CN104123480B - 新型微rna筛选方法、验证系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型微RNA筛选方法、验证系统及其应用。本发明的筛选验证系统可简单快速经济地检测hetRNA的表达。本发明为天然hetRNA的筛选验证提供了一个方便可行的路径和方法,为将来大规模的发现验证hetRNA提供了强大的技术支撑。本发明还提供了新的构建用于RNA筛选数据库的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种新型微RNA(hetRNA)筛选系统的构建方法及其应用。
背景技术
最近的研究表明,真核基因组90%以上的序列都会被转录,产生大量的非编码RNA(ncRNAs)【Costa FF.,Bioessays2010;32(7):599-608;Carninci P,Yasuda J,Hayashizaki Y.,Curr Opin Cell Biol2008;20(3):274-280】,包括长的非编码RNA(lncRNAs)和小的非编码(sRNAs<200nt)。sRNAs几乎能直接或间接影响细胞的每一个生物学活动【Czech B,Hannon GJ.,Nat Rev Genet 2010;12(1):19-31】。自从1993年发现microRNAs(一种sRNA)以来,解析小RNA组学(sRNAome)已经成了很多实验室的目标【LeeRC,Feinbaum RL,Ambros V.,Cell1993;75(5):843-854】。这导致多种功能性的内源微RNA(<30nt)的发现【Choudhuri S.,J Biochem Mol Toxicol2010;24(3):195-216.;Taft RJ,Pang KC,Mercer TR,Dinger M,Mattick JS.,J Pathol 2009;220(2):126-139.;Li Z,KimSW,Lin Y et al.,J Virol2009;83(24):12751-12758.;Taft RJ,Simons C,Nahkuri S etal.,Nat Struct Mol Biol;17(8):1030-1034】。但是,这些微RNA一般是连续地存在于对应的基因组上。
最近发展起来的深度测序技术(deep sequencing)特别适合于发现微RNA【HafnerM,Landgraf P,Ludwig J et al.,Methods 2008;44(1):3-12】。深度测序技术可以产生千万乃至上亿的微RNA数据,这使得人们能够比先前更为详尽地解析微RNA组学,特别是它能够发现那些先前克隆和标准的方法无法实现的新的尤其是低丰度的微RNA【NagalakshmiU,Waern K,Snyder M.,Curr Protoc Mol Biol2010;Chapter4:Unit4 11 11-13.;van derBrug M,Nalls MA,Cookson MR.,Brain Res2010;1338:146-154.】。但是,随之而来的挑战是如何确定这百万级以上的小核苷酸序列在基因组上的定位。事实上,对一般的测序平台来说,的确有明显比例的数据是不能在基因组中找到定位的【Blow N.,Nature2009;458(7235):239-242.】。有趣的是,最近,人们在高通量测序数据中发现一种不连续的小于200nt的小RNA,这种小RNA在基因组上被一个内含子所隔开【Nature2009;457(7232):1028-1032.;Mercer TR,Dinger ME,Bracken CP et al.,Genome Res;20(12):1639-1650.;Valen E,Preker P,Andersen PR et al.,Nat Struct Mol Biol;18(9):1075-1082.】。但是,有没有小于30nt的不连续的微RNA还有待进一步探究。毕竟小于200nt还是很大的分子,也容易与基因组匹配,但小于30nt的分子就很困难了。
综上所述,本领域对于微RNA的认识还非常有限,迫切需要开发新的鉴别新型微RNA的方法。此外,还需要开发简单方便快速的技术来进行验证,以便筛选和鉴别新型的微RNA。
发明内容
本发明的目的就是提供一种鉴别新型微RNA或其前体的方法。
本发明的第一方面,提供了一种构建用于hetRNA筛选的数据库的方法,所述方法包括:
(a)提供一微小RNA深度测序数据库(或称为微RNA垃圾数据库,或0级RNA筛选库),
其中所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列记为RNAj0,其中RNAj0表示序号为j0的RNA序列,j0为1-n0的正整数,n0为所述微小数据库中的RNA序列总数,并且RNAj0是未能与基因组序列匹配的微小RNA,并且所述微小RNA测序数据库不包括已验证或证实的hetRNA和已知小RNA的RNA序列;
(b)将所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列RNAj0,与标准RNA(reference RNA或RefSeq RNA)数据库进行比对,从而在所述标准RNA数据库中排除与各RNA序列RNAj0不匹配的标准RNA序列,并选取标准RNA数据库中与RNAj0匹配的标准RNA,并将对应于该匹配的标准RNA的截短序列组成一级RNA筛选库(匹配的RNAj0被称为起始微RNA),其中,所述标准RNA的截短序列的结构如式I所示:
X-SEQRNAj0-Y (I)
式中,
SEQRNAj0为相匹配的RNAj0的核苷酸序列;
X为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接上游(immediately upstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
Y为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接下游(immediately downstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
“-”为连接X和SEQRNAj0以及连接SEQRNAj0和Y的键(化学键);
