CN111257445A - 用于sle孕妇病情监测及其胎儿结局预测的产品及方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于系统性红斑狼疮(SLE)孕妇病情监测及其胎儿结局预测的产品及方法。具体涉及一种用于怀孕SLE对象病情监测和/或其胎儿结局预测的产品，其通过测定血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N‑糖链G₂FS₁和末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N‑糖链G₀F的丰度进行监测和预测。本公开还涉及相关的产品、应用及方法。

Description

用于SLE孕妇病情监测及其胎儿结局预测的产品及方法

技术领域

本公开属于生物技术和医学领域。具体而言，本公开涉及对系统性红斑狼疮(SLE)孕妇妊娠胎儿结局的预测和SLE患者孕期病情监测。更具体而言，本公开涉及通过测定SLE孕妇血液样品中免疫球蛋白G表面双天线复杂型N糖链末端单唾液酸化半乳糖糖链的水平(GS指标)对SLE患者孕期病情监测和胎儿结局进行预测的产品、方法及应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性多器官自身免疫性疾病，严重影响育龄妇女，甚至造成孕妇生命危险。研究统计，因非产科疾病导致孕产妇死亡的病例中，SLE位于第3位，其孕产妇死亡率高达21.1/1000，远远高于普通人群孕产妇的死亡率(70/10万)。来自中国SLE治疗研究组(CSTAR)的数据显示， SLE患者在男女中的发病比例约为1：10(2104例中女性1914例；男性190例)；平均发病与年龄为29.2岁，高发于20-40岁的育龄期女性；2026次妊娠中有 107次异常妊娠。

SLE患者发生不良妊娠并发症的风险增加，导致如高血压疾病(子痫前期；子痫；妊娠期高血压)、宫内生长受限(IUGR)、早产和低出生体重儿等不良妊娠结局。例如可参见Tan,E.M.等，The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupuserythematosus.Arthritis Rheum,1982.25(11):p.1271-7.；Tavares Da Silva,F.等，Stillbirth:Case definition and guidelines for data collection,analysis, andpresentation of maternal immunization safety data.Vaccine,2016.34(49):p.6057-6068.；Ruperto,N.等，International consensus for a definition of diseaseflare in lupus.Lupus,2011.20(5):p.453-62.)；以上文献均通过引用纳入本文作为参考。

美国风湿学会(ACR)数据提示，1/3的SLE患者实施剖宫产，33％的患者出现早产，大于20％的患者发生子痫，胎儿宫内发育迟缓患者可达30％。

孕期是一个比较特殊的时期，各项生理指标复杂而多变。由于妊娠期母体的生理变化可能与SLE病情活动的特征有重叠，因此对识别妊娠期疾病活动造成困难。妊娠期SLE活动可能会对胎儿健康和妊娠结局产生负面影响。

目前，临床上常用SLE妊娠疾病活动指数(systemic lupus erythematosus inpregnancy activity index，SLEPDAI)、妊娠期LAI(Lupus Activity Index inPregnancy，LAI-P)和修改后的SLAM(modified Systemic Lupus Activity Measure， m-SLAM)评估妊娠期SLE活动性。但受妊娠相关生理变化影响，上述方法均存在一定的局限性。此外，一些实验室检查结果如轻度血小板减少、蛋白尿、红细胞沉降率升高等，在妊娠期较为常见，检测结果需要审慎评估和解释。由此，目前亟需探索新的便捷的方法评估妊娠期SLE活动性及预测SLE患者胎儿结局。

综上，如何对妊娠合并自身免疫性疾病患者进行恰当的病情评估，及时做出有效的管理，减少自身免疫性疾病对母亲和胎儿的影响，是产科及多学科共同关注的重要问题。在这样的背景下，以孕产妇生命安全为前提，开发能够及时、准确评估SLE患者孕期病情、预测胎儿结局的产品和方法，对于有效控制病情，保障母儿生命安全，辅助临床医生做出合理的判断和临床处置，避免不良后果的发生，具有重要的社会意义和经济价值。

发明内容

本公开的主要目的在于提供一种基于血液的GS指标的检测方法和产品，其可用于SLE患者孕期的病情监测和/或妊娠胎儿的结局预测。

在本公开的第一方面中，提供了一种用于怀孕系统性红斑狼疮(SLE)对象病情监测和/或其胎儿结局预测的产品，所述产品包括：

(A)用于测定血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链G₂FS₁丰度的物质，例如试剂、仪器和/或系统；

(B)用于测定血液IgG表面末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N-糖链G₀F丰度的物质，例如试剂、仪器和/或系统；

例如，用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱 ES-MS；液相色谱法；超高效液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；微流控技术；核磁共振NMR，优选超高效液相色谱法；

(C)可任选地，用于计算G₂FS₁和G₀F的丰度比值GS指标的模块和/或处理器；其中GS指标按照以下公式进行计算：

GS指标＝aG₂FS₁/bG₀F；或者其倒数、对数等其他变换形式，

其中，a、b各自的取值独立地位于0至10之间，例如独立地选自0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、 8、9或10，其中a≠0，b≠0；

