 특유의 특성은 그것의 바람직한 주형이 초소형 단일 가닥 DNA여서 eLB가 다른 공급원으로부터의 순환 DNA를 무시하면서 우선적으로 ctDNA를 검출하는 것을 허용한다는 것이다.
또 다른 가능성은 eLB가 엑소좀 DNA를 측정하고 있다는 것이다. Fernando 및 동료들(Fernando et al.,2018, Clin Chim Acta, 483:39-47)은 대부분의 엑소좀 DNA가 대략 76 bp 길이인 것을 보고한다. eLB에 의해 분석된 단편의 기원 및 본질을 설명하기 위한 추가 작업이 필요할 것이다.
다른 기술보다 나은 eLB의 또 다른 장점은 비가닥 샘플 유형을 사용하는 능력이다. 이 보고에서 타액에 대한 정성적 및 정량적 eLB 검정 둘 다 검증될 수 있었다. 소변, 흉막 및 뇌척수액과 같은 다른 샘플 유형이 eLB 분석에 잘 맞을 수 있는 가능성이 있다.
EFIRM 방법론은 플레이트 기반이며 전체 검정은 4시간 내에 직접 실행하는 시간이 거의 없이 쉽게 수행될 수 있다. 그러므로, 총 처리 시간은 종종 완료하는 데 며칠이 걸리며 보고하는 데 10-14일이 걸리는 NGS 기반 방법보다 훨씬 우수하며 ddPCR 검정보다 더 신속하다.
eLB의 마지막 장점은 비용이다. eLB는 수백 달러로 수행될 수 있고, 따라서, 치료 반응, 재발의 조기 검출, 또는 최소 잔여 질환 평가를 위한 연속 모니터링에 사용될 수 있다. 만약 민감성 및 특이성이 충분하다면, eLB는 또한 CT 스캔시 불확실한 폐 결절이 있는 흡연자 또는 개체를 선별하는 데 사용될 수 있다. 현재 선별 테스트로서 eLB에 대한 민감성은 NSCLC 환자 중에서 3개의 변이체의 유병률에 의해 제한된다. 비록 빈도는 중국에서 40%로 높지만(Zhang et al., 2016, Oncotarget, 7:78985-93), 이들 3가지 돌연변이 중 하나를 포함한 NSCLC 종양의 분율은 미국에서 더 낮다. EGFR 돌연변이의 발생률은 2.7%이며 Forbes SA 등에 따르면 실제 발생률은 3.6%를 초과하지 않는다는 확신이 있다(Curr. Protoc. Hum. Genet., Hoboken, NJ, USA, John Wiley & Sons, Inc., 2008, p. hg1011s57). 선암종의 경우, 전체적인 빈도는 23%이다. 남성의 경우 19%이고 여성의 경우 28%이다. 흡연자의 경우 전체적으로 47%이며 비흡연자의 경우는 14%이다(Midha et al., 2015, Am J Cancer Res, 2015, 5:2892-911).
검출의 민감성을 증가시키기 위하여, NSCLC 환자의 50%로 검출 속도를 증가시키는 추가 변이체가 eLB에 첨가된다. 요약하면, 이 보고는 4가지 eLB 검정의 기술적 검증: 혈장 및 타액에 대한 정성적 및 정량적 검정을 보여준다. 플랫폼은 안정적이며 임상 실험실에 적합하다. 검정은 p.T790M의 경우 0.1% 및 엑손19del 및 p.L858R의 경우 1%의 작은 대립유전자 분율 검출을 가진다. 이들 특이성은 이들 EGFR 변이체에 대해 시험관내 진단을 승인한 유일한 FDA에 의해 보고된 것보다 훨씬 낫다.
실험에 사용된 물질 및 방법을 이제 기술한다.
eLB 검정
eLB 검정은 96개의 금 전극의 미세역가 플레이트 및 EFIRM(전기장 유도 방출 및 측정) 전기화학 판독기 장치(EZLife Bio)를 토대로 한 개방 플랫폼 신호 증폭 기술이다. 3개의 TKI-민감화 EGFR 변이체, 엑손 19del, p.L858R 및 p.T790M을 eLB 검정을 사용하여 검증하였다. 간단히 기술하며, 검정은 96 웰 금 전극 플레이트의 바닥에서 전도성 중합체 겔에 고정된 변이체 특이적 캡처 프로브를 사용한다. 샘플(타액 또는 혈장)을 선행 DNA 분리 또는 다른 조작 없이 혼성화 완충액에 직접 첨가한다. 그런 후 샘플 - 혼성화 혼합물을 웰에 직접 첨가하고 특이적 혼성화를 용이하게 하기 위해 교류를 실온에서 적용한다. 그런 후 플레이트를 집중적으로 세척하여 미결합 단편을 제거한다. 후속해서, 혼성화 완충액 중의 비오티닐화된 검출기 프로브를 웰에 첨가하고 전기적으로 촉진된 혼성화를 수행한다. 3개의 TKI-민감성 돌연변이에 특이적인 합성된(Integrated DNA Technologies) 프로브 쌍(캡처 및 검출기)을 표 1에 열거한다.
3개의 EGFR 변이체에 대한 캡처 및 검출기 프로브를 아래에 열거한다. *는 3' 뉴클레오타이드의 비오티닐화를 나타낸다.