其中所述一级RNA筛选库所含有的各标准RNA的截短序列记为RNAj1,其中,RNAj1表示序号为j1的标准RNA的截短序列,其中j1为1-n1的正整数,n1为一级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(c)将所述一级筛选库中的RNAj1,与基因组序列数据库进行比对,从而排除不含有内含子的RNA序列,并且选取内含子要位于成熟微RNA序列(即起始微RNA)之中的RNA序列,组成二级RNA筛选库,
其中所述二级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj2,其中,RNAj2表示序号为j2的RNA序列,其中j2为1-n2的正整数,n2为二级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(d)将所述二级筛选库中的RNAj2序列进行二级结构分析,进行二级结构预测,排除无法形成茎环结构的RNA序列,并将所述二级筛选库中可形成茎环结构的RNA序列组成三级RNA筛选库,即用于hetRNA筛选的数据库,
其中,所述三级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj3,RNAj3表示序号为j3的RNA序列,其中j3为1-n3的正整数,n3为三级RNA筛选库中的RNA序列总数。
在另一优选例中,所述的“-”表示连接式I中各序列的腱,更佳地,为化学键。
在另一优选例中,所述的微小RNA深度测序数据库、标准RNA数据库、和基因组序列数据库是来自同一物种的。
在另一优选例中,所述的物种包括(但并不限于):哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫。
较佳地,所述的哺乳动物包括人、啮齿动物、灵长目、牛、羊、猪、狗、猫。
更佳地,所述的哺乳动物包括小鼠、大鼠、人。
在另一优选例中,所述的标准RNA数据库是国际通用公用数据库NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)网站的标准RNA数据库。
在另一优选例中,在步骤(c)中,基因组序列是NCBI网站的基因组序列。
在另一优选例中,在步骤(d)中,二级结构预测是用公用网站the mFold Server进行。
在另一优选例中,所述的三级RNA筛选库也称为包含内含子剪接位点的hetRNA前体库。
在另一优选例中,所述的微小RNA测序数据库中的RNA序列长度为18-30nt。
在另一优选例中,在步骤(d)中还包括:将所述微小RNA测序数据库中对应于RNAj0的各RNA序列组成相应的成熟hetRNA库。
本发明第二方面,提供了一种鉴定由包含内含子的hetRNA前体产生的成熟hetRNA的方法,包括步骤:
(a)提供一微小RNA深度测序数据库(或称为微RNA垃圾数据库,或0级RNA筛选库),
其中所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列记为RNAj0,其中RNAj0表示序号为j0的RNA序列,j0为1-n0的正整数,n0为所述微小数据库中的RNA序列总数,并且RNAj0是未能与基因组序列匹配的微小RNA,并且所述微小RNA测序数据库不包括已验证或证实的hetRNA和已知小RNA的RNA序列;
(b)将所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列RNAj0,与标准RNA(reference RNA或RefSeq RNA)数据库进行比对,从而在所述标准RNA数据库中排除与各RNA序列RNAj0不匹配的标准RNA序列,并选取标准RNA数据库中与RNAj0匹配的标准RNA,并将对应于该匹配的标准RNA的截短序列组成一级RNA筛选库(匹配的RNAj0被称为起始微RNA),其中,所述标准RNA的截短序列的结构如式I所示:
X-SEQRNAj0-Y (I)
式中,
SEQRNAj0为相匹配的RNAj0的核苷酸序列;
X为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接上游(immediately upstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
Y为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接下游(immediately downstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
“-”为连接X和SEQRNAj0以及连接SEQRNAj0和Y的键(化学键);
其中所述一级RNA筛选库所含有的各标准RNA的截短序列记为RNAj1,其中,RNAj1表示序号为j1的标准RNA的截短序列,其中j1为1-n1的正整数,n1为一级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(c)将所述一级筛选库中的RNAj1,与基因组序列数据库进行比对,从而排除不含有内含子的RNA序列,并且选取内含子要位于成熟微RNA序列(即起始微RNA)之中的RNA序列,组成二级RNA筛选库,
其中所述二级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj2,其中,RNAj2表示序号为j2的RNA序列,其中j2为1-n2的正整数,n2为二级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(d)将所述二级筛选库中的RNAj2序列进行二级结构分析,进行二级结构预测,排除无法形成茎环结构的RNA序列,并将所述二级筛选库中可形成茎环结构的RNA序列组成三级RNA筛选库,
其中,所述三级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj3,RNAj3表示序号为j3的RNA序列,其中j3为1-n3的正整数,n3为三级RNA筛选库中的RNA序列总数;和
(e)对三级RNA筛选库中的RNAj3序列,测定其形成hetRNA的能力,其中,如果所述RNAj3能够形成hetRNA,则所述的RNAj3是包含内含子的hetRNA前体,而其所形成的hetRNA为成熟hetRNA。
在另一优选例中,所述的hetRNA来源于选自下组的物种:哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫。
在另一优选例中,所述的哺乳动物包括人、啮齿动物、灵长目、牛、羊、猪、狗、猫。
更佳地,所述的哺乳动物包括小鼠、大鼠、人。
在另一优选例中,所述的转染受体细胞是293FT细胞。
在另一优选例中,在转染后,通过茎环引物扩增法(STEM LOOP PCR)进行检测。
