CN116763810B - Ptbp1抑制剂及其在制备促进细胞向神经分化及转分化的药物中的应用 - Google Patents

Ptbp1抑制剂及其在制备促进细胞向神经分化及转分化的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PTBP1抑制剂及其在制备促进细胞向神经分化及转分化的药物中的应用。本发明提供的特定核苷酸序列合并化学修饰的PTBP1抑制剂能够特异性地抑制PTBP1的mRNA和蛋白表达水平，通过降低人真皮成纤维细胞和人脐带间充质干细胞中PTBP1的表达水平，可显著抑制成纤维细胞、间充质干细胞的增殖，并促进人脐带间充质干细胞发生神经转分化获得神经元样的细胞。本发明在研发和制备促进神经转分化的药物，治疗脑卒中、帕金森病、脑损伤等神经系统相关疾病的神经细胞替代治疗中具有广泛的用途。

Description

PTBP1抑制剂及其在制备促进细胞向神经分化及转分化的药 物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种反义寡核苷酸分子，具体涉及一种PTBP1抑制剂及其在制备促进细胞向神经分化及转分化的药物中的应用。
背景技术
多聚嘧啶串结合蛋白（Polypyrimidine tract-binding protein，PTB）是一种典型的RNA结合蛋白，含有4个RNA识别基序（RNA recognition motif，RRM），可直接结合富含CU的碱基基序，从而参与前体mRNA（pre-mRNA）的剪切调控。人类基因组共编码了三个PTB家族相关蛋白，其中PTBP1在除神经元之外的细胞中表达，而PTBP2只在分化和成熟的神经元中表达，PTBP3则主要在免疫细胞中表达。研究表明，PTBP1在非神经细胞中可结合在内含子的不同位置而促进或者抑制前体mRNA中盒式外显子的选择利用。已知PTBP1可抑制神经元的发育和分化过程，其抑制神经分化的功能主要通过两种机制来实现：（1）抑制神经细胞特异性剪接异构体的选择利用以达到抑制神经分化的功能；（2）PTBP1可结合在mRNA的3’ UTR区，以增加REST复合物关键组份的RNA稳定性，从而达到抑制神经细胞相关基因转录的目的。
利用小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲降PTBP1可在体外将神经前体细胞、成纤维细胞等多种细胞直接转变为神经元。近年来的研究表明，利用AAV病毒载体系统在星形胶质细胞中敲降PTBP1，也能诱导其原位转分化为功能性多巴胺能神经元，从而重建帕金森病（PD）小鼠模型受损的神经环路，减轻运动功能障碍。这些前期研究成果为神经退行性疾病的治疗提供了新的思路，但是，由于AAV载体系统的神经毒性，以及体内原位转分化效率低且难以示踪的难题，限制了该疗法的转化应用潜力。
人类中枢神经系统 (central nervous system，CNS) 应对损伤的修复能力有限，且受损的神经元一旦死亡就无法再生，从而导致严重且不可逆的临床症状。正是基于这一现实，科学家们尝试将体外诱导分化的神经元或者神经前体细胞移植到神经损伤区域，以达到神经细胞补充和环路重建的目的。但是，由于移植后的神经元存活率低下、难以有效整合，以及神经干细胞无法无限增殖等问题，阻碍了这类神经细胞移植疗法的临床应用。
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，简称MSCs）是一类成体干细胞，呈典型的成纤维细胞形态，在体外可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。已知MSCs具有抑制炎症反应、调节免疫细胞、促进组织修复和再生的功能。由于人脐带来源的MSCs（Humanumbilical cord mesenchymal stem cells，简称hUCMSCs）具有取材方便、自我更新和多向分化能力强、免疫原性低等优点，被广泛用于骨关节炎、肝硬化、肺纤维化、心血管疾病和糖尿病等疾病的临床试验项目研究。近年来的大鼠移植实验表明，HUCMSC可显著促进神经损伤修复，改善动物表型。考虑到HUCMSCs具有多向分化潜能，如果能将其移植入神经损伤区域，并将其原位定向转分化为神经元，将有望替代丢失的神经元并重建神经环路，以实现神经退行性疾病及损伤的有效治疗。因此，开发促进MSC定向转分化为神经元的方法和技术显得尤为迫切。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种PTBP1抑制剂，该PTBP1抑制剂可以特异性地降低人脐带间充质干细胞和成纤维细胞中PTBP1的mRNA和蛋白质表达水平，同时可促进细胞向神经分化及转分化的能力。
为了实现上述目的，本发明提供一种PTBP1抑制剂包含如下所示反义寡核苷酸分子中的一种或多种：ASO-1、ASO-2、ASO-3、ASO-4、 ASO-5、ASO-6、ASO-7、ASO-8、ASO-9、ASO-10、ASO-11、ASO-12、ASO-13、ASO-14；
其中，ASO-1的序列如Seq ID No.1所示：5’-GCAGCTTGAGGAATGGCAAA-3’；
ASO-2的序列如Seq ID No.2所示：5’-TGAGCTTGGAAAAGTCGATG-3’；
ASO-3的序列如Seq ID No.3所示：5’-CCGTAGACGCCGAAAAGAAT-3’；
ASO-4的序列如Seq ID No.4所示：5’-CTGGAAATATTGCTAGGCAC-3’；
ASO-5的序列如Seq ID No.5所示：5’-CAGGCGTTGTAGATGTTCTG-3’；
ASO-6的序列如Seq ID No.6所示：5’-CGGAGAGGCTGAGATTATAC-3’；
ASO-7的序列如Seq ID No.7所示：5’-CATACGGAGAGGCTGAGATT-3’；
ASO-8的序列如Seq ID No.8所示：5’-TTGAGGAATGGCAAAGGTGG-3’；
ASO-9的序列如Seq ID No.9所示：5’-GGCGGCGGGAAGCGTGCTTT-3’；
ASO-10的序列如Seq ID No.10所示：5’-AAAATGGGATCACGTGACGG-3’；
ASO-11的序列如Seq ID No.11所示：5’-AGGGGGAGAAAATGGGATCA-3’；
ASO-12的序列如Seq ID No.12所示：5’-GAATGATGGAAGTTGTCGCC-3’；
ASO-13的序列如Seq ID No.13所示：5’-GCTAAGGTCACTTCAGCTGT-3’；
ASO-14的序列如Seq ID No.14所示：5’-GGTGAGCAAGGTGAACTAGA-3’。
优选地，本发明进一步对上述反义寡核苷酸分子进行修饰后的分子也具有PTBP1抑制剂作用，且更稳定，可提供ASO的商品化应用。
具体地，所述修饰为硫代磷酸酯键修饰、2’-O甲氧基乙基基团修饰、5-甲基脱氧核糖胞苷修饰。
更进一步地，所述反义寡核苷酸分子5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基基团修饰；当反义寡核苷酸分子中含有未进行2’-O-甲氧基乙基基团修饰的核苷酸C时，核苷酸C采用5-甲基脱氧核糖胞苷修饰，全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
本发明还提供上述PTBP1抑制剂在制备促进细胞向神经分化及转分化的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种PTBP1抑制剂，该PTBP1抑制剂能够特异性地抑制PTBP1蛋白的活性，降低人脐带间充质干细胞、成纤维细胞中PTBP1 mRNA和蛋白质表达水平，显著抑制人脐带间充质干细胞和成纤维细胞的增殖能力，并诱导人脐带间充质干细胞向神经元样的细胞分化，从而作为制备神经损伤修复和再生治疗的相关药物，如治疗脑卒中的细胞注射液。