L858R 캡처 프로브(서열 번호:1)
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAAGTTTGACCCGCCCA
L858R 검출기 프로브(15 염기쌍 캡처 프로브의 경우)(서열 번호:2)
AAAATCTGTGATCTTGACATGCTGCGGTGTTTTGTGCAG*
대조군 / 교정기 올리고 L858R 야생형(서열 번호:3)
CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTG
대조군 / 교정기 올리고 L858R 돌연변이체(서열 번호:4)
CTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTG
엑손19 del 캡처 프로브(서열 번호:5)
AAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAACATGTTGCTTCCTTG
엑손19 del 검출기 프로브(서열 번호:6)
ATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCT*
대조군 / 교정기 올리고 엑손19 돌연변이 Del(서열 번호:7)
AGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAA
대조군 / 교정기 올리고 엑손19 del 야생형(서열 번호:8)
AGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCA
T790M 캡처 프로브(서열 번호:9)
AAAAAAAAAAGAAATAAACAAATAAAACAATAACAAATAAAAAAAAACAAATAAACAATAAAAAAAAACAAGAGCGGCATGATGA
T790M 검출기 프로브(서열 번호:10)
GCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGC*
대조군 / 교정기 올리고 T790M(서열 번호:11)
GCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCC
대조군 / 교정기 올리고 T790M 야생형 서열(서열 번호:12)
GCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCC
캡처 프로브(100 nM)를 먼저 순환 방형파 전기장을 350 mV에서 1초 동안 그리고 1100 mV에서 1초 동안 적용함으로써 피롤(W336805, Sigma-Aldrich)과 베어 골드 전극 위로 공중합하였다. 전체적으로, 중합을 각각 2초씩 4 주기 동안 진행하였다.
돌연변이체 대립유전자에 상응하는 합성 50 bp 올리고뉴클레오타이드(Integrated DNA Technologies)를 20 μl - 40 μl 부피의 대조군 혈장 및 타액(각각의 EGFR 돌연변이를 포함하지 않은 개체로부터의 환자 샘플)에 첨가하였다. 합성 올리고뉴클레오타이드 및 혈장 또는 타액을 Ultrahyb-올리고 혼성화 완충액(ThermoFisher)에 1:2 비율로 희석하였다. 결과적으로 희석된 완충액을 중복 웰에 첨가하였다.
혼성화를 300 mV에서 1초 동안 그리고 500 mV에서 1초 동안 각각 2초씩의 총 150 주기 동안 수행하고 이어서 eLB 기기에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 제거하고 자동 96 웰 플레이트 세척기(Biotek, Model 405LSR, Winooski, VT)에서 세척하는데, 세척기에서 처음에 기존 액체는 미세역가 플레이트의 각 웰로부터 흡인되고, 그런 후, 500 μL의 완충액(0.5% SDS를 포함한 2x SSC)이 각 웰로 분배된다. 세척 완충액을 흡인하고 이것을 총 2 주기 동안 반복한다.
세척 후, 검출기 프로브를 카세인-포스페이트 완충 식염수(Invitrogen)와 1:100 희석률로 혼합하고 전극 위로 옮겼다. 혼성화를 300 mV에서 1초 동안 그리고 500 mV에서 1초 동안 총 150 주기 동안 실온에서 수행하였다. 후속해서, 스트렙트아비딘 폴리 HRP(ThermoFisher)를 카세인-포스페이트 완충 식염수(Invitrogen)와 1:1000 비율로 혼합하고 30분 동안 실온에서 전극에서 인큐베이션하였다.
HRP의 첨가 후, 카세인-포스페이트 완충 식염수(Invitrogen)와 함께 1/60 μg/mL 농도의 항-HRP 항체(ab195239, Abcam)를 첨가하고 이어서 실온에서 30분 인큐베이션하고 PBS-T 완충액으로 세척하였다. 후속해서, 카세인-포스페이트 완충 식염수 (Invitrogen)와 975:25 비율로 혼합된 스트렙트아비딘 폴리-HRP80 콘쥬게이트(Fitzgerald Industries)를 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하여 이용 가능한 HRP 분자의 양을 증가시켰다. 이 과정 후에, 증폭된 신호를 금 전극을 통한 전류 생성에 의해 나노 암페어로 측정하였다. 전기화학적 측정을 위해 사용된 EFIRM® 판독기(EZLife Bio)는 기기의 기술적 용량 범위 내에 있도록 피코 암페어 범위로 전류를 검출할 수 있다.
eLB EGFR 검정을 위한 캡처 및 검출 올리고뉴클레오타이드.
변이체 캡처 프로브
엑손 19del 5' - TGTTGCTTCCTTG - 3' (서열 번호:13)
p.L858R 5' - GTTTGACCCGCCCA - 3' (서열 번호:14)
p.T790M 5' - GAGCGGCATGATGA - 3' (서열 번호:15)
검출기 프로브*
엑손 19del 5' - ATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCT - 3'* (서열 번호:6)
p.L858R 5' - AAAATCTGTGATCTTGACATGCTGCGGTGTTTTGTGCAG - 3'* (서열 번호:2)
p.T790M 5' - GCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGC - 3' * (서열 번호:10)
*검출기 프로브는 말단 3' 클레오타이드에서 비오틴 표지된다.
