KR101429113B1 - 난소과자극증후군의 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체외로 분리된 동물의 난포액 내 조직 인자(Tissue Factor)의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 난소과자극증후군의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 난소과자극증후군의 진단방법, 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법 및 난소과자극증후군 진단용 조성물을 제공하며, 본 발명의 조직 인자는 불임 치료 연구에 적용 될 수 있다.

Description

난소과자극증후군의 진단방법{Method for Diagnosting of Ovarian Hyperstimulation Syndrome}

본 발명은 난소과자극증후군의 진단방법에 관한 것이다.

모든 포유류에 있어, 성공적인 생식을 위해 배란은 필수적이다. 배란 과정은 뇌하수체로부터 LH(Luteinizing Hormone; 황체형성 호르몬)가 급증하면서 개시되며, 난소의 표면으로부터 수정가능한 난모세포가 유리됨으로써 종결된다. 이러한 과정이 완전하기 위해서는, 과립막세포(Granulosa Cells; GCs), 난구세포 및 난모세포에서 특정 유전자의 발현에 유의한 변화가 일어나야한다(Espey, 1980; Richards, 2005).

배란은 염증과 유사한 과정이라고 상정된다. 배란은 난포세포벽 및 난포세포액의 세포외 공간에서 적혈구의 유출 및 피브린 침착과 같은 다양한 형태학적 변화가 관찰된다(Hirota et al., 2003). 난모세포의 배출 후, 남은 공간에서 피브린 형성에 필수적인 프로테아제인 트롬빈이 관련된 피브린 응괴가 형성됨으로 배란이 진행된다. 이와 일관되게, 난모세포액에서 트롬빈의 생성 및 그 기능의 활성이 보고되었다(Roach et al., 2002).

조직손상을 동반하는 배란은 외부 응고 경로를 개시하는 조직 인자(Tissue Factor; TF)의 수준을 증가시킬 수 있다. 염증에서 조직 인자의 역할은 혈액 응고를 매개하는 것이다. 응고 인자 Ⅲ(coagulation factor Ⅲ; FⅢ)으로 알려진 조직 인자는 혈액 응고 과정의 주요 개시자이다(Price et al., 2004). 조직 인자는 클래스 Ⅱ 사이토카인 수용체 패밀리 8의 하나로, 자이모젠 세린 프로테아제 인자 Ⅶ(zymogen serine protease factor Ⅶ; FⅦ)에 결합을 통해 항상성을 개시하여 세포내 및 세포외 응고 인자 Ⅸ 및 Ⅹ를 활성화시키는 막결합성 당단백질이다(Nemerson et al., 1988). 조직 인자에 의해 개시된 트롬빈의 형성은 피브린을 생성하여 응고를 촉진한다(Lockwood et a., 1994). 조직 인자 경로의 억제제(Tissue Factor Pathway Inhibitor)로, TFPI-1 및 TFPI-2가 있다. 조직 인자 경로 억제제는 조직 인자 경로의 주요 조절자로 생각된다(Price et al., 2004). TFPI-1는 FⅦa/TF 복합체의 촉매활성 및 활성화된 인자 X를 조절하는 세린 프로테아제 억제제이다(Nermerson et al., 1988). 태반 단백질 5(Placental Protein 5; PP5)로 알려진 TFPI-2는 TFPI-1과 도메인 구조 및 부분적인 유전자가 유사한 세린 프로테아제 억제제이다(Udagawa et al., 2002).

