TR201807186T4 - Sno rna, bileşimleri ve kullanımları. - Google Patents

Sno rna, bileşimleri ve kullanımları. Download PDF

Info

Publication number
TR201807186T4
TR201807186T4 TR2018/07186T TR201807186T TR201807186T4 TR 201807186 T4 TR201807186 T4 TR 201807186T4 TR 2018/07186 T TR2018/07186 T TR 2018/07186T TR 201807186 T TR201807186 T TR 201807186T TR 201807186 T4 TR201807186 T4 TR 201807186T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
rna
sequence
expression
snorna
flies
Prior art date
Application number
TR2018/07186T
Other languages
English (en)
Inventor
MARTIN Jean-René
Original Assignee
Ninovax
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ninovax filed Critical Ninovax
Publication of TR201807186T4 publication Critical patent/TR201807186T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/148—Screening for cosmetic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, ilaç olarak özel RNA sekanslarının kullanılması ile ilgilidir. Buluş daha özellikle, buluş sahiplerinin yaşlanma mekanizmalarına dahil edilmesini gösterdiği küçük RNA nükleolarların (snoRNA'lar) kullanımları ile ilgilidir. Buluşun snoRNA'ları özellikle, yaşlanmanın sağlığa zararlı etkileri ile savaşmak için, tipik olarak nörodejeneratif bir hastalığın veya bir kanserin önlenmesi veya tedavi edilmesi için, daha genel olarak bir süjenin yaşam süresinin uzatılması için, bir süjenin stres direncinin arttırılması için kullanılabilmektedir. Buluş konusu snoRNA'lar aynı zamanda kısıtlığın tedavisinde de kullanılabilmektedir. Buluş aynı zamanda, buluşa göre bir snoRNA'yı eksprese edebilen bileşimler ve transjenik hayvanlari hücreler, vektörlerin yanı sıra, yaşlanma mekanizmasına bağlı bir patoloji, bir anomalı veya bir bozukluğun önlenmesi veya tedavisinde aktif bir molekülün tanımlanmasına yönelik araç olarak buluşun önceden bahsedilen ürünlerinden birisini kullanan yöntemler ile de ilgilidir.

Description

TARIFNAME SNO RNA, BILESIMLERI VE KULLANIMLARI Mevcut bulus, ilaç olarak özel RNA sekanslarII kullanilhiasljle ilgilidir. Bulus daha özellikle, bulus sahiplerinin yaslanma mekanizmalarlEla dahil edilmesini gösterdigi küçük RNA nükleolarlarlEl (snoRNA'Iar) kullanIiIarEliIe ilgilidir. Bulus konusu snoRNA'Iar özellikle, yaslanmanI sagllgla zararlEletkileri ile savasmak için, tipik olarak dejeneratif bir hastal[g]lBI, Özellikle de nörodejeneratif bir hastaligiül, bir Iaminopatinin, özellikle de Hutchinson-Gilford sendormunun (HGPS) (aynlâamanda progeria olarak da bilinmektedir), diyabetin, obezitenin veya bir kanserin önlenmesi veya tedavi edilmesi için, daha genel olarak bir süjenin yasam süresinin uzatllBiaslIÇIn, bir süjenin stres direncinin arttlEIlBiaslIibin kullanilâbilmektedir. Bulus konusu snoRNA'Iar aynlîamanda kEIIJHgll tedavisinde de kullanilâbilmektedir.
Aynüamanda bulusa göre bir snoRNA'ythekspere edebilen bilesimler, transgenik hayvanlar, hücreler, vektörler ve mevut metinde açiElanan nükleik asitler, vektörler, kasetler ve/veya hücreleri içeren kitler, bir yaslanma mekanizmasi bagIlIibIarak ortaya çllZlan veya meydana gelen bir patoloji, bir anomali, bir bozukluk veya bir hasar. önlenmesi ya da tedavi edilmesinde aktif bir molekülün belirlenmesine yönelik alet olarak bulusun bahsedilen ürünlerinden birisini kullanan yöntemler açiEJanmaktadB ÖNCEKI TEKNIK Yaslanma mekanizmalarübaska bir ifadeyle yas ilerledikçe hayatta kalma veya yeniden üreme kapasitesinin asamallîtblarak azalmasDJbilimsel topluluk ve birliklerin yüzyilBar boyunca ugrasEloImustur. Günümüzde hakim olan iki teoriden birisi, yaslanmanI genetik olarak önceden programlanmlglolan evrimsel bir yoldan kaynaklanmasIlElve diger ise yaslanmanI hücresel ve moleküler hasarlEl biriktigi varligll normal bir sonucu olmasIlE Bu hasarlara serbest radikaller taraflûdan tetiklenen oksidatif hasarlar, defektif mitokondriler, somatik mutaysonlar, telomerlerin asamalEblarak klîlalmasüprogramlanmlgl hücre ölümü ve bozuk hücrelerin çogalmasÇivs. dahildir (Semsei I. (2000) On the nature of aging. Mech Aging Dev 117293-108).