RNase 처리 방법
RNase 처리를 카세인/PBS 중의 RNase 칵테일(0.025U/μl의 RNase A 및 1 U/μl의 T1 RNase)을 첨가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 수행하였다. 세척을 2x SSC 0.5% SDS 세척 완충액을 사용하여 수행하였다. 이 처리를 eLB 프로토콜의 샘플 캡처 단계 후에 수행하였다.
DNase 처리 방법
DNase 처리를 DNA의 가닥성(strandedness)을 평가하기 위하여 수행하였다. 먼저, 단백 분해효소 K를 첨가하여 혈장 샘플 중의 2 μg/μl의 농도를 달성하였다. 그런 후 샘플을 30분 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 이 소화 후에, 단백 분해효소 K를 65℃로 10분 동안 가열하여 효소를 탈활성화한 다음 용액을 4℃로 1시간 동안 열 순환기에서 냉각시켰다(0.1℃/초의 냉각 속도 사용). 간섭 단백질을 제거하기 위한 이런 초기 단백 분해효소 K 소화 후에, 엑소뉴클레아제 VII을 0.33 unit/μl의 농도로 도입하여 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제를 계속해서 95℃에서 10분 동안 열처리한 후 4℃로 1시간 동안 냉각시킴으로써(0.1℃/초의 램프 속도로) 탈활성화하여 샘플에 존재하는 이중 가닥 DNA를 재어닐링하였다. 그런 후 최종 용액을 위에서 기술된 EFIRM 프로토콜로 검정하였다.
세포주
점 돌연변이 p.L858R 및 p.T790M에 대한 게놈 DNA 참조 가닥을 생성하기 위하여, 게놈 DNA를 NCI-H1975 세포주(ATCC)로부터의 QuickgDNA 미니프렙(miniprep)(Zymo Research)을 사용하여 분리하였다. 엑손19del　테스트의 경우,　엑손19del 돌연변이(COSM6623/6225/12370/12382)의 상위 4개의 변이체를 포함하고 있는 4개의 상이한 세포주로부터의 게놈 DNA를 획득하였다(Applied Stem Cell).
소프트웨어
다중채널 EFIRM 전기화학적 판독기 장치 하드웨어는 USB 2.0 연결을 통해 제어되며 파라미터는 EZLife Bio(Los Angeles, CA)에 의해 사내 맞춤형 소프트웨어에 의해 설정된다. 각각의 EFIRM 실험으로부터의 데이터를 쉼표로 분리된 값 파일 포맷으로 내보내고 통계 분석을 위해 R-Language를 사용하여 분석하였다.
생물학적 샘플
타액을 2006년에서 2011년 사이에 미국 치과 협회 회의에서 건강한 개인 지원자로부터 수집하였다. 18세에서 80세 사이의 대부분 비흡연자인 남성/여성, 인종이 혼합되어 있었다. 모든 대상체는 수집 전 서면 동의를 받았다. 각각의 대상체는 얼음 위에 놓인 50 cc 원추형 튜브에 약 5 mL의 전체 타액을 뱉어냈다. 전체 타액을 수집 후 30분 내에 처리하였다. 샘플을 4℃로 설정된 냉장 원심분리기에서 2600 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 그런 후 상층액(세포 없는 타액)을 2개의 2 mL 저온튜브에 피펫팅하고 다음의 시약을 첨가하여 RNA 및 DNA를 보존하였다: 1.1 μL Superase-In/1mL 상층액(Ambion, Austin TX). 추가 시약을 첨가한 후, 각각의 튜브를 뒤집어 혼합하였다. 그런 후 샘플을 드라이 아이스 상에서 냉동시키고 나중에 보관을 위해 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
실험 결과를 이제 기술한다.
DNA 또는 RNA?
EFIRM 기술은 DNA 또는 RNA 분자의 어느 하나를 검출할 수 있다. NSCLC 환자로부터의 임상 샘플에서 검출된 EGFR 변이체가 순환 DNA 또는 RNA에 대해 유래된 것인지의 여부를 조사하였다. 이것을 조사하기 위하여, RNase 처리 방법을 위에서 기술한 것과 같이 개발하였다. 마이크로RNA 종 mir415a에 대한 eLB 검정을 소화의 완료에 대한 대조군으로서 사용하였다. 대조군 실험에서, 합성 mir415a를 정상 혈장에 첨가하고 RNase 처리 전과 후에 모두 eLB 분석을 수행하였다. 이 결과를 도 1A에 도시한다. 좌측 패널은 mi415a의 스파이크 인이 없는 것이고 우측 패널은 mi415a가 첨가된 것이다. 도 1A의 두 패널에서 모두 적색은 RNase 처리가 없는 eLB 신호를 나타내며 청색은 RNase 처리 후의 것이다. 도 1A의 우측 패널에서 분명하게 볼 수 있는 것과 같이, RNase 처리는 마이크로RNA에 대한 eLB 반응으로부터 신호를 완전히 제거하여 RNase 소화가 완료된 것을 확인시켜준다.
도 1B의 좌측 패널은 EGFR의 엑손19del 변이체에 대해 분석된 치료전 및 후 정상 혈장 샘플을 나타낸다. 우측 패널은 종양이 엑손 19del에 대해 양성이고 eLB 결과가 또한 양성인 진행성 NSCLC 질환을 사용한 이전에 공개된 연구로부터의 NSCLC 환자로부터의 혈장을 보여준다(Pu et al., 2016, Thorac Cancer, 7:428-436). RNase 처리 후 신호에 10%의 감소만이 있는데 이것은 eLB 검정에서 측정된 순환 핵산이 주로 DNA이고 RNA가 아닌 것을 나타낸다.
