JP2008523799A - アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、胎児中に存在する２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）の量及び質を測定することによって、ヒト等の哺乳動物において子癇前症をスクリーニングする方法に関する。この方法を行う試薬及びキットも提供される。

Description

本発明は、胎児２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）の量及び質を測定することによって、ヒト等の哺乳動物における子癇前症をスクリーニングする方法に関する。この方法を行う試薬及びキットも提供される。

子癇前症は、（妊婦の約１０％が罹患する）妊娠時に特有の疾病であり、高血圧、すなわち１４０／９０ｍｍＨｇを超える血圧（６時間おいて行う少なくとも２回の血圧測定における）及び尿中のタンパク質の存在により特徴付けられる。場合によっては（妊婦の１〜２％）、子癇を引き起こす痙攣若しくは昏睡又はその両方が発現するおそれがある。子癇は、母親及び胎児の両方を危険にさらし、他の高血圧妊娠疾病と共に、妊娠時及び周産期の罹患及び死亡の主な原因の１つである。先進国世界では、子癇前症は、５人の妊婦死亡のうち大体１人の原因になっていると推測され、早産の原因の約１５％を占める。子癇前症を治療するのに伴うコストは、１年間でおよそ１００億米ドルになると推測されており、妊娠中の子癇前症に起因する出産後の疾患に対する対処において、同様の金額が示唆される。子癇前症の後期の影響としては、罹患した母親（脳出血及び成人呼吸窮迫症候群）及び子癇前症による早産及び子宮内生育遅延に関与する多くの幼児期状態における心理学的影響及び身体的影響が挙げられ、これは、早産児における呼吸困難から脳性麻痺、失明、癲癇、難聴、及び学習不能症にまで及ぶ。重症の場合、子宮内死を起こすおそれがある。全世界中の女性及び子供の健康における子癇前症の悪影響は、世界保健機構にこの疾病に取り組む世界的計画を立ち上げることを促している。

子癇前症は、複数の器官系に影響を及ぼす急速に進行する疾病である。重症の場合、集中治療における集学的治療アプローチは、これらの患者の治療を成功させるのに絶対不可欠である。子癇全症患者の現在の治療は、広範囲の血液検査、尿検査及び超音波検査(ドップラー)を用いた母親及び胎児の集中的な観察に集中する。降圧剤（メチルドーパ、ニフェジピン、ヒドララジン及びラベタロール）の使用は、特に脳血管の傷害の予防において十分に認識されている。子癇全症の根本的な治療は、この疾患の進行を常に和らげる、胎盤（及び胎児）の分娩である。

子癇前症の病態生理学は十分に研究されている。潜在的な異常は、全身の細動脈の血管収縮及び血圧を上昇させるペプチド及びアミンに対するこれらの血管の感受性が高まることである。プロスタグランジン、いわゆるプロスタサイクリン（血管拡張剤及び血小板凝集阻害剤）とトロンボキサンＡ２（血管収縮剤及び血小板凝集剤）の不均衡が、子癇前症の進行には重要であるということが、何人かの研究者によって示唆されている。他の研究者は、子癇前症において、内因性血管拡張剤である一酸化窒素の産生が低減することを見出している。しかし、広範囲の研究にも関わらず、子癇前症の正確な原因については依然として謎のままである。これに関して、子癇前症の病因に極めて重要な役割を果たす組織として、胎盤が特定されている。原則的には、子癇前症において、胎盤形成及び栄養膜侵入が異常となる。これは、子宮内胎盤血液循環を危険にさらし、胎盤虚血を引き起こす。

子癇前症アッセイは既知である。

国際公開第９１／１６６３３号は、Ａ１３４と結合する細胞マーカーに基づく子癇前症マーカーを示す。これは、抗細胞内フィブロネクチン抗体を使用して、アッセイされる。

米国特許第５，１９８，３６６号は、子癇前症、子宮内生育遅延及び早産のマーカーと
して、ｐｐ−１３を開示している。

サイトカインは子癇前症に関与していると考えられている。従って、アッセイ標的及び治療剤として、Ｍ−ＣＳＦレベルが提示されている（米国特許第５，５４３，１３８号）。

アッセイを試みている他のマーカーとしては、インスリン様成長因子結合タンパク質１（米国特許第５，７１２，１０３号）、マリノブタゲニン（国際公開第２００４／０７１２７３号）、デフェンシン（国際公開第９９／４２８２６号）及び遊離型のアルブミンと非エステル化脂肪酸の比（国際公開第０１／７７６７５号）が挙げられる。ホスファチジルコリンのように（米国特許第６，４６１，８３０号）、マイトジェンもアッセイされている（米国特許第５，２３８，８１９号）。