(D)可任选地，用于根据GS指标对怀孕SLE对象进行病情监测和/或其胎儿结局进行预测的模块和/或处理器，其中：

当GS指标用于对怀孕SLE对象病情进行监测时，包括步骤：

a)将GS指标与预先设定的阈值进行比较；

b)以阈值为界，达到或高于该值判定为病情稳定，低于该值判定为病情活动；

当GS指标用于对怀孕SLE对象的胎儿结局进行预测时，包括步骤：

a')将GS指标与预先设定的阈值进行比较；

b')以阈值为界，达到或高于该值判定为发生胎儿丢失风险较小，低于该值判定为胎儿丢失风险较大。

在一些实施方式中，血液选自：血清、血浆和全血。

在一些实施方式中，产品还包括选自下组的一种或多种：

a)用于采集和/或处理血液样品的试剂和/或仪器；

b)用于分离和/或纯化血清和/或血浆的试剂和/或仪器；

c)用于分离和/或纯化血清/血浆IgG的试剂和/或仪器；

d)用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器，

e)用于标记(例如用荧光标记物进行标记)IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器；

f)用于分析对象血清IgG表面N-糖链G₀F和G₂FS₁丰度、存储和/或处理 G₂FS₁和G₀F比值(GS指标)的数据库、模块和/或处理器；

g)IgG表面N-糖链标准品，可任选地所述IgG表面N-糖链标准品经过与对象样品相同的处理，能用于特征糖链的标定；

h)用于提供判断阈值的模块和/或处理器；

i)用于根据GS指标对对象进行预病情监测和胎儿结局预测的模块和/或处理器；

j)用于提供诊断和/或检测结果和/或报告的模块和/或处理器；

k)说明书或使用指南，其中记载了如下一种或多种应用和/或判断方式：

(i)将GS指标用于胎儿结局预测：当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如47.38±10，47.38±5，47.38±1)，则预测患者发生胎儿丢失风险较小；当GS指标低于预先设定的阈值或阈值范围，则预测患者发生胎儿丢失风险较大；

(ii)将GS指标用于怀孕SLE对象病情监测：在第一孕期中，当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如41.04±10，41.04±5，41.04±1)，则表示患者病情稳定；当GS指标低于预先设定的阈值，则表示患者病情活动；在第二孕期中，当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如 63.94±10，63.94±5，63.94±1)，则表示患者病情稳定；当GS指标低于预先设定的阈值或阈值范围，则表示患者病情活动。

在一些实施方式中，k)中预先设定的阈值范围包括该范围的任意子范围、该范围的端点以及范围内的任意点。

在一些实施方式中，可基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定最佳阈值，且优选的所述阈值范围可为最佳阈值±1～15％(包括该范围内的任意数值点或子范围)的范围，包括该范围的端点、范围内的任意数值点或子范围。

在一些实施方式中，前述(A)和/或(B)为用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；超高效液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；微流控技术；核磁共振NMR，优选超高效液相色谱法。

在一些实施方式中，产品用于包含如下步骤的检测方法中：

(A')测定对象血液样品中IgG表面G₂FS₁的丰度；

(B')测定对象血液样品中血液IgG表面G₀F的丰度；

(C')计算G₂FS₁和G₀F的丰度比值，即GS指标；

(D')根据GS指标判断对该对象进行病情监测和/或对其胎儿结局进行预测。

在一些实施方式中，方法还包括选自下组的一个或多个步骤：

(a')采集和/或处理血液样品；

(b')分离和/或纯化血清和/或血浆；

(c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；

(d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；

(e')标记IgG表面N-糖链，例如用荧光标记进行标记；

(f')分析对象血清IgG表面N-糖链G₀F和G₂FS₁丰度，存储和/或处理G₂FS₁和G₀F比值(GS指标)，例如所述丰度通过与IgG表面N-糖链标准品(优选经过与对象样品相同处理的IgG表面N-糖链标准品)的相应丰度或标准曲线进行比较得出；

(g')提供判断阈值；

(h')根据GS指标对对象进行预病情监测和胎儿结局预测；

(i')提供检测结果和/或报告。

在本公开的一些方面中，提供了用于测定对象血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链G₂FS₁丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)和/或用于测定对象血液IgG表面末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N-糖链G₀F丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)在制备用于怀孕SLE对象病情监测和/或其胎儿结局预测的产品中应用。

在一些实施方式中，所述产品和/或其中所包含的物质可如本文中其它部分中所述。

在本公开的一些方面中，还提供了一种对怀孕系统性红斑狼疮(SLE)对象进行病情监测和/或对其胎儿结局进行预测的方法。

在一些实施方式中，所述方法采用了本公开中的产品。

在一些实施方式中，所述方法包括：

(A')测定对象血液样品中IgG表面G₂FS₁的丰度；

(B')测定对象血液样品中测定血液IgG表面G₀F的丰度；

(C')计算G₂FS₁和G₀F的丰度比值的丰度比值，即GS指标；

(D')根据GS指标判断对该对象进行病情监测和/或对其胎儿结局进行预测。

在一些实施方式中，所述方法还包括：

选自下组的一个或多个步骤：

(a')采集和/或处理血液样品；

(b')分离和/或纯化血清和/或血浆；

(c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；

(d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；

(e')标记IgG表面N-糖链，例如用荧光标记进行标记；

(f')分析对象血清IgG表面N-糖链G₀F和G₂FS₁丰度，存储和/或处理G₀F 和G₂FS₁比值(GS指标)，例如所述丰度通过与IgG表面N-糖链标准品(优选经过与对象样品相同处理的IgG表面N-糖链标准品)的相应丰度或标准曲线进行比较得出；