단일 가닥 대비 이중 가닥 DNA
다음으로, EFIRM에 의해 측정된 분자가 단일 가닥 DNA인지 이중 가닥 DNA인지를 조사하였다. 이들 실험을 위해 단일 가닥 특이적 뉴클레아제 엑소뉴클레아제 VII을 사용한 효소적 처리를 사용하였다. 도 2는 3개의 대조군 실험 및 임상 샘플의 분석으로부터의 데이터를 함유한다. 도 2A는 건강한 대조군으로부터의 혈장을 도시하며, 미처리 및 엑소뉴클레아제 VII 소화된 샘플 모두에서 배경 신호만을 나타낸다. 도 2B는 dsDNA 함유 변이체가 혈장으로 스파이크되었을 때, 엑소뉴클레아제 VII 소화 후 신호가 감소하지 않은 것을 나타낸다. 예상과 같이, 합성 ssDNA를 첨가한 경우, 엑소뉴클레아제 VII 소화는 eLB 신호의 상당한 감소를 초래한다(도 2C). 도 2D는 선행 조직 및 eLB 결과가 p.T790M EGFR 변이체를 입증한 진행성 NSCLC 환자로부터의 혈장 샘플을 나타낸다. 엑소뉴클레아제 VII 처리는 도 2C에서 도시된 실험에서 ssDNA 스파이크에서 관찰된 감소와 유사한 eLB 신호의 극적인 감소를 초래하였다. 이들 데이터는 함께 eLB가 주로 단일 가닥 DNA 표적을 측정하는 것임을 입증한다.
3개의 EGFR 변이체에 대한 정성적 eLB 검정의 기술적 검증
eLB에 대한 한 가지 용도는 흡연 이력이 있는 무증상 개체에서, 또는 선별 방사선 검사에 의해 관찰된 불확실한 결절이 있는 개체에서 악성에 대한 스크리닝이다. 이 목적에 대해, '양성" 또는 "음성" 결과로 충분하다. 이 목적에 대해, 정성적 eLB의 기술적 검증을 혈장 및 타액 둘 다에 대해 수행하였다.
엑손19del은 단일 변이체가 아니지만, 엑손 19의 길이가 약간 다른 밀접하게 관련된 변이체의 패밀리이다. eLB의 본질로 인해, 모든 엑손19del 변이체는 아니지만, 대부분을 검출하는 캡처 프로브 - 신호 프로브 조합을 설계하는 것이 가능하였다. 단일 캡처 프로브 - 검출기 프로브 쌍이 4개의 가장 흔한 엑손19del 변이체를 검출할 수 있는 것을 입증하는 데이터를 아래에 제시한다. 이 문제에 대한 추가의 논의는 정량적 검정 설명에서 찾아볼 수 있다.
혈장 정성 검정
정성 검정의 검증을 위해, 혈장을 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 100명의 건강한 개인으로부터 구입하였다. 이들 샘플을 3개의 EGFR 변이체, 엑손19del, p.L858R, 및 p.T790M에 대해 eLB 기술에서 이중으로 작업하였다. 그 결과를 도 3에 도시한다. 나노암페어(nA)의 전류를 Y 축에 도표화한다. 샘플은 각 플레이트에서 두 개의 주형 없는 대조군(NTC)의 평균 nA를 뺌으로써 표준화한 nA를 가진 건강한 혈장 샘플이다. 표준 2 SD 참조 범위를 점선으로서 도표화한다. 실선은 검정 성능을 확인하기 위해 각 플레이트에 첨가된 대조군 올리고뉴클레오타이드이다. 검정 성능을 정성적 검정에 적절하다. 확립된 참조 범위는 각 변이체에 따라 약간 달라진다. 혈장 정성 검정을 위해, 엑손19del, p.L858R, 및 p.T790M에 대한 컷오프 값을 각각 표 2에 제시한다. 참조 범위를 영향을 받지 않은 대조군의 3 SD 아래로 설정하였다. 도 3에서 알 수 있는 것과 같이, 내부 표준은 각 변이체에 대해 컷오프 값보다 훨씬 위에 있다.
검정내 및 검정간 가변성 두 실험을 모두 위에서 기술한 유도된 참조 범위를 사용하여 정성 검정에 대해 수행하였다. 검정간 가변성의 경우 음성 및 양성 샘플을 단일 플레이트에서 여러번 실행시켰다. 각 샘플을 적어도 8회 검정하였다(3개 돌연변이 각각에 대해 돌연변이 음성 대조군의 8개 복제물 및 돌연변이 양성 대조군의 12개 복제물을 테스트함). 모든 음성 샘플이 컷오프보다 작고 모든 양성 샘플이 컷오프 위에 있는 불일치는 없었다.
검정내 가변성의 경우,　돌연변이 음성 대조군 및 돌연변이　양성 대조군(생체액에 스파이크된 12 pM 올리고뉴클레오타이드)을 2명의 상이한　작동자에 의해 3개의 상이한 플레이트에서 실행시켰다(각 플레이트는 돌연변이 음성 대조군의 8개 복제물 및 돌연변이 양성 대조군의 12개 복제물을 가짐). 다시 한 번, 검정내 가변성과 검정간 가변성이 모두 0이 되는 불일치 결과는 없었다.