附图说明
图1为磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的连接结构示意图；其中，A为磷酸二酯键，B为硫代磷酸酯键。
图2为2’-O-甲氧基乙基基团修饰的结构示意图；其中，A为修饰前呋喃糖基环的2’位为羟基，B为修饰后呋喃糖基环的2’位为甲氧乙基。
图3为5-甲基脱氧核糖胞苷的结构示意图；其中，A为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，B为5-甲基脱氧核糖胞苷。
图4为本发明提供的PTBP1抑制剂在人脐带间充质干细胞中抑制PTBP1 mRNA的相对表达水平的荧光定量PCR统计分析结果图。
图5为本发明提供的PTBP1抑制剂在人真皮成纤维细胞中抑制PTBP1 mRNA的相对表达水平的荧光定量PCR统计分析结果图。
图6为本发明提供的PTBP1抑制剂在人脐带间充质干细胞中抑制PTBP1蛋白的相对表达水平图。
图7为本发明提供的PTBP1抑制剂在人真皮成纤维细胞中抑制PTBP1蛋白的相对表达水平图。
图8为本发明提供的mASO-1在DNA酶I作用下的稳定性分析结果图。
图9为本发明提供的mASO-1在RNA酶A作用下的稳定性分析结果图。
图10为本发明提供的mASO-1在不同温度下的稳定性分析结果图。
图11为本发明提供的mASO-1、mASO-6、ASO-1和ASO-6在转染人脐带间充质干细胞后抑制PTBP1 mRNA的表达水平图。
图12为本发明提供的mASO-1、mASO-6、ASO-1和ASO-6在转染人真皮成纤维细胞后抑制PTBP1 mRNA的表达水平图。
图13为本发明提供的60 nM终浓度的mASO-1和mASO-6在hUCMSCs中转染24 h后检测PTBP1 mRNA的表达水平图。
图14为本发明提供的60 nM浓度的mASO-1和mASO-6不加转染试剂的条件下直接处理hUCMSCs 24 h后检测PTBP1 mRNA的表达水平图。
图15为本发明提供的100 nM浓度的mASO-1和mASO-6在hUCMSCs中转染24 h后检测PTBP1 mRNA的表达水平图。
图16为本发明提供的100 nM浓度的mASO-1和mASO-6不加转染试剂的条件下直接处理hUCMSCs 24 h后检测PTBP1 mRNA的表达水平图。
图17为本发明提供的60nM浓度的mASO1和mASO-6在添加转染试剂情况下PTBP1mRNA表达水平的作用效率统计图。
图18为本发明提供的60nM浓度的mASO1和mASO-6在不添加转染试剂情况下PTBP1mRNA表达水平的作用效率统计图。
图19为本发明提供的mASO-1和mASO-6直接处理人真皮成纤维细胞24h后使用MTT法检测细胞增殖曲线的结果。
图20为本发明提供的mASO-1和mASO-6直接处理人真皮成纤维细胞24h后使用Ki67抗体染色法检测Ki67阳性细胞比例的统计图。
图21为本发明提供的mASO-1和mASO-6直接处理人脐带间充质干细胞24h后使用MTT法检测细胞增殖曲线的结果。
图22为本发明提供的mASO-1和mASO-6直接处理人脐带间充质干细胞24h后使用Ki67抗体染色法检测Ki67阳性细胞的荧光照片。
图23为本发明提供的mASO-1和mASO-6直接处理人脐带间充质干细胞24h后使用Ki67抗体染色法检测Ki67阳性细胞比例的统计图。
图24为本发明提供的mASO-1和mASO-6处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，用RT-qPCR的方法检测细胞中干细胞标志分子CD90mRNA表达水平的统计图。
图25为本发明提供的mASO-1和mASO-6处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，用RT-qPCR的方法检测细胞中神经细胞标志分子Tuj1 mRNA表达水平的统计图。
图26为本发明提供的mASO-1和mASO-6处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，用RT-qPCR的方法检测细胞中神经细胞标志分子NEUN mRNA表达水平的统计图。
图27为本发明提供的mASO-1和mASO-6处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，用RT-qPCR的方法检测神经细胞标志分子MAP2 mRNA表达水平的统计图。
图28为本发明提供的mASO-1处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，免疫荧光方法分析神经细胞标志分子Tuj1的阳性细胞免疫荧光图。
图29为图28的统计图。
图30为本发明提供的mASO-1处理的人脐带间充质干细胞经过28天分化后，免疫荧光方法分析神经细胞标志分子MAP2的免疫荧光图。
图31为图30的统计图。
具体实施方式
以下介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，这些实施例为示例性描述，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASOs）被定义为化学合成的寡核苷酸单链，通常长度为12-30个核苷酸，可以通过Watson-crick碱基配对规则与目标mRNA结合。ASOs的碱基互补配对长度决定了它们的特异性。ASOs和目标mRNA结合以后，会诱导内源的RNase H1特异性切割目标mRNA，释放后的ASOs可继续作用于其他目标mRNA。未经修饰的ASOs在体内会被核酶迅速降解，为了增强寡核苷酸药物特性，需要进行化学结构改造和制剂开发。
ASOs是最早应用的一类核酸药物。ASOs药物具有特异性高、靶向范围广、免疫原性低、毒性及不良反应小等优点，已成为各种疾病治疗的优选手段。ASOs作为治疗性药物可以高特异性地抑制靶标mRNA的表达水平。因此，靶向PTBP1的反义寡核苷酸在促进干细胞神经定向分化和神经替代治疗中有着非常重要的研究意义和临床应用价值。本发明根据预测的PTBP1的RNA结构设计了14条靶向PTBP1全长的反义寡核苷酸，本发明所提供的反义寡核苷酸序列的特异性和抑制PTBP1的作用明显，提高了PTBP1抑制剂的效率。
本发明所述含修饰的PTBP1反义寡核苷酸主要包含在上述靶向PTBP1的原始反义寡核苷酸序列上，添加一些特殊的化学修饰等，使这些序列更加稳定和适用于细胞转染实验和商品化应用。本发明所述十四条反义寡核苷酸序列进行的化学修饰主要包括如下所述几种具体修饰类型：
本发明所述硫代磷酸酯键修饰指反义寡核苷酸分子的每个核苷酸间通过硫代磷酸酯键连接，即用硫原子取代磷酸二酯键中非桥接的氧原子之一来修饰二酯键，如图1所示，其中A为DNA骨架的碱基之间一个标准的磷酸二酯键连接，两个五碳糖通过磷酸键形成典型的寡核苷酸骨架，B为硫代磷酸酯键，硫原子提升反义寡核苷酸分子的稳定性。
本发明所述2’-O-甲氧基乙基基团修饰指反义寡核苷酸分子中5’-端和3’-端的5个连续核苷酸包含修饰的2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团。2’-O-甲氧基乙基基团是指呋喃糖基环的2’位的3甲氧基修饰（羟基修饰为甲氧乙基），如图2所示，其中，A为修饰前呋喃糖基环的2’位为羟基，B为修饰后呋喃糖基环的2’位为甲氧乙基。2’-O-甲氧基乙基基团修饰可以增强核酸酶抵抗能力，减少脱靶效应并增强反义寡核苷酸的杂交亲和力。
本发明所述5-甲基脱氧核糖胞苷（5-Me-dC）修饰指在胞嘧啶脱氧核糖核苷酸碱基的第五位修饰甲基，如图3所示，其中，A为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，B为5-甲基脱氧核糖胞苷。5-Me-dC与dG碱基互补配对，该修饰提高了双链的稳定性，向寡核苷酸中每掺入一个5-Me-dC，寡核苷酸的Tm值可提高约1.3℃。