(g')提供判断阈值；

(h')根据GS指标对对象进行预病情监测和胎儿结局预测；

(i')提供检测结果和/或报告。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本公开作进一步说明，其中提供这些附图仅是为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。

图1：G₀F和G₂FS₁的主要糖链结构。在结构图示中：左侧为糖链与IgG 的连接位点，右侧为糖链末端，且其中：三角形表示岩藻糖；正方形表示N- 乙酰葡萄糖；深灰色圆形表示甘露糖；浅灰色圆形表示半乳糖；菱形表示唾液酸。

图2：GS指标在妊娠SLE患者胎儿结局预测中的ROC曲线。

图3：GS指标在妊娠SLE患者第一孕期病情监测中的ROC曲线。

图4：GS指标在妊娠SLE患者第二孕期病情监测中的ROC曲线。

具体实施方式

本申请人研究表明：与正常女性相比较，同年龄层(18-40岁)SLE女性IgG 的多种糖链发生改变，例如，GP4、GP6、GP7、GP8、GP9等，而GP1、GP2、 GP15、GP16、GP18(即G₂FS₁)等水平在两组间则无明显差异。SLE患者怀孕期间，IgG表面各种糖链随着孕期波动性发展，其表现为与正常孕妇相比：同一糖链在不同孕期的变化方向并不一致；而同一孕期，不同糖链的变化方向也不一致。因此，要找出特定疾病过程中特定怀孕阶段时特定糖链水平变化的规律存在极高的技术难度。

本申请基于发明人对于怀孕SLE患者血液中免疫球蛋白G(IgG)表面双天线复杂型N糖链广泛而深入的研究过程中出乎预料的发现：尽管孕末期正常孕妇和SLE孕妇间的血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链G₂FS₁(mono-sialylated,galactosylated biantennary, core-substituted with fucose)水平无明显差异，但在第一孕期和第二孕期并非如此，G₂FS₁的水平与末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N-糖链 G₀F(asialo,agalacto biantennary core-substitutedwith fucose)的水平之比与怀孕 SLE患者的病情及其胎儿结局具有密切的相关性。基于此，本公开中提供了采用相应末端糖链丰度比值来监测怀孕SLE患者的病情及预测其胎儿结局的新产品和新方法。

本申请的产品、方法及应用填补了本领域目前在SLE患者妊娠期病情监测和胎儿结局预测方面的不足，具有敏感性高、特异性好、操作便捷的特性，对于精准治疗，优生优育，降低病患负担具有重要的意义。并且，本申请的方法便捷易操作，相对于各项评分，更加直观，容易获得。由此，本申请的产品、方法及应用具有优异的推广应用前景。

相关术语定义

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本申请提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，术语“GS指标”是指对象血液IgG表面G₂FS₁与G₀F的丰度比。除非另有说明，术语“末端”是指糖链远离与IgG本体连接点的一端。

如本文所用，术语“双天线复杂型N-糖链”是指：N-糖链中共有的核心五糖上连接入2个非纯甘露糖的分支糖链，宛如天线状(参见查锡良主编，《生物化学》人民卫生出版社，2008年第7版，第454-455页)。

示例性的G₀F和G₂FS₁的结构如下所示，其中，Fuc代表岩藻糖，GlcNAc 代表N-乙酰葡萄糖胺，Man代表甘露糖，Gal代表半乳糖，Neu5Ac代表唾液酸：

G₀F和G₂FS₁的主要糖链结构也可如图1所示。

如本文所用，术语“特异度”、“灵敏度”、“符合率”均与相对应的医学统计学术语具有相同的含义。本文中的“特异度”(specificity)是指临床判断为对细胞因子靶向治疗不敏感的病例中经本申请指标检测为阴性(即不敏感)的比例。“灵敏度”(sensitivity)是指临床判断为对细胞因子靶向治疗敏感的病例中，经本申请指标检测为阳性(即敏感)的比例。“符合率”(accuracy)是指真阳性样本量与真阴性样本量之和占总样本量的比例，反映本申请指标检测结果与受试者对细胞因子靶向治疗是否敏感的真实情况相符合的程度。

如本文所用，术语“截断值”、“阈值”、“cut-off值”、“界值”和“参考值”、可以互换使用，指的是用来判断检测结果的标准，即临界值。通常，检测结果高于阈值即视为阳性，低于阈值即视为阴性；但有些情况下反之亦然。

如本文所用，术语“第一孕期/孕初期”或“1^sttrim(trimester)”可互换使用，通常是指怀孕第1周至第14周前。如本文所用，术语“第二孕期/孕中期”或“2^nd trim(trimester)”可互换使用，通常是指怀孕第14周至第28周。