난소과자극증후군(Ovarian Hyperstimulation Syndrome; OHSS)은 생식샘자극호르몬에 의한 난소과자극 주기를 조절하는 여성에게 유발되는 심각한 합병증으로 잘 알려져 있다. 의원성 조건은 혈관내 부피 감소, 혈농축, 백혈구 증가, 요량 감소증 및 전해질 불균형과 결합된 다낭성 난소확장, 빠른 증체량, 심각한 혈관외액 축적을 포함하는 임상적 및 실험적 징후의 넓은 스펙트럼이 특징이다(Whelan et al., 2000). 배란과 관련된 몇몇의 매개자는 에스트로겐, 히스타민, 사이토카인, 프로스타글란딘 및 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system)과 같은 OHSS를 유도하는 요소로 제안되었다(Bergh et al., 1992; Morris et al., 1994). VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)는 OHSS 진행의 중요한 원인 인자와 관련된다(Brinsden et al., 1995; Abramov et al., 1997). OHSS의 발생은 외인성 투여 또는 내인성 hCG(human Chorionic gonadotrophin), 또는 드물게 황체형성 호르몬이 주요한 인자인 것으로 보고되었다(Lancet, 1991). OHSS 환자에서 지혈시스템의 변화는 혈전증 위험을 증가시키는데 기여하는 것으로 보고되었고, 소수의 연구에서 심각한 OHSS의 여성에서 지혈 시스템의 변화와 관련된 기작이 조사되었다(Ellis et al., 1998; Dulitzky et al., 2002). 특히, 원형질 조직 인자 및 TFPI의 역할은 아직 규명되지 않았다. 활성화된 인자 Ⅶ(FⅦa)와 결합된 조직 인자는 정상 및 병리학적 조건에서 혈액 응고를 개시하는데 중요한 역할을 한다(Semeraro et al., 1997). 전염증 사이토카인 및 성장인자로 활성화된 단핵백혈구, 내피세포 및 혈관평활근세포에서 조직 인자(Tissue Factor; TF)의 발현이 유도된다(Nemerson et al., 1995).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 배란과정동안 염증반응을 조절하는 인자를 조사하여 난소과자극증후군을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 난포액 내 존재하는 조직 인자(Tissue Factor)가 난소과자극증후군 동물 모델 및 환자에서 감소조절되는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 난소과자극증후군의 진단방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 난소과자극증군 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 체외로 분리된 동물의 난포액 내 조직 인자(Tissue Factor)의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 난소과자극증후군의 진단방법을 제공한다.

본 발명자들은 배란과정동안 염증반응을 조절하는 인자를 조사하여 난소과자극증후군을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 난포액 내 존재하는 조직 인자(Tissue Factor)가 난소과자극증후군 동물 모델 및 환자에서 감소조절되는 것을 규명하였다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 체외로 분리된 동물의 난포액 내 조직 인자의 존재를 확인하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 동물은 포유류이고, 보다 바람직하게는, 상기 포유류는 인간, 랫트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소이다.

본 발명의 진단방법은 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시할 수 있다.

상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 조직 인자의 존재를 확인한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 조직 인자의 뉴클레오타이드 서열인 서열목록 제1서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 난소과자극증후군 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 난소 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 난소과자극증후군 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 난소세포)보다 약하게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 혼성화법으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상순한 본 발명의 조직 인자에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 실시된다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 유전자 증폭법에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 난소세포)에서 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 체외로 분리된 동물의 난포액에서 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 난소세포)보다 낮게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

따라서 본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 조직 인자의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열을 프라이머로 이용하여 유전자 증폭하여 실시할 수 있다.

본 발명의 난소과자극증후군의 진단방법은 면역분석법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 난소과자극증후군을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 조직 인자 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 조직 인자에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 조직 인자에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MLN 51 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 조직 인자의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 난소과자극증후군을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 조직 인자에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 난소과자극증후군으로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 조직 인자는 난소과자극증후군에서 저발현 되는 생체 분자이다. 이러한 조직 인자의 저발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “저발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 낮은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 적은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 조직 인자들이 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 저발현 되는 경우, 본 발명에서의 “저발현”으로 판정하고 난소과자극증후군으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 난소과자극증후군의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 동물의 생물학적 시료에 있는 조직 인자(Tissue Factor)를 검출하는 방법을 통해 난소과자극증후군 조직 인자를 검출하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 동물은 포유류이고, 보다 바람직하게는, 상기 포유류는 인간, 랫트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소이다.

본 발명의 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법은 조직인자를 검출하는 방법을 통해 실시된다.

바람직하게는, 상기 조직 인자의 검출은 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시된다.

본 발명의 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법은 상기 언급된 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 조직 인자(Tissue Factor)의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 조직 인자 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 난소과자극증후군 진단용 조성물이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 난소과자극증후군의 진단방법, 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법 및 난소과자극증후군 진단용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조직 인자는 불임 치료 연구에 적용 될 수 있다.