在另一优选例中,所述的测序数据库是深度测序的数据库。
在另一优选例中,所述的深度测序指测序深度≥20。
本发明第三方面,提供了一种鉴定候选RNA序列是否是包含内含子的hetRNA前体的方法,包括步骤:
(i)构建一表达载体,所述质粒携带对应于待鉴定的RNA序列的DNA序列并可将所述DNA序列表达为RNA序列,其中所述的待鉴定的RNA序列包含内含子;
(ii)用所述表达载体转染受体细胞,并培养所述的经转染的受体细胞;
(iii)鉴别所述的经转染的受体细胞中hetRNA,从而确定所述待鉴定的RNA序列是否是包含内含子的hetRNA前体,其中,如果与对照的受体细胞相比,并经测序列证明,在经转染的受体细胞中形成了对应于所述待鉴定的RNA序列的hetRNA序列,则表示待鉴定的RNA序列是包含内含子的hetRNA前体,而所形成的hetRNA为成熟hetRNA。
在另一优选例中,所述的待鉴定的RNA序列来自用本发明第一方面所述方法构建的用于hetRNA筛选的数据库,即所述三级RNA筛选库所含有的RNAj3。
在另一优选例中,在步骤(iii)中,鉴别步骤包括:抽提所述经转染的受体细胞的总RNA;PCR扩增待验证的成熟hetRNA序列;以及对上述PCR扩增序列进行测序验证。
本发明第四方面,提供了一种用本发明第三方面所述的方法所鉴别出的微RNA分子或微RNA分子的前体。
在另一优选例中,所述的微RNA分子的序列如SEQ ID NO.:22或23所示的hetRNA;或
所述的微RNA分子前体的序列如SEQ ID NO.:24或25所示。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了hetRNA(前体包含内含子的微RNA)形成的示意图。
图2显示了本发明筛选天然hetRNA的分析流程图。
图3显示人工构建的包含内含子的miRNA前体可在细胞体系中剪切形成成熟miRNA。图中,“Primer”表示引物。
其中,(A)为人造的包含内含子的miRNA前体的剪接过程的示意图。
(B)对应于(A)中的核酸序列及结构。箭头表示内含子hmirtron-1224插入miR-1955前体的位点。
(C)内含子剪接后剩余产物的RT-PCR结果。剪接的确认引物与载体匹配,不与前体匹配,如图(A)所示,其序列为PCDNA6F和PCDNA6R。最后一条泳道的235bp和320bp条带分别指剪接前后的PCR产物。
(D)人工设计结构产生的成熟hetRNA-1955的RT-PCR结果。引物设计用标准的茎环引物法。“No vector”指HEK293FT没有转染质粒;PE-miR-126,PE-miR-1955和PE-miR-1955-hmirtron-1224指样品各自转染包含miR-126,miR-1955和miR-1955中含内含子mirtron-1224的miR-1955前体质粒;PE指载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。U6和gapdh作为上样对照。所有PCR产物均经测序验证。
图4显示了天然内源性hetRNA-Ubap2l的筛选和验证。
其中,(A)hetRNA-Ubap2l的筛选示意图。
(B)天然hetRNA-Ubap2l过表达的证明。上图的表达情况证实了内含子剪接。最后一条泳道的926bp和243bp条带指剪接前后的PCR产物。剪接的确认引物与载体匹配,但不与前体匹配,如图3(A)所示,其序列为PCDNA6F和PCDNA6R;下图指检测成熟的hetRNA-Ubap2l。
(C)检测小鼠组织中天然的内源性hetRNAs。上图,证明天然内含子的剪接,引物设计跨过内含子(见实施例)。下图检测小鼠组织中的hetRNA-Ubap2l。PCR引物设计用标准的茎环引物法。质粒被转染进HEK293FT细胞。PE指所用载体。U6和gapdh作为上样对照。所有PCR产物均经测序验证。
图5显示了天然内源性hetRNA-Pccb的验证。
其中,(A)天然内源性hetRNA-Pccb利用细胞体系的验证示意图。
(B)对应于(A)中的核酸序列及结构。箭头表示天然内含子插入hetRNA-Pccb前体的位点。
(C)天然人hetRNA-Pccb过表达的证明。上图的表达证实了内含子剪接的证明。最后一条泳道的217bp条带指剪接后的PCR产物,剪接的确认引物与载体匹配,但不与前体匹配,如图(A)所示,其序列为PCDNA6F和PCDNA6R;下图指检测成熟的hetRNA-Pccb。
(D)检测小鼠组织中天然的内源性hetRNAs。hetRNA-Pccb序列在大鼠附睾小RNA文库的垃圾序列中发现。在大鼠睾丸中能够被RT-PCR和测序证明。PCR引物设计用标准的茎环引物法。质粒被转染进HEK293FT细胞。PE指所用载体。U6和gapdh作为上样对照。所有PCR产物均经测序验证。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次开发了一种RNA-hetRNA筛选系统,并利用筛选系统,首次验证了在哺乳动物等物种中,存在内源性的含内含子的hetRNA前体分子,即hetRNA前体。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明人选取质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR作为载体,用含内含子的hetRNA前体序列作为受体,FASTDIGEST限制性内切酶作为消化酶,293FT细胞作为反应器,STEM LOOP PCR作为表达检测方法,形成一个完全的筛选技术系统,从而实现简单快速经济地检测hetRNA的表达。
术语
如本文所用,术语“本发明RNA”、“hetRNA”可互换使用,指由hetRNA前体所产生的、长度≤30nt的微RNA。通常,hetRNA的长度为18-30nt。
如本文所用,术语“本发明前体”、“本发明的RNA前体”、“hetRNA前体”可互换使用,指可产生所述hetRNA的RNA分子,该前体的特点是具有茎环结构(也称为发夹结构),并且在前体的序列中含有插入的内含子序列。所述hetRNA前体在剪接过程中,可剪切掉内含子序列,从而产生长度≤30nt的hetRNA。通常,hetRNA前体的长度为50-200bp。
应理解,本发明前体可指RNA序列、DNA序列或RNA-DNA序列,也包括相应的正义序列或反义序列。
hetRNA
本发明证实了,在未匹配的深度测序数据中,至少一部分序列是基因组转录来的hetRNA前体,它被一个内含子所隔开。
如图1所示,在未匹配的深度测序数据中,基因组转录来的转录物(hetRNA前体)被一个内含子所隔开。不象典型的miRNA和mirtron前体,产生的成熟hetRNA是前体中的内含子被剪接后所形成的产物。