血液IgG及其分离和纯化

在本申请的实施方式中，可采集对象的血液样品并用本领域中已知的常规方法分离和保存全血、血清和/或血浆。可采用新鲜或冻存血液、血清或血浆，优选血清进行本申请的测试。所述血液样品可获自各种哺乳动物对象，优选人。本领域技术人员可以理解，由于在成分上的区别，当采用受试者的血浆样本和血清样本分别进行检测时，GS指标可能会略有不同。出于便于定量和比较的目的，在本申请中血清样本是优选的。

分离IgG的方法是本领域普通技术人员已知的，所述方法包括但不限于： IgG纯化柱、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇置换法、液相层析、亲合层析(例如蛋白A或蛋白G亲合法、聚酰胺复合膜亲合法)，只要所述方法不破坏 IgG上所连N-糖链即可。可市售获得IgG分离试剂盒，例如购自Thermo Fisher Scientific。

在本申请的一个实施方式中采用了IgG纯化柱来分离样品中的IgG，优选采用蛋白A纯化柱，并采用与纯化柱配套的弱碱性结合缓冲溶液和弱酸性淋洗缓冲溶液，更优选所述纯化柱为高通量纯化柱，例如可同时处理96个样品的纯化柱。

N糖链的分离、纯化及检测

可采用本领域中已知的方法从IgG上分离N糖链，包括但不限于：酶法，例如采用糖苷酶，优选糖苷酶PNGase F；化学法，例如采用糖蛋白肼解试剂，如ADM0155A肼解试剂盒。

从IgG上分离N糖链后，可采用本领域中已知的方法对N糖链进行分离和/或纯化，所述方法包括但不限于：多孔石墨化碳PGC固相萃取法、多糖/ 寡糖纯化柱、凝集素亲合法(如连续凝集素亲合色谱SLAC)、毛细管电泳、高效/超高效液相色谱、有机试剂沉淀(如65％乙醇)等。

在一些实施方式中，采用了多孔石墨化碳PGC固相萃取法分离N糖链。在一个实例中，在PGC固相萃取分离N糖链中，优选采用0.1％三氟醋酸的80％的乙腈水溶液活化PGC，采用用0.1％的三氟醋酸水溶液平衡PGC、采用0.05％的三氟醋酸的25％乙腈水溶液洗脱糖链。

可采用本领域中已知的定量方法对IgG表面G₀F和G₂FS₁的丰度进行测定。所述方法包括但不限于：液相色谱法；超高效液相色谱法；质谱法，例如基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ESI-MS；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；微流控技术；核磁共振 NMR或以上方式的任合组合。

在一些实施方式中，采用超高效液相色谱法定量分析N-糖链中GS指标相关糖链水平。在一些实施方式中，超高效液相色谱法定量分析的步骤如下：

(a)标记N-糖链：

以2-AB标记为例：悬干或冻干上述糖链(待测样品糖链及标准品糖链)溶液，加入2-AB，60℃孵育2小时(如37℃孵育17-24小时)后加30-50μl超纯水混匀。

(b)UPLC检测：

示例性的仪器及参数设置如下：

流速为500μ0速为M5-1，λ1速为M5 rsmm，λλ速为M5 rsmm，分析时间为25.67min，液相条件为梯度洗脱(0～25.67min,78％～55.9％乙腈(纯溶液)，根据梯度洗脱条件，由液相泵自动控制两种流动相的比例。

(c)定量分析GS指标相关糖链组份：

根据标准品定位相关糖链。在色谱图中，不同类型糖链的保留时间不同，将样品的谱图与标记的标准品谱图叠加对比，确定样品色谱图中GS指标相关糖链的保留时间，定位糖链；并根据相应糖链的峰高或峰面积大小计算GS指标相关糖链的丰度，根据计算公式求得GS值。

数据分析方法

在本申请中，将GS指标，即对象血液IgG表面上G₂FS₁与G₀F的丰度比，其可作为系统性红斑狼疮孕妇病情监测及其胎儿结局预测的可靠指标。

GS指标计算的示例性公式如下所示：GS指标＝aG₂FS₁/bG₀F；或者其倒数、对数等其他变换形式。

其中，a、b各自的取值独立地位于大于0至10之间，例如独立地选自0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、 6、7、8、9或10，其中a≠0，b≠0)。可根据所采用的测试仪器和/或方法中各种参数的响应程度，对a、b的具体取值进行调整。例如，可基于所使用的试验方法与标准方法(例如超高效液相色谱，UPLC)校验后的比值，对a、b的具体取值进行调整。

例如，所述公式可为：GS指标＝G₂FS₁/G₀F，即a＝b＝1。

上述用于丰度比值的G₀F和G₂FS₁优选均来源于同一样本、同次检测和/ 或同一谱图。因此，采用该指标可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，从而减小平行样本进入质谱检测时的误差，确保分析的高重现性和准确性。