정성적 EGFR 검정에 대한 참조 범위 연구의 결과
매트릭스 변이체 중앙값 평균 전류(nA) SD 2 SD 3 SD 참조 범위(3SD)
혈장 T790M -6.43771 -5.96 16.18 32.37 48.55 <43 nA
혈장 L858R -25.84727 -22.79 14.07 28.14 42.21 <20 nA
혈장 엑손19 -34.24165 -28.05 15.90 31.79 47.69 <20 nA
타액 T790M 10.49715 8.82 11.58 23.16 34.75 <44 nA
타액 L858R -0.5126045 -1.13 10.56 21.13 31.69 <31 nA
타액 엑손19 -3.927202 -4.46 12.08 24.16 36.24 <32 nA
타액에 대한 정성 eLB 검정의 검증
도 4는 미국 치과 협회의 연례 회의에서 서면 동의를 받은 건강한 치과의사로부터 얻어진 타액 샘플을 사용하는 동일 실험을 나타낸다. 플레이트 설계 및 검증 설계는 혈장 검증의 것과 동일하였다. 검정 성능을 혈장 검정과 유사하다. 검정내 및 검정간 가변성은 또한 양성 또는 음성 결과에 대해 일치하는 모든 복제물로 0이었다. 혈장과 마찬가지로, 참조 범위는 각 변이체에 따라 약간 달라진다. 표 2는 6개의 검정, 즉 3개의 EGFR 및 엑손19del, p.L858R, 및 p.T790M에 대한 혈장 및 타액에 대한 참조 범위 측정을 요약한 것이다. 비록 각 검정에 대한 참조 범위에 작은 변동이 있지만, 양성 임상 샘플은 이들 컷오프 값보다 훨씬 위에 있다. 내부 양성 대조군은 모든 변이체에 대한 3 SD 컷오프보다 훨씬 위에 있다.
임의의 잠재적인 스크리닝 테스트와 같이, 참조 범위는 임상 성능에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다. 다른 기법보다 나은 eLB의 한 가지 장점은 동일한 환자로부터의 타액 및 혈장을 둘 다 분석하는 능력이다. 두 테스트는 각 환자에 대해 동시에 수행될 수 있고 혈액 및 타액 둘 다에 대한 양성 결과를 가진 환자를 양성으로 선별할 수 있는 것으로 간주된다. 하나의 양성 및 하나의 음성 테스트를 가진 개체의 경우, 불일치를 해소하기 위해 반복 샘플을 얻어 분석한다.
eLB 정성 검정에 대한 임상 민감성 및 특이성
임의의 검정의 유용성을 테스트에 대한 민감성/특이성 및 양성 및 음성 예측 값에 의해 측정한다. eLB 플랫폼의 경우, NSCLC 환자에서 EGFR 변이체의 검출을 위한 이들 파라미터에 대해 제한된 데이터가 있다. 말기(III 및 IV) NSCLC 환자를 포함한 2가지 공개 연구에서, 데이터(Wei et al., 2014, Am J Respir Crit Care Med, 190:1117-1126; Pu et al., 2016, Thorac Cancer, 7:428-436)는 정성 eLB 검정이 각각의 종양에 p.L858R 변이체를 가진 전부 23명의 환자 및 엑손 19del 변이체를 가진 모든 15명의 환자를 검출했음을 보여준다. 종양에 이들 변이체를 함유하지 않은 28명의 NSCLC 환자에서는 위양성이 없었다. 그러므로, 정성 eLB는 이들 말기 NSCLC 환자에서 높은 민감성 및 특이성으로 치료 선택을 위해 사용된다.
초기(I 및 II) NSCLC 환자에서 혈장 정성 eLB의 성능의 연구는 p.L858R에 대해 92% 및 엑손 19del에 대해 77%의 민감성을 보였다. 특이성은 양성 폐 결절이 있는 환자의 대조군 그룹에서 두 변이체에 대해 95%였다. 참고로, 조직 변이체 분석과 eLB 결절 생검 사이의 일치율은 100%였다. 이들 연구에서 불일치 결과는 없었다.
eLB 정량 검정
정량적 eLB의 평가는 2 부분으로 행해졌다. 초기에 검출 한계 및 선형성 및 선형 범위는 게놈 DNA 대조군을 사용하여 확립하였다. 그러나, 생물학적 물질은 검정에 대한 내부 교정기로서 사용하기에는 최적이 아니다. 그러므로, 게놈 DNA를 사용하는 검출 한계, 선형성 및 선형 범위의 확립 후에, 임상 검정의 개발을 내부 표준 및 교정기로서 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다.
EGFR 엑손 19del
EGFR의 엑손 19del 변이체는 실제로 밀접하게 관련된 변이체의 패밀리이다. 표 2는 이 패밀리에서 5개의 가장 우세한 변이체를 열거한다. 이들 결실의 중단점이 서로 근접하기 때문에, 변이체의 엑손 19del 패밀리의 전부는 아니지만, 대부분을 검출할 수 있는 캡처/검출기 프로브 세트를 이론적으로 설정하는 것이 가능하였다(표 3). eLB 검정이 4개의 가장 흔한 엑손 19del 변이체를 검출할 수 있음을 입증하기 위하여, 각각 공통 변이체 중 하나를 함유하는 DNA를 4개 세포주로부터 얻었다. 게놈 DNA를 처리하고 다양한 농도로 eLB 반응에 배치하였다.