Mayalar ve fareler gibi organizmalar üzerinde, kalori tedarikinin azaltlßialellEl, yasam süresinin uzamasEiiizerinde belirleyici bir pozitif etkiye sahip oldugu kaniElhnmlStlEl(Sohal, R S, Finch, C E, Revkun, G. (2001) The genetics of aging. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2:435-462). Son zamanlarda yaplßn çallglrialar, kalori sIIElamasII aynüamanda insanlar da dahil olmak üzere primatlarda da etkili oldugunu göstermistir (Roth, G S, Lasnikov, V, Lesnikov, M, Ingram, D K, Land, M A (2001) Dietary caloric restriction prevents the age- related decline in plasma melatonin levels of rhesus monkeys. J Clin Endocrinol Metab. 86:3292-5 ; Roth G S, Lane M A, Ingramn D K, Mattison J A, Elahi D, Tobin J D, Muller D, Metter E J (2002) Biomarkers of caloric restriction may predict Iongevity in humans. Science. biosphere 2: alterations in physiologic, hematologic, hormonal, and biochemical parameters in humane restricted for a 2-year period. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 57:211-24). Ne yazili] ki insanlar. çogunun, bu kesiften faydalanmak için gerekli olan katüdiyetetik diyeti sürdürebilecek olmasünuhtemel degildir.
Birçok arastlîrlna grubu, birkaç yIan beri, yaslanma sürecine dahil olan genler ve sinyalizasyon yollarII tanIiIIanmas adanmgtlü Burada belirtilen çallglnalar Saccharomyces cerei//SI'ae su su, Caenorhabd/I/'s e/egans kurdu ve Drosoph/ki me/anagaster drosophilasII (Fontana ve ark., 2010) aralarlEtla bulundugu birçok organizma üzerinde gerçeklestirilmistir ve büyük bir gen lsitesinin tanIiIanmasI olanak saglamlgtlîl Bunlardan birçogu hormonal sinyalizasyonda yer almaktadlElve büyük bir ökaryotik organizma çesitliligi içinde muhafaza edilmektedir.
En azIan düsük türler için, yasamlEl baslang-a gelisme ve büyümeden sorumlu olan yollarI yasam süresi boyunca bir etkiyi muhafaza ettigi ve yasam süresinin bir kEnIEl belirledigi anlasllBiStB Bu çalismalar ayrlîla dolayIlZIolarak, bir süjenin yasam süresinin degerlendirilmesi için stres direnci ve metabolik kapasitenin önemini de ortaya koymustur. Örnegin Caenorhabd/I/s e/egans'lEl cik-1 geninin mutantlarüoksijen reaktif türlerin ekstra mitokondriyal üretiminin azalmaleUa rol oynamaktadlEl(Hekimi, S, Guarente, L. (2003) numaralEl patent dokümanü gelisim süreci ve uzum yasamda cik-1 geninin islevini açllZlamaktadB Bu doküman özellikle cik-1 geninin ekspresyonun ayarlanmasüle bir bireyin yasam süresinin arttlEIIBias- yönelik bir yöntemi açllZlamaktadB Methuselah genindeki bir mutasyonun (bu G proteinlerine baglEl bir reseptör için kodlamaktadlE), DrosophilanI yasam süresini %35 civarIda arttlgbildigi aç[EIanmlStlEl(US 6,303,768).
Telomerlerin klîalmasII hücre yaslanmasIan sorumlu bir mekanizma oldugu bilinmektedir. Omurgalilârda telomeraz, RiboNükleoProtein (RNP) türünde ters bir transkriptazdIE ve rolü, bölünmekte olan ökaryot hücrelerinde kromozomlarl ucuna telomerik DNA'nI eklenmesiyle telomerlerin uzunlugunun korunmasIlEl(Kiss, 2002).