本领域普通技术人员基于本领域常识可根据不同对象群的检测数据绘制相应的ROC曲线，例如本申请的实施例中根据不同人群的数据绘制相应的 ROC曲线。根据本领域公知技术，每一条ROC曲线都提供了一系列阈值及与之相对应的灵敏度和特异度。因此，使用这些ROC曲线，本领域技术人员能很容易地查出选取任意截断值(即cut-off值)时该项检测对敏感性的识别能力，即筛选的灵敏度、特异度和符合率。

筛查结果的计算(截断值的计算)取决于特异度和灵敏度。截断值的计算方法包括但不限于：

方法1：选定ROC曲线中斜率最大点，取其对应的GS指标为截断值。

方法2：最大化灵敏度和特异度的值，即[灵敏度％-(1-特异度％)]_max对应的GS比即为最优截断值(最大约登指数，Youden index)。

以采用公式GS指标＝G₂FS₁/G₀F为例，以截断值为界，达到或高于该值判定为病情稳定或胎儿结局好，低于该值判定为病情有活动或胎儿结局不良。

本领域技术人员可以理解，由于具体情况的不同，例如受试群体人种的不同，截断值的选取及其对应的灵敏度、特异度和符合率等参数会有所差别，但均包含在本申请的截断值范围内。本领域技术人员可以根据实际使用需求，如对灵敏度、特异度等的要求，从本申请公开的ROC曲线或截断值范围内选取适当的优选截断值。可在确定最佳截断值后，将该最佳截断值±1～15％的范围 (包括该范围内的任意数值点或子范围)。

GS指标的应用

本申请GS指标可应用于对SLE孕妇的病情监测和胎儿结局预测。这些应用包括但不限于：

(1)将GS指标用于SLE孕妇病情监测

在一些实施方式中，在第一孕期中检测GS指标(例如G₂FS₁/G₀F)，当GS 指标达到或高于预先设定的阈值(例如41.04)或阈值范围(例如41.04±10、±5或±1)，则判定患者病情稳定，当GS指标低于预先设定的阈值(例如41.04)或阈值范围(例如41.04±10、±5或±1)，则判定患者病情活动。

在一些实施方式中，在第二孕期中检测GS指标(例如G₂FS₁/G₀F)，当GS 指标达到或高于预先设定的阈值(例如63.94)或阈值范围(例如63.94±10、±5或±1)，则判定患者病情稳定，当GS指标低于预先设定的阈值(例如63.94)或阈值范围(例如63.94±10、±5或±1)，则判定患者病情活动。

(2)将GS指标用于SLE孕妇的胎儿结局预测

在一些实施方式中，在第一孕期末(例如约孕14周前)检测GS指标(例如 G₂FS₁/G₀F)，当GS指标达到或高于预先设定的阈值(例如47.38)或阈值范围(例如47.38±10、±5或±1)，则预测患者在第二孕期发生胎儿丢失风险较小；当GS 指标低于预先设定的阈值(例如47.38)或阈值范围(例如47.38±10、±5或±1)，则预测患者在第二孕期发生胎儿丢失风险较大。

应理解，本申请中SLE孕妇病情监测以及胎儿结局预测结果可随阈值的变化、所用GS指标计算公式的不同而有所变化，这些变化也均包含在本申请的范围内。

GS指标检测产品

本申请中还提供了GS指标检测产品，其可包括：用于检测对象血液IgG 表面上无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链(G₀F)的丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)，和/或用于检测对象血液IgG表面上末段连有1个唾液酸化双半乳糖化核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链(G₂FS₁)丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)；可任选的：计算GS指标的系统、容器、说明书；等。

在一些实施方式中，提供了用于检测对象血液IgG表面上无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链(G₀F)与末段连有1个唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链(G₂FS₁)丰度的试剂和/或仪器在制备用于GS指标检测的产品中的应用。

在一些实施方式中，提供了用于检测对象血液IgG表面上无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链(G₀F)与末段连有1个唾液酸连接的双核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链(G₂FS₁)丰度的试剂和/或仪器和/或用于测定GS指标的试剂和/或仪器在制备用于SLE孕妇病情监测和/或胎儿结局预测产品中的应用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York： Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.GS指标在判定SLE患者妊娠胎儿结局预测中的作用

A.试验目的：

判断GS指标在判定SLE患者妊娠胎儿结局预测中的意义。

B.试验材料：

Protein G Bestarose 4FF(抗体亲和介质)购自博格隆(上海)生物技术有限公司；BCA试剂盒购自Thermo fisher scientific公司；PNGaseF购自New England Biolabs公司；多孔石墨化碳PGC购自Grace公司；2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氢化钠(SC)、二甲亚砜(DMSO)均购自SIGMA-ALDRICH；三氟醋酸购自百灵威；乙腈、甲醇购自迪马科技；其他生化试剂购自国药集团；标准糖链G₀F(CN-NGA₂F-20)和G₂FS₁(CN-A1F-20)购自Ludger公司。

C.入组样本情况和入选标准

83例妊娠期SLE女性患者(25-39岁)，于2017年6月至2019年9月间在住院或门诊期间被招募。诊断为系统性红斑狼疮的患者均符合ACR修订的标准(Tan,E.M.等,The 1982revised criteria for the classification of systemic lupuserythematosus.Arthritis Rheum,1982.25(11):p.1271-7)，根据该标准，系统性红斑狼疮的患者至少满足11项标准中的4项。

