CN114622002A - 一种对总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行绝对定量的方法 - Google Patents

一种对总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行绝对定量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行绝对定量的方法。具体而言，本发明涉及一种对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的方法，其包括以下步骤：a)任选地对所述样品进行预处理；b)将所述样品用稀释液稀释；c)将稀释的样品与反应体系混合；d)生成液滴，使得大多数液滴，优选每个液滴包含不多于一个细胞外囊泡；e)裂解液滴中的细胞外囊泡；f)进行数字液滴PCR（ddPCR）的反应；和g)进行ddPCR检测。

Description

一种对总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外 囊泡进行绝对定量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及细胞外囊泡的检测和计数。
背景技术
细胞外囊泡（Extracellular Vesicle, EV）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微粒/微囊泡（Microvesicle, MV）、凋亡小体、肿瘤小泡和外泌体（Exosome）组成。越来越多的证据表明，细胞外囊泡在许多生理过程，比如细胞间通讯、抗原呈递以及细胞代谢等方面发挥着至关重要的作用。由于细胞外囊泡的特征类似于其亲代细胞，因此它们被认为是疾病诊断、预后以及治疗的下一代生物标志物。由于细胞外囊泡是天然产生的内源性结构，因此它们可以避免机体产生免疫应答和抗性，是运送药物或者其他物质的绝佳载体。此外，健康人和患者的细胞外囊泡数量以及组成有着很大的不同。因此，细胞外囊泡的定量对于促进生理学以及免疫学的研究、细胞外囊泡的研究和应用、药物的递送以及疾病的诊断与治疗等有着至关重要的作用。
目前细胞外囊泡的定量技术主要包括免疫亲和捕获定量技术（ImmunoaffinityChromatography, IAC）、非对称流动场场流分离（Asymmetrical-flow field flowfractionation, AF4）、纳米粒子跟踪分析（NTA）、动态光散射技术（DSL）以及表面等离激元共振检测技术（SPR）、利用流式细胞仪对细胞外囊泡进行定量等。
免疫亲和捕获定量技术（Immunoaffinity Chromatography, IAC）是一种利用细胞外囊泡膜中存在的特征性表面蛋白（抗原）与外部添加的标记抗体之间的高度特异性免疫亲和相互作用的技术。免疫亲和捕获存在以下缺点：①由于细胞外囊泡上的许多抗原在其他细胞中也会被发现，因此使用免疫亲和捕获技术需提前对细胞外囊泡进行纯化；②由于靶抗原翻译后的修饰而导致的脱靶结合和表位的掩蔽；③肿瘤的异质性导致不是肿瘤相关的所有细胞都具有靶抗原，这可能导致肿瘤相关的细胞外囊泡被低估；④免疫亲和捕获的性能在很大的程度上取决于抗体质量，重复性不好；⑤免疫亲和捕获中抗体结合所需的长时间孵育会增加样品的污染问题。
非对称流动场场流分离（Asymmetrical-flow field flow fractionation, AF4）是场流分级分离技术的一个子类别，该技术根据大分子和粒子的扩散系数来分离大分子和粒子。当AF4与多检测系统（例如DLS和多角度光散射（MALS）检测器）耦合时，它成为一种可用于表征和量化细胞外囊泡的可靠技术。但是目前该技术还不够成熟，通过优化和标准化场流分离来表征和定量细胞外囊泡的相关研究还比较少；此外，AF4技术通过大小来表征和定量细胞外囊泡，但是无法有效区分脂蛋白或蛋白聚集体等大小相似的杂质，容易使检测结果偏高；最后，AF4技术只能对样品中的细胞外囊泡进行总定量，但是却无法对特定细胞产生的特定细胞外囊泡进行定量，限制了其应用。
纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）是一种旨在表征纳米粒子的光散射技术，对于悬浮在液体中的纳米粒子，例如体液中的细胞外囊泡，纳米粒子的布朗运动速率与其尺寸之间存在直接的相关性，利用这种已建立的相关性，NTA能够通过跟踪悬浮液中的布朗运动来观察细胞外囊泡并生成其大小和浓度数据。但是NTA有其局限性。作为一个相对较新的细胞外囊泡定量技术，NTA容易受样品类型干扰，NTA缺乏细胞外囊泡分析的标准化规程，这会影响NTA在不同条件下对不同样品进行分析的兼容性。例如，一些实验要求样品预处理以去除可能的干扰细胞和其他结构，而其他实验仅简单地进行连续稀释以防止细胞外囊泡的团聚。这些实验的重现性将因此受到影响。由于使用NTA进行分析需要对仪器和软件设置进行手动调整以消除测量中的偏差，因此这很耗时且容易发生人为错误；由于使用NTA所需的高水平的经验和技能，不同的用户也很难获得高度可重复的结果；此外，NTA能对样品中的细胞外囊泡进行总定量，却不容易区分及表征特定的细胞外囊泡。
动态光散射技术（Dynamic Light Scattering, DSL）是一种光散射技术，用于根据以固定角度检测到的散射光强度的波动来表征粒径分布，前提是该粒径比光的波长小。DLS可以基于散射光强度的波动来测量粒度分布，但是在缺乏算法分析的情况下，DLS本身无法确定颗粒浓度。这样，DLS需要与其他技术结合以完成细胞外囊泡的定量和表征，以提供浓度信息，这将带来更大的可变性并可能影响准确性。此外，由于DLS获得的数据偏向较大的颗粒，因为散射光强度可能会掩盖较小的颗粒。这对使用DLS分析多分散样品提出了挑战，因为直径较大的细胞外囊泡会严重干扰直径较小的细胞外囊泡的测定。
表面等离激元共振检测技术（Surface Plasmon Resonance, SPR）是指当入射光的频率与负介电常数和正介电常数的两种材料之间的界面处的离域表面电子的固有频率匹配时，离域表面电子的共振振荡会受到入射光的激发。这种振荡以非辐射电磁波的形式，在平行于具有负介电常数的材料界面（通常是金属薄膜）（即金属薄膜与外部介质之间的界面，即含有分析物的界面）的方向上传播。由于这种振动对界面上的任何变化高度敏感，因此可以将共振频率用作分析信号，以评估带到金属薄膜上的质量痕迹。但是除了与细胞外囊泡相互作用以外，其他任何折射率变化的影响条件都会使得SPR产生信号，从而使得结果不可靠；此外，吸附在SPR芯片上的细胞外囊泡很能去除干净，这就使得SPR芯片很难重复利用多次；最后由于在SPR芯片上的金属膜的厚度也起着重要作用，因此对其进行精细控制可能在一定程度上具有挑战性。
也有人利用流式细胞仪对细胞外囊泡进行表征和定量，但是传统的流式细胞仪无法检测低于250 nm的微粒，因此无法对细胞外囊泡最重要的组成部分——外泌体（直径30-150 nm）进行有效的表征和定量。此外，目前利用流式细胞仪往往需要配合磁珠首先对细胞外囊泡进行免疫亲和捕获才能对细胞外囊泡进行表征和鉴定。这不仅使得操作过程繁琐，还会引入上文涉及的用免疫亲和捕获法定量细胞外囊泡的一系列问题。
最近，申请公布号CN110106233A提出用数字PCR的方法对细胞外囊泡/外泌体进行定量检测，然而该专利有着以下缺点：
①需要先用磁珠对细胞外囊泡/外泌体进行孵育结合，不仅操作过程繁琐、耗时长，还会：因为磁珠与细胞外囊泡/外泌体孵育结合的效率问题（磁珠法无法100%捕获细胞外囊泡/外泌体），从而导致检测结果偏低；磁珠与细胞外囊泡/外泌体孵育结合会引入上文涉及的用免疫亲和捕获法定量细胞外囊泡的一系列问题；
②该专利利用磁珠和数字PCR配合只能对细胞外囊泡/外泌体进行总定量，无法通过数字PCR对细胞外囊泡/外泌体的某个特定的细胞外囊泡进行特异性定量；
③该专利提供的数据大都是基于流式细胞仪的细胞外囊泡/外泌体定量技术；
