KR20110042678A - 전립선암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 전립선암 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레지스틴 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 전립선암에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다. 또한, 본 발명은 전립선암 환자의 조직에서만 특이적으로 발현이 증가되는 레지스틴을 이용하여 전립선암의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

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Description

전립선암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 전립선암 진단{Biomarker Indicative of Prostate Cancer and Diagnosis Using the Same}

본 발명은 전립선암에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것에 관한 것이다.

전립선암은 최근에 많은 관심이 증가하고 있는 가운데, 특히 고령화 사회에서 그 중요성이 대두되고 있다 전립선 암의 발생률과 질병 특이 사망률은 북미와 유럽에서 가장 높게 나타난다.¹ 미국에서 아시아계 이민자들 중 전립선암 의 발생빈도는 본토 아시아인에 비해 높게 나타나며, 지난20년 동안 아시아 국가에서도 전립선암의 발생률을 급격히 증가했다.² 이런 보고들은 전립선암의 발생에 있어서 서구의 생활방식, 고지방 섭취와 연관된 운동부족이 중요한 요인임을 시사한다. 여러 연구에서 식사량과 지방섭취의 양이 전립선암의 발생에 영향을 미친다는 연구결과도 보고되었고,³ 전립선암의 진행 및 사망률이 체질량지수 (body mass index; BMI)와 상관관계가 있음을 밝혀냈다.⁴

비만, 특히 복부비만 환자에서는 인슐린이 증가되어 있는데, 논란의 여지는 있지만 증가된 인슐린은 인슐린 저항성과 과인슐린혈증을 유발하고 이로 인하여 전립선암의 발생 및 진행이 증가되는 것으로 알려져 있다.⁵ 비만과 관련이 있는 지방세포 (adipocytes)는 과거에는 체내 과다 에너지의 저장고로서의 수동적인 역할을 하는 것으로 생각되었으나, 최근의 여러 연구에서는 지방세포들이 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α: TNF-α), 렙틴(leptin), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6), 플라즈미노겐 엑티베이터 인히비터-1(plasminogen activator inhibitor-1), 아디포넥틴(adiponectin), 레지스틴(resistin) 등을 포함하는 아디포카인(adipokines)이라고 불리는 생물학적 활성사이토카인(cytokines)을 생성하고 분비하는 내분비 기관의 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다.⁶

인슐린에 대한 저항성을 의미하는 뜻에서 명명된 레지스틴은 독특하고 다양한 작용을 하는데, 혈중 레지스틴 농도는 당뇨약인 로지그리타존(rosiglitazone)에 의해 감소되며, 식이나 비만 유전자에 의해 증가하는데, 이는 레지스틴이 비만과 인슐린 저항성의 연결 고리 역할을 하는 호르몬임을 추측하게 한다.⁷ Holcomb⁸ 등이 처음으로 레지스틴 유전자 가계도와 조직에서의 특이한 분포에 대해 기술하였는데, 인체 여러 부위에서 발견되며, 현재까지 비만, 당뇨, 고혈압등의 발생과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 배양된 혈관 내피 세포에서 레지스틴이 직접적으로 세포 증식에 작용한다는 연구가 보고 되었다.⁹ 이미 레지스틴이 융모막암종(choriocaricnoma) 및 유방암의 발생 및 진행에 관여한다는 보고가 있다.^10,11

인슐린 저항성은 전립선암의 발현 및 진행과 연관이 있으며, 아디포카인은 암 전구세포를 표적으로 작용하여, 신호 전달 연쇄반응을 활성화시켜 비정상적인 세포증식과 악성세포로의 변형을 유도한다. 이러한 사실을 근거로 전립선상피세포에서 레지스틴발현의 증가가 전립선암과 인슐린 저항성의 상관관계에 관여한다는 가설을 세울 수 있다.¹² 이번 연구에서 전립선 상피세포에서 레지스틴의 발현정도와 전립선암의 세포 분화 및 진행과의 상관관계에 대해서 알아보고자 한다.

현재, 레지스틴이 포함된 멀티마커를 이용하여 자궁내막암을 조기 진단할 수 있는 방법(미국특허공개번호 제20080090258호)과 심장 혈관 질환에 대한 진단 마커로서의 레지스틴 단백질(미국공개특허번호 제20050244892호)에 대한 특허문헌이 보고 되어 있다.

그러나, 전립선암 조직 및 세포에서 레지스틴의 발현이 증가한다는 문헌 및 전립선암의 진단 마커로 레지스틴이 사용될 수 있음을 개시한 문헌은 아직 보고된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다.