도 5는 4개의 가장 흔한 EGFR 19del 변이체를 함유하는 게놈 DNA의 연속 희석을 사용하여 얻어진 결과를 도시한다. 알 수 있는 것과 같이, EGFR 검정은 이들 4개 변이체 전부를 유사한 성능으로 검출할 수 있다.
검정은 변이체 c.2235_2249 del18, c2236_2250 del18, c2240_2257 del18, 및 c.2239_2248 del11에 대해 각각 0.99, 0.99, 0.95, 및 0.94의 R2 값으로 전부 4개 변이체에 대해 선형이다. 선형 범위는 20,000 복사물/25 μL로부터 500 복사물/25 μL까지 확장된다. 전단된 게놈 DNA 단편은 eLB 반응에 대한 최적 주형이 아닌 것을 주지하는 것이 중요하다. 그러므로, 검출의 하한은 크게 과소평가될 수 있다. 그러므로, 이들 데이터는 eLB 반응에 대한 최소 민감성으로서 간주되어야 한다.
공통 엑손 19del 변이체의 목록
아미노산 뉴클레오타이드 COSMIC # 유병률a 유병률b
p.E746_A750delELREA (1) c.2235_2249del18 6623
70%		 45%
p.E746_A750delELREA (2 c.2236_2250del18 6225 29.6%
p.L747_P753>S c.2240_2257del18 12370 5.9% 8.4%
p.L747_A750>P c.2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2.0% 3.4%
p.L747_E749delLRE c.2239_2247delTTAAGAGAA 6218 0.3% n/a
a Cosmic 데이터베이스: cancer.sanger.ac.uk/cosmic
b Su et al., 2017, Oncotarget, 8:111246-111257
T790M에 대한 eLB의 선형성 및 검출 한계
도 6은 변이체 p.T790M을 함유한 게놈 DNA의 다양한 희석으로부터의 데이터를 나타낸다. 검정은 25 μL당 300에서 한 자릿수 복사물 수 범위에 걸쳐 0.99의 R2로 선형이다.
p.L858R에 대한 eLB의 선형성 및 검출 한계
도 7은 p.L858R에 대한 선형성 및 범위를 입증한다. 선형성은 25 μL당 300 복사물에서 한 자릿수 복사물 수까지 0.998의 R2로 우수하다.
3개의 EGFR 변이체에 대한 eLB의 분석 검증
각각의 변이체에 대해 별도로 선형성 및 LOD가 측정되면, 단일 검정으로 조합된 변이체에 대한 eLB의 성능을 조사하였다. 액체 생검 플랫폼의 민감성의 한 측정은 비변이체 서열의 배경에서 변이체 서열을 검출하는 검정 능력이다. 야생형 및 변이체 서열의 인공 혼합물을 함유한 참조 물질이 이 목적에 이용 가능하다. 표준을 Horizon Diagnostics로부터 구입하였고 이들 샘플에 대해 eLB 분석을 수행하였다(도 8 참고). 데이터는 3개의 EGFR 변이체에 대한 eLB 결과를 입증하며 T790M eLB가 0.1% 수준에서 변이체를 검출할 수 있음을 나타낸다. 엑손 19del 및 p.L858R은 약간 덜 민감하지만, 1% 수준에서 변이체 서열을 분명하게 검출할 수 있다. 표준은 1% 내지 0.1%에서는 이용할 수 없어서 EFRIM이 엑손 19del 및 p.L858R에 대해 검출할 수 있는 1% 마이너 대립유전자 분율보다 얼마나 낮은지 측정할 수 없다. 이들 검출 수준은 액체 생검에서 EGFR을 검출하기 위한 Roche로부터 이용 가능한 시험관내 진단 키트보다 더 낫다.
정량적 eLB 3개의 변이체 검정에 대해, 합성 올리고뉴클레오타이드 표준을 교정 및 내부 표준으로 사용하였다. 0.02 pM 내지 1600 pM의 농도에서 3개 변이체 각각을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 다양한 희석을 사용하여 적정을 4중으로 수행하였다. 선형성은 p.T790M, p.L858R, 및 엑손 19del에 대해 각각 0.99, 0.98 및 0.99의 R2 값으로 우수하였다.
검증 성능 결과(선형성, 검정간 및 검정내 CV, 참조 범위)
eLB의 정량적 검증을 p.L858R, 엑손19 결실, 및 p.T790M에 대해 검정 선형성, 검정 CV, 및 참조 범위를 평가하기 위해 혈장 및 타액 매트릭스로 일련의 실험을 수행함으로써 달성하였다. 선형성에 대해, 1000 pM 내지 24 펨토몰 범위의 2배 희석을 혈장 또는 타액 매트릭스에 스파이크된 합성 올리고뉴클레오티드 표적으로 실행하였다. 각 희석을 4회 수행하였다. 결과는 타액에서 각각 0 내지 10 pM 범위, 0 내지 50 pM 범위, 및 0 내지 12.5 pM 범위인 경우 모든 p.L858R(R2 = 0.99), 엑손19 결실(R2 = 0.99), 및 p.T790M(R2 =0.99)에 대해 R2 ≥0.99인 것을 입증하였다. 유사하게, 각각 0 내지 6.25 pM 범위, 0 내지 12.5 pM 범위, 및 0 내지 12.5 pM 범위에서 혈장에서 p.L858R(R2 =0.996), 엑손19 결실(R2 =0.999), 및 p.T790m(R2 = 0.996)에 대해 R2 ≥0.99를 달성하였다. 검출 한계를 올리고뉴클레오타이드 표적 등가법에 대한 복사물 수를 통해 계산하였고, 타액의 검출 한계는 p.L858R, 엑손19 결실, 및 p.T790M 돌연변이에 대해 각각 27.51 fM(3개 복사물), 144.86 fM(31개 복사물), 60.38 fM(9개 복사물)인 것으로 측정되었고, 혈장의 경우 각각 41.63 fM(119개 복사물), 28.26 fM(211개 복사물), 및 27.72 fM(142개 복사물)인 것으로 측정되었다.