Insanlarda, telomeraz snoRNA'sII H/ACA kutusundaki bir mutasyon, pleiotropik bir genetik hastal@l]etiklemektedir ve hastalarda daha klîia telomerler bulunmaktadB(Mitchell ve ark., 1999; Vulliamy ve ark., 2001). Yaslanma mekanizmalar.. sifresinin çözülmesi ve bu sürecin geciktirilmesine ve/veya zararllîbtkilerine karsElsavasmaya olanak saglayan yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi için bilimsel topluluklar. sarfettigi çabalara ragmen mevcut araçlar yetersiz kalmaktadlEl “Iyi yaslanmaya” olanak saglayan, baska bir ifadeyle hastallEIar olmadan ve genellikle yasllEthan kaynaklanan rahatslîlllgiar olmadan yaslanmaya olanak saglayan araçlara duyulan ihtiyaç, yasam kosullarIa genel iyilesmeye iliskin olan ilaçlarI gelismesinin halihazlma insan nüfusunun sadece son birkaç on yIa gözle görülür bir biçimde ortalama yasam süresinin arttiEIIBialela olanak saglamaslýla su an her zamankinden daha çok hissedilmektedir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, bulus sahiplerinin yaslanma mekanizmalar. özel olarak dahil edilmesini ortaya koydugu ilgili RNA sekanslarII terapötik veya profilaktik bir baglamda kullanilmasi iliskindir. Bulus sahipleri özellikle, bu sekanslarlEl, yaslanma mekanizmalarIEtlurdurarak ve buna iliskin olan zararlüatkilere karsElsavasarak bir süjenin yasam süresinin olaganüstü bir sekilde arttlülna kapasitesini ortaya koymustur. DolayEIîla bulusun sekanslarlsîl dejeneratif hastalllZIar, Iaminopatiler ve kanserler gibi yaslanmaya iliskin hastalllîlara karslZlve aynlZl zamanda diyabet ve obeziteye karsElsavasmaya olanak saglamaktadß Bu sekanslarI öte yandan, Infertilite ve klglflillZl (baska bir ifadeyle üreme zorlugu veya imkanslîligDJ problemlerinin tedavisinde, ayrlEia özellikle de cinsel olgunluga erismis süjelerin, tercihen yasllZl süjelerin stres direncinin arttlEllIhasIa etkili oldugu ortaya çEnlgtB Bulusun bir birinci amacÇlilaç olarak bir kullanma yönelik olarak, SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansIEilçeren sentetik veya izole bir RNA sekansühomolog bir sekans, tercihen ortolog bir sekans veya fonksiyonel planda analog bir sekans ile ilgilidir.
Bulus sahipleri, drosophilalarda kesfedilen SEKANS KIMLIK NO: 1 RNA sekansIiEi, primatlar ve insan gibi memelilerde ve fare ve siglan gibi kemirgenlerde ortolog sekanslara karsilJEl geldigini kanlfiiamlgtlîl Bulus aynüamanda, mevcut metinde açilZlanan uygulamalardan birisi veya digerinde, tercihen insan kaynakIIZSEKANS KIMLIK NO: 2 sekansEl/e yarasa kaynaklEi SEKANS KIMLIK NO: 3 ve SEKANS KIMLIK NO: 4 sekanlarIan birisi arasIan seçilmis sentetik veya izole bir RNA sekansII kullanilma kapsamaktadLEi Mevcut metinde tablo sekanslarÇlSEKANS KIMLIK NO: 1 sekansII ortolog sekans örnekleridir.
Bulusun baska bir amacübulusa göre ilgili bir RNA sekanslükodlayan bir DNA sekansIE Bulus ayriîa, bulusa göre bir RNA sekansII in vitro, ex w'vo veya 177 l//VO ekspresyonuna olanak saglayan bir vektör ile ilgilidir.
Bulus aynIIizamanda bulusa göre bir RNA sekansIEliçeren ve bulusa göre bir vektör yardIiiýla dönüstürülmüs bir hücrenin yanElsiE, farmasörik veya diyetetik planda kabul edilebilir bir destek ve bulusa göre bir ürün içeren bir bilesim ile ilgilidir.