子癇前症剤の標的として、シンシチンレベルを使用している（国際公開第０２／０４６７８号及び米国特許出願公開第２００２／０１０２５３０号）。

米国特許第５，８４９，４７４号は、妊娠している雌の哺乳動物の血液から、ヘモグロビンバリアント、ヘモグロビンバリアント前駆体又は赤血球糖分解酵素、あるいはこのような酵素の前駆体を探すアッセイ方法を開示している。アッセイした化合物が雌の哺乳動物の赤血球内で産生される。この文献によって、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）レベルの低減が、解糖の阻害を誘導することができ、これによってＡＴＰ産生が低減され、溶血が増大することが示唆されている。正常な妊娠における２，３−ＤＰＧの増大によって、母親の血液に関する酸素ヘモグロビン解離曲線のシフトが引き起こされ、このことは母親の組織だけでなく、胎児への輸送に利用可能な酸素の供給を増大させる。

２，３−ＤＰＧの産生に影響を及ぼす、非常に多くの様々な酵素が関与する複雑な酵素カスケードが存在する。米国特許第５，８４９，４７４号によって、母親由来の１つ又は複数のこれらの酵素が２，３−ＤＰＧレベルに影響を及ぼすことに関与することが示唆されている。このアプローチの問題点は、母親における２，３−ＤＰＧの産生に影響を及ぼす多くの様々な因子が存在し、この因子には、母親が生活する高度及び母親が喫煙しているか否かといった様々なストレス因子が含まれる。

すでに知られている幾つかの異なる子癇前症アッセイが存在するが、妊娠中のできるだけ早くにその症状の存在を判定し、母親又は胎児のいずれかに対して更に悪影響を及ぼす前にこの症状を治療することを可能にするために、改良されたアッセイを開発する必要性が依然として存在する。

本発明者は、この症状の最初の研究にマウスモデルを使用した。Ｉｇｆ２ノックアウトマウスは、子癇前症に罹患したヒトの母親の胎児において見られるものと同様の生育遅延にかかった小さいマウスの子供を生み出す(Constancia, M. 他, Nature(2002); 417, 945-948)。

市販の発現アレイアッセイを使用して、遺伝子発現に関してマウスの胎盤をスクリーニングした。これにより、この生育遅延に関する約３００個の候補遺伝子と推定される遺伝子を同定した。これらの候補遺伝子から、本発明者は、更なる研究のための候補として、２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）遺伝子を同定した。リアルタイムＰＣＲによって、ヒト及びマウスの胎盤の両方において、この酵素の存在を確認した。更に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ヒト及びマウスの胎盤の両方における胎盤絨毛の合胞体栄養細胞層において、２，３−ＢＰＧＭのｍＲＮＡが豊富
に存在することが示される。

２，３−ＢＰＧＭは、１，３−ビスホスホグリセリン酸の２，３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ＢＰＧ）への変換を触媒する。２，３−ＢＰＧはこれまでに２，３−ジホスホグリセリン酸と呼ばれていたため、２，３−ＢＰＧＭは、２，３−ジホスホグリセリン酸ムターゼ（ＤＰＧＭ）としても知られている。以下の文献で実際に示されるように、この酵素の特性付け、シーケンシングが行われてきた。
Wang, Y., Wei, Z., Bian, Q., Cheng, Z., Wan, M., Liu, L.及びGong, W.著「ヒトのビスホスホグリセリン酸ムターゼの結晶構造」 J. Biol. Chem. (2004); 279(37), 39132-38
Joulin, V., Garel, M.C., Le Boulch, P., Valentin, C., Rosa, R., Rosa, J.及びCohen-Solal, M.著「ヒトの２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ遺伝子の単離及び特性付け」 J. Biol. Chem. (1998); 263(30), 15785-90
Barichard, F., Joulin, V., Henry, I., Garel, M.C., Valentin, C., Rosa, R., Cohen-Solal, M.及びJunien, C.著「領域７ｑ３４−−−−７ｑ２２に対するヒトの２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ遺伝子（ＢＰＧＭ）の染色体割当て」 Hum. Genet. (1987); 77(3), 283-285
Joulin, V., Peduzzi, J., Romeo, P.H., Rosa, R., Valentin, C., Dubart, A., Lapeyre, B., Blouquit, Y., Garel, M.C., Goossens, M.他著「ヒト赤血球の２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼｃＤＮＡの分子クローニング及びシーケンシング：修正アミノ酸配列」 EMBO J.(1986); 5(9), 2275-83