검정내 변동의 경우, 각 돌연변이에 대해 3.25 pM의 올리고뉴클레오타이드 표적의 88개 복제물의 플레이트가 4점 표준 곡선(3.25 pM, 1.56 pM, 0.78 pM, 및 0 pM 농도)으로 생체액에 첨가되었다. 검정내 CV는 혈장에서 p.L858R, 엑손19 결실, 및 p.T790M에 대해 각각 8.72%, 18.6%, 및 12.5%였고 타액에서 각각 29.3%, 25.2%, 및 23.3%였다.
검정간 CV의 경우, 각각의 실행이 생체액 및 3점 표준 곡선에서 3.25 pM의 각각의 돌연변이의 24개 복제물을 검정하는 4개의 실행을 실시하였다. 검정간 CV는 p.L858R, 엑손19 결실, 및 p.T790M에 대해 혈장의 경우 각각 42.2%, 45.9%, 및 30.7%였고 타액의 경우 40.6%, 35.9%, 및 29.0%였다.
각각의 생체액의 경우, 40명의 건강한 대상체로부터의 건강한 혈장 및 타액을 4점 표준 곡선으로 3개의 돌연변이 각각에 대해 4 또는 5개 플레이트를 교차하여 실행하여 건강한 집단 내에서 신호 수준의 가변성을 평가하였다. 컷오프 값을 p.L858R, 엑손19 결실, 및 p.T790M에 대해 각각 타액의 경우 표준화된 배경 전류 측정보다 위인 4.04 nA, 4.34 nA, 6.40 nA에서 및 혈장의 경우 표준화된 배경 전류 측정보다 위인 7.10 nA, 9.18 nA, 및 12.57 nA에서 평균으로부터 3 표준 편차를 토대로 확립하였다.
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물의 개시내용은 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
본 발명이 특정 구현예를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변동이 기술분야에 숙련된 다른 사람들에 의해 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 고안될 수 있는 것이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 그러한 구현예 및 동등한 변동을 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다.
<110> The Regents of the University of California Wong, David Wei, Fang Strom, Charles Tu, Michael Liao, Wei Cheng, Jordan Chia, David Tang, Hieu Ye, Qianlin Li, Feng <120> LIQUID BIOPSY PLATFORM IN PLASMA AND SALIVA <130> 206030-0205-00WO <150> US 63/021,172 <151> 2020-05-07 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, <400> 1 aaaaaaaaaa gaaataaaca aataaaacaa taacaaataa aaaaaaacaa ataaacaata 60 aaaaaaaaca agtttgaccc gccca 85 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, L858R Detector Probe <400> 2 aaaatctgtg atcttgacat gctgcggtgt tttgtgcag 39 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Control calibrator oligo L858R wild type <400> 3 ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actg 54 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, control calibrator oligo L858R mutant <400> 4 ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggcgggccaa actg 54 <210> 5 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Exon19 del Capture Probe <400> 5 aaaaaaaaaa aaataaaaaa aaaaaaataa aaaaaaaaaa ataaaaaaaa aaaaataaaa 60 aaaaacatgt tgcttccttg 80 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Exon19 del Detector Probe <400> 6 atagcgacgg gaattttaac tttctcacct 30 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Control calibrator oligo Exon19 Mutation Del <400> 7 aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat caaggaagca acatctccga aagccaa 57 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Control calibrator oligo Exon19 del Wild type <400> 8 aggtgagaaa gttaaaattc ccgtcgctat caaggaatta agagaagcaa catctccgaa 60 agcca 65 <210> 9 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, T790M Capture Probe <400> 9 aaaaaaaaaa gaaataaaca aataaaacaa taacaaataa aaaaaaacaa ataaacaata 60 aaaaaaaaca agagcggcat gatga 85 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, T790M Detector Probe <400> 10 gctgcacggt ggaggtgagg cagatgccca gc 32 <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Control calibrator oligo T790M <400> 11 gctgggcatc tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcatg cagctcatgc cc 52 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Control calibrator oligo T790M Wildtype Sequence <400> 12 gctgggcatc tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc cc 52 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, Exon 19del capture probe <400> 13 tgttgcttcc ttg 13 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, p.L858R capture probe <400> 14 gtttgacccg ccca 14 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemcially synthesized, p,T790M Capture Probe <400> 15 gagcggcatg atga 14

Claims (20)

  1. 샘플 중의 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 시스템으로서,
    a) 센서 어레이를 포함하는 다중 웰 플레이트로서, 각 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 적어도 하나의 유닛의 작업 전극은 전도성 중합체로 코팅되는 것인, 다중 웰 플레이트;
    b) 캡처 및 검출기 프로브 쌍을 포함하는 적어도 하나의 프로브 세트로서, 캡처 프로브는 전도성 중합체에 내재되어 있거나 기능화되며 추가로 검출기 프로브는 말단 3' 뉴클레오타이드에서 표지된 비오틴인 것인, 프로브 세트;
    c) 다중 웰 플레이트 세척기; 및
    d) 어레이 센서 위로 적용된 전기장을 제어하고 전류 측정 전류를 동시에 기록하는 다중 채널 전기화학 판독기
    를 포함하는, 샘플 중의 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 캡처 및 검출기 프로브 중 적어도 하나는 폐암 마커를 포함하는 핵산 분자에 혼성화되는 것인, 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 캡처 프로브는 폴리A 영역을 포함하는 것인, 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 및 c.2239_2248 del11로 이루어지는 군으로부터 선택된 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 변이체인 것인, 시스템,
  5. 제4항에 있어서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, 및 L858R로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 캡처 및 검출 프로브쌍은:
    a) 엑손19 결실의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:5 및 서열 번호:13으로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:6을 포함하는 것인, 프로브 쌍;
    b) L858R의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:1 및 서열 번호:14로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:2를 포함하는 것인, 프로브 쌍; 및
    c) T790M의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:9 및 서열 번호:15로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:10을 포함하는 것인, 프로브 쌍
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 시스템.