④细胞外囊泡/外泌体是由磷脂双分子层包裹的囊泡状结构，细胞外囊泡/外泌体的核酸都被包裹在磷脂双分子层内，该专利未涉及到细胞外囊泡/外泌体内核酸的释放过程，未释放的核酸无法与核酸扩增体系相结合，无法实现核酸的扩增，未给出任何使所属技术领域的技术人员能够实施的技术手段；和
⑤该专利涉及用核酸捕获杂交的方法捕获细胞外囊泡/外泌体，但该专利中未涉及去除游离核酸干扰的相关内容，无法保证磁珠核酸捕获杂交的一定是细胞外囊泡/外泌体，而不是游离的核酸，结果的可靠性存在较大问题。
⑥一个磁珠上可能有两个或多于两个的细胞外囊泡/外泌体且一个液滴内可能有两个或多于两个的磁珠，影响定量的准确性。
因此，存在对新的细胞外囊泡及其中含有特异性基因的细胞外囊泡的绝对定量方法的未满足的需求。
发明内容
本发明涉及对新的细胞外囊泡及其中含有特异性基因的细胞外囊泡的绝对定量方法，所述方法区别于现有的细胞外囊泡绝对定量方法，不仅可以对总的细胞外囊泡进行定量，还可以同时对含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量；区别于现有的技术利用特定细胞分泌的细胞外囊泡上的特定蛋白质对这些细胞外囊泡进行捕获、定量或利用细胞外囊泡的特定物理性质对外泌体进行定量，所述方法利用核酸对特定细胞分泌的细胞外囊泡进行分类定量；所述方法不需要用到磁珠对细胞外囊泡进行孵育捕获，省掉了细胞外囊泡提取分离、细胞外囊泡孵育捕获等过程，成本更低、技术要求更简单、检测速度更快，避免了细胞外囊泡在分离、再捕获过程中的损失，使得定量结果更准确可靠；所述方法不仅可以对总的细胞外囊泡进行定量，还可以对特定类型的细胞外囊泡（含有特异性基因的细胞外囊泡）进行定量；所述方法解决现有技术例如CN110106233A无法区分游离核酸与细胞外囊泡，使得结果不可靠的问题，本发明可以排除游离核酸对检测结果的影响。现有常规的细胞外囊泡定量技术无法对微量的细胞外囊泡进行定量（比如最常用的NTA，检测细胞外囊泡的浓度下限不低于10000000个/mL），本发明最低检测线（LoD）更低，可以对单个细胞外囊泡进行定量。
具体而言，在第一方面，本发明涉及一种对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的方法，其包括以下步骤：
a)任选地对所述样品进行预处理；
b)将所述样品用稀释液稀释；
c)将稀释的样品与反应体系混合；
d)生成液滴，使得大多数液滴，优选每个液滴包含不多于一个细胞外囊泡；
e)裂解液滴中的细胞外囊泡；
f)进行数字液滴PCR（ddPCR）的反应；和
g)进行ddPCR检测。
在一些实施方案中，所述样品选自：血浆、血清、尿液、全血、乳汁、唾液、鼻涕、脑脊液、肺泡灌洗液等机体产生的样品；细胞培养基、细胞培养上清液等人工培养的样品；分离或纯化后的细胞外囊泡及其重悬液；和从植物或其他生物中提取的细胞外囊泡。在一些实施方案中，所述稀释液为酸性缓冲液、中性溶液缓冲液或碱性缓冲液或水，优选地所述中性溶缓冲液为pH在5-10之间的缓冲液溶液，更优选地所述溶液的溶剂为水；优选地，所述稀释液选自水Tris缓冲液、PBS溶液缓冲液和含有NaCl溶液的缓冲液。在一些实施方案中，当所述样品为包含细胞、细胞碎片和/或细胞器的复杂样品时，进行所述预处理；优选地所述预处理选自离心和/或过滤。在一些实施方案中，所述反应体系包含用于进行核酸扩增的酶、核酸扩增缓冲液、引物、探针和/或其他组分。在一些实施方案中，所述其他组分为例如蛋白酶等用于消化样品中的杂质和/或缓慢裂解细胞外囊泡的组分。在一些实施方案中，所述蛋白酶在稀释的样品与反应体系混合后的混合溶液中的终浓度为0-1 mg/mL。
在一些实施方案中，所述引物包含两种或更多种引物，和所述探针包含两种或更多种探针；更优选地，所述两种或更多种探针使用两种或更多种不同的荧光染料修饰，例如一种探针用FAM标记，另一种探针用VIC标记；或者一种探针用FAM标记，另一种探针用HEX标记。在一些实施方案中，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针分别对细胞外囊泡所包含的分别在两个或更多个不同的核酸序列上的两种或更多种基因具有特异性。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡进行总定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，例如所述管家基因为GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等；例如针对GAPDH的引物和探针和针对B2M的引物和探针共同组成对细胞外囊泡进行总定量的引物和探针组合。在一些实施方案中，当需要对含有特异性基因的特定的细胞外囊泡进行定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，并且所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中的该特定细胞外囊泡的特异性基因具有特异性，例如一种引物和一种探针对阿比特龙耐药性AR-V7基因具有特异性，和另一种引物和另一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因如B2M基因具有特异性。
在一些实施方案中，样品的稀释倍数用梯度稀释的方法确定，其中所述样品用所述稀释倍数稀释后，阳性液滴数应低于总液滴数的100%，优选地，阳性液滴数应低于总液滴数的50%，更优选地，阳性液滴数应在总液滴数的1%-50%之间。
在一些实施方案中，所述步骤d）中生成液滴所用的原料是步骤c）中的稀释的样品与反应体系混合后的混合溶液。在一些实施方案中，所述步骤d）中生成液滴的体积为0.1nL-10 nL之间，优选地，生成液滴的体积为1 nL。在一些实施方案中，所述步骤d）中生成液滴的个数大于5000个，优选地，生成液滴的数目大于10000个。在一些实施方案中，所述步骤d）中生成液滴的个数应比样品中细胞外囊泡的个数多；尤其优选地，所述步骤d）中生成液滴的个数应是细胞外囊泡个数的2倍以上；更优选地，所述步骤c）中生成液滴的个数应是细胞外囊泡个数的2-100倍之间。
在一些实施方案中，所述步骤e）中的裂解为通过所述反应体系所包含的其他组分和/或通过温度等物理条件引起的细胞外囊泡裂解。
在一些实施方案中，所述步骤f）中进行的数字液滴PCR（ddPCR）的反应包括逆转录反应以及PCR反应。
在一些实施方案中，所述步骤g）中的ddPCR检测包括用商用的ddPCR仪器进行检测或通过PCR反应，对各个液滴中的信号进行检测；优选地，所述信号包括荧光信号、电信号等通过检测液滴之间差异从而区分出阴阳性的现象。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤h)对ddPCR的结果进行分析，优选地，所述ddPCR的结果包括各个液滴中引物和探针的扩增结果、阴性液滴数、特定阳性液滴数、阳性液滴总数、多阳性液滴数、总液滴数、阳性液滴总数占总液滴数的比例、多阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴占总液滴数的比例、多阳性液滴占总液滴数的比例以及其他ddPCR分析软件提供的结果。
在一些实施方案中，所述引物和探针的扩增结果包括各个液滴的荧光值和液滴的阴阳性，其中所述液滴的阴阳性指的是如果液滴的信号大于阈值则为阳性，如果液滴的信号小于阈值则为阴性；所述阈值为本底信号三倍处的荧光值。
在一些实施方案中，所述特定阳性液滴数指的是对以下探针为阳性的液滴的数量，所述探针对细胞外囊泡所包含的特异性基因具有特异性。
在一些实施方案中，所述阳性液滴总数指的是至少一个探针为阳性的液滴。