これまで、この酵素は、母親の赤血球に関連するものとして知られていた。この酵素は、哺乳動物の胎盤ではこれまでに観察されていない。この酵素は、胎盤の合胞体栄養細胞層で合成される。この層は、胎盤絨毛を覆う細胞の最外層であり、母親の供給血液に直接接する。つまり、この酵素は母親及び胎児の血液循環の間の接触面で発現する。

考えられる唯一の役割がヘモグロビンから放出される酸素の調節であることに加え、胎児及び母親のヘモグロビンにおける様々な効果を有する胎盤中に２，３−ＢＰＧＭが存在することによって、このタンパク質が子癇前症といった、妊娠時の幾つかの疾病のキーとなり得ることが示される。合胞体栄養細胞層のフラグメントは、母親の供給血液に放出されることが知られている。従って、母親から得られた体液及び組織サンプル中に、胎児によって産生される２，３−ＢＰＧＭを検出することができる。

従って、本発明は、ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）母親又は胎児の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）前記サンプル中の胎児２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）又はそのバリアントの量を測定する工程と、
（ｉｉｉ）前記量と胎児２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの既知の正常レベルとを比較する工程
を含む方法を提供する。

本発明はまた、ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）母親の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）前記サンプル中の胎児２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの存在を検出する
工程
を含む方法を提供する。

本発明はまた、ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）母親又は胎児の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）胎児２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）又はそのバリアントの量を測定、及び／又は前記サンプルにおいて胎児２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの存在を検出する工程と、
（ｉｉｉ）前記量と胎児２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの既知の正常レベルとを比較する工程
を含む方法を提供する。

好ましくは、胎盤機能不全は子癇前症である。しかし、この酵素が、胎盤に子宮内発育不全等の問題がある他の種類の症状に関与し得ることが予測される。

胎児２，３−ＢＰＧＭの量と、例えば、正常な妊娠又は子癇前症のように予め特性付けられた症状を有するこれまでに特性付けられた妊娠している哺乳動物から得られた既知のレベルの２，３−ＢＰＧＭを比較する。

このことにより、胎盤機能不全の存在の兆候を判断することが可能になる。超音波等の胎児の発育の更なる診断方法を使用して、この機能不全を確認することができる。

好ましくは、サンプルは母親の血液、胎児の血液、母親の尿、母親の便、母親の唾液、羊膜液、及び絨毛膜絨毛サンプル等の胎盤物質から選択される。

好ましくは、血液等の母親の体液がサンプルとして提供される。母親の血液は、比較的安全で、容易に得られるという利点がある。例えば以下に記載したもののように、当該技術分野で既知の技術を使用して、血液から胎盤物質を単離することができる：
Vona, G., Beroud, C., Benachi, A., Quenette, A., Bonnefont, J.P., Romana, S., Dumez, Y., Lacour, B., Paterlini-Brechot, P.著「母親の血液中に循環する胎児の細胞の濃縮特性、免疫形態学的特性及び遺伝学的特性」 Am. J. Pathol. (2002 １月); 160(1), 51-8
Levine, R.J., Qian, C., Leshane, E.S., Yu, K.F., England, L.J., Schisterman, E.F., Wataganara, T., Romero, R., Bianchi, D.W.著「子癇前症の発症前の母親の血清における細胞無含有の胎児ＤＮＡの二段階上昇」 Am. J. Obstet. Gynecol. (2004 ３月); 190(3), 707-13。

存在する酵素の濃度として、又は代替的には、酵素の活性レベルを測定することによって、２，３−ＢＰＧＭの濃度又は活性等の量を決定することができる。あるいは又は更に、例えば、２，３−ＢＰＧＭをコードするｍＲＮＡの濃度を測定することができる。２，３−ＢＰＧＭの種類は、２，３−ＢＰＧＭの発現レベルの違いであるか、あるいは胎児によって産生される２，３−ＢＰＧＭの活性の違いによるものであると考えられる。