Bulus öte yandan, söz konusu RNA sekansII /n i/I'vo, in vitro veya ex V/'Vo ekspresyonunun modüle edilmesi veya onarilBiasEiçin, devamIEi/eya sßliîbir sekilde, bulusa göre bir RNA sekansIIEl, bir vektörün, bir hücrenin veya bir bilesimin kullanliîhasliiie ilgilidir.
Bulusun baska bir amacEise bulusa göre ilgili RNA sekansIlEi, tipik olarak SEKANS KIMLIK NO: 3 ve SEKANS KIMLIK NO: 4 sekanslariEhan birisi ve/veya digerini ekspresyonunun önlenmesi veya modifiye edilmesi, tercihen bozulmasElçin genomu genetik olarak modifiye edilmis bir transgenik fare ile ilgilidir.
AYRINTILI A IKLAMA Bulus, drosophilalarI yasam süreleri üzerinde küçük bir nükleoler RNA sekansII (mevcut metinde SEKANS KIMLIK NO: 1 olarak tanIilanan “gençlik” olarak adlandlEllân snoRNA: l11285-1153) etkisinin bulus sahipleri tarafIan kanifiianmaslîiile ortaya çiKmlStE Bu snoRNA, bugüne kadar hiçbir fonksiyon ile bagdastiEiiIhadan, drosophila genomuna iliskin snoRNA'IarI (Huang ve ark., 2005) sistematik olarak taranmasEkapsamIa belirlenmistir.
Bulus sahipleri bu sekansEkarakterize etmistir ve özellikle drosophilalarI yasam sürelerini bölgesindeki 632 baz çiftinin genomik olarak çEarUBîaslüanifliamiglardIEi Bulus sahipleri daha sonra, bu snoRNA'yEkodlayan genomik DNA'yEbarIßn bir transgenin bir örnegi yardIilýla, bu RNA sekansII aslElEékspresyonunun olagan üstü bir sekilde drosophilalarI yasam sürelerini %100 civarIa arttlEliigilüanlBhsmlgardlEl Bulusun RNA sekanslarlßslül] eksprese eden sinekler iki kat daha uzun yasamaktadlB Bulus sahipleri öte yandan, farelerde ve insanlarda ortolog “gençlik" sekanslarII ekspresyonunu tnanlamlglve saptamlgtlEl Bulusun RNA sekanslarü/e diger ürünlerinin özellikleri Yukari da açilZlandigiElüzere bulus, faydalanmaya elverisli bir süjede, tipik olarak bir hayvanda veya bir böcekte, örnegin bir memelide veya bir kemirden, tercihen bir insanda ilaç olarak kullanma yönelik olarak, drosophila (DrosophiYa me/anogastei) kaynaklEIolarak tnaIilanmlg olan SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansII islevsel özelliklerini sergileyen bir ribonükleotidik (RNA sekansDJ izole veya sentetik bir sekans ile ilgildir. kapsamIa, bir ilaç daha önce belirtildigi üzere bir süjede, anormal veya basitçe arzu edilmeyen bir yaslanma sürecine baglüilan bir patoloji, anomali veya bozukluk ile savasmak, savasElesteklemek, bunlarI hafifletilmesi veya önlenmesi için tasarlanmlgtEl Drosophilada ilgili RNA sekansÇlkromozom 2R üzerinde bulunan bölge F4 olarak tanIilanmE olan genomik bölge içinde bulunmaktadlEl Bu nükleotidik sekans, 148 baz çiftinden olusan, bulus sahipleri taraflEUan üzerinde çallsllân birinci drosophila (DrosophiYa me/anogaster) türüne yöneliktir. Bu mevcut metinde SEKANS KIMLIK NO: 1 olarak tannlanmaktadlEl SEKANS KIMLIK NO: 1'in homologlarübrtologlarüanaloglarlZi/e islevsel varyantlarÇlmevcut bulusun konusu olan ilgili sekanslardlE böcek veya baska herhangi bir hayvanlEl baska bir türünde) esdegeri oalrak varsayilEiaslZIlçin, bu biricin drosophila türünde tanIilanan, SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansIlEki ile özdes olan veya buna yeterince yakI olan bir