天然hetRNA的鉴别
本发明提供了一种鉴别各物种中,天然存在的或内源性hetRNA的方法和系统。
参见图2,一种代表性的方法包括:
■通过对RNA深度测序小RNA数据的“垃圾”数据在NCBI网站上对标准RNA使用BLAST,然后选取能够匹配的标准RNA(reference RNA)(也可称为参照RNA);
■将匹配的标准RNA再与基因组序列(同一物种)进行基因组的BLAST,选出在基因组中被内含子所分隔的序列作为目标序列;
■将目标序列用the mFold Server网站进行二级结构预测,选取前体有茎环结构的内含子打断的微RNA作为以后实验验证的候选分子;
■对所述具有茎环结构的RNA序列,测定其形成hetRNA的能力,其中,如果所述RNA能够形成hetRNA,则表示所形成的微RNA是hetRNA,而相应的RNA序列是hetRNA前体。
在本发明方法中,可使用商业化的或公开的数据库,也可使用通过常规方法构建的数据库。代表性的数据库包括(但并不限于)NCBI数据库等。例如,网站blast可使用地址:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/;mFold Server网站可使用地址:http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold。
筛选系统和测定方法
本发明还提供了一种用于本发明方法的筛选系统(RNA-hetRNA筛选系统)。
一种代表性的RNA-hetRNA的筛选系统包括:
(a)转染质粒,所述转染质粒用于插入对应于待筛选RNA分子的DNA序列;
(b)转染受体细胞,所述的转染受体细胞用于转入所述的转染受体,并且将所述转染质粒中所插入的DNA转录为RNA;
(c)任选的抽提细胞总RNA的试剂;
(d)任选的进行STEM-LOOP PCR的试剂。
一种代表性的转染系统测定方法包括:
(e1)提供质粒(例如pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR)作为转染载体;
(e2)用多个引物对(含前体序列及插入其中的intron序列),通过PCR拼接形成序列X,或商业化人工合成所述序列X,其中该序列X包含待测定的具有茎环结构的hetRNA前体序列;
(e3)用合适内切酶分别酶切质粒和序列X;
(e4)将上述序列X亚克隆进所述载体;
(e5)将步骤(e4)所得到质粒转染合适的转染受体细胞(如293FT细胞);
(e6)用TRIZOL试剂提取细胞总RNA;
(e7)将步骤(e6)所得RNA用STEM-LOOP PCR方法检测目标hetRNA的表达。
本发明的主要优点包括:
(a)提供了一种筛选天然hetRNA的方便可行的路径和方法,为将来大规模的发现验证hetRNA提供了强大的技术支撑。
(b)首次证实了包括人在内的物种中,存在hetRNA前体以及所述hetRNA前体可产生长度≤30nt的hetRNA。为研究hetRNA及其前体的功能奠定了基础。
(c)为从废弃的微RNA深度测序列数据库中挖掘新型微RNA提供了一种新思路。
(d)打破了基因测序结果分析中传统以与基因组匹配为标准的黄金准则,建议改为以RNA和基因组双重匹配为标准。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和通用方法
1.主要试剂
pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR:购自INVITRIGEN。
限制性内切酶Fast-Digest:购自Fermentas。
2.试验方法
2.1质粒构建
质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-X的产生。序列X由上海博尚生物技术公司合成,然后亚克隆进载体pcDNA6.2-GW/EmGFP(Invitrogen,UK)的Hind III和EcoR I位点。质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Y的产生。序列Y用引物对通过PCR,然后亚克隆进载体pcDNA6.2-GW/EmGFP(Invitrogen,UK)的BamHI and XhoI位点。为了成功的构建质粒,不要选用通常所的限制性内切酶,而要选用Fast-Digest系统(如Fermentas,Canada)来作用于特别复杂的双发夹前体结构的。X序列用于构建人工模型,Y序列用于鉴定内源性的hetRNAs。所有的序列最终均过测序确认(Biosune,China)。
X序列如下:
Mir-1955-hmirtron-1224前体:
ctggtttacttactacaagtcccag gatgcactgcagctttttcttaacttcagacaagagcattgcatgctgggacatgtagttggtttaaatagca(SEQID NO:1)
其中,粗体为intron hmirtron-1224;非粗体部分为mir-1955precursor;下划线部分是成熟的mir-1955(agtcccaggatgcactgcagctttt,SEQ ID NO:2);斜体碱基为突变碱基。
Y序列如下:
HetRNA-Ubap2l前体序列(含天然内含子),PCR扩增用小鼠Raw264.7细胞基因组DNA为模板。引物如下:
Pre-hetRNA-Ubap2l-F:catcgcggatcctcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO:3);
Pre-hetRNA-Ubap2lin-R:gaaccgctcgagaccttcaacagattgcgtggtctg(SEQ ID NO:4)。
HetRNA-Ubap2l前体序列(不含天然内含子),用Trizol法抽提的Raw264.7细胞总RNA转录来的cDNA为模板,通过PCR扩增获得。其中,引物如下:
hetRNA-Ubap2l-F:CATCGCGGATCCtcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO.:5);
hetRNA-Ubap2lin-R:GAACCGCTCGAGactgtttcattgagagagggtatact(SEQ ID NO.:6)。
hetRNA-Pccb的前体序列(含或不含天然内含子)均用HEK293FT细胞,其中不含天然内含子的前体序列扩增所使用的是Trizol法抽提的细胞总RNA转录来的cDNA为模板,前体含天然内含子的序列扩增则使用细胞基因组DNA为模板。扩增hetRNA前体及前体含内含子的引物如下:
hhetRNA-Pccb-F:TCACCGGAATTCgtcacagtcatcaccaggaa(SEQ ID NO.:7);
hhetRNA-Pccb-R:GTACCCAAGCTTtagttggtatcaccacaaaggtgc(SEQ ID NO.:8)。
细胞培养和转染
HEK293T细胞(实验室保存或常规市售)用培养其常规的市售培养基Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM),其中含10%胎牛血清(Hyclone,USA)。质粒转染用Lipofectamine2000(Invitrogen,UK),操作按说明书进行。
E14T小鼠胚胎干细胞(ESCs)(购自Austin Smith)用无饲养层培养。E14T小鼠胚胎干细胞用悬滴法诱导向心肌的自发分化。简单讲,ESCs被胰酶消化(D0)并悬浮培养在培养基中,没有LIF for2days(D2),接下悬浮培养四天,胚状体铺板于明胶覆盖的培养盘(D6)当出现自发收缩的买心肌细胞时收集样品D9。在各个时间点样品用于提取RNA。
RNA分离和RT-PCR
小鼠或培养的细胞总RNA用TRIzol提取(购自Invitrogen,UK),用Super ScriptII reverse transcriptase(Invitrogen,UK)反转录cDNA,其中miRNA用特异性茎环引物,mRNA和u6用随机引物,mRNA和gapdh用oligo dT。PCR扩增必须用高保真的KOD-PLUS DNApolymerase(Toyobo,Japan)。所有操作根据说明书进行。所有PCR产物均经测序确认(Invitrogen,UK)。
引物如下(5'to3'):
方向 | 序列 | SEQ ID NO.: | |
PCDNA6 | F | cttcgtggccgtcgatcgtt | 9 |
PCDNA6 | R | gggccctctagatcaaccac; | 10 |
hGAPDH | F | ctctctgctcctcctgttcgac | 11 |
hGAPDH | R | tgagcgatgtggctcggct; | 12 |
U6 | F | cggcagcacatatactaaa | 13 |
U6 | R | atggaacgcttcacgaatt | 14 |
PCR所用通用引物为Universe-miRNA R:tgtcgtggagtcggctaatg(SEQ ID NO.:15)。
反转录基因特异性茎环引物如下:
RT-mmiR-1955:
TGGACGACCGTGTCGTGGAGTCGGCTAATGGTCGTCCAaaaagctg(SEQ ID NO.:16)
RT-hetRNA-Ubap2l:
TGGACGACCGTGTCGTGGAGTCGGCTAATGGTCGTCCAttcttag(SEQ ID NO.:17)
RT-hhetRNA-Pccb:
TGGACGACCGTGTCGTGGAGTCGGCTAATGGTCGTCCAccata(SEQ ID NO.:18)
PCR所有基因特异性hetRNA正向引物如下:
PCR-mmiR-1955:agtcccaggatgcactgc(SEQ ID NO.:19);
PCR-hetRNA-Ubap2l:ATTaaaggacctgactcaggc(SEQ ID NO.:20);
PCR-hetRNA-PCCB:CCCCtcatcaccaggaaggcct(SEQ ID NO.:21)。
深度测序和生物信息学分析
ESCs小RNA测序采用华大基因公司(BGI,China)的Genome Analyzer II(Illumina,USA)平台。
已知的miRNA前体及成熟体序列来自miRBase database(release15,Sanger,http://www.mirbase.org)。
一般序列比对用Basic Local Alignment Search Tool(Blast)软件在Genbank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)。
RNA二级结构预测用the mFold Server(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)。
从未匹配数据中挖掘hetRNAs
所有匹配数据被用于hetRNA分析。每个候选的hetRNA必须要满足以下条件:
(1)能与Genebank上的标准RNA匹配;
(2)可匹配的标准RNA再一次与基因组匹配;
(3)前体必须有茎环结构。
每一个候选分子必须同时满足这些条件,候选的分子还要进一步通过RT-PCR系统验证。
实施例1人造hetRNA分子的检测
在本实施例中,首先建立一个模型来证明这类小分子在哺乳动物细胞中能够产生。为了简化起见,在本实施例中,通过插入一个已知的内含子进入一个已知的miRNA前体来建立一个特殊的人造发夹结构。
实验的测试用一个简单的系统,即通过RT-PCR和测序方法来检测特殊人造发夹结构在剪接后的剩余产物和剪切拼接后最终产生的miRNA成熟体来证明hetRNA存在。
由于插入miRNA前体的内含子在剪接反应后必须被准确地清除,而当前对“剪接码”的认识还有限,这就无形中出现了困难。本发明人也尝试了不同的方法,但没有成功。最后,本发明人以Sanger的miRNA数据库(release15,Sanger)和GenBank为对象,进行大量筛选工作,寻找合适的受体miRNA和赠体内含子。最终确定miR-1955作为受体,mirtron-1224作为赠体。内含子mitron-1224插入miR-1955前体的5'臂。当用构建好的质粒转入293FT细胞后,提取RNA,进行茎环RT-PCR检测。
本实施例的具体实施步骤如下:
(1)选质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。
(2)选取mitron miR-1224作为实验用intron
(3)将上述intron,插入miR-1955前体序列,得到设计的前体序列hetRNA-1955precursor
(4)用多个引物对hetRNA前体序列通过PCR拼接或者公司合成以形成序列hetRNA-1955precursor。
(5)用Fermantus公司的FastDigest酶Hind III和EcoR I分别酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒和序列hetRNA-1955precursor。