CpG基序（CpG motif）是DNA序列中的一种特殊序列模式，由两个连续的碱基组成：胞嘧啶（C，Cytosine）和鸟嘌呤（G，Guanine），它们以磷酸二酯键（phosphodiester bond）相连。在某些情况下，ASO设计时会包含CpG基序，因为CpG基序在免疫调节中具有重要作用。但是，包含CpG基序的ASO给药到动物体内后，会激活Toll-like receptor 9（Toll样受体9）而引起比较大的免疫反应。研究发现用5-Me-dC替代dC则可以大幅减弱这种免疫反应。在真核生物中，5-Me-dC是最常见的DNA甲基化修饰；哺乳动物中，大多数5-Me-dC发生在CpG位点，并由DNA甲基转移酶将甲基转移到胞嘧啶上进行修饰；5-Me-dC在胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。
材料：
1. 人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）货号为HT-X2318，购买自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；人真皮成纤维细胞（HDF）货号为PCS-201-012，购自美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
2. 人干细胞专用无血清培养基：MSCBM培养基（货号：6114011）购买自北京达科为生物技术有限公司。
3. DMEM高糖培养基（货号：11966025）、DMEM/F-12培养基（货号：10565018 ）、Neurobasal培养基（货号：21103049）、Opti-MEM培养基（货号：31985070 ）和 GlutaMAXTM添加剂（货号：35050061） ，LipoRNAiMAX 转染试剂（货号：13778150）和青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)（货号：15140122）均购自英潍捷基（上海）贸易有限公司。
4. TRIZOL REAGENT（货号：15596026）购买自英潍捷基（上海）贸易有限公司。Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix（货号：11203ES08）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。
5. 抗体： Anti-Ki67 antibody（ab16667）购自北京永泰兴成商贸有限公司；anti-Tuj1抗体（货号：801201）和anti-MAP2（货号：840601）均购买于美国Bio-legend公司；内参蛋白 ACTB购买自武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司，货号：AC026。
实施例1：PTBP1抑制剂的制备及表达
1. PTBP1抑制剂的制备
人多聚嘧啶串结合蛋白1（Polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）的转录本变异体1序列（NM_002819）全长3206 bp，具体序列如Seq ID No.15所示：
attccggcgcctccactccgtcccccgcgggtctgctctgtgtgccatggacggcattgtcccagatatagccgttggtacaaagcggggatctgacgagcttttctctacttgtgtcactaacggaccgtttatcatgagcagcaactcggcttctgcagcaaacggaaatgacagcaagaagttcaaaggtgacagccgaagtgcaggcgtcccctctagagtgatccacatccggaagctccccatcgacgtcacggagggggaagtcatctccctggggctgccctttgggaaggtcaccaacctcctgatgctgaaggggaaaaaccaggccttcatcgagatgaacacggaggaggctgccaacaccatggtgaactactacacctcggtgacccctgtgctgcgcggccagcccatctacatccagttctccaaccacaaggagctgaagaccgacagctctcccaaccaggcgcgggcccaggcggccctgcaggcggtgaactcggtccagtcggggaacctggccttggctgcctcggcggcggccgtggacgcagggatggcgatggccgggcagagccccgtgctcaggatcatcgtggagaacctcttctaccctgtgaccctggatgtgctgcaccagattttctccaagttcggcacagtgttgaagatcatcaccttcaccaagaacaaccagttccaggccctgctgcagtatgcggaccccgtgagcgcccagcacgccaagctgtcgctggacgggcagaacatctacaacgcctgctgcacgctgcgcatcgacttttccaagctcaccagcctcaacgtcaagtacaacaatgacaagagccgtgactacacacgcccagacctgccttccggggacagccagccctcgctggaccagaccatggccgcggccttcggtgcacctggtataatctcagcctctccgtatgcaggagctggtttccctcccacctttgccattcctcaagctgcaggcctttccgttccgaacgtccacggcgccctggcccccctggccatcccctcggcggcggcggcagctgcggcggcaggtcggatcgccatcccgggcctggcgggggcaggaaattctgtattgctggtcagcaacctcaacccagagagagtcacaccccaaagcctctttattcttttcggcgtctacggtgacgtgcagcgcgtgaagatcctgttcaataagaaggagaacgccctagtgcagatggcggacggcaaccaggcccagctggccatgagccacctgaacgggcacaagctgcacgggaagcccatccgcatcacgctctcgaagcaccagaacgtgcagctgccccgcgagggccaggaggaccagggcctgaccaaggactacggcaactcacccctgcaccgcttcaagaagccgggctccaagaacttccagaacatattcccgccctcggccacgctgcacctctccaacatcccgccctcagtctccgaggaggatctcaaggtcctgttttccagcaatgggggcgtcgtcaaaggattcaagttcttccagaaggaccgcaagatggcactgatccagatgggctccgtggaggaggcggtccaggccctcattgacctgcacaaccacgacctcggggagaaccaccacctgcgggtctccttctccaagtccaccatctaggggcacaggcccccacggccgggccccctggcgacaacttccatcattccagagaaaagccactttaaaaacagctgaagtgaccttagcagaccagagattttatttttttaaagagaaatcagtttacctgtttttaaaaaaattaaatctagttcaccttgctcaccctgcggtgacagggacagctcaggctcttggtgactgtggcagcgggagttcccggccctccacacccggggccagaccctcggggccatgccttggtggggcctgtgtcgggcgtggggcctgcaggtgggcgccccgaccacgacttggcttccttgtgccttaaaaaacctgccttcctgcagccacacacccacccggggtgtcctggggacccaaggggtgggggggtcacaccagagagaggcagggggcctggccggctcctgcaggatcatgcagctggggcgcggcggccgcggctgcgacaccccaaccccagccctctaatcaagtcacgtgattctcccttcaccccgcccccagggccttcccttctgcccccaggcgggctccccgctgctccagctgcggagctggtcgacataatctctgtattatatactttgcagttgcagacgtctgtgcctagcaatatttccagttgaccaaatattctaatcttttttcatttatatgcaaaagaaatagttttaagtaactttttatagcaagatgatacaatggtatgagtgtaatctaaacttccttgtggtattaccttgtatgctgttacttttattttattccttgtaattaagtcacaggcaggacccagtttccagagagcaggcggggccgcccagtgggtcaggcacagggagccccggtcctatcttagagcccctgagcttcagggaaggggcgggcgtgtcgccgcctctggcatcgcctccggttgccttacaccacgccttcacctgcagtcgcctagaaaacttgctctcaaacttcagggttttttcttccttcaaattttggaccaaagtctcatttctgtgttttgcctgcctctgatgctgggacccggaaggcgggcgctcctcctgtcttctctgtgctctttctaccgcccccgcgtcctgtcccgggggctctcctaggatcccctttccgtaaaagcgtgtaacaagggtgtaaatatttataattttttatacctgttgtgagacccgaggggcggcggcgcggttttttatggtgacacaaatgtatattttgctaacagcaattccaggctcagtattgtgaccgcggagccacaggggaccccacgcacattccgttgccttacccgatggcttgtgacgcggagagaaccgattaaaaccgtttgagaaactcctcccttgtctagccctgtgttcgctgtggacgctgtagaggcaggttggccagtctgtacctggacttcgaataaatcttctgtatcctc。
人多聚嘧啶串结合蛋白1（Polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1）CDS的氨基酸序列长度为550aa，具体序列如Seq ID No.16所示：
MDGIVPDIAVGTKRGSDELFSTCVTNGPFIMSSNSASAANGNDSKKFKGDSRSAGVPSRVIHIRKLPIDVTEGEVISLGLPFGKVTNLLMLKGKNQAFIEMNTEEAANTMVNYYTSVTPVLRGQPIYIQFSNHKELKTDSSPNQARAQAALQAVNSVQSGNLALAASAAAVDAGMAMAGQSPVLRIIVENLFYPVTLDVLHQIFSKFGTVLKIITFTKNNQFQALLQYADPVSAQHAKLSLDGQNIYNACCTLRIDFSKLTSLNVKYNNDKSRDYTRPDLPSGDSQPSLDQTMAAAFASPYAGAGFPPTFAIPQAAGLSVPNVHGALAPLAIPSAAAAAAAAGRIAIPGLAGAGNSVLLVSNLNPERVTPQSLFILFGVYGDVQRVKILFNKKENALVQMADGNQAQLAMSHLNGHKLHGKPIRITLSKHQNVQLPREGQEDQGLTKDYGNSPLHRFKKPGSKNFQNIFPPSATLHLSNIPPSVSEEDLKVLFSSNGGVVKGFKFFQKDRKMALIQMGSVEEAVQALIDLHNHDLGENHHLRVSFSKSTI。
结合上述PTBP1基因全长序列，通过RNA结构预测工具RNAstructure（https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/）预测了PTBP1 RNA的二级结构，选取其中位于单链区的RNA作为靶标序列，设计14条靶向PTBP1的反义寡核苷酸作为PTBP1抑制剂，由湖州河马生物科技有限公司合成。
ASO-1的序列如Seq ID No.1所示：5’-GCAGCTTGAGGAATGGCAAA-3’；
ASO-2的序列如Seq ID No.2所示：5’-TGAGCTTGGAAAAGTCGATG-3’；
ASO-3的序列如Seq ID No.3所示：5’-CCGTAGACGCCGAAAAGAAT-3’；
ASO-4的序列如Seq ID No.4所示：5’-CTGGAAATATTGCTAGGCAC-3’；
ASO-5的序列如Seq ID No.5所示：5’-CAGGCGTTGTAGATGTTCTG-3’；
ASO-6的序列如Seq ID No.6所示：5’-CGGAGAGGCTGAGATTATAC-3’；
ASO-7的序列如Seq ID No.7所示：5’-CATACGGAGAGGCTGAGATT-3’；
ASO-8的序列如Seq ID No.8所示：5’-TTGAGGAATGGCAAAGGTGG-3’；
ASO-9的序列如Seq ID No.9所示：5’-GGCGGCGGGAAGCGTGCTTT-3’
ASO-10的序列如Seq ID No.10所示：5’-AAAATGGGATCACGTGACGG-3’
ASO-11的序列如Seq ID No.11所示：5’-AGGGGGAGAAAATGGGATCA-3’
ASO-12的序列如Seq ID No.12所示：5’-GAATGATGGAAGTTGTCGCC-3’
ASO-13的序列如Seq ID No.13所示：5’-GCTAAGGTCACTTCAGCTGT-3’
ASO-14的序列如Seq ID No.14所示：5’-GGTGAGCAAGGTGAACTAGA-3’。
上述具体反义寡核苷酸交由湖州河马生物科技有限公司合成。
同时，由湖州河马生物科技有限公司合成一条针对随机选择碱基或重排获得的“Scramble”靶序列设计的反义寡核苷酸为阴性对照（Ctrl ASO），序列Seq ID No.17为：5’-TCTATGTACTCGGTACCGTT-3’。本发明中的ASO通过与scramble ASO进行比较，可以确认观察到的效应是否是由于目标ASO与目标基因的特异性相互作用引起的，从而确定PTBP1ASO的特异性。
2. PTBP1抑制剂对PTBP1表达的影响
(1) 人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）和人真皮成纤维细胞（HDF）的培养
人脐带间充质干细胞在无血清的间充质干细胞培养基中培养。人真皮成纤维细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养。待人脐带间充质干细胞或人真皮成纤维细胞生长到至汇集度达到70-80％，利用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以每孔500,000个细胞分别将hUCMSCs或HDF接种到6孔板中，37℃，5%CO2饱和湿度条件培养过夜。
(2) 细胞转染：
配制以下溶液：
寡核苷酸溶液：将合成的ASO-1至ASO-14的粉末，分别用PBS溶解至终浓度为100µM的ASO-1至ASO-14溶液。