当該技術分野で既知の技術によって、ＢＰＧＭの濃度及びその活性をアッセイすることができる。例えば、Takubo, T.他(Journal of Clinical Laboratory Analysis(1998); 12; 263-267)は、ポリクローナル抗ＢＰＧＭ抗体を使用した、ヒト赤血球における２，３−ＢＰＧＭの測定のための酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）システムを作製する方法を開示している。このアッセイを使用して、胎児のＢＰＧＭを測定することができる。当該技術分野で既知の技術、例えばケラー及びミルスタインの方法を使用して、ＢＰＧ
Ｍに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製することができる。使用する抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥクラスの抗体、結合フラグメント、並びに例えば、抗体のＦａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）₂フラグメントを含む抗体のハイブリッド誘導体である。このような抗体は、酵素を同定することを可能にするために、選択的に２，３−ＢＰＧＭと結合することが好ましい。好ましくは、このような抗体又はフラグメントは、他の化合物と１０％未満、好ましくは５％未満の交差反応性を有する。

免疫検定法は抗体の選択的結合特性を利用して、２，３−ＢＰＧＭの同定を可能にする。当該技術分野で既知の免疫検定法には、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、凝集アッセイ、沈澱アッセイ、トランジスタブリッジプローブ免疫検定法、粒子選別免疫検定法、光遮断免疫検定法、光散乱免疫検定法、及び超音波コード免疫検定法が含まれる。このような免疫検定法は、標識として、例えば、放射性同位体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素、蛍光物質、発色物質、又は化学発光物質を利用することができる。このようなアッセイは、それ自体が当該技術分野で既知であり、実際に、例えば、国際公開第９１／１６６３３号及び米国特許第５，７１２，１０３号に示されており、これらは本明細書に参照により援用される。

例えば、サンプルにおける胎児ＢＰＧＭのｍＲＮＡの濃度を測定することにより、２，３−ＢＰＧＭの発現レベルを決定することができる。ＢＰＧＭの濃度を測定するのに適切な方法としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。リアルタイムＰＣＲは、ｍＲＮＡに特異的で適したプライマー及び酵素を使用して、メッセンジャーＲＮＡの濃度の測定を可能にする。この技術自体は当該技術分野で既知である。例えば、Wittwer, C.T.他は、Biotechniques, (1997); 22, 130-138の論文において、多くの様々な技法を使用したＤＮＡ増幅のモニタリングを開示している。この論文には、市販のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）色素の考察が含まれている。また、ＲＴ−ＰＣＲを開示している欧州特許第１１７９６００号、国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１２号及び国際公開第９７／４６７１４号を参照されたい。

例えば、１，３−ＢＰＧの２，３−ＢＰＧへの変換をアッセイすることによって、２，３−ＢＰＧＭの酵素活性を測定することができる。当該技術分野で既知の技術、例えば１，３−ＢＰＧ又は２，３−ＢＰＧに特異的な抗体を免疫学的に使用してこれらの化合物の相対濃度を同定することによって、２，３−ＢＰＧの形成を測定することができる。

２，３−ＢＰＧＭバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の付加、欠失又は置換によって、図３ａ又は図３ｂに示される配列等の２，３−ＢＰＧＭ配列から変化する核酸配列又はアミノ酸配列によってコードされることが好ましい。

例えば、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードすることを可能にする遺伝子コードには冗長性が存在する。以下の表で、ｍＲＮＡトリプレット及びこれらがコードするアミノ酸を示す。

タンパク質又はタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域等の調節領域をコードするヌクレオチド配列における変異もまた、産生されるタンパク質の濃度又は産生されるタンパク質の活性に影響を及ぼす可能性があることが知られている。一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含むこのような変異は、例えばタンパク質の転写レベルに影響を及ぼすこと、又はフレームシフト突然変異を発生させること、又は異なるアミノ酸をコードさせることが知られている。このような変異は、観察される異なる発現レベル又は異なる活性レベルをもたらし得る。従って、胎児２，３−ＢＰＧＭバリアントの量を検出する代わりに、又はそれに加えて、このようなバリアントを検出することができる。本発明者にとって、変異型とは、プロモーターをコードする領域の上流領域又はエンハンサー領域等の他の調節領域、並びに２，３−ＢＰＧＭタンパク質をコードする領域（エキソン及びイントロンを含む）を意味する。

バリアントは、２，３−ＢＰＧＭ活性を有することが好ましい。好ましくは、本発明によるプローブ又はプライマーと相補的な又は同一の領域を含むヌクレオチド配列によって、バリアントがコードされる（下記に定義される）。