도 1은 랫트 OHSS 모델의 배란 과정에서 조직 인자의 발현을 확인한 결과를 보여준다. 도 1a는 노던 블럿 결과이고, 도 1b는 실시간 PCR 분석 결과이며, 도 1c는 면역형광 분석법 결과이고, 도 1d는 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 랫트 OHSS 모델의 배란 과정에서 TFPI-1 및 TRPI-2의 발현정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 배란은 억제하는 물질인 RU486, 인도메타신, NDGA 및 GW9662를 처리하여 (a)조직인자 및 (b)TFPI-2의 발현을 조사한 결과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4b는 OHSS 동물모델을 제조하여 (b)VEGF, (c)조직 인자, TFPI-1 및 TFPI-2의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 체외수정 환자의 낭포액에서 조직 인자 및 TFPI-2의 상관관계를 조사한 결과를 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 체외수정 환자를 나이 및 임신여부로 분리하여 낭포액에서 조직 인자 및 TFPI-2의 상관관계를 조사한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

호르몬 및 시약

임신 말 혈청 성선 자극호르몬(Pregnant mare's serum gonadotropin; PMSG)는 국제호르몬으로부터 얻었다. 인간 융모성 성선 자극호르몬(human Chorionic Conadotropin; hCG)은 시그마(미국)로부터 구매하였다.

과배란 유도를 위한 실험동물 및 호르몬의 처리

미성숙 자성 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 랫트를 대한 실험실(대한민국)로부터 구매하였다. 상기 실험동물을 10시간 암기/15시간 명기의 주기로 자유식이 조건하에 사육하였다. 26일령(체중 60-65 g)된 상기 랫트에 15 IU(International Unit) PMSG를 피하 투여하여 다낭성 난포 성장을 유도하였다. 48시간 후, 경추탈골법을 이용하여 랫트를 희생하였다. RNA를 추출하기 위해, 적출한 난소를 드라이아이스를 이용하여 신속하게 동결하였다. 난소과자극증후군의 모델 랫트는 10 IU hCG 를 단회 복강투여하여 배란을 유도하고 난소를 시간 간격을 두어 적출하였다.

hCG 투여 10 분전에 배란-중단 억제제를 피하투여하였다. 1 M 아세트산 및 9% 살린(Saline)으로 희석된 DMSO에 프로제스테론 수용체 안타고니스트(RU486, Enzo Life Sciences Inc., 미국)를 용해하여 각 랫트에 1 ㎎/랫트의 농도로 200 ㎕씩 hCG 투여 10분 전에 단회 복강투여하였다. 사이클로옥시제나제(cycloxygenase)의 억제제인 인도메타신(indomethacin, Sigma, 미국)을 인도메타신 10 ㎎당 4 ㎎ Na₂CO₃을 포함하는 탄산나트륨 수용액에 용해하여 1 ㎎/랫트의 농도로 200 ㎕씩 hCG 투여 10분 전에 단회 복강투여하였다. 리폭시게나제(lipoxygenase)의 억제제인 노르디히드로구아이아레트산(Nordihydroguaiaretic acid; NDGA, Sigma, 미국)을 폴리에틸렌 글리콜400 및 0.9% 살린 1:1(v/v) 혼합물에 용해하여 300 ㎎/㎏으로 200 ㎕씩 hCG 투여 10분 전에 단회 복강투여하였다. PPARγ(GW9662, Sigma, 미국)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)/살린(1:100)에 용해하여 2 ㎎/㎏의 농도로 100㎕씩 hCG 투여 10분 전에 단회 복강투여하였다.

난소과자극증후군의 유도

난소과자극증후군을 유도하기 위해, 미성숙 랫트(23 일령)을 10 IU PMSG로 연속 4일 동안 피하투여하고 30 IU hCG로 5일째에 복강투여하였다. 대조군 랫트는 10 IU PMSG로 연속 4일 자극하고 5일째에 살린을 투여하였다(도 1).