伦理学说明：本研究符合赫尔辛基宣言，并经上海交通大学医学院仁济医院伦理委员会批准。已收集每一位被调查病人的书面知情同意书。

D.试验内容及过程

1.概述

入组妊娠期初次建卡产检(约孕12周)SLE女性患者83例，在第一孕期(1st trim)末，接近孕14周收集患者血清，检测GS指标。至第二孕期(2nd trim，14 周～28周)，结合妊娠期胎儿丢失情况，判断GS指标在SLE患者妊娠胎儿结局预测中的意义。

患者入组时及孕期均采用孕期可接受的标准治疗(采用糖皮质激素、慢作用抗风湿药(DEMARDs)和/或非甾体类抗炎药)，未发现糖皮质激素等用药对 IgG糖组有显著影响。

血样采集时间：第一孕期末(接近孕14周)；

观察时间段：第二孕期(孕14～28周)。

2.检测与分析

2.1.血清IgG的分离纯化：

采用96孔Protein G纯化板亲和层析的方法纯化血清中的IgG。具体步骤如下：用结合缓冲溶液平衡96孔蛋白G纯化板；在纯化板内室温孵育血清(70 μL)和结合缓冲液(100μL)的混合溶液45分钟；离心去除过柱的废液，用结合缓冲液洗脱去除未结合的蛋白质；用洗脱溶液将IgG洗脱并收集至预先加入Tris-HCL溶液的96孔板中。采用BCA试剂盒定量IgG。

2.2.IgG表面N-糖链的游离和纯化：

在每份纯化的IgG样品溶液(200μL)中加入10μL糖苷酶工作溶液，37℃孵育过夜。孵育结束后，将样品加入到预活化过的石墨化碳96孔纯化板中，用超纯水洗涤去除盐分与杂质。再用含0.05％(v/v)三氟醋酸的25％(v/v)乙腈水溶液洗脱，收集糖链后真空浓缩至干。

2.3.IgG表面N-糖链的标记：

荧光标记溶液配制：将20mg 2-氨基苯甲酰胺(2-AB)完全溶解于400μL二甲亚砜(DMSO)和冰乙酸的混合液(体积比为7:3)中，然后将24mg氰基硼氢化钠(SC)溶解于以上溶液，即为荧光标记溶液。

标记糖链制备：在每份糖链中加入3μL荧光标记溶液后振荡，60℃孵育2 小时。孵育结束后，在每份标记的糖链溶液中加入50μL超纯水混匀，过0.22μm 膜后待超高效液相色谱(UPLC)分析。

2.4.标记糖链的超高效液相色谱(UPLC)定量分析：

对标记后的糖链样品采用配有四元泵，荧光检测器的Waters Acquity UPLC 进行分离检测。色谱参数如下所示：

2.5.GS指标相关糖链糖链色谱峰的确定方法和定量方法：

在色谱图中，不同修饰的糖链的保留时间不同，将样品的谱图与同样标记的标准品谱图叠加对比(G₀F、G₂FS₁)，确定样品色谱图中G₀F、G₂FS₁的保留时间，定位糖链。根据峰面积的大小分别计算G₀F、G₂FS₁糖链的丰度。

根据公式计算GS指标，得到免疫球蛋白G表面双天线复杂型N糖链末端单唾液酸化半乳糖糖链的水平。GS指标的计算公式如下：

GS＝G₂FS₁/G₀F。

以上所有血清检测和数据处理均在双盲条件下实施。

3.胎儿结局判定方法

根据第二孕期(14～28周)中是否发生胎儿丢失将妊娠期SLE女性患者分为两组：a.胎儿丢失组；b.非胎儿丢失组。

胎儿丢失组包括死胎/死产、自然流产、治疗性流产(因病情需要)，其中：

(1)死产：在怀孕28周及以后出生的无生命迹象的婴儿(Tavares Da Silva,F.等，Stillbirth:Case definition and guidelines for data collection,analysis,andpresentation of maternal immunization safety data.Vaccine,2016.34(49):p.6057-6068)；

(2)自然流产：妊娠28周前终止妊娠；

(3)治疗性流产：由于危及生命的突发事件或其他严重的产科并发症，如严重血小板减少症或HELLP(溶血、肝酶升高和血小板减少)综合征，妊娠可能对产妇健康构成威胁，因此出于治疗性原因进行流产(Ruperto,N.等, International consensus for adefinition of disease flare in lupus.Lupus,2011.20(5): p.453-62)。

4.统计学方法

使用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism，V.8.0.1软件进行统计分析。采用 Mann-Whitney U试验分析组间差异，同时采用t检验和Mann-Whitney试验比较其他临床特征，以及ROC曲线分析、卡方检验评价GS指标对SLE患者发生胎儿丢失的预测价值。双侧P值＜0.05被认为具有统计学意义。