细胞转染用溶液分为A和B两部分：
溶液A：20 µl LipoRNAiMAX 转染试剂 + 500µl Opti-MEM培养基。
溶液B：2 µl浓度为100nM的寡核苷酸溶液 + 500 µl Opti-MEM培养基，共500 µl。
溶液A和B配制后室温静置5 min，将溶液A和溶液B混合均匀，室温静置20 min，之后按每孔1 ml混合溶液加入到培养hUCMSCs或HDF的六孔板中。将六孔板置于37℃的CO2培养箱培养6 h，之后吸去细胞中的混合溶液，hUCMSCs细胞更换成无血清的间充质干细胞培养基，HDF细胞更换为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37°C，5% CO2细胞培养箱中进行培养。
(3) 更换培养基后继续培养48h，吸去细胞培养基，加入RNA提取试剂 TRIZOLREAGENT从细胞分离RNA，将RNA反转录为cDNA后通过实时定量PCR的方法检测PTBP1的mRNA水平。RT-qPCR使用人PTBP1的引物，上游引物序列如Seq ID No.18所示：5’-CTCCAAGTTCGGCACGTGTTG-3’，下游引物序列如Seq ID No.19所示：5’-CAGGCGTTGTAGATGTTCTGCC-3’，使用RT-qPCR的方法检测PTBP1的mRNA水平，实验数据采用非配对t检验，结果如图4和图5所示，其中****表示P<0.0001，***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。图4显示人脐带间充质干细胞的mRNA水平，图5显示人真皮成纤维细胞的mRNA水平，以Ctrl ASO作为阴性对照。
从图4和图5可以看出，人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞经过终浓度100nM的ASO-1至ASO-14任一种处理后，细胞中PTBP1的mRNA水平下降，其中ASO-1、ASO-6、ASO-9、ASO-12、ASO-13和ASO-14在两种细胞中的敲降效率最好，降低mRNA水平的效率可达75%以上，与同时合成的阴性对照ASO（Ctrl-ASO）相比，ASO-1至ASO-14任一种均可实现降低PTBP1mRNA的表达。
（4）蛋白印迹杂交：
利用1%的SDS裂解液从细胞分离出总蛋白，进一步通过蛋白质免疫印迹法检测PTBP1蛋白水平，具体步骤：
配制溶液：
10 × TBS溶液(1L): 250mM Tris-HCl，1500mM NaCl；
氯化钠 88 g；
Tris碱 30 g；
1 × TBST溶液：25mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05%吐温-20，PH8.0；
100ml 10 × TBS；
898 ml 双蒸水；
1.3 ml 盐酸；
0.5 ml 吐温-20；
封闭溶液: 5% 脱脂牛奶（溶于TBST溶液）。
1）蛋白电泳：细胞总蛋白定量后，取20 µg加入垂直蛋白电泳槽，120伏恒压下跑电泳约2小时。2）将聚丙烯酰胺蛋白胶取出，与PVDF膜一起移入转膜槽，安装转膜装置后，200毫安恒流转膜2小时。3）从转移装置中取出PVDF膜，用封闭缓冲液阻断非特异性位点，在室温下轻轻摇晃1小时。4）移除封闭缓冲液并加入适当的一抗稀释液，将PVDF膜与一抗在2-8℃下孵育过夜。5）在TBST缓冲液中简单冲洗膜1 min，将膜悬浮在TBST缓冲液中清洗，摇床晃动洗膜，每次15 min共3次。6）用稀释比1:20,000的HRP标记的二抗室温下孵育PVDF膜1小时。7）重复用TBST缓冲液洗膜，每次15 min共3次。8）将等量的稳定过氧化物溶液和鲁米诺/增强剂溶液混合，准备工作溶液。9）将膜与工作液孵化5 min，从工作液中取出，放在塑料膜保护套中；用吸水纸巾去除多余的液体，并仔细压出印迹和膜保护膜表面之间的气泡。10）将膜放在压片盒中，蛋白面朝上。暗室压X光片，曝光显影，结果如图6和图7所示，其中以ACTB作为内参对照。
从图6和图7可以看出，人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞经过ASO-1至ASO-14任一种转染48小时后，相对于内参蛋白 ACTB的表达，细胞中PTBP1蛋白表达明显减少，其中，ASO-1和ASO-6对PTBP1蛋白表达的抑制作用是最优的，PTBP1蛋白几乎检测不到，这与mRNA水平的检测结果一致。
实施例2：ASO的稳定性检测
本发明为了进一步对上述ASO在体内应用的稳定性维持及在商业化应用、保存和运输中的稳定性的提高，对上述实施例1中的ASO-1至ASO-14进行了化学修饰得到mASO-1至mASO-14，具体如下：
mASO-1为在ASO-1的5’-GCAGCTTGAGGAATGGCAAA-3’的5’-端和3’-端的5个连续的核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），序列中全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-2为在ASO-2的5’-TGAGCTTGGAAAAGTCGATG-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-3为ASO-3的5’-CCGTAGACGCCGAAAAGAAT-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-4为ASO-4的5’-CTGGAAATATTGCTAGGCAC-3’的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-5为ASO-5的5’-CAGGCGTTGTAGATGTTCTG-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-6为ASO-6的5’-CGGAGAGGCTGAGATTATAC-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-7为ASO-7的5’-CATACGGAGAGGCTGAGATT-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-8为ASO-8的5’-TTGAGGAATGGCAAAGGTGG-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-9为ASO-9的5’-GGCGGCGGGAAGCGTGCTTT-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-10为ASO-10的5’-AAAATGGGATCACGTGACGG-3’的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-11为ASO-11的5’-AGGGGGAGAAAATGGGATCA-3’的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-12为ASO-12的5’-GAATGATGGAAGTTGTCGCC-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-13为ASO-13的5’-GCTAAGGTCACTTCAGCTGT-3’的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
mASO-14为ASO-14的5’-GGTGAGCAAGGTGAACTAGA-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