在一些实施方案中，所述多阳性液滴数指的是对两个或更多个探针均呈阳性的液滴。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤i)对结果进行判断，其中判断标准包括：针对由N对引物和探针组成的反应体系，对基因1的探针呈阳性的液滴数记为a1，对基因2的探针呈阳性的液滴数记为a2，对基因i的探针呈阳性的液滴数记为ai（2≤i≤N），总液滴数记为b，若若对基因1到基因i的探针都呈阳性的多阳性液滴数c满足：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，则判断样品中含有对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡；所述基因1到基因i分别为所述细胞外囊泡中普遍包含的管家基因和特异性基因中的一种，并且分别位于不同的核酸序列上。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡进行总定量时，所述基因1到基因i分别为所述细胞外囊泡中普遍包含的管家基因，例如所述管家基因为GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等。在一些实施方案中，当需要对含有特异性基因的特定的细胞外囊泡进行定量时，所述基因1到基因i中的至少一个基因为特异性基因，例如基因1到基因i中包括至少一个管家基因（如B2M基因）和至少一个特异性基因（如AR-V7基因）。在本发明中，“特异性基因”是指特定部位的健康组织或细胞分泌的细胞外囊泡所特有的基因（比如正常的前列腺分泌的细胞外囊泡含有AR-FL基因，而其他部位如肺部的细胞分泌的细胞外囊泡则不含有AR-FL基因）；和/或病变和/或功能紊乱的组织或细胞分泌的细胞外囊泡所特有的基因（比如人前列腺癌细胞22Rv1所分泌的细胞外囊泡含有AR-V7基因，而正常的前列腺细胞则不分泌AR-V7基因）。
在一些实施方案中，所述方法还包括定量步骤j），其包括：若
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，参与液滴生成的样品总体积为d μL，那么样品中对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e计算为
Figure 499584DEST_PATH_IMAGE004
；当对基因1、基因2、…、基因i都呈阳性的多阳性液滴数c远小于总液滴数b时（例如
Figure DEST_PATH_IMAGE005
时），对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e的计算公式可以简化为
Figure 88829DEST_PATH_IMAGE006
，在样品中细胞外囊泡的浓度为
Figure DEST_PATH_IMAGE007
个/μL。在本发明中，在例如使用两个基因(即i=2)进行检测的情况下，当基因1和基因2均为管家基因时，对基因1和基因2都呈阳性的细胞外囊泡数量e即为样品中细胞外囊泡的总数；当基因1和基因2中的一个为特异性基因时，对基因1和基因2都呈阳性的细胞外囊泡数量e即为样品中含有该特异性基因的特定细胞外囊泡的数量。在一些实施方案中，在例如使用多于两个基因(即i>2)进行检测的情况下，当基因1到基因i均为管家基因并且存在于所有囊泡中时，对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e即为样品中细胞外囊泡的总数；当基因1到基因i中含有至少一个管家基因和至少一个特异性基因并且存在于所要检测的特定囊泡中时，对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e即为样品中含有这个或这些特异性基因的特定细胞外囊泡的数量。在第二方面，本发明涉及一种用于对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的试剂盒或微阵列，其中所述试剂盒或微阵列包含本发明第一方面所定义的反应体系和使用该反应体系进行ddPCR检测的说明书。
在一些实施方案中，所述反应体系包含用于进行核酸扩增的酶、核酸扩增缓冲液、引物、探针和/或其他组分。在一些实施方案中，所述引物包含两种或更多种引物，和所述探针包含两种或更多种探针；更优选地，所述两种或更多种探针使用两种或更多种不同的荧光染料修饰，例如一种探针用FAM标记，另一种探针用VIC标记；或者一种探针用FAM标记，另一种探针用HEX标记。在一些实施方案中，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针分别对细胞外囊泡所包含的分别在两个或更多个不同的核酸序列上的两种或更多种基因具有特异性。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡进行总定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，例如所述管家基因为GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等；例如针对GAPDH的引物和探针和针对B2M的引物和探针共同组成对细胞外囊泡进行总定量的引物和探针组合。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡中的特定细胞外囊泡进行定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，并且所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中的该特定细胞外囊泡的特异性基因具有特异性，例如一种引物和一种探针对阿比特龙耐药性AR-V7基因具有特异性，和另一种引物和另一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因如B2M基因具有特异性。
在第三方面，本发明涉及一种用于对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的系统，其包括：
a)任选的预处理模块，其配置成用于对所述样品进行预处理；
b)稀释模块，其配置成用于对所述样品用稀释液稀释；
c)混合模块，其配置成用于将稀释的样品与反应体系混合；
d)液滴生成模块，其配置成用于生成液滴，使得大多数液滴，优选每个液滴包含不多于一个细胞外囊泡；
e)裂解模块，其配置成用于裂解液滴中的细胞外囊泡；
f)数字液滴PCR反应模块，其配置成用于进行数字液滴PCR（ddPCR）的反应；和
g)检测模块，其配置成用于进行ddPCR检测。
在一些实施方案中，所述反应体系包含用于进行核酸扩增的酶、核酸扩增缓冲液、引物、探针和/或其他组分。在一些实施方案中，所述引物包含两种或更多种引物，和所述探针包含两种或更多种探针；更优选地，所述两种或更多种探针使用两种或更多种不同的荧光染料修饰，例如一种探针用FAM标记，另一种探针用VIC标记；或者一种探针用FAM标记，另一种探针用HEX标记。在一些实施方案中，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针分别对细胞外囊泡所包含的分别在两个或更多个不同的核酸序列上的两种或更多种基因具有特异性。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡进行总定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，例如所述管家基因为GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等；例如针对GAPDH的引物和探针和针对B2M的引物和探针共同组成对细胞外囊泡进行总定量的引物和探针组合。在一些实施方案中，当需要对细胞外囊泡中的特定细胞外囊泡进行定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，并且所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中的该特定细胞外囊泡的特异性基因具有特异性，例如一种引物和一种探针对阿比特龙耐药性AR-V7基因具有特异性，和另一种引物和另一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因如B2M基因具有特异性。