본 발명자들은 전립선암을 신속하고 정확하게 분자 진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 레지스틴(resistin)이 전립선암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 전립선암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 전립선암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 레지스틴 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전립선암 진단 또는 예후에 필요 한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 레지스틴의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 전립선암을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 전립선암을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상술한 분자 마커가 전립선암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다. 특히, 본 발명의 마커는 전립선암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

본 발명의 분자 마커는 전립선암의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 전립선암의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

전립선암 세포 또는 조직이 분화를 하는 경우와 원격전이성 전립선암의 세포 또는 조직에서는 특이적으로 레지스틴 단백질이 미만성(diffuse positivity) 발현 한다(참조: 본 발명의 실시예). 본 발명의 명세서에서 표현 “미만성 발현”은 생시료(예를 들면, 암조직 또는 암세포)에서 균일하고 넓게 레지스틴 단백질이 발현되는 양상을 의미하며, 보다 상세하게는 레지스틴-특이 항체를 이용하여 면역조직화학염색(immunohistochemical staining)에 의해 전립선 조직을 염색하는 경우 염색되는 세포가 전체 세포의 70% 이상인 경우를 의미한다. 따라서, 본 발명의 키트는 전립선암을 진단 할 수 있을 뿐 만 아니라, 바람직하게는 분화하는 전립선암 또는 원격전이성 전립선암을 매우 특이적으로 진단할 수 있다. 레지스틴의 미만성발현을 기준으로 판단하면, 분화하는 전립선암 또는 원격전이성 전립선암은 다른 상태의 전립선암(예컨대, 기관-국한 전립선암 및 국소적 진행 전립선암)보다 1.8-3배 정도 레지스틴이 고발현 된다.

본 발명의 실시예에 따르면, 레지스틴이 전립선암 상피세포에서 정상전립선 상피세포 또는 전립선비대증 상피세포보다 특이적으로 고발현하는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로는, 레지스틴의 미만성 발현 양상을 기준으로 하여 전립선비대증 상피세포보다 전립선암 상피세포에서 5-10배, 보다 바람직하게는 7-10배, 가장 바람직하게는 9-10배 레지스틴이 고발현된다(참조: 실시예 표 1). 전립선비대증과 전립선암이 바이오마커를 이용하여 잘 구별되지 않는 것이 일반적인데, 본 발명의 마커인 레지스틴을 이용하면 전립선비대증과 전립선암을 확실하게 구별하여 전립선암을 진단할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 전립선비대증 시료와 전립선암 시료 중에서 전립선암 시료 만을 선택적으로 진단 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 전립선암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 전립선암을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단 계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 레지스틴 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자 이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 전립선암을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 전립선암으로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 레지스틴 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 레지스틴의 접근번호를 이용하여 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또 는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 전립선암 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또 는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 전립선(prostate) 조직세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리 움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 전립선암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 전립선암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 전립선 조직세포)보다 강하게 나오는 경우에는 전립선암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 전립선암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 전립선 조직, 혈액 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리 된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공 하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오는 경우에는 전립선암으로 진단된다.

따라서 본 발명의 전립선암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서 열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 전립선암에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 전립선암으로 판정한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 전립선암에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다

(ⅱ) 본 발명에서의 레지스틴은 전립선암에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 전립선암 환자의 조직에서만 특이적으로 발현이 증가 되는 레지스틴을 이용하여 전린섭암의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

실험 재료 및 방법

1. 실험 대상군 및 조직의 선택

2007년 1월부터 9월까지 본원 외래에서 전립선비대증으로 진단 받은 26명(평균 나이 68.7±8.3세)을 전립선 비대증군으로, 전립선암으로 진단 받은 환자 67명(평균나이 68.1±8.1세)을 전립선암군으로 포함시켰다. 전립선 비대증 환자는 하부 요로 증상이 있고, 전립선-특이 항원(prostate-specific antigen; PSA)이 정상 수치(＜4 ng/㎖)이며, 직장 수지 검사에서 이상이 없는 환자를 대상으로 경요도 전립선 절제술을 통해 조직을 얻었으며, 전립선 암환자는 초음파 유도 전립선 생검을 통해서 조직을 얻었다.