yapi. tasarlanmas. yönelik olarak kullanüßîaktadü Bir sekans, SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansüile veya bunun en az 50 ardlEl nükleotiddeki fragmentlerinden birisi ile birlikte bulunuyorsa bu sekanlel homologu olarak varsaylEiaktadlîj 98 veya 99 oranütla bir sekans kimligi, örnegin blastN sekanslarII hizalanma programEile elde edilen (Altschul ve ark., 1990) veya RNA'larI yap-an veya bunlari sekans benzerlerinden DNA sekanslarIthanilayan “INFERence of RNA ALignment'". klîlaltmaslîl olan INFERNAL program [ile elde edilmektedir. Iki farklEliürün iki homolog genetik sekansÇliki türde de ortak olan son atada bulunan tek bir sekansa sahiplerse ortolog olarak varsayllBiaktadB Kimlik yüzdesi, optimal bir hizalamanI gerçeklestirildigi iki sekans. klýlaslanmaslýla belirlenmektedir. Kimlik yüzdesi, toplam pozisyonlar. say_ bölünüp 100 ile çarpllîhlglaynü posizyondaki iki sekans Üzerinde ortaya çilZan aynDkallEtEliçin pozisyonlar. say-I belirlenmesiyle hesaplanmaktadE Iki sekans. optimal olarka hizalanmasülokal bir homoloji algoritmasEKSmith & Watherman, 1981) ie veya teknikte uzman kisiler taraflEidan bilinen esdeger sistemler ile elde edilebilmektedir. ettigi nükleotidik sekansI (fonksiyonel planda esdeger RNA sekansm endojenlerinin fonksiyonlarlEban en az birisine, örnegin taklit ettigi nükleotidik sekans. endojenlerinin fonksiyonlarII tümüne sahip bir kimyasal bilesik olan mimetiklerin tümünü belirtmektedir.
Bir analog bilesik örnegi, örnegin aynEgenlerin birlesmesine olanak saglayan bir sekanstan olusmaktadlB Bulusun özel bir amacü Drosoph//a me/anogaste/I Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG, CG11125, CG9339, ve CG40006 genleri arasIan seçilmis olan bir ya da daha fazla birlesmeye olanak saglayan SEKANS KIMLIK NO: 1'in bir analog sekansIlE Bulus sahipleri taraflEban gerçeklestirilen deneyler, örnegin CG9339 geninin (adlandlElIîha sekli: skywa/ker) (Uytterhoeven ve ark., 2011), bu genin alternatif birlesmesinde (bakIlîl Sekil 17) yer alan genç/Ik snoRNA'sIIII belirtilen, mutant F4'te dogru bir sekilde birlesmedigini göstermistir. Benzer sonuçlar aynEl zamanda, mutant F4'te birlesen RNA'nI Canton-S yabani türdeki kontrol farelerindekinden daha az oldugunun gözlemlendigi (Sekil 18A) k/ars/Cht geninin transkripsiyon ürünü için, ayrlîla faZ/7 genini kodlayan CG30502 geni (Sekil 188) için elde edilmistir; bu gen Insanda demir, lökodistrofiler (tipik olarak fa2h geninin mutasyonlarIan kaynaklanmaktadlî.) birikimine baglÜiöro-dejenerasyonlarEgibi çesitli demiyelinizasyon sekillerinde ve bir kallBal spastik parapleji (tipik olarak SPGBS kallßal spastik parapleji) yer almaktadEI(Dick ve ark., da daha fazla modifikasyon ve mutasyon (bir ya da daha fazla örnegin bir ya da daha fazla bazIçlâI kapsamIa aç[lZlanan uygulamalardan birisine olanak saglayan nükleik asitlerin tümünü belirtmektedir.
Bulus kapsamIa homolog olarak varsayllân, tercihen ortolog olarak varsayllân bir ekans, bir referans sekanslîlörnegin, söz konusu referans sekansII bulus kapsamliîtla fonksiyonel varyantII bir örnegidir. Bu tür bir sekans dogal, rekombinant veya sentetik olabilmektedir.
SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansüevrim süsia çok iyi muhafaza edilmis ve birçok hayvan türünde bulunan bir sekanstlE Dolaylîlsîla bulus sahipleri özellikle, bu sekans. genomu bilinen diger 12 drosophila türlerinde de bulundugunu göstermistir. SEKANS KIMLIK NO: 1 RNA sekansII homolog/ortolog sekanslar.. örnekleri, mevcut metinde tablo n0.1'de içermektedir (bakIESekil 9). bulunan bir ortolog RNA sekansIEtanIilamlStE Burada mevcut metinde SEKANS KIMLIK NO: 2 olarak tanIilanan sekans söz konusudur. Bulus sahipleri ayrlîb farede, kromozom 15 üzerinde ve kromozom 18 üzerinde iki ortolog RNA sekansIIiEtanIamlStIEIwurada mevcut metinde süaslsîla SEKANS KIMLIK NO: 3 ve 4 olarak tannlanmgiolan sekanslar söz konusudur.
Drosophila, insan ve farede tanllanan ilgili nükleotidik sekanslar asaglki tablo 1'de verilmistir.
Tablo no. 1 Tür RNA sekanslarEGS'ten 3'e kadar) SEKANS Drosophi/a AAAGCGUUAGAUAU UAAACUGUGGUUGAAU UCACAAA 1 me/anogaster AUAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAAC GGUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAU AAGAAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA UUAGCCCCAAUUCUGCAAUUUUCACCGCAAUAAAAGCU UCUCCAGUUAUACAUGGUGAUUGGUCUUGAUGGGCUAU UGUGGACAGAGGAGGGUGCUAGGUUGGGGUGGACGGG AUCAGAGAAACUCCAGAGCCAGCAGGAAACAUUAUAGA GCCUUUGCUACAAUGUCCUGUUUCUUUCUUGGCUUUUA GAAAGCAUUUAAUAUUUACCAAUAGUUUAUUCCGAGCU AGGGUAAAGCAGUCAGUGCUAGAAAAAUGAGAAAACAC AAUACAUAAGACCUCUCAAGGGGAGAUGCUGUUACUGU DKEQMWbSMNMWß AAAGCGUUAGGUAUAAACCUGUGGUUGAAUUCACAAAA UAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAACG GUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAUA AAACAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA AAAGCGUUAGGUAUUAACCUGUGGUUUAAUUCACAAAA UAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAACG GUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAUA AAAUAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA DKNWWMâyaMMu CAAGCGUUGUAUAAUAUUAAACUGUGGAAACUUCACAA AUAGGCCACAGUUAUGCAAGAAACGCUAGAAAAACUUG GUAGUAUUUAAUAACGUGCUGACUAACGUCUGCGGAUA AAAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAUUA DKEmMMaa?da CAUGCGUUGAAUAAUAUUAAACUGUGGACGAAUUCCCA AAUAAGCCACAGUUAUGCAAGAAACGCUAGAAAAAAUA GGUAGUAUUUAAUAACGUGCUGACUAACAUCUGCGGAU AAGAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAAUA amwmgüe UUAGGCGUUCAAAACAUUAAACGUUGGCUGAUUUAUGA UUAGGCUAGUGUUAUGCACGCAACGCUAGAGAAAAUUG GUAGUAUUUAAUAAUGCGUUGGUGGCAAAUCUAUCGA UUUUGAUCUUCGCAUUUUGAGGUACUAGCACAGUU pammbmßawa CAUGGCGCUCAAACAUUAAUCGGUGGCCUGAUCCACAC GUCGGCCACAUUUAUGCACGCAGCGCCAGAUAAUAGUA GGCAGCAUUUAAUAAUGUAUUGGUUCCAAAUGACUCAG ACUUUUGCAUUUUGAGGUGUUAGCCACAACG EhxxwWHapEßWnM3 CAUGGCGCUCAAACAUUAAUCGGUGGCCUGAUCCACAC