本発明者は、２，３−ＢＰＧＭが、子癇前症等の胎盤機能不全を同定するのに重要であると考えるので、２，３−ＢＰＧＭの代謝レベルを同定することが可能であることにも気付いた。これまでに、ＢＰＧＭは母親の赤血球内で見出されることは知られている。しかし、母親の血液胎盤障壁の酵素の存在によって、この酵素が、直接的又は間接的に血液へ拡散し、母親のヘモグロビンの酸素解離曲線に影響を及ぼす代謝を発生させることが示さ
れるであろう。従って、本発明の更なる態様は、
ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）母親又は胎児の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
（ｉｉ）遊離型２，３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ＢＰＧ）の濃度を測定する工程と、
（ｉｉｉ）前記濃度と２，３−ビスホスホグリセリン酸の既知の正常レベルとを比較する工程
を含む方法を提供する。

遊離型の２，３−ビスホスホグリセリン酸の濃度は、例えば、血漿又は間質液における胎児又は母親の赤血球の外側の濃度であることが好ましい。

２，３−ビスホスホグリセリン酸を同定及びアッセイ法は、当該技術分野で既知である。しかし、これまでに示しているように、２，３−ビスホスホグリセリン酸は免疫学的にアッセイすることができる。

好ましくは、母親の血液、胎児の血液、母親の尿、母親の便、母親の唾液、羊膜液、及び絨毛膜絨毛サンプル等の胎盤物質からサンプルを選択する。サンプルは、母親の血液、母親の尿、又は母親の唾液であることが好ましい。

好ましくは、正常なサンプルと比較した、２，３−ビスホスホグリセリン酸の濃度の変化又は２，３−ＢＰＧＭの量の変化は、胎盤機能不全の指標となる。

２，３−ＢＰＧＭの重要性は、２，３−ＢＰＧＭが子癇前症治療のための候補薬剤の同定の標的である可能性が高いことを示す。従って、本発明の更なる態様は、
子癇前症等の胎盤機能不全の治療のための候補薬剤を決定する方法であって、
（ｉ）胎児２，３−ＢＰＧＭを発現する細胞を準備すること、
（ｉｉ）前記細胞を化合物で処理すること、及び
（ｉｉｉ）前記細胞で産生される２，３−ＢＰＧＭの量に対する前記化合物の効果を測定すること
を含む方法を提供する。

好ましくは、細胞は、胎児の胎盤細胞等の胎児の細胞である。細胞によって産生される２，３−ＢＰＧＭの量、２，３−ＢＰＧＭをコードするｍＲＮＡ、又は細胞における２，３−ＢＰＧＭの酵素活性を測定することができ、この量に対する化合物の効果を決定し、それにより２，３−ＢＰＧＭ産生のアゴニスト又はアンタゴニストを同定することができる。２，３−ＢＰＧＭの量を測定するのに使用する方法は、上記のようなものであり得る。

特許請求の範囲に記載されている発明で使用するためのプローブ及びプライマーはまた、以下のように与えられる：
５’ｔｇｇｔｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｃａ（配列番号３）及び５’ｇｇｃｇｔｔｔｔｃａａａｔｇｇｇｃｔａａ（配列番号４）
ヒトプローブ：５’ａｇｃｃａａｃａｇｔｔｇａｇａａａｇａｃ（配列番号５）
マウスプローブ：５’ａｔａａａｃｔｇｃｔａｃｃａｃｔｇｔｇｃｃａｔａｃｃ（配列番号６）。

本発明の方法で使用するためのアッセイキットも提供される。このキットは、サンプル中の２，３−ＢＰＧＭの量を検出するための抗体又はプライマー等の検出手段と、アッセ
イキットを使用するための取扱説明書とを含む。

更に、胎児の胎盤残屑は、トリソミー２１及び子宮内生育遅延を含む多くの様々な疾患の特徴である。胎児の胎盤残屑に２，３−ＢＰＧＭが存在することによって、ＢＰＧＭをこのような残屑のマーカーとして使用することが可能になる。Vonag他(Am. J. Pathol.(2002); 116; 51-58)又はLevine, R.J.(Am. J. Obstet. Gynecol.(2004); 190; 707-13)による論文で示される技術を使用して、胎盤の残屑を同定することができ、このような物質の存在を確認するためのマーカーとして、２，３−ＢＰＧＭを使用することができる。例えば、２，３−ＢＰＧＭに対するポリクローナル抗体、あるいは、この酵素に対して生じたモノクローナル抗体を使用して、２，３−ＢＰＧＭを検出することができる。

本発明はまた、
妊娠している哺乳動物における胎児の胎盤残屑を同定する方法であって、
（ｉ）母親の体液又は組織のサンプルを準備すること、
（ｉｉ）胎児の胎盤残屑を単離すること、及び
（ｉｉｉ）前記残屑中の２，３−ＢＰＧＭを検出すること
含む方法を提供する。

本発明に関し、例示目的のみで、添付の図を参照して記載をする。

マウスモデル
生育遅延のモデルとして、Ｉｇｆ−２ノックアウトマウスを使用した。これらのマウスには、ヒトの胎児で見られるものと同様の生育遅延を患う小さいマウスの子供及び子癇前症に罹患した母親が含まれる。このマウスモデルは、ＩｇＦ２遺伝子に欠失を含む。

Ｉｇｆ−２マウスの胎盤を分析した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マウスゲノム４３０ ２．０アレイ(Affymetrix UK Limited, High Wycombe, United Kingdom)を使用して、マウスの胎盤内の遺伝子の発現を分析した。このアレイは、３９，０００を超える転写産物の発現及び３４，０００を超えるマウス遺伝子に由来するバリアントの分析を可能にする発現セットを含む。製造業者の取扱説明書に従って、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行った。野生型マウスの胎盤のＲＮＡサンプルの正常な発現値は、豊富な発現値を示す１．４６３（ＳＤ０．１２５、Ｎ＝３）であった。Ｉｇｆ−２ノックアウトマウスでは、胎盤のＲＮＡ発現が０．５６３（ＳＤ０．０８６、Ｎ＝３）に下方調節された。

ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア(Affymetrix Ltd.)を使用して、遺伝子アレイから得られたデータを解析し、この生育遅延に関連するおよそ３００個の候補遺伝子と推定される遺伝子を同定した。

本発明者は、子癇前症に罹患したヒトの妊娠は、キーとなる栄養素、特に酸素の不足によりｉｎ ｕｔｅｒｏで死亡する危険性が高い胎児が増加することを見出した。従って本発明者は、酸素移動及び解糖に関与する遺伝子を同定することに焦点を当てた。

２，３−ＢＰＧＭ遺伝子は、遺伝子アレイデータ上に３つ分離してヒットした。

リアルタイムＰＣＲ
胎盤のｃＤＮＡで、リアルタイムＰＣＲを行った。

Applied Biosystems Inc.から購入したＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイを使用して、マウスのＲＴ−ＰＣＲを行った。購入したアッセイは、アッセイＩＤ番号Ｍｍ０
０５００２９１＿ｍ１であった。これは、マウス（ハツカネズミ）における２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼの定量を可能にするアッセイである。

以下のプライマーを使用して、ヒトの胎盤のｃＤＮＡにおいてヒトのＲＴ−ＰＣＲを行った。
５’ｔｇｇｔｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｃａ（配列番号３）及び５’ｇｇｃｇｔｔｔｔｃａａａｔｇｇｇｃｔａａ（配列番号４）

ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ試薬及び製造業者のプロトコル(Applied Biosystems Inc.)を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。

リアルタイムＰＣＲによって、ヒト及びマウスの両方の胎盤において２，３−ＢＰＧＭが産生されることが確認された（データ図示せず）。

ヒト及びマウスの胎盤における２，３−ＢＰＧＭのｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの局在化
ヒト及びマウスから正常な胎盤を得た。

ＢＰＧＭをコードする核酸に特異的なプローブを調製した。
ヒトプローブ：５’ａｇｃｃａａｃａｇｔｔｇａｇａａａｇａｃ（配列番号５）
マウスプローブ：５’ａｔａａａｃｔｇｃｔａｃｃａｃｔｇｔｇｃｃａｔａｃｃ（配列番号６）

市販のキットを使用して、製造業者の取扱説明書に従い、ジゴキシゲニンシステムを利用して、プローブを標識化して検出した（ロシュテーリングキット、カタログ番号３３５３５８３、ロシュＤＩＧ核酸検出キット、カタログ番号１１７５０４１(F. Hoffmann-La Roche Ltd.(United Kingdom)製)）。