(6)将上述序列hetRNA-1955precursor亚克隆进载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的Hind III和EcoR I位点。
(7)将步骤(4)所得到测序正确的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1955质粒转染293FT细胞。
(8)用TRIZOL试剂,按公司说明操作,提取细胞总RNA
(9)将步骤(8)所得到的RNA用STEM-LOOP PCR方法检测目标hetRNA的表达。
结果如图3所示。结果表明,构建的人造含内含子的前体的确能够发生内含子的剪切反应,在内含子剪切后产生了miR-1955的前体序列,并且这样一种前体序列的确能够产生成熟的miR-1955。
该实验也证明hetRNA的实验验证技术体系的可行性。
实施例2包含内含子的天然hetRNA前体及其成熟分子的筛选和建库
(a)提供一来自小鼠的微小RNA深度测序数据库(或称为微RNA垃圾数据库,或0级RNA筛选库)(深圳华大公司提供),
其中所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列记为RNAj0,其中RNAj0表示序号为j0的RNA序列,j0为1-n0的正整数,n0为所述微小数据库中的RNA序列总数,并且RNAj0是未能与基因组序列匹配的微小RNA,并且所述微小RNA测序数据库不包括已验证或证实的hetRNA和已知小RNA的RNA序列;
(b)将所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列RNAj0,与NCBI网站的小鼠标准RNA(reference RNA)数据库进行比对,从而在所述标准RNA数据库中排除与各RNA序列RNAj0不匹配的标准RNA序列,并选取标准RNA数据库中与RNAj0匹配的标准RNA,并将对应于该匹配的标准RNA的截短序列组成一级RNA筛选库(匹配的RNAj0被称为起始微RNA),其中,所述标准RNA的截短序列的结构如式I所示:
X-SEQRNAj0-Y (I)
式中,
SEQRNAj0为相匹配的RNAj0的核苷酸序列;
X为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接上游(immediately upstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
Y为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接下游(immediately downstream)的长度为50-100bp的核苷酸序列;
其中所述一级RNA筛选库所含有的各标准RNA的截短序列记为RNAj1,其中,RNAj1表示序号为j1的标准RNA的截短序列,其中j1为1-n1的正整数,n1为一级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(c)将所述一级筛选库中的RNAj1,与基因组序列数据库进行比对,从而排除不含有内含子的RNA序列,并且选取内含子要位于成熟微RNA序列(即起始微RNA)之中的RNA序列,组成二级RNA筛选库,
其中所述二级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj2,其中,RNAj2表示序号为j2的RNA序列,其中j2为1-n2的正整数,n2为二级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(d)将所述二级筛选库中的RNAj2序列进行二级结构分析,进行二级结构预测,排除无法形成茎环结构的RNA序列,并将所述二级筛选库中可形成茎环结构的RNA序列组成三级RNA筛选库,即用于hetRNA筛选的数据库,
其中,所述三级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj3,RNAj3表示序号为j3的RNA序列,其中j3为1-n3的正整数,n3为三级RNA筛选库中的RNA序列总数。
实施例3天然hetRNA-Ubap2l分子的检测
为了寻找天然的hetRNAs,本发明人选用深圳华大公司丢弃的深度测序列数据(小鼠E14T mouse ESCs)作为分析的对象,即作为微RNA的目标筛选数据库(微RNA垃圾数据库,或称为0级筛选数据库)。
以GenBank数据库为对象,通过配对这些丢弃的数据和参考RNA(代替传统的与基因组的配对),发现其中一个“垃圾”分子能够与mRNA Ubap2l配对,而且配对的地方刚好对应于基因组中被内含子分隔开的位置(图4A)。
本实施例的具体实施步骤如下:
(1)选质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。
(2)将按图2天然hetRNA分析流程分析得到的微RNA序列Ubap2l作为天然hetRNA的候选分子(含两端前体序列)。
(3)以小鼠基因组为模板,通过PCR扩增,得到上述含内含子的前体序列hetRNA-Ubap2l precursor。
(4)用Fermantus公司的FastDigest酶Hind III和EcoR I分别酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒和序列hetRNA-Ubap2l precursor。
(5)将上述序列hetRNA-Ubap2l precursor亚克隆进载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的Hind III和EcoR I位点。
(6)将步骤(5)所得到测序正确的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Ubap2l质粒转染293FT细胞。
(7)用TRIZOL试剂,按公司说明操作,提取细胞总RNA。
(8)将步骤(7)所得到的RNA用STEM-LOOP PCR方法检测目标hetRNA-Ubap2l的表达。
结果如图4所示。结果表明,使用实施例1中的筛选系统,证实了内含子剪接反应(upper panel)的发生和成熟hetRNA-Ubap2l(lower panel)的产生(图4B)。也用跨过内含子的引物证实了内源性的剪接发生(upper panel),也分析了小鼠中几个组织的表达情况(lower panel)(图4C)。这说明我们建立的hetRNA筛选验证系统的确有效,能够在传统分析数据后被丢弃的数据中找到天然的hetRNA。hetRNA-Ubal2l:24nt(小鼠),aaaggaccugacucaggcua agaa(SEQ ID NO.:22)。