환자로부터 황체화과립세포 및 난포액의 수집

체외수정을 위해 난소자극된 환자로부터 황체화과립세포을 포함하는 난포액을 흡입하였다. 실험과정은 임상시험심사위원회로부터 승인되었고 환자로부터 과립막세포의 사용에 대한 동의를 얻어 진행되었다. 난소 자극 과정은 공지된 방법으로 하였다(Koga et al., 2000; Osuga et al., 1999). 각 환자로부터 얻은 난포 흡입물을 200 ×g로 5분 동안 원심분리를 실시하여 수득한 상층액을 -70℃에 보관하였다. 과립막세포를 0.2% 히알루로니다제(Sage IVF Inc. 미국)을 포함하는 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 현탁하고 37℃에서 30분 동안 항온반응하였다. 현탁물을 히스토파크(Histopaque, Sigma-Aldrich, 미국)에 층을 이루게 하여 150 ×g로 30분 동안 원심분리를 실시하여 세포를 분리하였다. 인터페이스로부터 수득한 과립막세포를 세척하고 200 ×g로 10분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하였다.

노던 블럿 분석

TRIzol 시약(Molecular Research Center Inc., 미국)을 사용하여 난소의 총 RNA를 추출하였다. 10 또는 20 ㎍의 총 RNA를 포름알데히드를 포함하는 1.2% 아가로즈 젤에 전기영동을 실시하여 분획하고 20×SSC(sodium citrate-sodium chloride)로 캐피러리 블럿팅(capillary blotting)하여 나일론막에 전달하였다. UV 가교 및 전혼성화(prehybridization) 후, 막을 50% 포르마마이드(formamide), 5×SSC, 1.6×Denhart's 수용액, 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 250 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA, 500 ㎍/㎖ 효모 tRNA(tansfer RNA) 및 총 프로브에 대한 각 유전자의 2-4 ×10⁶ cpm ³²P-표지 cDNA를 포함하는 용액에서 42℃로 항온반응하였다. 혼성화 후, 막을 65℃에서 1시간동안 0.5×SSC 및 0.1% SDS로 항온반응 한 후에 상온에서 2×SSC 및 0.1% SDS로 2차례 5분 동안 세척하였다. Kodak RX 필름(Eastman Kodak Co., 미국)을 사용하여 7일 동안 -70℃에서 막을 노출하였다. TF cDNA 중 242 bp를 이용하여 노던 블럿의 프로브로 사용하였다(표 1).

실시간 PCR 분석

다양한 조건 하에 TRIzol 시약(Molecular Research Center, 미국)을 사용하여 설명서에 따라 총 RNA를 추출하였다. 분석에 사용된 특정 프라이머는 표 1에 기재하였다.

다음의 PCR 조건으로 PCR을 실시하였다:

변성단계는 95℃에서 20초, 어닐링단계는 60℃에서 20초 및 신장단계는 72℃에서 30초. 모든 결과는 β-액틴 발현값으로 보정하였다. 실시간 PCR 분석은 QuantiTect SYBR GreenER PCR Kit(Qiagen) 및 Roter-Gene 6000 실시간 PCR 시스템으로 수행하였다.

웨스턴 블럿 분석

난소 추출물을 프로테아제 억제제 및 포스파타제가 첨가된 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 및 10% SDS를 포함하는 용해 완충액(pH 7.4)에서 조직 균질화하였다. 13,600×g로, 15분 동안 원심분리를 실시한 후, 상층액을 수집하여 분석하였다. Bio-Rad 단백질 분석법(Bio-Rad Laboratories Inc., 미국)으로 단백질 농도를 결정하였다. 20 ㎍ 단백질을 10% SDS를 포함하는 40% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 전달하여 Ponceau-S 염색을 사용하여 단백질을 염색하였다. 니트로셀룰로오스 막을 5% 탈지분유를 포함하는 TBS(Tris-Buffered Saline)로 블로킹하였다. 블럿을 세척하고 조직 인자 항-인간 다클론성 항체(American Diagnostica Inc., 미국)와 반응시켰다. 퍼옥시다제-결합 2차 항체를 사용하여 블럿을 현상하고 ECL 시스템으로 단백질을 가시화하였다.