同时以Ctrl ASO的序列按照上述修饰方法进行修饰，制备mCtrl ASO，将Ctrl ASO的序列5’-TCTATGTACTCGGTACCGTT-3’ 的5’-端和3’-端的5个连续核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰（斜体加粗所示），未进行2’-O-甲氧基乙基（MOE）基团修饰的核苷酸C采用5-Me-dC修饰（下划线所示），全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
(1) 含化学修饰的反义寡核苷酸的合成： 按上述化学修饰类型标注的ASO序列，交由湖州河马生物科技有限公司合成mASO-1至mASO-14，以及mCtrl ASO，并以mASO-1为代表测试修饰后序列的稳定性，mCtrl ASO为阴性对照。
(2) DNA酶I处理：按照实施例1中的方法，配制100µM浓度的ASO-1和100µM浓度的mASO-1。分别取ASO-1 、mASO-1各1µl，加入10 × DNA酶反应缓冲液和DNA酶I，37 ℃条件下分别处理2 h、8 h、12 h和24 h，之后取处理结果进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图8所示。从图8可以看出，ASO-1在DNA酶I作用下两小时即被完全降解（第二列），而mASO-1在DNA酶I作用2 h、8 h、12 h直至24 h仍非常稳定，未发生明显的降解。
(3) RNA酶A处理：分别取100µM浓度的ASO-1和mASO-1各1 µl，加入10 × DNA酶反应缓冲液和RNA酶A，37 ℃条件下分别处理2 h、8 h、12 h和24 h，之后进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示。从图9可以看出，ASO-1在RNA酶作用两小时后即被完全降解，而mASO-1在2 h、8 h、12 h直至24 h仍非常稳定，未发生明显的降解。
(4) 反义寡核苷酸在不同温度下的稳定性检测：取100 µM浓度的mASO-1，分别在4℃和37℃两个温度条件下处理，-20℃作为对照，mASO-1放置1天、2天、4天和7天之后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图10所示。从图10可以看出，与保存在-20℃的mASO-1序列相比，本发明中合成的mASO-1在4℃和37℃仍非常稳定，未发生明显的降解。
(5) mASO-1和mASO-6转染细胞：
将合成的mASO-1和mASO-6分别溶于PBS中制备成浓度为100µM的溶液，同样方法配制ASO-1和ASO-6的溶液作为对照。同时以Ctrl ASO作为未修饰组的阴性对照，mCtrl ASO作为修饰组的阴性对照。
采用实施例1中步骤（2）至步骤（3）进行操作分别转染人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞，结果分别如图11和图12所示，实验数据采用非配对t检验，其中，图11中****表示P<0.0001，***表示P<0.001，图12中**** 表示P<0.0001，***表示P<0.001，**表示P<0.01。
从图11和图12可以看出，人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞经过终浓度100 nM的mASO-1和mASO-6任一种处理后，细胞中PTBP1的mRNA水平均有下降，并且与未修饰的ASO-1和ASO-6的作用相比效果相同，说明修饰后的mASO也可实现降低PTBP1 mRNA的表达作用。
从上述结果可以看出，采用修饰后的反义寡核苷酸不仅保持了原始未修饰的反义寡核苷酸的效果，而且在保存、运输中可以保持稳定，具有更好的商业应用价值。
实施例3：检测不同浓度的mASO-1和mASO-6在添加转染试剂和不添加转染试剂的处理条件下在人脐带间充质干细胞中抑制PTBP1 mRNA的表达情况
根据实施例1中ASOs对PTBP1 mRNA水平以及蛋白质表达的敲降效率， ASO-1和ASO-6的抑制效果较好，接下来以结合实施例2选择mASO-1和mASO-6进行后续实验。
(1) 反义寡核苷酸的合成与稀释：按本发明中的Ctrl ASO-1的核苷酸序列合成一条含化学修饰的反义寡核苷酸作为对照即mCtrl ASO。配制100 µM浓度的mASO-1和mASO-6以及mCtrl ASO。
(2) 人脐带间充质干细胞（hUMSCs）的培养
将hUMSCs在有含10％血清替代物的间充质干细胞培养基中培养，所用干细胞培养基为人干细胞专用无血清培养基。待细胞生长至汇集度达到70-80％，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以每孔500，000个把细胞分别接种到6孔板中，培养过夜。
(3) 细胞转染：
1）用转染试剂LipoRNAiMAX转染
配制以下溶液：
溶液A：每份20 µl LipoRNAiMAX 转染试剂 + 500 µlOpti-MEM培养基，按所需处理的孔数配若干份。
溶液B：500 µl Opti-MEM培养基配制终浓度为60 nM和100 µM的反义寡核苷酸溶液，按所需处理的孔数配若干份。
将以上溶液A和B室温静置5 min后，溶液A和溶液B混合均匀，室温静置20 min，期间用0.25%胰酶消化hUMSCs或HDF细胞，1000 rpm离心5 min，细胞沉淀重悬于Opti-MEM，计数，每孔铺50000个细胞。再将上述 A和B的混合液按每孔1 ml混合溶液加入到已经铺了细胞的六孔板中。六孔板置于37℃的CO2培养箱培养6 h，之后更换为含10％血清替代物的间充质干细胞培养基。
2）mASO-1和mASO-6无转染试剂添加处理细胞：
将实施例1中配制的浓度为100µM/µl的mASO-1和mASO-6分别用Opti-MEM培养基稀释为终浓度为60 nM和100 nM的mASO-1以及终浓度为60 nM和100 nM的mASO-6。
在前述步骤(2)培养hUCMSCs或HDF的六孔板中吸去细胞培养基，每孔加入500 µl人脐带间充质干细胞无血清培养基或不含血清的DMEM培养基。分别将上述配制的终浓度为60 nM和100nM的mASO-1以及终浓度为60 nM和100 nM的mASO-6室温静置5 min后，按每孔500µl加入到六孔板中，每组为三个生物学重复，置于CO2培养箱培养24h，之后更换为每孔2mL的含青链霉素的人脐带间充质干细胞培养基。
以mCtrl-ASO作为阴性对照，分别配制成终浓度为60 nM和100 nM的对照组溶液处理细胞。
(4) 在培养48 h后，吸去细胞培养基，加入RNA提取试剂TRIZOL从细胞分离RNA，将RNA反转录为cDNA后通过实时定量PCR的方法检测PTBP1的mRNA水平。RT-qPCR使用人源PTBP1的引物，上游引物序列如Seq ID No.18所示：5’-CTCCAAGTTCGGCACGTGTTG-3’，下游引物序列如Seq ID No.19所示：5’-CAGGCGTTGTAGATGTTCTGCC-3’，使用RT-qPCR检测PTBP1的mRNA水平，实验数据采用非配对t检验，结果如图13至图16所示。图13为60 nM终浓度的mASO-1和mASO-6在hUCMSCs中转染24 h后检测PTBP1 mRNA的表达，其中+LipoRNAiMAX表示使用转染试剂转染，***表示P<0.001，**表示P<0.01。图14为60 nM浓度的mASO-1和mASO-6不加转染试剂的条件下直接处理hUCMSCs 24 h后检测PTBP1mRNA的表达，其中-LipoRNAiMAX表示不使用转染试剂处理，***表示P<0.001。图15为100nM浓度的mASO-1和mASO-6在hUCMSCs中转染24 h后检测PTBP1 mRNA的表达，其中+LipoRNAiMAX表示使用转染试剂转染，****表示P<0.0001。图16为100 nM浓度的mASO-1和mASO-6不加转染试剂的条件下直接处理hUCMSCs 24 h后检测PTBP1 mRNA的表达，其中-LipoRNAiMAX表示不使用转染试剂处理，****表示P<0.0001，***表示P<0.001。