本实施例中验证的相应前体为:caaaaggacc ugacucaggc uaagaaugguuuuagcucug ugcaggccac gcag(SEQ ID NO.:24)。
实施例4天然hetRNA-PCCB分子的检测
在本实施例中,对另一个大鼠附睾“垃圾”RNA数据(用常规方法进行T载体克隆测序而获得)进行筛选。
具体实施的方案如下:
(1)选质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。
(2)将按图2天然hetRNA分析流程分析得到的大鼠微RNA序列PCCB作为天然hetRNA的候选分子(含两端前体序列)。
(3)将这个大鼠微RNA的前体与人的基因组序列比对,找到在人中的同源序列(含两端前体序列)。
(4)以人293FT细胞基因组为模板,通过PCR扩增,得到上述含内含子的前体序列hetRNA-PCCB precursor。
(5)用Fermantus公司的FastDigest酶Hind III和EcoR I分别酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒和序列hetRNA-PCCB precursor。
(6)将上述序列hetRNA-PCCB precursor亚克隆进载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的Hind III和EcoR I位点。
(7)将步骤(5)所得到测序正确的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PCCB质粒转染293FT细胞。
(8)用TRIZOL试剂,按公司说明操作,提取细胞总RNA
(9)将步骤(8)所得到的RNA用STEM-LOOP PCR方法检测目标hetRNA-PCCB的表达。
结果如图5所示。结果发现并证明了一个天然的hetRNA-Pccb。
hetRNA-Pccb:22nt(人和鼠相同),ucaucaccag gaaggccuau gg(SEQ ID NO.:23)。
本实施例中验证的相应前体为:gucacaguca ucaccaggaa ggccuauggaggugccuaug augucaugag cucuaagcac cuuuguggug auaccaacua(SEQ ID NO.:25)。
此外,通过这个大鼠的hetRNA-Pccb前体与人基因组的比对,找到了其同源序列,并使用筛选系统,证实了内含子剪接反应(upper panel)的发生和成熟hetRNA-PCCB(lowerpanel)的产生(图5C)。本发明人还分析了大鼠中几个组织的表达情况(图5D)。测序结果表明,live,stomach,和intestine的条带大小不对,测序也不对。在附睾中由于丰度低RT-PCR并没有检测到(sequencing reads只有2),但在睾丸中检测到,测序也正确。这说明本发明人建立的hetRNA筛选验证系统的确有效,能够在传统分析数据后被丢弃的数据中找到天然的hetRNA。
结合实施例3和4,说明了通过本发明方法,可以在小鼠、大鼠数据库中找到天然hetRNA,而且在人中也有同源的序列发现。
讨论
研究表明,对一般的测序平台来说,的确有明显比例的数据是不能在基因组中找到定位的【Blow N.,Nature2009;458(7235):239-242.】。
虽然最近人们在高通量测序数据中发现一种不连续的即被一个内含子所隔开的小于200nt的小RNA【Nature2009;457(7232):1028-1032.;Mercer TR,Dinger ME,BrackenCP et al.,Genome Res;20(12):1639-1650.;Valen E,Preker P,Andersen PR et al.,Nat Struct Mol Biol;18(9):1075-1082.】。但是,在本发明之前尚没有发现和证实过有小于30nt的不连续的微RNA。
本发明的研究表明,在丢弃的深度测序数据中,会存在着一种新的内含子打断微RNA(<30nt,not<200nt),即具发夹样前体的外显子连接微RNA(hetRNAs)。因为这种hetRNA完全不同于现有的微RNA,需要构建一种简单方便快速的研究技术来进行验证,并进行后续天然hetRNA的筛选。
上述实验说明本发明人建立的hetRNA筛选验证系统非常有效,能够在传统分析数据后被丢弃的数据中找到天然的hetRNA。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种构建用于前体包含内含子的微RNA筛选的数据库的方法,其特征在于,所述方法包括:
(a)提供一微小RNA深度测序数据库,
其中所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列记为RNAj0,其中RNAj0表示序号为j0的RNA序列,j0为1-n0的正整数,n0为所述微小数据库中的RNA序列总数,并且RNAj0是未能与基因组序列匹配的微小RNA,并且所述微小RNA测序数据库不包括已验证或证实的前体包含内含子的微RNA和已知小RNA的RNA序列;
(b)将所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列RNAj0,与标准RNA数据库进行比对,从而在所述标准RNA数据库中排除与各RNA序列RNAj0不匹配的标准RNA序列,并选取标准RNA数据库中与RNAj0匹配的标准RNA,并将对应于该匹配的标准RNA的截短序列组成一级RNA筛选库,其中,所述标准RNA的截短序列的结构如式I所示:
X-SEQRNAj0-Y (I)
式中,
SEQRNAj0为相匹配的RNAj0的核苷酸序列;
X为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接上游的长度为50-100bp的核苷酸序列;
Y为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接下游的长度为50-100bp的核苷酸序列;
“-”为连接X和SEQRNAj0以及连接SEQRNAj0和Y的键;