在一些实施方案中，所述系统还包括h)对ddPCR的结果进行分析的模块，优选地，所述ddPCR的结果包括各个液滴中引物和探针的扩增结果、阴性液滴数、特定阳性液滴数、阳性液滴总数、多阳性液滴数、总液滴数、阳性液滴总数占总液滴数的比例、多阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴占总液滴数的比例、多阳性液滴占总液滴数的比例以及其他ddPCR分析软件提供的结果。
在一些实施方案中，所述引物和探针的扩增结果包括各个液滴的荧光值和液滴的阴阳性，其中所述液滴的阴阳性指的是如果液滴的信号大于阈值则为阳性，如果液滴的信号小于阈值则为阴性；所述阈值为本底信号三倍处的荧光值。
在一些实施方案中，所述特定阳性液滴数指的是对以下探针为阳性的液滴的数量，所述探针对细胞外囊泡所包含的特异性基因具有特异性。
在一些实施方案中，所述阳性液滴总数指的是至少一个探针为阳性的液滴。
在一些实施方案中，所述多阳性液滴数指的是对两个或更多个探针均呈阳性的液滴。
在一些实施方案中，所述系统还包括i)对结果进行判断的模块，所述模块经配置用于执行以下判断标准：针对由N对引物和探针组成的反应体系，对基因1的探针呈阳性的液滴数记为a1，对基因2的探针呈阳性的液滴数记为a2，对基因i的探针呈阳性的液滴数记为ai（2≤i≤N），总液滴数记为b，若对基因1到基因i的探针都呈阳性的多阳性液滴数c满足：
Figure 315236DEST_PATH_IMAGE001
，则判断样品中含有对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡；所述基因1到基因i分别为所述细胞外囊泡中普遍包含的管家基因和特异性基因中的一种，并且分别位于不同的核酸序列上。
在一些实施方案中，所述系统还包括j）定量模块，其经配置用于进行下列计算：若参与液滴生成的样品总体积为d μL，那么样品中对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e计算为
Figure 648129DEST_PATH_IMAGE004
；当对基因1到基因i都呈阳性的多阳性液滴数c远小于总液滴数b时（例如
Figure 462501DEST_PATH_IMAGE005
时），对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e的计算公式可以简化为
Figure 206335DEST_PATH_IMAGE006
，在样品中该细胞外囊泡的浓度为
Figure 473368DEST_PATH_IMAGE007
个/μL。
需要说明的是，本发明第二和第三方面可以使用第一方面所有内容例如对样品、稀释液、反应体系、液滴等的定义。
附图说明
图1为细胞外囊泡和特异性细胞外囊泡含有多个核酸序列的多个基因的示意图。
图2为样品中的细胞外囊泡分散到液滴中的示意图。
图3为ddPCR对液滴中的核酸进行检测的示意图。
图4为本发明对样品中的细胞外囊泡的定量结果。
图5为经检测细胞外囊泡参考品2的ddPCR双通道扩增结果。
图6为对样品中掺入的细胞外囊泡标准品2用ddPCR进行检测后各液滴数的统计结果。
图7为在样品中掺入不同浓度的22Rv1外泌体的核酸后，对不同样品的ddPCR检测结果。
图8为在不同的样品类型中掺入等量的细胞外囊泡参考品2后进行ddPCR检测的结果统计。
图9为用不同方式裂解液滴中的细胞外囊泡对检测结果的影响。
具体实施方式
参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。
本发明提出了一种新的细胞外囊泡总数和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡数量的绝对定量方法。相对于现有技术，本发明具有如下优点：
1）采用一种新的ddPCR的方法来对细胞外囊泡的总数及其中含有特异性基因的细胞外囊泡的数量实现绝对定量；
a)这种方法可以通过引物和探针的筛选设计，用ddPCR同时实现细胞外囊泡的总定量和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡的定量；
b)区别于现有技术，本发明不需要用到磁珠，操作更方便、成本更低、适用范围更广；和
c)本发明可以不需要对样本进行预处理，就可以直接用样品进行检测，更便捷；2）本发明提出了一种新的分析、判断方法，可以排除样品中游离核酸对检测结果的干扰，可以方便地判断出样品中是否含有细胞外囊泡；
3）本发明提出了一种新的定量方法，并提供了计算和修正的公式，可以排除样本中游离核酸的干扰，实现样本中细胞外囊泡的绝对定量；
4）本发明方法具有非常高的灵敏度、非常低的最低检测线（LoD），区别于现有的NTA（检测下线为10000000个/mL）等细胞外囊泡定量技术无法精确定量低浓度的细胞外囊泡，本发明可以对单个细胞外囊泡进行定量。
本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非上下文另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。此外，开放式的表述“包括”和“包含”解释为还可以含有没有述及的结构组成部分或方法步骤，但需要注意的是，该开放式的表述也涵盖仅由所述的组分和方法步骤组成的情形(即涵盖了封闭式表述“由……组成”的情形)。
如全文所用，范围用作描述该范围内的每个数值和所有数值的简写形式。范围内的任何数值例如整数值、以十分之一递增的值(当范围的端值为小数点后一位时)或以百分之一递增的值(当范围的端值为小数点后二位时)都可选做该范围的终点。例如，范围0.1nL-10 nL用作描述该范围内的所有数值，例如0.1 nL、0.2 nL、0.3 nL、0.4 nL、0.5 nL、0.6nL、0.7 nL、0.8 nL……9.5 nL、9.6 nL、9.7 nL、9.8 nL、9.9 nL和10 nL (以十分之一递增的值)，并且包括所有子范围，例如0.1 nL-1.0 nL、2.0 nL-3.0 nL、4.0 nL-5.0 nL、6.0nL-7.0 nL、8.0 nL-9.0 nL等。
在本文中，术语“样品”和“样本”可互换使用，意指含有细胞外囊泡的材料。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物在内的细胞培养物和生物或生理流体，例如全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆、稀释黏液等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是人生理流体，例如人血清或人血浆。
在本发明的某些方面，在对包含细胞、细胞碎片和/或细胞器的复杂样品进行稀释前，可通过离心、过滤等步骤进行预处理，以得到不含细胞、细胞碎片、线粒体等含有较大(例如大于0.45 μm)磷脂双分子层膜结构的样品。在一些实施方案中，所述离心指的是通过低速离心去掉细胞，更高速度的离心去除细胞碎片，更高的速度去除凋亡小体、线粒体或其他含有膜结构的细胞器；优选地，通过300 g离心10 min去除细胞，取上清2000 g离心10min去除细胞碎片，取上清10000 g离心30 min去除凋亡小体、线粒体或其他含有膜结构的细胞器。在一些实施方案中，所述离心也可以通过16000 g、4℃离心10 min对样品进行处理。
在本文中，关于管家基因的术语“普遍包含”指的是在所有样品中的外泌体（细胞外囊泡中最重要的一类）中均能检出，且表达等级在前10%的核酸，例如GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等。