从图13至图16可以看出，人脐带间充质干细胞经过终浓度60 nM和100 nM的mASO-1与mASO-6分别处理细胞后，均可导致PTBP1的mRNA水平下降。其中浓度为100 nM 的mASO-1和mASO-6降低mRNA水平的效率可达80%以上。60 nM或100 nM终浓度的mASO-1和mASO-6在不添加转染试剂的条件下直接处理细胞，对PTBP1mRNA的抑制作用要优于同等条件下添加转染试剂组。
本发明提供的mASO-1和mASO-6可直接用于处理细胞，避免了转染试剂添加对细胞状态和活性的影响，以及转染试剂对细胞培养基和缓冲液的要求，本发明中经修饰ASO转染方法不限于其他靶基因的ASO转染和其它细胞的ASO转染，涉及的修饰ASO更加稳定，转染无需添加转染试剂从而减小了转染试剂对细胞的毒性，更适用于相关神经系统疾病包括脑卒中、帕金森病等疾病和神经损伤的神经元替代治疗或体内应用。
实施例4：mASO-1和ASO-6抑制人真皮成纤维细胞中PTBP1的表达和细胞增殖情况
(1) 细胞铺板：按照实施例1中的方法， HDF在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养。待细胞生长至汇集度70-80％，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以每孔500,000个分别接种到6孔细胞培养板中，37℃，5%CO2饱和湿度条件培养过夜。
(2) HDF用mASO-1或mASO-6处理：按照实施例1中的方法，配制60 nM终浓度的体积2 µL 的mASO-1溶液或mASO-6溶液，同时配制60 nM终浓度的实施例3的提供的mCtrl ASO溶液作为阴性对照。
(3)按照实施例3步骤(2)-(3)的方法对使用60 nM终浓度的mASO-1或mASO-6对人真皮成纤维细胞进行转染或直接处理，结果如图17和图18所示，其中图17为加入转染试剂的（+LipoRNAiMAX），图18为不加转染试剂直接转染的（-LipoRNAiMAX），采用非配对t检验，所有数值均为平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复。图17中***表示P<0.001，图18中****表示P<0.0001，***表示P<0.001。
(4) MTT方法检测细胞增殖：按照实施例1中的培养方法培养人真皮成纤维细胞，不加转染试剂的mASO-1或mASO-6处理24 h后的人真皮成纤维细胞分别以每孔3000个细胞接种到96孔板上。每孔加入含10％血清DMEM培养基至200µl，每种细胞重复接种5个复孔。每种细胞组，同时以mCtrl ASO处理细胞作为阴性对照。细胞铺好后将96孔板放入培养箱中，5% CO2和37℃培养。
在培养第0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天，取出96孔板，每孔中加入10µlMTS（购自Promega）溶液，然后在37℃培养箱中避光孵育2 h，酶标仪测定490 nm波长处的吸光值。检测7天的所有OD值绘制细胞增殖曲线，结果如图19所示，其中采用非配对t检验，所有数值均为平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复。图19中****表示P<0.0001。
(5) Ki67细胞增殖检测：应用购自上海生工的Ki67 细胞增殖检测试剂盒（细胞免疫荧光法）检测mASO-1和mASO-6处理后的人真皮成纤维细胞的增殖能力。
具体步骤为：1）mASO-1或mASO-6处理48 h后的HDF用0.25%胰酶消化，1000 rpm离心5 min，重悬沉淀于培养基中，铺在预先用Poly-D-Lysine处理过的细胞爬片。2）细胞培养过夜后，吸走培养基用PBS洗细胞3次，每次5 min。然后用4%多聚甲醛室温固定20 min。 3）洗涤：PBS 洗 3 次，每次 5 min。4）通透：0.1%-0.5% 的 Triton X-100 室温透膜 5-10min，用PBS洗涤 3 次，每次 5 min。5）封闭：加适量封闭液（3%牛血清白蛋白），湿盒中室温孵育 30-60 min。 6）封闭后，轻轻擦干样品周围的封闭液，加入一抗：按1:100-1:500 用封闭液稀释 Anti-ki67 Rabbit antibody (Component A)； 每个样品中加入稀释好的Anti-ki67 Rabbit antibody (Component A)，4°C 湿盒中孵育过夜。 7）复温：从 4°C 冰箱取出，室温孵育 60 min。PBS洗涤洗 3 次，每次 5 min。洗涤后，轻轻擦干样品周围的封闭液。 8） Ki67荧光抗体孵育：每个样品加入 5 μL FITC-conjugated Goat anti-RabbitKi67抗体 (1:500 稀释)，室温避光孵育 60 min。PBS洗涤3 次，每次 5 min。9）复染：用DAPI 进行复染，主要对细胞核进行染色，室温下避光染色15min。10）用抗淬灭的封片剂封片，荧光倒置显微镜进行检测分析，结果如图20所示，其中采用非配对t检验，所有数值均为平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，***表示P<0.001。
从图17至图18可以看出，人真皮成纤维细胞经过终浓度60 nM的mASO-1与mASO-6分别处理后，均可导致PTBP1的mRNA水平下降。其中，mASO-1和mASO-6在不添加转染试剂的条件下直接处理细胞，对PTBP1 mRNA的抑制作用要优于同等条件下添加转染试剂组。
图19可以看出，mASO-1和mASO-6对人成纤维细胞处理后的细胞增殖有明显的抑制作用，图20可以看出，mASO-1或mASO-6处理后的人真皮成纤维细胞组，Ki67阳性细胞的比例明显下降，细胞增殖明显受到抑制。
实施例5：mASO-1和ASO-6抑制人脐带间充质干细胞中PTBP1的表达和细胞增殖。
(1) 细胞铺板：按照实施例1中的方法，人脐带间充质干细胞在无血清的培养基中培养。待细胞生长至汇集度70-80％，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，以每孔500,000个分别接种到6孔细胞培养板中，37℃，5%CO2饱和湿度条件培养过夜。
(2) 人脐带间充质干细胞用mASO-1和mASO-6处理：按照实施例1中的方法，配制60nM终浓度的体积2 µl 的mASO-1溶液或mASO-6溶液，同时配制60 nM终浓度的实施例3的提供的mCtrl ASO溶液作为阴性对照。
(3) MTT方法检测细胞增殖：按照实施例1中的培养方法，mASO-1和mASO-6处理24h后的人脐带间充质干细胞分别以每孔3000个细胞接种到96孔板上。每孔加入无血清间充质干细胞培养基至200µl，每种细胞重复接种5个复孔。每种细胞组另设mCtrl-ASO处理组和不加药物组为阴性对照和空白对照（Mock）。细胞铺好后将96孔板放入培养箱中，5% CO2和37℃培养。
在培养第0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天，取出96孔板，每孔中加入10µlMTS（购自Promega）溶液，然后在37℃培养箱中避光孵育2 h，酶标仪测定490 nm波长处的吸光值。检测7天的所有OD值绘制细胞增殖曲线，结果如图21所示，其中采用非配对t检验，所有数值均为平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，****表示P<0.0001。