2. 검사 항목 및 실험군의 분류

모든 임상 시험 참가자에게 서면 동의서를 받았으며, 혈액채취(PSA, 공복혈당, 총콜레스테롤) 및 신체계측(키, 몸무게)을 시행하였다. 체질량지수는 몸무게(kg)를 키의 제곱값(㎡)으로 나누어서 계산하였다. 전립선암군은 진단시의 PSA수치, 근치적 전립선 절제술이나 전립선 생검 조직의 병리학적 등급, 컴퓨터단층촬영(computed tomography; CT)이나 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 소견, 골주사 소견등을 종합하여 TNM 시스템에 따라 분류하였다. 전립선암군을 진행 정도에 따라 조직국한(organ-confined, n=37), 국소침습(locally advanced, n=13) 및 원격전이 (metastatic disease, n=17) 3군으로 분류하였고, 글리손(Gleason) 점수에 따라 7점 미만을 저등급(low grade, n=23), 7점을 중등급(intermediate grade, n=24) 및 7점 초과를 고등급(high grade, n=20)으로 3군으로 분류하였다.

3. 레지스틴 단백질의 면역조직화학 염색

모든 조직은 10% 포르말린 완충액에서 고정한 뒤, 파라핀 포매를 제작하였다. 5 ㎛ 두께의 절편을 박절하여 탈파라핀 한 뒤, 무수알코올, 90%, 75% 및 50% 알코올에서 순서대로 함수 과정을 거쳐서 증류수에 5분 간 수세하였다. H&E 염색을 하고, ABC (the avidin-biotin-streptavidin complex) 테크닉 (Biogenex kit)을 이용하여 면역조직화학염색을 하였다. 레지스틴에 일차 단일클론 항체(R&D system, Cat. No: MAB1359, clone: 184335, Minneapolis, USA)를 1:70으로 희석하여 하루 동안 실온에서 처리하였다. 항원성 회복을 위해 극초단파 조사(microwave irradiation)와 pH 8.0¹⁴의 EDTA-NaOH (TiTriplex, Merck) 완충액을 사용하였다. 음성 대조군은 일차 항체를 처리하지 않고, 비면역 마우스 혈청을 사용하였다.

4. 면역조직화학 염색의 평가

레지스틴에 대한 염색의 판정은 현미경을 통해 세포질에 적갈색으로 염색되는 정도에 따라, 4점 척도를 바탕으로 반 정량적인 방법으로 평가하였다. 염색되는 세포가 없는 경우를 음성으로 판정하였고, 30% 미만인 경우를 1＋(국소성, focal positivity), 30-70%인 경우를 2＋(다발성, multifocalpositivity), 70% 이상인 경우를 3＋(미만성, diffuse positivity)로 판정하였으며, 병리학적 판독은 동일한 연구실에서 시행되었다(도 1).

5. 결과 분석

전립선 비대증군과 전립선암군, 전립선암의 진행 정도, Gleason 점수에 따라 레지스틴의 발현도를 각각 비교하였다. SPSS 소프트웨어 패키지 버젼 11.0 (Statistical Package for Social SciencesTM, Chicago, USA)을 사용하여 Mann- Whitney U 테스트, chi-square 테스트 및 Kruskal-Wallis 테스트를 이용하여 분석하였으며, p값이 0.05 미만인 경우가 통계학적으로 의미가 있다.

실험 결과

1. 대상군의 특성

전립선 비대증군과 전립선암군에서 혈청 PSA는 전립선암군에서 높게 나타났으며(p＜0.05), 환자의 연령, 체질량지수, 공복혈당 및 총콜레스테롤 수치는 두 군 간에 차이가 없었다(표 1). 전립선암군에서 진행 정도에 따른 세 군 간의 비교에서 환자의 연령, 혈청 PSA는 진행 정도에 비례해 의미 있게 증가하나(p＜0.01), 체질량지수, 공복혈당 및 총콜레스테롤 수치는 차이가 없었다(표 2). Gleason 점수에 따른 세 군 간의 비교에서 글리손 점수가 증가할수록 환자의 연령은 증가하나(p＜0.05), 혈장PSA, 체질량지수, 공복혈당 및 총콜레스테롤 수치는 차이가 없었다(표 3).

2. 전립선 비대증과 전린선암에서 레지스틴의 발현도 비교

미만성(3＋)발현은 전립선 비대증군에서 1례(3.8%) 나타났고, 전립선암군에서 25례(37.3%)가 나타났으며, 전체적으로 레지스틴은 전립선 비대증군에 비해 전립선암군에서 통계적으로 유의하게 강한 발현도를 나타냈다(p＜0.001)(표 1).

BMI (body mass index): 체질량지수, PSA (prostate-specific antigen): 전립선-특이 항원, BPH(benign prostatic hyperplasia): 전립선 비대증, PCa (prostate cancer): 전립선암, ^a: Mann-Whitney U 테스트, ^b: chi-square 테스트

3. 전립선암의 진행 정도에 따른 레지스틴의 발현도 비교

전립선암의 진행 정도에 따른 분류에서 미만성발현은 조직 국한군에서 10례(27.0%), 국소 침습군에서 4례(30.8%), 원격 전이군에서 11례(64.7%)가 나타났으며, 진행이 될수록 레지스틴은 통계적으로 유의하게 강한 발현도를 나타냈다(p＜0.05)(표 2).