其中所述一级RNA筛选库所含有的各标准RNA的截短序列记为RNAj1,其中,RNAj1表示序号为j1的标准RNA的截短序列,其中j1为1-n1的正整数,n1为一级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(c)将所述一级筛选库中的RNAj1,与基因组序列数据库进行比对,从而排除不含有内含子的RNA序列,并且选取内含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列,组成二级RNA筛选库,
其中所述二级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj2,其中,RNAj2表示序号为j2的RNA序列,其中j2为1-n2的正整数,n2为二级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(d)将所述二级筛选库中的RNAj2序列进行二级结构分析,进行二级结构预测,排除无法形成茎环结构的RNA序列,并将所述二级筛选库中可形成茎环结构的RNA序列组成三级RNA筛选库,即用于前体包含内含子的微RNA筛选的数据库,
其中,所述三级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj3,RNAj3表示序号为j3的RNA序列,其中j3为1-n3的正整数,n3为三级RNA筛选库中的RNA序列总数。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的微小RNA测序数据库中的RNA序列长度为18-30nt。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(d)中还包括:将所述微小RNA测序数据库中对应于RNAj0的各RNA序列组成相应的成熟前体包含内含子的微RNA库。
4.一种鉴定由包含内含子的前体包含内含子的微RNA前体产生的成熟前体包含内含子的微RNA的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)提供一微小RNA深度测序数据库,
其中所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列记为RNAj0,其中RNAj0表示序号为j0的RNA序列,j0为1-n0的正整数,n0为所述微小数据库中的RNA序列总数,并且RNAj0是未能与基因组序列匹配的微小RNA,并且所述微小RNA测序数据库不包括已验证或证实的前体包含内含子的微RNA和已知小RNA的RNA序列;
(b)将所述微小RNA测序数据库中的各RNA序列RNAj0,与标准RNA数据库进行比对,从而在所述标准RNA数据库中排除与各RNA序列RNAj0不匹配的标准RNA序列,并选取标准RNA数据库中与RNAj0匹配的标准RNA,并将对应于该匹配的标准RNA的截短序列组成一级RNA筛选库,其中,所述标准RNA的截短序列的结构如式I所示:
X-SEQRNAj0-Y (I)
式中,
SEQRNAj0为相匹配的RNAj0的核苷酸序列;
X为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接上游的长度为50-100bp的核苷酸序列;
Y为所述标准RNA中位于所述RNAj0直接下游的长度为50-100bp的核苷酸序列;
“-”为连接X和SEQRNAj0以及连接SEQRNAj0和Y的键;
其中所述一级RNA筛选库所含有的各标准RNA的截短序列记为RNAj1,其中,RNAj1表示序号为j1的标准RNA的截短序列,其中j1为1-n1的正整数,n1为一级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(c)将所述一级筛选库中的RNAj1,与基因组序列数据库进行比对,从而排除不含有内含子的RNA序列,并且选取内含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列,组成二级RNA筛选库,
其中所述二级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj2,其中,RNAj2表示序号为j2的RNA序列,其中j2为1-n2的正整数,n2为二级RNA筛选库中的RNA序列总数;
(d)将所述二级筛选库中的RNAj2序列进行二级结构分析,进行二级结构预测,排除无法形成茎环结构的RNA序列,并将所述二级筛选库中可形成茎环结构的RNA序列组成三级RNA筛选库,
其中,所述三级RNA筛选库所含有的各RNA记为RNAj3,RNAj3表示序号为j3的RNA序列,其中j3为1-n3的正整数,n3为三级RNA筛选库中的RNA序列总数;和
(e)对三级RNA筛选库中的RNAj3序列,测定其形成前体包含内含子的微RNA的能力,其中,如果所述RNAj3能够形成前体包含内含子的微RNA,则所述的RNAj3是包含内含子的前体包含内含子的微RNA前体,而其所形成的前体包含内含子的微RNA为成熟前体包含内含子的微RNA。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的前体包含内含子的微RNA来源于选自下组的物种:哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的哺乳动物包括人、啮齿动物、灵长目、牛、羊、猪、狗、猫。
7.一种鉴定候选RNA序列是否是包含内含子的前体包含内含子的微RNA前体的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)构建一表达载体,所述表达载体携带对应于待鉴定的RNA序列的DNA序列并可将所述DNA序列表达为RNA序列,其中所述的待鉴定的RNA序列包含内含子;
(ii)用所述表达载体转染受体细胞,并培养所述的经转染的受体细胞;
(iii)鉴别所述的经转染的受体细胞中前体包含内含子的微RNA,从而确定所述待鉴定的RNA序列是否是包含内含子的前体包含内含子的微RNA前体,其中,如果与对照的受体细胞相比,并经测序列证明,在经转染的受体细胞中形成了对应于所述待鉴定的RNA序列的前体包含内含子的微RNA序列,则表示待鉴定的RNA序列是包含内含子的前体包含内含子的微RNA前体,而所形成的前体包含内含子的微RNA为成熟前体包含内含子的微RNA。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,在步骤(iii)中,鉴别步骤包括:抽提所述经转染的受体细胞的总RNA;PCR扩增待验证的成熟前体包含内含子的微RNA序列;以及对上述PCR扩增序列进行测序验证。
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