면역조직화학법

Bouin's-고정된, 파라핀-임베드된, 5-마이크론 난소 섹션을 자일린(xylene)으로 왁스를 제거하고, 알코올 연속희석으로 재수화하였다. 섹션을 0.1 M 구연산나트륨 완충액(pH 6.0)에 담그고, 마이크로웨이빙하여 항체를 회수하였다. 10% 정상 고트 혈청에서 반응시켜 비특이적 조직 결합을 억제하였다. 섹션에 1:100 희석된 조직 인자 고트 항-인간 다클론성 항체(American Diagnostica Inc., 미국)를 6시간동안 4℃에서 항온반응하였다. 다이아미노벤지딘 처리 및 헤마톡실린으로 대비염색한 후에 벡타스테인 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 키트(Vector Labs, 미국)를 사용하여 항원을 가시화하였다. 음성 대조군은 1차 항체 대신 정상 고트 IgG를 사용하여 수행하였다.

ELISA ( Ezyme - linked Immunosorbent Assay ) 분석

조직 인자 농도의 측정은 상업적으로 이용가능한 ELISA(USCNLIFE, 중국)를 사용하여 수행하였다. 모든 실험 과정은 설명서대로 실시하였다. 측정하기 전에 인간 난포액 샘플을 샘플 완충액으로 적절히 희석하였다.

통계 분석

결과는 3번의 독립적인 실험에 대하여 ‘평균±표준오차’로 나타내었다. 군 간의 유의한 차이는 그래프패드 프리즘 소프트웨어(미국)를 적용한 뉴먼-컬스(Neuman-Keuls) 시험법에 적용 후 ANOVA로 분석하였다. P 값은 0.05 미만의 유의성을 갖는다.

실험 결과

과배란 유도 랫트 난소에서의 조직 인자 및 TFPI 의 발현 조절

LH(Luteinizing Hormone)/hCG(human Chorionic Gonadotropin) 투여에 의하여 랫트 난소에서 조직 인자의 유전자 발현이 촉진되었으며, 이는 배란기난포의 과립막세포에서 주로 촉진되었다(도 1a 및 도 1b). 단백질 발현을 확인한 결과 유사하게 배란기난포에서 발현되었으며 약 9시간 후 가장 높게 촉진됨을 확인했다(도 1c 및 도 1d).

TFPI-1의 발현은 배란과정 동안 변화가 없는 반면, TFPI-2의 발현은 LH/hCG 투여 후 6시간에 일시적으로 촉진되었다가 낮아짐을 확인했다(도 2). TFPI-2는 조직 인자와 다르게 난포막세포에서 촉진되었다.

배란을 억제하는 물질을 랫트 복강에 투여한 후 조직 인자 발현의 조절을 확인한 결과 프로제스테론 수용체 억제제인 RU486에 의해서만 조직 인자의 발현이 억제 되었다(도 3a). TFPI-2의 발현은 변화가 없었다(도 3b).

OHSS 유도 랫트 난소에서의 조직 인자 및 TFPI 의 발현

높은 농도의 hCG(30 IU/랫트)에 의해 유도된 OHSS 난소에서 VEGF 발현이 증가되는 결과는 본 모델이 성공적으로 만들어졌음을 시사한다(도 4b). OHSS 난소에서 조직 인자의 발현은 감소했으며, TFPI 발현은 변화가 없었다(도 4c).

IVF 환자 난포액에서의 조직 인자 및 TFPI -2의 농도

조직 인자의 농도는 불임 인자 중 웅성 인자와 OHSS 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보였다(도 5a). 반면, TFPI-2 농도는 차이를 보이지 않았다(도 5b). 더 나아가 조직 인자의 농도는 나이와 상관관계가 있었으며, 임신과는 관련성이 없었다(도 6a). TFPI-2 농도는 나이나 임신과 상관관계가 없었다(도 6b).