GUCGGCCACAUUUAUGCACGCAGCGCCAGAUAAUAGUA GGCAGCAUUUAAUAAUGUAUUGGUUCCAAAUGACUCAG ACUUUUGCAUUUUGAGGUGUUAGCCACAAAG Dnmqwmbnwmmwu AGAGGCGUUCAACAUUUAACUUUAGCCGUUCUUUUAAA CUAAGCUAUUUGUUAUGCAAGUAACGCUAGAAUAUAAU UUCUGCAACAUUUAAUAAUGCUUUGGUCGUAUACUAAC AAAAAUCUCAGCAUUUUGAGGUGUCUGCUACAAUU CCCUGCGUUGAGCAGUAAAUUGUCGCUGAUUGAUAAUU AGGCGACGAUAAUGCAAACAACGGUAGAAAAAACUAAC GACAUUUAAUAAUACAUUGACCACUAAAUCCCAUGAAC DMEqmmbLWMS UUAUGCGUUCAACAGUAAAUUGUCGCCGAUAGAUUACU AGGCGACAGUUAUGCAAGGCAACGCUAGAAUAAGCAGA CGACAUUUAAUAAUGCAUUGGCCGACAAACUCCACGGC UUGUGCGUUCGACAGUAAAUUUUCGAUGACUGUAGAUA GGCGAAAAUUAUGCAAGGCAACGCUAGACCAAUUAGAU GACGACAUUUAAUAAUGCAUUGGCCGAUUAACUCAGAU KarslJJIE gelen DNA sekanslarEl melanogaster AAAGCGTTAGATATTAAACTGTGGTTGAATTCACAAAAT AGGCCACAGTTATGCAATAAACGCTAGAAAAAAACGGTA GTATTTAATAACGTGTTGACTAACATCTGCGGATAAGAA GCTTTGCGTTTTGAGGTACTAACCACAGTA GTAAGTGTAGCCTAGAAATTGGGGCTGGATTTGAAAATT AGCCCCAATTCTGCAATTTTCACCGCAATAAAAGCTTCTC CAGTTATACATGGTGATTGGTCTTGATGGGCTATTGTGGA CAGAGGAGGGTGCTAGGTTGGGGTGGACGGGGCCACAG AAAGGGGTTGAAGAATGGTATGGATTCAGAATGAACTAT CAGAGAAACTCCAGAGCCAGCAGGAAACATTATAGAGCC TTTGCTACAATGTCCTGTTTCTTTCTTGGCîTTTAGTTCTG GAAAGCATTTAATATTTACCAATAGTTTATTCCGAGCTAG GGTAAAGCAGTCAGTGCTAGAAAAATGAGAAAACACAA TACATAAGACCTCTCAAGGGGAGATGCTGTTACTGTATAT AAAGCGTTAGGTATAAACCTGTGGTTGAATTCACAAAAT AGGCCACAGTTATGCAATAAACGCTAGAAAAAAAACGGT AGTATTTAATAACGTGTTGACTAACATCTGCGGATAAAA CAGCTTTGCGTTTTGAGGTACTAACCACAGTA Drosoph//a seche//ia AAAGCGTTAGGTATTAACCTGTGGTTTAATTCACAAAATA GGCCACAGTTATGCAATAAACGCTAGAAAAAAAACGGTA GTATTTAATAACGTGTTGACTAACATCTGCGGATAAAATA GCTTTGCGTTTTGAGGTACTAACCACAGTA Drosophi/a yakuba CAAGCGTTGTATAATATTAAACTGTGGAAACTTCACAAA TAGGCCACAGTTATGCAAGAAACGCTAGAAAAACTTGGT AGTATTTAATAACGTGCTGACTAACGTCTGCGGATAAAA GCTTTGCGTTTTGAGGTACTAACCACATTA Drosoph//a erecta CATGCGTTGAATAATATTAAACTGTGGACGAATTCCCAA ATAAGCCACAGTTATGCAAGAAACGCTAGAAAAAATAGG TAGTATTTAATAACGTGCTGACTAACATCTGCGGATAAG AGCTTTGCGTTTTGAGGTACTAACCACAATA vasqphMa TTAGGCGTTCAAAACATTAAACGTTGGCTGATTTATGATT AGGCTAGTGTTATGCACGCAACGCTAGAGAAAATTGGTA GTATTTAATAATGCGTTGGTGGCAAATCTATCGATTTTGA CAGCATTTAATAATGTATTGGTTCCAAATGACTCAGACTT CmiîuWHapEÜWNMS CATGGCGCTCAAACATTAATCGGTGGCCTGATCCACACG 22 TCGGCCACATTTATGCACGCAGCGCCAGATAATAGTAGG CAGCATTTAATAATGTATTGGTTCCAAATGACTCAGACTT L»a&y#MblmWßüwü AGAGGCGTTCAACATTTAACTTTAGCCGTTCTTTTAAACT 24 AAGCTATTTGTTATGCAAGTAACGCTAGAATATAATTTCT nmybveags GCGACGATAATGCAAACAACGGTAGAAAAAACTAACGA CATTTAATAATACATTGACCACTAAATCCCATGAACATTG GCGACAGTTATGCAAGGCAACGCTAGAATAAGCAGACGA CATTTAATAATGCATTGGCCGACAAACTCCACGGCCTTTG L#aay#Mbngßhand TTGTGCGTTCGACAGTAAATTTTCGATGACTGTAGATAGG 30 CGAAAATTATGCAAGGCAACGCTAGACCAATTAGATGAC GACATTTAATAATGCATTGGCCGATTAACTCAGATCTTGC Bulusun özel bir amaclî.] bir hedef genin