在本文中，关于裂解细胞外囊泡的术语“缓慢”指的是需要一定的温度、时间或者满足一些其他的条件才能完成细胞外囊泡的充分裂解。在一些实施方案中，所述温度指的是本发明中PCR反应前所经历的各个温度。在一些实施方案中，所述时间为从样品形成液滴到PCR开始的这一段时间。在一些实施方案中，所述其他条件为步骤d）中所采用的各项措施。
本文所用的“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。本文使用的术语“测序引物”是指用于起始对核酸进行的测序反应的寡核苷酸引物。
本文所用的“探针”是一小段单链DNA或者RNA片段（长度通常在8-50个核苷酸内变化），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、荧光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据探针的标记物种类，可进行放射自显影、荧光发光、酶联化学发光等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。
本发明的引物和探针的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增效果或者探针的杂交效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形成的引物或探针也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。在一个实施方案中，引物和探针的核苷酸序列的修饰形式为如CN103270174A中所公开的化学增强型引物。
探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)可通过报告荧光基团标记，并且探针的另一个末端(例如3'末端或5'末端)可通过相应的淬灭荧光基团标记。例如，探针的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由MGB或BHQ1或BHQ2标记。
在本发明中，扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)。优选使用PCR法对待检测基因进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR (RT-PCR)、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。
在本发明中，可使用各种常规的反转录酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶；禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、黄栖热菌(Thermus flavus)等嗜热微生物的热稳定性反转录酶；MMLV反转录酶的RNA酶H突变体(商品名为SuperScript 和SuperScriptII)。然后，在引物、模板cDNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物)，通过使退火、延伸和变性步骤的循环重复大约30次～50次(例如40次)来进行PCR。
在本发明中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq (注册商标, Takara)、Z-Taq、AccuPrime TaqDNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶。可使用市售反转录酶和DNA聚合酶的混合物，例如BIO-RAD的One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes)。
基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最佳条件。例如，可使用以下条件进行PCR反应：50℃ 60分钟，94℃ 10分钟，94℃ 30秒和60℃60秒 (循环40次)，98℃ 10分钟，4℃持续。
本发明探针与样品中的核酸进行特异性杂交反应，从而实现对扩增产物的定量或定性检测。本发明的探针可通过标记物进行标记以方便光学仪器检测，标记物例如包括荧光物质和生物素中的任一种。标记物的实例包括FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、Dabcyl、ROX、TET、罗丹明、德克萨斯红、HEX、Cyber Green、FAM、MGB、BHQ1和BHQ2等。优选的标记物可包括但不限于FAM、MGB、BHQ1和BHQ2等。通过采用光学检测手段，观察源于这类荧光物质的荧光强度，能够以高灵敏度检测被用于荧光标记的各种荧光物质。标记物还可包括报告荧光基团和淬灭荧光基团。报告荧光基团可为例如FAM、HEX或TET；猝灭荧光基团可为例如TAMRA、MGB、BHQ1或BHQ2。
虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
本文提及的所有文献都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利文件都为所有目的而通过引用结合，引用程度如同单独地指出各个出版物或专利文件一样。
实施例
除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得，用于进行实验的各种具体实验方法均为本领域常规的实验方法或者按照制造商所建议的步骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。
1.细胞外囊泡参考品1的制备：将新鲜收集的健康人的血浆1500g 4℃离心10min；取上清，16000g 4℃离心20 min；取上清，用PBS稀释后，120000g 4℃离心2 h；去上清，用PBS重悬后用NTA对细胞外囊泡重悬进行定量，经过定量后细胞外囊泡的浓度为1 x 109个/mL，如无特殊说明，实施例中所述细胞外囊泡参考品1均为这种细胞外囊泡；
2. 细胞外囊泡参考品2的制备：取阿比特龙耐药的细胞系22Rv1细胞上清1500g 4℃离心10 min；取上清，5000g 4℃离心20 min；取上清，16000g 4℃离心20 min；取上清，用PBS稀释后，120000g 4℃离心2 h；去上清，用PBS重悬后用NTA、透射电镜等手段对细胞外囊泡重悬进行反复精确定量，经过定量后细胞外囊泡的浓度为1 x 109个/mL，如无特殊说明，实施例中所述细胞外囊泡参考品2均为这种22Rv1细胞外囊泡；
3. 如无特殊说明，实施例中所用的ddPCR所用的试剂均为市售试剂，采用的过程为其说明书所述过程（比如BIO-RAD的One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes）；
4. 如无特殊说明，实施例中ddPCR所用的仪器为QX200 Droplet Digital PCRSystem；
5. 如无特殊说明，PBS为1X PBS，pH为7.4；
6. AR-V7基因是对阿比特龙耐药的前列腺癌患者特有的，22Rv1细胞为对阿比特龙耐药的前列腺癌细胞，因此其细胞外囊泡含有AR-V7基因，因此如无特殊说明，除了添加细胞外囊泡参考品2（22Rv1细胞外囊泡）的样品，其他样品均不含有AR-V7基因；
7. 实施例中所用的引物和探针如下：
AR-V7正向引物: 5′-TTGTCCATCTTGTCGTCTTCG-3′;
AR-V7反向引物: 5′-CAATTGCCAACCCGGAATTT-3′;
AR-V7探针：5′-AGCAGGGATGACTCT-3′
B2M正向引物: 5′-GATGAGTATGCCTGCCGTGT-3′
B2M反向引物: 5′-CTGCTTACATGTCTCGATCCCA-3′
B2M探针: 5′-AACTATCTTGGGCTGTGAC-3′
ACTB正向引物: 5′- CCTCGCCTTTGCCGATCC -3′