결론

본 발명은 조직 인자가 배란기난포의 과립막세포에서 발현되며 프로제스테론 수용체 경로를 거쳐 조절됨을 규명하였다. TFPI-2는 배란기난포 난포막세포에서 발현됨으로써, 조직 인자가 파라크린 작용임을 의미한다. 랫트 OHSS 실험모델과 IVF(in vitro fertilization) 환자 난포액에서의 조절 인자 농도는 OHSS와 대조군 사이에 유의한 차이를 보임으로써, 조직 인자가 OHSS와 연관성이 있는 인자일 가능성을 제시하고 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for Diagnosting of Ovarian Hyperstimulation Syndrome <130> PN120561 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 888 <212> DNA <213> Tissue Factor <400> 1 atggctatcc ccatgcgccc gcgcctccta gcggccctcg cgcccacctt tctcggcttc 60 cttctccttc aggtggccgc tggtgcaggc actcctccag ggaaagcgtt taatttaact 120 tggatatcaa ctgatttcaa gacaatcttg gagtggcaac cgaaacccac caactatacc 180 tacactgttc agataagcga tagatctaga aactggaaat acaaatgcac tggaaccaca 240 gacactgagt gtgacctcac cgacgagatt gtgaaggatg tgaactggac ctatgaagca 300 agggtcctat ctgtcccatg gaggaactca actcatggaa aggaaacact ctttggaact 360 catggggagg aaccgccatt tacaaatgcc cggaagtttt taccttaccg agacacaaaa 420 attggacagc cagtaattca gaagtatgaa caagacggta cgaaactgaa ggtgactgta 480 aaagactcat ttacattagt cagaaagaat ggtacattcc tcactctgcg gcaagttttt 540 ggcaatgact tgggttatat tcttacgtat cggaaagact caagcacagg aaggaaaaca 600 aacactacac ataccaatga attcttgatt gatgtggaaa agggggtaag ctactgcttc 660 ttcgtacaag ccgtgatttt ctccaggaaa actaaccaca agagcccaga aagcatcacc 720 aagtgcactg agcaatggaa gagtgtcctg ggagaaacac tcatcattgt gggagcagtg 780 gtgttcctgg tcactgtctt tatcatcctg ctgaccatat ctctgtgcaa gcgcagaaag 840 aacagagcag gacagaaaag gaagaacacc ccgtcgcgct tggcatag 888 <210> 2 <211> 295 <212> PRT <213> Tissue Factor <400> 2 Met Ala Ile Pro Met Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Thr 1 5 10 15 Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Gly Ala Gly Thr Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp Phe Lys Thr 35 40 45 Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr Thr Val Gln 50 55 60 Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Tyr Lys Cys Thr Gly Thr Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Asn Trp 85 90 95 Thr Tyr Glu Ala Arg Val Leu Ser Val Pro Trp Arg Asn Ser Thr His 100 105 110 Gly Lys Glu Thr Leu Phe Gly Thr His Gly Glu Glu Pro Pro Phe Thr 115 120 125 Asn Ala Arg Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Lys Ile Gly Gln Pro 130 135 140 Val Ile Gln Lys Tyr Glu Gln Asp Gly Thr Lys Leu Lys Val Thr Val 145 150 155 160 Lys Asp Ser Phe Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr Phe Leu Thr Leu 165 170 175 Arg Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Gly Tyr Ile Leu Thr Tyr Arg Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Thr Gly Arg Lys Thr Asn Thr Thr His Thr Asn Glu Phe 195 200 205 Leu Ile Asp Val Glu Lys Gly Val Ser Tyr Cys Phe Phe Val Gln Ala 210 215 220 Val Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn His Lys Ser Pro Glu Ser Ile Thr 225 230 235 240 Lys Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Val Leu Gly Glu Thr Leu Ile Ile 245 250 255 Val Gly Ala Val Val Phe Leu Val Thr Val Phe Ile Ile Leu Leu Thr 260 265 270 Ile Ser Leu Cys Lys Arg Arg Lys Asn Arg Ala Gly Gln Lys Arg Lys 275 280 285 Asn Thr Pro Ser Arg Leu Ala 290 295 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> TF forward primer <400> 3 cacaaaaatt ggacagccag ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> TF reverse primer <400> 4 agtagcttac ccccttttcc ac 22

Claims (9)

1. 체외로 분리된 인간을 제외한 포유동물의 난포액 내 조직 인자(Tissue Factor)의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 난소과자극증후군의 진단방법; 상기 조직 인자가 저발현 되는 경우에 난소과자극증후군으로 진단한다.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유동물은 랫트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 진단방법은 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 난소과자극증후군의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 동물의 생물학적 시료에 있는 조직 인자(Tissue Factor)를 검출하는 방법을 통해 난소과자극증후군 마커를 검출하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 동물을 인간, 래트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 5 항에 있어서, 상기 조직 인자의 검출은 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 조직 인자(Tissue Factor)의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 조직 인자 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 난소과자극증후군 진단용 조성물.

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