(4) Ki67细胞增殖检测：应用购自上海生工的Ki67 细胞增殖检测试剂盒（细胞免疫荧光法）检测mASO-1和mASO-6处理后的人脐带间充质干细胞的增殖能力。具体步骤按照实施例4步骤(5)，结果如图22和图23所示，其中，图22为荧光显微镜下染色的照片，最左列为PTBP1的染色照片。图23为每组选取不同视野进行的阳性细胞统计图，其中采用非配对t检验，所有数值均为平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，****表示P<0.0001。
从图21可以看出，mASO-1和mASO-6对人脐带间充质干细胞处理后的细胞增殖有明显的抑制作用，从图22和图23中可以看出，mASO-1和mASO-6处理后的人脐带间充质干细PTBP1染色阳性率减少，Ki67阳性细胞的比例明显下降。
从实施例1至实施例5可以看出mASO可以降低细胞中PTBP1蛋白的表达水平，同时显著抑制人干细胞、体细胞系等不同细胞的增殖能力。本发明mASO-1和mASO-6可显著抑制人脐带间充质干细胞和人真皮成纤维细胞的生长增殖。
实施例6:利用mASO-1或mASO-6敲降PTBP1可促进人脐带间充质干细胞向神经元的定向分化
(1) 细胞铺板：按照实施例1中的培养方法培养人脐带间充质干细胞，以每孔350，000个细胞分别接种到6孔板中，培养过夜。
(2) 细胞处理：按照实施例1中的方法，以100 nM浓度的mASO-1或mASO-6处理人脐带间充质干细胞48 h。然后用终浓度100 µg/ml的Poly-L-ornithine处理12孔细胞培养板中的玻璃爬片，37℃处理过夜后吸走液体，利用灭菌的双蒸水洗涤玻片两次，再用终浓度为10 µg/ml的laminin在37℃处理玻片2 h，PBS洗一次。在ASO处理细胞24 h后，用0.25%的胰酶消化细胞，细胞计数后，按每孔100,000个细胞铺在预先处理过的爬片上。
(3) 诱导人脐带间充质干细胞向神经分化：
1）配制神经转分化培养基：N3/basal +NTF培养基：Neurobasal 培养基与DMEM/F12培养基1:1混合 (Life Technologies , 11330032)，其中加入25ng/ml 胰岛素（I9278），50ng/mlapo-transferrin (T4117)，30 nM sodium selenite，20 nMprogesterone (Sigma)，100 nM putrescine (Sigma)，0.4%B27和1%青链霉素。每次配制前新鲜加入CNTF (20ng/ml)，BDNF (10ng/ml)，NT3 (10ng/ml) and GDNF (20ng/ml)，上述四种细胞因子均购自苏州近岸蛋白质科技有限公司。
2）细胞转分化：更换人脐带间充质干细胞培养基为上述神经转分化培养基，隔日半量更换培养基。
(4) 在诱导分化到28天时，取部分分化前后的细胞进行神经相关标志物的mRNA表达水平检测。吸去细胞培养基，加入RNA提取试剂TRIZOL从细胞分离RNA，将RNA反转录为cDNA，通过实时定量PCR的方法检测分化前后细胞中不同标志物：干细胞标志物CD90和神经元标志物MAP2、NEUN以及Tuj1的mRNA表达水平。
以人CD90、MAP2、NeUN和Tuj1的引物进行qPCR的验证，引物序列如下：
CD90上游引物如Seq ID No.20所示： 5’-GAAGGTCCTCTACTTATCCGCC -3’；下游引物如Seq ID No.21所示： 5’-TGATGCCCTCACACTTGACCAG-3’。MAP2上游引物如Seq ID No.22所示：5’-AGGCTGTAGCAGTCCTGAAAGG-3’；下游引物如Seq ID No.23所示：5’-CTTCCTCCACTGTGACAGTCTG-3’。
NEUN上游引物如Seq ID No.24所示：5’-TACGCAGCCTACAGATACGCTC-3’；下游引物如Seq ID No.25所示：5’-TGGTTCCAATGCTGTAGGTCGC-3’。
Tuj1上游引物如Seq ID No.26所示：5’- GAGGAGATGACTCCTTCAACACC -3’；下游引物如Seq ID No.27所示：5’- TGATGAGCTGCTCAGGGTGGAA -3’。
结果如图24至图27所示，其中，Mock代表仅加入相同体积的Opti-MEM培养基处理的细胞作为空白对照(Mock组)，图24中的CD90作为未分化的标志分子对照，其中，采用非配对t检验，所有数值均用平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，图24中 ****表示P<0.0001，图25中***表示P<0.001，图26中****表示P<0.0001，图27中****表示P<0.0001。从图24至图27可以看出，CD90作为间充质干细胞的表面标志，在mASO-1处理后的分化28天的细胞中几乎不表达，而在细胞分化28天后，神经元的标志物Tuj1、MAP2和NEUN的 mRNA表达水平明显上升，说明mASO-1可促进人脐带间充质干细胞向神经元的分化。
(5) 免疫荧光分析：细胞分化第28天，弃去培养基，用PBS润洗后，每孔加入4％多聚甲醛固定15 min。然后用PBS洗涤液，洗涤5 min，重复三次。加入1 ml 0.3％Triton X-100透化液处理15 min，再用PBS洗涤三次，每次5 min。加入3% BSA溶液室温封闭样品30min，吸掉封闭液，加入神经标志蛋白抗体Tuj1或MAP2在4℃下孵育过夜。第二天，移走抗体液，PBS洗涤三次后，加入荧光二抗，室温下避光孵育2h，再用PBS洗涤。用DAPI染细胞核，室温孵育15 min后，PBS洗片，取出爬片用抗淬灭的封片剂封片于载玻片上，避光晾干。用激光共聚焦显微镜拍照，每个视野选取50个细胞进行阳性率的统计，加入神经标志蛋白抗体Tuj1的结果如图28和图29所示，其中，图29采用非配对t检验，所有数值均用平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，***表示P<0.001。加入神经标志蛋白抗体MAP2的结果如图30和图31所示，其中，图31采用非配对t检验，所有数值均用平均值±标准差表示，每组为三个生物学重复，**表示P<0.01。
从图28至图31可以看出，诱导分化28天后的人脐带间充质干细胞与未分化的细胞相比较，神经元的标志物Tuj1和MAP2的表达水平明显上升，细胞形态呈现胞体小且伸出较长的突触的神经细胞形态，说明mASO-1可促进人脐带间充质干细胞向神经元的分化。
从实施例6可以看出，mASO-1和mASO-6可促进人脐带间充质干细胞向神经元的分化。
从上述实施例可以看出本发明提供的反义寡核苷酸分子ASO-1至ASO-14能够特异性地抑制PTBP1蛋白的活性。而且，对上述原始序列添加一定的化学修饰后，可以使ASO更加稳定，有助于商业化。修饰后的mASO也具有降低人成纤维细胞、间充质干细胞中PTBP1的mRNA和蛋白质表达水平，显著抑制人成纤维细胞和间充质干细胞增殖并促进细胞向神经细胞转分化，在研发和制备神经替代治疗药物上具有广泛的用途。由于无需使用细胞转染试剂即可达到抑制效果，从而具有优秀的商业化应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进并且这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种PTBP1抑制剂，其特征在于，为反义寡核苷酸分子ASO-1，其中，该ASO-1的序列如Seq ID No.1所示。
2.一种PTBP1抑制剂，其特征在于，为对反义寡核苷酸分子ASO-1进行修饰的分子mASO-1，其中，该ASO-1的序列如Seq ID No.1所示，具体修饰为：mASO-1为在ASO-1的5’-端和3’-端的5个连续的核苷酸均采用2’-O-甲氧基乙基基团修饰，序列中全部核苷酸之间均通过硫代磷酸酯键连接。
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