ACTB反向引物: 5′- ATCATCATCCATGGTGAGCTGG -3′。
ACTB探针：5′- CGGGTGTGGACGGGC -3′
实施例1.本发明对样品中不同浓度的细胞外囊泡的定量
1. 将细胞外囊泡参考品1用PBS进行梯度稀释，将细胞外囊泡参考品1的浓度稀释为1个/10 μL、5个/10 μL、10个/10 μL、50个/10 μL、100个/10 μL
2. 各取10 μL上述稀释好的细胞外囊泡参考品1与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶以及自己设计的细胞外囊泡的管家基因的引物和探针（针对ACTB的引物和探针（用FAM标记）、针对B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物（图1为细胞外囊泡和特异性细胞外囊泡含有多种核酸的示意图）；
3. 按照说明书将反应液混合物生成液滴（图2为含有细胞外囊泡的液滴的示意图）；
4. 按照下面的程序进行PCR：
Figure 672268DEST_PATH_IMAGE008
a)其中50℃过程为逆转录过程，也为发明内容中步骤d）的裂解液滴中的细胞外囊泡的过程；
5. 将PCR完成后的样品用QX200 Droplet Digital PCR System进行检测和分析，按照发明内容中所述的方法对样品进行分析、判断和定量（图3为进行PCR后液滴进行检测的示意图）；
6. 检测结果如图4和表1所示，本发明可以对样品中的细胞外囊泡进行定量，且检测灵敏度非常高，可实现样品中单个细胞外囊泡的检测与定量；本发明对细胞外囊泡的定量结果与细胞外囊泡数量高度拟合，R2达到了0.999以上，是一种非常好的定量方法。
表1：本发明对样品中的细胞外囊泡的定量结果
每10μL样本中细胞外囊泡的个数 用本发明的定量的细胞外囊泡个数
0 0
1 1
5 5
10 9
50 49
100 102
实施例2.对特定的细胞外囊泡的定量以及本发明提出的细胞外囊泡分析判断标准和定量公式的可靠性验证
1. 将用PBS稀释的细胞外囊泡参考品1和用PBS稀释的细胞外囊泡参考品2混合得到样品，使得细胞外囊泡参考品1在样品中的终浓度为100个/10 μL，细胞外囊泡参考品2在样品中的终浓度为10个/10 μL;
2. 取10 μL上述稀释好的样品与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶以及内部设计的特异性引物和探针（针对AR-V7的引物和探针（用FAM标记，细胞外囊泡参考品2的特异性引物和探针）、针对细胞外囊泡的管家基因B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物；
3. 按照说明书将反应液混合物生成液滴；
4. 按照下面的程序进行PCR：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
5. 将PCR完成后的样品用QX200 Droplet Digital PCR System进行检测，检测结果如图5、图6所示；
6. 代入发明内容中的公式
Figure 544409DEST_PATH_IMAGE001
进行分析判断：因为
Figure DEST_PATH_IMAGE011
，因此待检测样品中含有22Rv1细胞外囊泡；
7. 按照发明内容中所述的方法对样品进行定量：将检测到的数据代入公式
Figure DEST_PATH_IMAGE013
，样品中22Rv1细胞外囊泡个数为9.5≈10个，通过本发明的方法以及本发明提供的计算公式计算出的样品中含有的22Rv1细胞外囊泡的结果和实际加入的22Rv1细胞外囊泡结果相同，证明了本发明的有效性以及可靠性；同时证明了本发明提供的细胞外囊泡判断依据的可靠性以及定量计算公式的准确性；
8. 该结果还证明了在多种细胞外囊泡存在的情况下，本发明可以特异性地对某一种细胞外囊泡进行定量。
实施例3.本发明对于游离核酸的抗干扰能力的验证
1. 将用PBS稀释的细胞外囊泡参考品1和用PBS稀释的细胞外囊泡参考品2混合得到样品，在样品中分别加入0个拷贝、1个拷贝、10个拷贝、100个拷贝、1000个拷贝的22Rv1基因的核酸，分别得到样品1、2、3、4、5，细胞外囊泡参考品1在各样品中的终浓度均为100个/10 μL，细胞外囊泡参考品2在各样品中的终浓度均为10个/10 μL;
2. 各取10 μL上述稀释好的样品与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶以及内部设计的特异性引物和探针（针对AR-V7的引物和探针（用FAM标记，细胞外囊泡参考品2的特异性引物和探针）、针对细胞外囊泡的管家基因B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物；
3. 按照说明书将反应液混合物生成液滴；
4. 按照下面的程序进行PCR：
Figure 537773DEST_PATH_IMAGE014
5. 将PCR完成后的样品用QX200 Droplet Digital PCR System进行检测，检测结果如图7所示；
6. 将图7中的结果代入发明内容中的公式
Figure 292103DEST_PATH_IMAGE001
进行分析判断：各样品均满足公式
Figure 950486DEST_PATH_IMAGE001
，因此各待检测样品中均含有22Rv1细胞外囊泡，这与实际的22Rv1细胞添加情况相符，说明本发明具有很好的抗游离核酸的能力，能准确判断出检测数据是来源于游离的核酸还是细胞外囊泡；
7. 按照发明内容中所述的方法对各样品进行定量：将检测到的数据代入公式：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
，
计算得出，样品1中22Rv1细胞外囊泡个数为9.7≈10个、样品2中22Rv1细胞外囊泡个数为10.0≈10个、样品3中22Rv1细胞外囊泡个数为10.4≈10个、样品4中22Rv1细胞外囊泡个数为10.2≈10个、样品5中22Rv1细胞外囊泡个数为10.3≈10个。从结果中我们可以看出，无论加入的游离的核酸是多少，本发明都可以准确地计算出样品中细胞外囊泡参考品2（22Rv1细胞外囊泡的个数）为10个，与实际添加的22Rv1细胞外囊泡的个数相同。证明了本发明可以准确区分出游离的核酸以及细胞外囊泡的核酸，抗干扰能力很强。
实施例4.对不同样品中的细胞外囊泡进行定量
1. 准备采集自健康志愿者的新鲜的血浆、血清、尿液和唾液、H2228细胞上清以及PBS；
2. 将上述样品16000 g、4℃离心10 min，取上清；
3. 在5 μL上述样品的上清中各加入5 μL浓度为20个/10 μL的细胞外囊泡参考品2稀释液；
4. 各取10 μL上述混合好的样品与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶以及内部设计的特异性引物和探针（针对AR-V7的引物和探针（用FAM标记，细胞外囊泡参考品2的特异性引物探针）、针对细胞外囊泡的管家基因B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物；
5. 按照说明书将反应液混合物生成液滴；
6. 按照下面的程序进行PCR：
Figure 473871DEST_PATH_IMAGE016
7. 将PCR完成后的样品用QX200 Droplet Digital PCR System进行检测，检测结果如图8所示；
8. 将图8中的结果代入发明内容中的公式
Figure 903715DEST_PATH_IMAGE001
进行分析判断：各样品均满足公式
Figure 145341DEST_PATH_IMAGE001
，因此各待检测样品中均含有22Rv1细胞外囊泡，这与实际的22Rv1细胞添加情况相符，说明本发明具有很好的抗游离核酸的能力，能准确判断出检测数据是来源于游离的核酸还是细胞外囊泡；