E.结果

结果表明，GS指标与SLE患者胎儿不良结局之间存在着密切的关系：

1)胎儿丢失组(n＝38)和非胎儿丢失组(n＝45)的GS指标存在极明显差异 (38.85±4.03vs.95.69±8.62,p＜0.0001)；

2)ROC结果表明，在将GS截断值设置为47.38时，GS指标能很好的预测胎儿结局。数据分析结果显示，GS指标的曲线下面积(AUC)值为0.9018(95％ CI，0.8267至0.9768)。参照AUC的判定标准(如下)，本指标的AUC≥0.9，表明该指标作为诊断指标“高度准确”：

AUC(area-under-the-curve)的判定标准(Clin.Chem.2007，53：1615-22.)：ROC曲线在临床中常用于比较判断诊断指标对疾病的识别能力。理论上，当 AUC≥0.9时，该诊断指标被认为是“高度准确”；当AUC介于0.7≤AUC<0.9 和0.5<AUC<0.7时，分别为“适用”和“无效”。

并且，在截断值设置为47.38的情况下，GS指标可以很好地区分胎儿丢失组和非胎儿丢失组，灵敏性达到了84.21％，特异性则为95.56％(参见图2的 ROC曲线)。

以上结果表明，GS指标能够用于很好的区分胎儿丢失组和非胎儿丢失组，提示该指标可以用于SLE患者妊娠胎儿结局预测。

实施例2.GS指标在SLE患者孕期病情监测中的作用

A.试验目的：

判断GS指标在SLE患者孕期病情监测中的作用。

B.入组样本情况和入选标准

共176例妊娠期SLE女性患者(25-39岁)，于2017年6月至2019年9月间在住院或门诊期间被招募，其中处于第一孕期有66名，处于第二孕期有110 名。系统性红斑狼疮诊断判定标准同实施例1。

血样采集时间：第一孕期(12～<14周)、第二孕期(26周～28周)；

观察时间段：第一孕期(12～<14周)、第二孕期(26周～28周)。

C.试验内容及过程

1.概述

入组妊娠期初次建卡产检(约12周)SLE女性患者176例，收集第一孕期 (12～14周)、第二孕期(26周～28周)患者血清，检测GS指标，结合系统性红斑狼疮妊娠疾病活动指数(SLEPDAI评分)，判断GS指标在SLE患者孕期病情监测中的意义。

患者入组时及孕期均采用孕期可接受的标准治疗(采用糖皮质激素、慢作用抗风湿药(DEMARDs)和/或非甾体类抗炎药)，未发现糖皮质激素等用药对 IgG糖组有显著影响。

2.检测与分析

GS指标检测步骤同实施例1。

3.病情发展判定方法

按照SLEPDAI对入组病患进行评分：

SLEDAI：

每项8分：癫痫、精神病、器质性脑病、视觉异常、颅神经病变、狼疮性头痛、脑血管意外(卒中)、血管炎；

每项4分：关节炎、肌炎、管型尿、蛋白尿、脓尿；

每项2分：新发红斑、脱发、黏膜溃疡、胸膜炎、心包炎、低补体血症、抗DNA抗体滴度增高；

每项1分：发热、血小板减少、白细胞减少。

0～4分基本无活动，5～9轻度活动，10～14中度活动，≥15分重度活动。

根据SLEPDAI评分将入组病患分为两组，其中：SLEPDAI≤4分为病情稳定组；SLEPDAI＞4分为病情活动组。

4.统计学方法

使用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism，V.8.0.1软件进行统计分析。采用Mann-Whitney U试验分析组间差异，同时采用ROC曲线分析、卡方检验评价 GS指标对SLE病情的评估价值。双侧P值＜0.05被认为具有统计学意义。

D.结果

结果表明，GS指标与SLE妊娠患者病情严重程度存在着密切的关系：

1)第一孕期和第二孕期两个阶段中狼疮稳定组和狼疮活动组GS指标存在极明显差异(第一孕期：56.72±3.70vs.18.84±1.52,p<0.0001；第二孕期： 98.71±7.72vs.46.45±3.66,p<0.0001)。

2)ROC结果表明，GS指标在第一孕期和第二孕期能很好的提示是否存在病情活动。

数据分析结果显示，第一孕期GS指标的曲线下面积(AUC)值为0.9352(95％ CI，0.8737至0.9966)，第二孕期GS指标的曲线下面积(AUC)值为0.8112(95％ CI，0.7263至0.8961)。参照AUC的判定标准(如下)，本指标的AUC≥0.9，表明该指标作为诊断指标“高度准确”。

第一孕期：在截断值设置为41.04的情况下，GS指标可以很好地区分病情稳定组和病情活动组，灵敏性达到了100％，特异性则为84.21％(参见图3的 ROC曲线)；

第二孕期：在截断值设置为63.94的情况下，GS指标可以很好地区分病情稳定组和病情活动组，灵敏性达到了85.19％，特异性则为80.36％(参见图4 的ROC曲线)。

以上结果表明，GS指标在第一孕期和第二孕期均能很好的区分病情稳定组和病情活动组，是提示SLE病情活动、反映SLE妊娠患者病情严重程度的有效指标。

在本公开提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于怀孕系统性红斑狼疮(SLE)对象病情监测和/或其胎儿结局预测的产品，所述产品包括：

(A)用于测定血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链G₂FS₁丰度的物质，例如试剂、仪器和/或系统；