キシレン中でパラフィン包埋切片を脱蝋させ、１５分間、ＰＢＳに溶解した０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を使用して透過させた後、３７℃で１５分間、１５μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫで処理した。室温で１８時間、１８％のホルムアミドを使用して、プローブハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣにおける２回の１５分間の洗浄、１×ＳＳＣ（標準的なクエン酸生理食塩水）における２回の１５分間の洗浄、及び０．２×ＳＳＣにおける２回の１５分間の洗浄を行った。ロシュキットで提供されるＮＴＢ試薬を使用して発現したアルカリホスファターゼと結合した抗ＤＩＧ抗体を利用して、結合したプローブを可視化し、顕微鏡写真を撮影した。

この実験により、ヒトの胎盤絨毛に関して図１で実証されるように、マウス及びヒトの切片の両方において、２，３−ＢＰＧＭのｍＲＮＡがヒトの胎盤絨毛の合胞体栄養細胞層で発現されることが示された。

免疫局在化
アセトンで固定され、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標）で透過し、更にヒトの２，３−ＢＰＧＭに対するマウスのポリクローナル抗血清を使用してプローブ化したヒトの胎盤生検切片において、免疫局在化を行った。当該技術分野の標準的な方法を使用して、マウスのポリクローナル抗血清を調製した（例えば、http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Antibody_Explorer/Procedures/Immunofluorescence.htmlを参照のこと）。テキサスレッド(Vector Laboratories, Ca, USA)で蛍光標識化した市販のヤギ抗ウサギＩｇＧによって、結合した抗体を可視化した。合胞体栄養細胞層及び赤血球において、蛍光が観察された。

このデータ（図示せず）によって、ＢＰＧＭが胎盤の合胞体栄養細胞層及び、予想通り赤血球で見出されることが確認された。

ウェスタンブロット分析
ヒトの胎盤生検からタンパク質を抽出し、タンパク質の変性ＳＤＳ ＰＡＧＥを行った。同様に分画したヒトの赤血球のタンパク質抽出物と共に、ニトロセルロース膜上にこれをエレクトロブロットした。標準的な技術を使用してこの膜をブロッキング、ウサギで産生したヒトの２，３−ＢＰＧＭに特異的なポリクローナル抗血清を使用してプローブ化した。このようなポリクローナル抗体の例は、例えば、Takubo, T.(Journal of Clinical Laboratory Analysis(1998); 12; 263-267)における論文で示されている。

抗ウサギ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体によって、ウェスタンブロットを展開し、市販のキットを使用して製造業者の取扱説明書(Amersham Biosciences, 製品コード番号ＲＰＮ２１０９)に従って、ＥＣＬ試薬によって検出した。

図２によって、２，３−ＢＰＧＭのわずかなバンドが、ヒトの血液及び胎盤組織の両方で見出されることが示される。

この結果によって、予想外に胎盤組織で２，３−ＢＰＧＭが見出されることが示される。これにより初めて、この組織においてこの酵素の存在が同定された。更に、マウスの子癇前症モデルにおいて、この酵素が様々なレベルで発現され、このことにより、２，３−ＢＰＧＭが子癇前症等の胎盤機能不全の検出の簡便なマーカーであることが示される。

更に、胎児の胎盤残屑は、トリソミー２１及び子宮内発育不全を含む多くの様々な疾患の特徴である。胎児の胎盤残屑に２，３−ＢＰＧＭが存在することによって、ＢＰＧＭをこのような残屑のマーカーとして使用することが可能になる。Vonag他(Am. J. Pathol.(2002); 116; 51-58)又はLevine, R.J.(Am. J. Obstet. Gynecol.(2004); 190; 707-13)による論文で示される技術を使用して、胎盤の残屑を同定することができ、このような物質の存在を確認するためのマーカーとして、２，３−ＢＰＧＭを使用することができる。例えば、２，３−ＢＰＧＭに対するポリクローナル抗体、あるいは、この酵素に対して生じたモノクローナル抗体を使用して、２，３−ＢＰＧＭを検出することができる。