9. 按照发明内容中所述的方法对各样品进行定量：将检测到的数据代入公式：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
，
计算得出，血浆中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为10.1≈10个、血清中添加的22Rv1中细胞外囊泡个数为9.9≈10个、尿液中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为9.8≈10个、唾液中添加的22Rv1中细胞外囊泡个数为10.3≈10个、H2228细胞上清中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为9.7≈10个、PBS中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为9.5≈10个。从结果中我们可以看出，无论是什么样品类型，本发明均可以从中准确地定量出细胞外囊泡。
实施例5.用不同方式裂解液滴中的细胞外囊泡，再进行定量
1. 将用PBS稀释的细胞外囊泡参考品1和用PBS稀释的细胞外囊泡参考品2混合得到样品，使得细胞外囊泡参考品1在样品中的终浓度为100个/10 μL，细胞外囊泡参考品2在样品中的终浓度为10个/10 μL;
2. 将样品分成4份，记为样品A、样品B、样品C、样品D
3. 取10 μL上述样品A、样品B、样品C分别与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶以及内部设计的特异性引物和探针（针对AR-V7的引物和探针（用FAM标记，细胞外囊泡参考品2的特异性引物和探针）、针对细胞外囊泡的管家基因B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物 A、B、C；
4. 取10 μL上述样品D与市售的ddPCR试剂盒中的Supermix，逆转录酶、0.1 mg蛋白酶K以及内部设计的特异性引物和探针（针对AR-V7的引物和探针（用FAM标记，细胞外囊参考品2的特异性引物和探针）、针对细胞外囊泡的管家基因B2M的引物和探针（用VIC标记））配置成反应液混合物D；
5. 按照说明书将反应液混合物生成液滴；
6. 将生成的液滴按照以下方式进行处理以裂解液滴中的细胞外囊泡：
a)对于样品A：将生成的液滴冻融5次，以使得液滴内的细胞外囊泡破裂；
b)对于样品B：这一步不做任何处理；
c)对于样品C：这一步不做任何处理；
d)对于样品D：将生成的液滴37℃孵育10 min，以使得液滴中的细胞外囊泡破裂
7. 样品A、B、D按照下面的程序进行PCR：
Figure 623727DEST_PATH_IMAGE018
注：在42℃条件下细胞外囊泡的膜结构不会被完全破坏，因此样品B中细胞外囊泡在逆转录过程中仍然可能保持结构的完整，使细胞外囊泡中的核酸难以释放出来。
8. 样品C按照下面的程序进行PCR：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
注：在50℃条件下孵育60 min，细胞外囊泡的膜结构被破坏，因此样品C中细胞外囊泡在逆转录过程中核酸被释放出来。
9. 将PCR完成后的样品用QX200 Droplet Digital PCR System进行检测，检测结果如图9所示；
10. 将图9中的结果代入发明内容中的公式
Figure 267198DEST_PATH_IMAGE001
进行分析判断：各样品均满足公式
Figure 602364DEST_PATH_IMAGE001
，因此各待检测样品中均含有22Rv1细胞外囊泡，这与实际的22Rv1细胞添加情况相符；
11. 按照发明内容中所述的方法对各样品进行定量：将检测到的数据代入公式：
Figure 518236DEST_PATH_IMAGE020
，
计算得出，样品A中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为10.1≈10个、样品B中添加的22Rv1中细胞外囊泡个数为1.5≈2个、样品C中添加的22Rv1细胞外囊泡个数为10.1≈10个、样品D中添加的22Rv1中细胞外囊泡个数为9.5≈10个。从结果中我们可以看出，在液滴中的样品A、C、D的细胞外囊泡在逆转录过程前或逆转录过程中在液滴中发生裂解，其定量结果与实际添加的22Rv1细胞外囊泡的数量一致。而液滴中的样品B的细胞外囊泡在逆转录过程前或逆转录过程中细胞外囊泡未在液滴中发生裂解，其定量结果相对于添加的22Rv1细胞外囊泡偏少。因此，本发明需在PCR发生前将液滴中的细胞外囊泡进行裂解才可以准确定量。裂解方式包括但不限于上述的添加蛋白酶等可以消化样品中的杂质和/或缓慢裂解细胞外囊泡的组分、反复冻融、高温裂解。

Claims (10)

1.一种对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的方法，其包括以下步骤：
a)任选地对所述样品进行预处理；
b)将所述样品用稀释液稀释；
c)将稀释的样品与反应体系混合；
d)生成液滴，使得大多数液滴，优选每个液滴包含不多于一个细胞外囊泡；
e)裂解液滴中的细胞外囊泡；
f)进行数字液滴PCR（ddPCR）的反应；和
g)进行ddPCR检测。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品选自：血浆、血清、尿液、全血、乳汁、唾液、鼻涕、脑脊液、肺泡灌洗液等机体产生的样品；细胞培养基、细胞培养上清液等人工培养的样品；分离或纯化后的细胞外囊泡及其重悬液；和从植物或其他生物中提取的细胞外囊泡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述稀释液为酸性缓冲液、中性缓冲液或碱性缓冲液，优选地所述缓冲液为pH在5-10之间的缓冲液；优选地，所述稀释液选自Tris缓冲液、PBS缓冲液和含有NaCl的缓冲液；和/或
当所述样品为包含细胞、细胞碎片和/或细胞器的复杂样品时，进行所述预处理；优选地所述预处理选自离心和/或过滤。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述反应体系包含用于进行核酸扩增的酶、核酸扩增缓冲液、引物、探针和/或其他组分例如蛋白酶等用于消化样品中的杂质和/或缓慢裂解细胞外囊泡的组分，优选地所述蛋白酶在稀释的样品与反应体系混合后的混合溶液中的终浓度为0-1 mg/mL；
优选地，所述引物包含两种或更多种引物，和所述探针包含两种或更多种探针；更优选地，所述两种或更多种探针使用两种或更多种不同的荧光染料修饰，例如一种探针用FAM标记，另一种探针用VIC标记；或者一种探针用FAM标记，另一种探针用HEX标记；
优选地，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针分别对细胞外囊泡所包含的分别在两个或更多个不同的核酸序列上的两种或更多种基因具有特异性；
优选地，当需要对细胞外囊泡进行总定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，例如所述管家基因为GAPDH、B2M、ITGA2B、ACTB、HBB等；例如针对GAPDH的引物和探针和针对B2M的引物和探针共同组成对细胞外囊泡进行总定量的引物和探针组合；和/或
优选地，当需要对含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量时，所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因具有特异性，并且所述两种或更多种引物和所述两种或更多种探针中的至少一种引物和至少一种探针对细胞外囊泡中的该特异性基因具有特异性，例如一种引物和一种探针对阿比特龙耐药性AR-V7基因具有特异性，和另一种引物和另一种探针对细胞外囊泡中普遍包含的管家基因如B2M基因具有特异性。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于样品的稀释倍数用梯度稀释的方法确定，其中所述样品用所述稀释倍数稀释后，阳性液滴数应低于总液滴数的100%，优选地，阳性液滴数应低于总液滴数的50%，更优选地，阳性液滴数应在总液滴数的1%-50%之间；