BMI (body mass index): 체질량지수, PSA (prostate-specific antigen): 전립선-특이 항원, PCa (prostate cancer): 전립선암, ^a: Kruskal-Wallis 테스트, ^b: chi-square 테스트

4. 글리손(Gleason) 점수에 따른 레지스틴의 발현도 비교

전립선암의 글리손 점수에 따른 분류에서 미만성 발현은 저등급에서 4례(17.4%), 중등급에서 7례(29.2%), 고등급에서 14례(70.0%)가 나타났으며, 레지스틴은 글리손 점수가 높은 경우 통계적으로 유의하게 강한 발현도를 나타냈다(p＜0.05)(표 3 및 도 1).

GS(Gleason score): 글리손 점수, BMI (body mass index): 체질량지수, PSA (prostate-specific antigen): 전립선-특이 항원, PCa (prostate cancer): 전립선암, ^a: Kruskal-Wallis 테스트, ^b: chi-square 테스트

고찰

비만은 중요한 보건 문제의 하나로 지난 10년 간 급격히 증가하여 미국 국민의 30%가 비만 환자로 보고되고 있으며,¹³ 식생활의 변화나 사회 환경의 급격한 변화를 겪고 있는 우리나라도 예외는 아니어서 2001년 통계청 자료에 의하면 전체 인구의 30.6%가 과체중을 포함한 비만 환자로 보고되었다.¹⁴ 비만은 관상동맥 질환, 고혈압, 당뇨병과 같은 다양한 만성 질환의 발생과 관련이 있으며,¹⁵ 유방암 및 대장암을 비롯한 몇 가지 암과 관련이 있는 것으로 알려지고 있다.^10,11 과체중과 비만은 전립선암을 포함한 다양한 악성종양과 관련되어 사망률을 증가시킨다.⁴ 역학적 연구에 의하면 논란이 있기는 하지만 체질량 지수의 증가는 전립선 암 진행과 관련이 있다고 한다. 최근의 한 연구에 의하면 체질량 지수가 30 ㎏/㎡ 이상인 환자에서 전립선암 발생은 9% 증가되어 통계적인 유의성이 없었으나, 상대적으로 저 연령인 50-59세 사이의 환자에서는 58% 증가되어 통계적으로 유의한 차이를 보였다.⁵ 이는 비만이 전립선암 발생보다는 전립선암 진행과 관련이 있을 가능성을 시사한다.¹⁶ 또한 근치적 전립선 적출술을 시행한 환자에서 체질량 지수의 증가는 등급 또는 병기의 증가와 관련이 있고, 수술 후 높은 생화학적 재발률과 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며,¹⁷ 전립선암에 의한 사망률을 유의하게 증가시킨다.⁴ 이렇게 재발률이 높은 몇 가지 이유가 제시되어 있다. 체질량 지수가 증가할수록 전립선암의 분화도가 증가하는 것도 중요한 원인이며,^18,19 비만으로 인한 출혈과¹⁸ 수술술기의 어려움으로 수술 변연의 양성일 가능성이 높고,^19,20 방사선 치료에서도 방사선조사 부위를 설계하기 어려우므로 치료의 효과를 떨어뜨릴 수 있으며, 또한 비만으로 진단이 늦어져 진단 당시에 좋은 결과를 기대하기 어려운 경우도 있다. 또한 체질량 지수가 증가할수록 이로 인한 전립선암 사망률도 증가하여, Cancer Prevention Study (CPS) Ⅰ과 Ⅱ에서는 비만환자에서 정상인보다 21-27% 이상 전립선암으로 사망할 위험도가 증가하는 것으로 보고되었으며, 특히 심한 비만이 있는 경우는 정상인보다 34% 이상 전립선암으로 인한 사망의 위험도가 증가하는 것으로 보고되고 있다.²¹ 레지스틴은 가장 최근에 기술된 지방세포 유래 펩타이드이며, 처음에는 인슐린 저항성과 비만을 초래하는 역할을 가지는 것으로 제시되었다. 레지스틴은 생체내 및 생체외 세포에서 모두 인슐린 작용을 길항하는 것으로 보고되고 있으며, 수용체는 아직까지 확인되고 분리되지 않았으며, 신호 전달도 알려진 것이 별로 없다. 혈중 레지스틴 농도는 비만인 사람과 당뇨병 환자에서 증가되는 것으로 보고되고 있는데, 혈중 평균 레지스틴 농도가 당뇨병 환자에서 40 ng/㎖(체구가 마르고 당뇨병이 아닌 환자에서는 15 ng/㎖)라고 제시하였다.²² Shalev 등²³의 연구에서는 건강한 대조군에서는 혈중 평균 레지스틴 농도가 30.7 ng/㎖이며, 당뇨병 환자에서는 49.7 ng/㎖로 현저히 증가한다고 보고하였다.