胎盤絨毛の横断面における２，３−ＢＰＧＭのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブ化を示す図である。２，３−ＢＰＧＭのｍＲＮＡが絨毛膜絨毛を覆う黒色に染色した合胞体栄養細胞層（ＳＴ）で見出される。絨毛と、絨毛内の胎児の赤血球（Ｆ）との間を循環する母親の赤血球（Ｍ）を矢印で示す。 成人のヒト血液（レーン１）及び胎盤組織（レーン２）由来のＳＤＳ変性タンパク質を、２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼの存在に関して分析したウェスタンブロット分析を示す図である。２，３−ＢＰＧＭを染色したバンドを矢印で示す。 ヒト２，３−ＢＰＧＭの核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。ヒト２，３−ＢＰＧＭの配列はまた、ＰｕｂＭｅｄヌクレオチド登録番号ＮＭ＿１９９１８６、並びにマウスに関しては、ＮＭ＿００７５６３及びＢＣ００４５８９で見出される。

Claims (17)

1. ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
   （ｉ）母親又は胎児の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
   （ｉｉ）前記サンプル中の胎児２，３−ビスホスホグリセリン酸ムターゼ（２，３−ＢＰＧＭ）又はそのバリアントの量を測定する工程と、
   （ｉｉｉ）前記量と胎児２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの既知の正常レベルとを比較する工程
   を含む方法。
2. ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
   （ｉ）母親の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
   （ｉｉ）前記サンプルにおいて、胎児の２，３−ＢＰＧＭ又はそのバリアントの存在を検出する工程
   を含む方法。
3. 前記サンプルが、母親の血液、胎児の血液、母親の尿、母親の便、母親の唾液、羊膜液、及び絨毛膜絨毛サンプル等の胎盤物質から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記サンプルが、母親の血液、母親の尿、母親の便、母親の唾液、羊膜液、及び絨毛膜絨毛サンプル等の胎盤物質から選択される、請求項２に記載の方法。
5. 母親の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、該サンプル中の胎児２，３−ＢＰＧＭの量を測定する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記サンプルが母親の血液であり、前記方法が、
   （ａ）母親の血液から胎児の胎盤物質を単離する工程と、
   （ｂ）前記単離した胎児の胎盤物質中の胎児２，３−ＢＰＧＭの量を測定する工程
   を含む、請求項５に記載の方法。
7. 胎児２，３−ＢＰＧＭの量が、前記サンプル中の２，３−ＢＰＧＭ又は２，３−ＢＰＧＭをコードするｍＲＮＡの濃度、あるいは前記サンプル中の２，３−ＢＰＧＭ酵素活性のレベルである、前記いずれかの請求項に記載の方法。
8. ２，３−ＢＰＧＭの量が、イムノアッセイ、酵素アッセイ又はリアルタイムＰＣＲによって測定される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
9. ヒト又はマウス等の妊娠している哺乳動物において、子癇前症等の胎盤機能不全をスクリーニングする方法であって、
   （ｉ）母親又は胎児の体液又は組織のサンプルを準備する工程と、
   （ｉｉ）遊離型２，３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ＢＰＧ）の濃度を測定する工程と、
   （ｉｉｉ）前記濃度と２，３−ビスホスホグリセリン酸の既知の正常レベルとを比較する工程
   を含む方法。
10. 前記サンプルが、母親の血液、胎児の血液、母親の尿、母親の便、母親の唾液、羊膜液、及び絨毛膜絨毛サンプル等の胎盤物質から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記サンプルが母親の血液、母親の尿又は母親の唾液である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記２，３−ビスホスホグリセリン酸がイムノアッセイによって測定される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 子癇前症等の胎盤機能不全の治療のための候補薬剤を決定する方法であって、
    （ｉ）胎児２，３−ＢＰＧＭを発現する細胞を準備すること、
    （ｉｉ）前記細胞を化合物で処理すること、及び
    （ｉｉｉ）前記細胞で産生される２，３−ＢＰＧＭの量に対する前記化合物の効果を測定すること
    を含む方法。
14. 前記細胞が胎児の胎盤細胞である、請求項１３に記載の方法。
15. ２，３−ＢＰＧＭの量が、細胞による２，３−ＢＰＧＭの発現レベル又は２，３−ＢＰＧＭの酵素活性により決定される、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法で使用するためのアッセイキットであって、サンプル中の２，３−ＢＰＧＭの量を測定するための検出手段及び該アッセイキットを使用するための取扱説明書を含むアッセイキット。
17. 妊娠している哺乳動物中の胎児の胎盤残屑を同定する方法であって、
    （ｉ）母親の体液又は組織のサンプルを準備すること、
    （ｉｉ）前記胎児の胎盤残屑を単離すること、及び
    （ｉｉｉ）前記残屑中の２，３−ＢＰＧＭを検出すること
    を含む方法。

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