(B)用于测定血液IgG表面末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N-糖链G₀F丰度的物质，例如试剂、仪器和/或系统；

例如，用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；超高效液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；微流控技术；核磁共振NMR，优选超高效液相色谱法；

(C)可任选地，用于计算G₂FS₁和G₀F的丰度比值GS指标的模块和/或处理器；其中GS指标按照以下公式进行计算：

GS指标＝aG₂FS₁/bG₀F；或者其倒数、对数等其他变换形式，

其中，a、b各自的取值独立地位于0至10之间，例如独立地选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9或10，其中a≠0，b≠0；

(D)可任选地，用于根据GS指标对怀孕SLE对象进行病情监测和/或其胎儿结局进行预测的模块和/或处理器，其中：

当GS指标用于对怀孕SLE对象病情进行监测时，包括步骤：

a)将GS指标与预先设定的阈值进行比较；

b)以阈值为界，达到或高于该值判定为病情稳定，低于该值判定为病情活动；

当GS指标用于对怀孕SLE对象的胎儿结局进行预测时，包括步骤：

a')将GS指标与预先设定的阈值进行比较；

b')以阈值为界，达到或高于该值判定为发生胎儿丢失风险较小，低于该值判定为胎儿丢失风险较大。

2.如权利要求1所述的产品，所述血液选自：血清、血浆和全血。

3.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品还包括选自下组的一种或多种：

a)用于采集和/或处理血液样品的试剂和/或仪器；

b)用于分离和/或纯化血清和/或血浆的试剂和/或仪器；

c)用于分离和/或纯化血清/血浆IgG的试剂和/或仪器；

d)用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器，

e)用于标记(例如用荧光标记物进行标记)IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器；

f)用于分析对象血清IgG表面N-糖链G₀F和G₂FS₁丰度、存储和/或处理G₂FS₁和G₀F比值(GS指标)的数据库、模块和/或处理器；

g)IgG表面N-糖链标准品，可任选地所述IgG表面N-糖链标准品经过与对象样品相同的处理，能用于特征糖链的标定；

h)用于提供判断阈值的模块和/或处理器；

i)用于根据GS指标对对象进行预病情监测和胎儿结局预测的模块和/或处理器；

j)用于提供诊断和/或检测结果和/或报告的模块和/或处理器；

k)说明书或使用指南，其中记载了如下一种或多种应用和/或判断方式：

(i)将GS指标用于胎儿结局预测：当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如47.38±10，47.38±5，47.38±1)，则预测患者发生胎儿丢失风险较小；当GS指标低于预先设定的阈值或阈值范围，则预测患者发生胎儿丢失风险较大；

(ii)将GS指标用于怀孕SLE对象病情监测：在第一孕期中，当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如41.04±10，41.04±5，41.04±1)，则表示患者病情稳定；当GS指标低于预先设定的阈值，则表示患者病情活动；在第二孕期中，当GS指标达到或高于预先设定的阈值或阈值范围(例如63.94±10，63.94±5，63.94±1)，则表示患者病情稳定；当GS指标低于预先设定的阈值或阈值范围，则表示患者病情活动。

4.如权利要求3所述的产品，其中k)中预先设定的阈值范围包括该范围的任意子范围、该范围的端点以及范围内的任意点。

5.如权利要求3所述的产品，其特征在于：可基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定最佳阈值，且优选的所述阈值范围可为最佳阈值±1～15％(包括该范围内的任意数值点或子范围)的范围，包括该范围的端点、范围内的任意数值点或子范围。

6.如权利要求1所述的产品，其中，(A)和/或(B)为用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；超高效液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；微流控技术；核磁共振NMR，优选超高效液相色谱法。

7.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品用于包含如下步骤的检测方法中：

(A')测定对象血液样品中IgG表面G₂FS₁的丰度；

(B')测定对象血液样品中血液IgG表面G₀F的丰度；

(C')计算G₂FS₁和G₀F的丰度比值，即GS指标；

(D')根据GS指标判断对该对象进行病情监测和/或对其胎儿结局进行预测。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：

(a')采集和/或处理血液样品；

(b')分离和/或纯化血清和/或血浆；

(c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；

(d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；

(e')标记IgG表面N-糖链，例如用荧光标记进行标记；

(f')分析对象血清IgG表面N-糖链G₀F和G₂FS₁丰度，存储和/或处理G₀F和G₂FS₁比值(GS指标)；

(g')提供判断阈值；

(h')根据GS指标对该对象进行预病情监测和对其胎儿结局进行预测；

(i')提供检测结果和/或报告。

9.用于测定对象血液IgG表面末端单唾液酸连接的核心岩藻糖基化的双天线复杂型N-糖链G₂FS₁丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)和/或用于测定对象血液IgG表面末端无半乳糖连接的核心岩藻糖基化双天线复杂型N-糖链G₀F丰度的物质(例如试剂、仪器和/或系统)在制备用于怀孕系统性红斑狼疮(SLE)对象病情监测和/或其胎儿结局预测的产品中应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品和/或其中所包含的物质如权利要求1-8中任一项所限定。

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