본 연구에서는 전립선암 조직에서 전립선 비대증 조직에 비하여 레지스틴의 발현이 높음을 알 수 있었으며 이는 전립선암의 발생에 레지스틴이 관여할 수 있다는 가설을 설명할 수 있다. 다른 아디포카인인 렙틴의 경우에는 이러한 사실이 보고되어 있는데, Stattin 등²⁴은 혈중 렙틴 농도와 전립선 암 조직에서 렙틴 및 그 수용체의 발현을 측정하였으며, 이들 모두가 전립선암의 발생 및 진행에 관련이 있다는 보고를 하였고, 이전의 본 저자들의 연구에서도 전립선비대증 조직에 비하여 전립선암 환자에서 렙틴이 유의하게 높은 발현도를 나타내었다.²⁵ 또한 본 연구에서 세포 분화 및 전립선암의 병기와 레지스틴의 발현이 유의한 양의 상관관계가 있다는 결과를 보였다. 이는 결국 조직에서 레지스틴 발현의 증가가 결국 전립선암의 미분화도 및 병기의 진행에 영향을 미칠 수 있음을 의미하며, 결국 비만과 전립선암의 관계에서 레지스틴이 가교 역할을 할 수 있음을 암시한다.

최근에 한 연구에서 혈장 레지스틴 농도와 비만과 인슐린 저항성과 연관된 종양의 상관관계에 대해 보고하였다. Kang 등¹¹은 혈장 레지스틴 수치가 높을수록 유방암의 발생 빈도가 높으며, 혈장 레지스틴 수치가 평균치 이상인 경우, 종양의 병리학적 등급이 가장 높게 나타나는 빈도가 증가한다고 보고하였다. 이런 결과는 높은 혈장 레지스틴 수치가 인슐린 저항성과 연관된 종양의 발생 위험을 높이는 또 다른 아디포사이토카인일 가능성을 시사한다. 본 연구에서 전립선암이 진행될수록 레지스틴의 발현이 증가하는 것으로 미루어 레지스틴이 전립선암의 분화와 진행을 유발할 수 있음을 추측케 하지만, 그 기전에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. Calabro 등⁹은 인체 대동맥 혈관 평활근을 이용한 실험에서 레지스틴이 두 가지 경로를 통해 세포 증식을 유발함을 밝혀냈다. 레지스틴은 P42/p44 MAPK (mitogen activated protein kinase) 활성화 및 PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)에 의한 Akt 세린/트레오닌 키나아제(Akt serine/threonine kinase)의 활성화를 통해 세포 증식을 유발한다는 사실을 입증하였다. 레지스틴이 이러한 경로를 통해 전립선암 발생과정에서 관여할 가능성을 제시할 수 있다.

참조 문헌

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 레지스틴(resistin) 단백질의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 이미지이다. 패널 (A)는 전립선 비대증 전립선 상피세포, 패널 (B)는 저등급(low grasde) 전립선 상피세포, 패널 (C)는 중등급(intermediate) 전립선 상피세포, 및 패널 (D)는 전립선암 전립선 상피세포에서의 레지스틴 단백질에 대한 면역조직화학 염색을 나타낸 결과 이미지이다(항-레지스틴 항체, x 100 확대 이미지). 전립선 상피세포 레지스틴 발현의 강도는 전립선비대증 그룹에서 보다 전립선암 그룹에서 유의적으로 높게 나타내었으며, 고등급(high grade)에서 유의적으로 증가하였다.

Claims (14)

1. 레지스틴(resistin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 레지스틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 전립선암은 분화하는 전립선암 또는 원격전이성 전립선암인 것을 특징으로 하는 키트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 전립선비대증과 전립선암 중에서 전립선암만을 선택적으로 진단 분석할 수 있는 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 키트.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단 또는 예후 분석용 키트.
8. 전립선암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 레지스틴 단백질 또는 레지스틴의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 전립선암 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 전립선암은 분화하는 전립선암 또는 원격전이성 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 전립선비대증 시료와 전립선암 시료 중에서 전립선암 시료 만을 선택적으로 진단 분석할 수 있는 키트인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 시료는 인간의 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.

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