优选地，所述步骤d）中生成液滴所用的原料是步骤c）中的稀释的样品与反应体系混合后的混合溶液；
更优选地，所述步骤d）中生成液滴的体积为0.1 nL-10 nL之间，优选地，生成液滴的体积为1 nL；
优选地，所述步骤d）中生成液滴的个数大于5000个，优选地，生成液滴的数目大于10000个；
更优选地，所述步骤d）中生成液滴的个数应比样品中细胞外囊泡的个数多；尤其优选地，所述步骤d）中生成液滴的个数应是细胞外囊泡个数的2倍以上；更优选地，所述步骤d）中生成液滴的个数应是细胞外囊泡个数的2-100倍之间。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤e）中的裂解为通过所述反应体系所包含的其他组分和/或通过温度等物理条件引起的细胞外囊泡裂解；和/或
所述步骤f）中进行的数字液滴PCR（ddPCR）的反应包括逆转录反应以及PCR反应；和/或
所述步骤g）中的ddPCR检测包括用商用的ddPCR仪器进行检测或通过PCR反应，对各个液滴中的信号进行检测；
优选地，所述信号包括荧光信号、电信号等通过检测液滴之间差异从而区分出阴阳性的现象。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤h)对ddPCR的结果进行分析，优选地，所述ddPCR的结果包括各个液滴中引物和探针的扩增结果、阴性液滴数、特定阳性液滴数、阳性液滴总数、多阳性液滴数、总液滴数、阳性液滴总数占总液滴数的比例、多阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴数占阳性液滴总数的比例、特定阳性液滴占总液滴数的比例、多阳性液滴占总液滴数的比例以及其他ddPCR分析软件提供的结果；
优选地，所述引物和探针的扩增结果包括各个液滴的荧光值和液滴的阴阳性，其中所述液滴的阴阳性指的是如果液滴的信号大于阈值则为阳性，如果液滴的信号小于阈值则为阴性；所述阈值为本底信号三倍处的荧光值；
优选地，所述特定阳性液滴数指的是对以下探针为阳性的液滴的数量，所述探针对细胞外囊泡所包含的特异性基因具有特异性；
所述阳性液滴总数指的是对至少一个探针为阳性的液滴数；
所述多阳性液滴数指的是对两个或更多个探针均呈阳性的液滴。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤i)对结果进行判断，其中判断标准包括：针对由N对引物和探针组成的反应体系，对基因1的探针呈阳性的液滴数记为a1，对基因2的探针呈阳性的液滴数记为a2，对基因i的探针呈阳性的液滴数记为ai（2≤i≤N），总液滴数记为b，若对基因1到基因i的探针都呈阳性的多阳性液滴数c满足：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，则判断样品中含有对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡；所述基因1到基因i分别为所述细胞外囊泡中普遍包含的管家基因和特异性基因中的一种，并且分别位于不同的核酸序列上。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法还包括定量步骤j），其包括：若参与液滴生成的样品总体积为d μL，那么样品中对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e计算为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；当对基因1到基因i都呈阳性的多阳性液滴数c远小于总液滴数b时（例如
Figure DEST_PATH_IMAGE006
时），对基因1到基因i都呈阳性的细胞外囊泡数量e的计算公式可以简化为
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，在样品中该细胞外囊泡的浓度为
Figure DEST_PATH_IMAGE010
个/μL。
10.一种用于对样品中总的细胞外囊泡和/或其中含有特异性基因的细胞外囊泡进行定量的系统，其包括：
a)任选的预处理模块，其配置成用于对所述样品进行预处理；
b)稀释模块，其配置成用于对所述样品用稀释液稀释；
c)混合模块，其配置成用于将稀释的样品与反应体系混合；
d)液滴生成模块，其配置成用于生成液滴，使得大多数液滴，优选每个液滴包含不多于一个细胞外囊泡；
e)裂解模块，其配置成用于裂解液滴中的细胞外囊泡；
f)数字液滴PCR反应模块，其配置成用于进行数字液滴PCR（ddPCR）的反应；和
g)检测模块，其配置成用于进行ddPCR检测；
优选地，所述系统经配置用于使用权利要求1-9中任一项的方法进行定量。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058498A (zh) * 2022-07-26 2022-09-16 日照天光生物技术有限公司 一种基于量子点的细胞外囊泡检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130084572A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Quantalife, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
CN110106233A (zh) * 2019-03-25 2019-08-09 杭州师范大学 一种胞外囊泡/外泌体的数字pcr检测方法
CN111235309A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 湖南农业大学 一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量pcr方法
CN111321111A (zh) * 2020-02-23 2020-06-23 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种利用脂肪干细胞胞外囊泡促进皮肤损伤修复的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130084572A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Quantalife, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
CN110106233A (zh) * 2019-03-25 2019-08-09 杭州师范大学 一种胞外囊泡/外泌体的数字pcr检测方法
CN111235309A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 湖南农业大学 一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量pcr方法
CN111321111A (zh) * 2020-02-23 2020-06-23 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种利用脂肪干细胞胞外囊泡促进皮肤损伤修复的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058498A (zh) * 2022-07-26 2022-09-16 日照天光生物技术有限公司 一种基于量子点的细胞外囊泡检测方法

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