  7. 대상체에서 폐암을 검출하는 방법으로서,
    대상체의 적어도 하나의 샘플을 얻는 단계;
    적어도 하나의 샘플의 제1 부분을 표지된 검출기 프로브를 포함하는 용액과 혼합하는 단계;
    혼합물을 제1항에의 시스템에 사용하기 위한 다중 웰 플레이트의 단일 웰에 첨가하는 단계로, 다중 웰 플레이트의 각각의 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 작업 전극은 캡처 프로브가 내재된 전도성 중합체로 코팅되는 것인 단계;
    순환 방형파 전기장을 전극 칩에 적용하는 단계; 및
    전극 칩에서 전류를 측정하는 단계로서, 전류의 변화는 샘플 중의 폐암과 관련된 마커의 존재와 상관이 있는 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 세척 단계를 추가로 포함하며, 다중 웰 플레이트는 자동 플레이트 세척기를 사용하여 세척되는 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 신호를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하며, 방법은:
    a) 적어도 하나의 샘플의 제1 부분을 비오틴 표지된 검출기 프로브를 포함하는 용액과 혼합하는 단계
    b) 혼합물을 제1항의 시스템에서 사용하기 위해 다중 웰 플레이트의 단일 웰에 첨가하는 단계로서, 다중 웰 플레이트의 각각의 웰은 작업 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는 전극 칩을 포함하며; 작업 전극은 캡처 프로브가 내재된 전도성 중합체로 코팅되는 것인, 단계;
    c) 순환 방형파 전기장을 전극 칩에 적용하는 단계;
    d) 제1 라운드의 스트렙트아비딘 결합 서양고추냉이 과산화효소(HRP)를 웰에 첨가하는 단계,
    e) 비오틴 표지된 항-HRP 항체를 웰에 첨가하는 단계,
    f) 제2 라운드의 스트렙트아비딘 결합 HRP를 웰에 첨가하는 단계, 및
    g) 전극 칩에서 전류를 측정하는 단계로서, 전류의 변화는 샘플 중의 폐암과 관련된 마커의 존재와 상관이 있는 것인, 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 시약은 사용 전에 4℃에서 유지되는 것인, 방법.
  11. 제7항에 있어서, 캡처 및 검출기 프로브의 적어도 하나는 폐암의 마커를 포함하는 핵산 분자에 혼성화되는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 핵산 분자는 순환 종양 DNA(ctDNA) 분자인 것인, 방법.
  13. 제7항에 있어서, 캡처 프로브는 폴리A 영역을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제7항에 있어서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, L858R, c.2235_2249 del18, c.2236_2250 del18, c.2240_2257 del18, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C, c.2239_2247delTTAAGAGAA 및 c.2239_2248 del11로 이루어지는 군으로부터 선택된 EGFR의 변이체인 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 폐암의 마커는 엑손19 결실, T790M, 및 L858R로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 캡처 및 검출 프로브 쌍은:
    a) 엑손19 결실의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:5 및 서열 번호:13으로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:6을 포함하는 것인, 프로브 쌍;
    b) L858R의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:1 및 서열 번호:14로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:2를 포함하는 것인, 프로브 쌍; 및
    c) T790M의 검출을 위한 프로브 쌍, 여기서 캡처 프로브는 서열 번호:9 및 서열 번호:15로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 검출기 프로브는 서열 번호:10을 포함하는 것인, 프로브 쌍
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  17. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 샘플은 타액 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플 및 혈청 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제7항에 있어서, 대상체로부터의 타액 샘플은 다중 웰 플레이트의 제1 웰에 첨가되고 동일한 대상체로부터의 혈장 샘플은 다중 웰 플레이트의 제2 웰에 첨가되는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대상체는 폐암의 마커가 대상체로부터의 타액 샘플 및 동일한 대상체로부터의 혈장 샘플에서 모두 검출되는 경우에 폐암을 가졌거나 폐암의 발병 위험이 있는 것으로 진단되는 것인, 방법.
  20. 제7항에 있어서, 폐암에 대한 마커가 검출되는 경우에 대상체에게 폐암에 대한 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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