tanIilanmasEiçin SEKANS KIMLIK NO: 1 RNA sekansII kullanllßîasliile ilgili olup; söz konusu SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansIüDrosoph//a hedef bir sekansEtanlîclabilmesi; söz konusu hedef sekanlel tercihen SEKANS KIMLIK NO:31 (TGGTFGAATFCACAAAA), SEKANS KIMLIK NO:32 (TFGAATFCACAAAATA), SEKANS KIMLIK NO:33 (AATl'CA-CAAAATAGGC), SEKANS KIMLIK NO:34 (AAGCGTFAGATATI'AA), SEKANS KIMLIK NO:35 (ACATCTGCGGATAAGA), SEKANS KIMLIK NO:36 (AAGC'I'I'I'GCG'I'I'I'I'GA), ve SEKANS KIMLIK NO:37 (AGAAGCTITGCG'ITI'I'), veya bunun bir analog sekanslZlarasIan seçilmesi ile karakterize edilmektedir.
Mevcut bulus kapsamIa ilgili RNA sekanslarliltercihen snoRNA'lar formunda bulunmaktadü Bulus kapsamIda “snoRNA '/ar”terimi, ökaryot hücrelerinin tümünde bulunan bir kodlamayan RNA'lar grubunu kapsamaktadE Çekirdekte ve daha özellikle küçük nükleoler ribonükleoproteinleri (small nucleolar ribo-nucleoproteins veya snoRNP'Iar) olusturduklarlîl proteinler ile iliskili olduklarlZhükleol içinde bulunmaktadlEI Bunlar genellikle ön-RNA'larI intronlarIan elde edilen ürünlerdir. Evrimsel seviyede, kodlaylEElolmayan bu RNA'Iar, arkeobakterilerden memelilere kadar bulunmaktadlE SnoRNA'lar, farleRNA sIIIlBlar psödo-üridilasyonu veya 2'-O-riboz metilasyonu gibi, ribozomal RNA modifikasyonu gibi birçok fonksyiona sahip olabilmektedir. Ribozomal RNA nükleolitik sürecinde veya telomerik ana sIEâ ayrHBiaktadlE bir C/D kutusu (Box) içerenler ve bir H/ACA kutusu içerenler (Sekil 2A): C/D kutularlZl özel alanlardan 2'-O-riboz metilasyonunun yönlendirilmesine yaramaktayken, H/ACA kutularEise üridinin psödo-üridine dönüstürülmesini yönetmektedir Bir birinci drosophila türünde tanIllanan ilgili snoRNA:1P285-1153 (genç/ik), H/ACA sIlI'JEla aittir, baska bir ifadeyle yaplgübir H/ACA kutusu içeremektedir. DolaylgEa ribozomal RNA'larI olgunlasmasüslßslia psödo-üridinilasyon (baska bir ifadeyle üridinin psödo- üridine dönüstürülmesinde) yer almaktadlEI ve bazEl genlerin proteik sentezini düzenlemektedir.
Bulusa göre snoRNA'Iar, tipik olarak snoRNA'larI nükleazlara karslîlirencinin arttlElBiasülçin, snoRNA'lara daha iyi bir afinite/selektivite ve dolayisiyla daha iyi bir fonksiyonalitenin saglanmaslîiçin kimyasal olarka modifiye edilebilmektedir. Modifikasyonlar tipik olarak bir nükleosit veya bir nükleosit içi bag ile ilgilidir. Bunlar örneginseker (tipik olarak sekerin 2' pozisyonu), nükleosidin azotlu bazEl(tipik olarak 2, 4 veya 6 pozisyonunda bir ikame içerebilmektedir) veya bir (ya da daha fazla) fosfat grubu içerebilmektedir.
Modifikasyon örnegin bir aminasyon, örnegin florinasyon ile bir halojenasyon ya da örnegin metilasyon ile bir alkilasyondan olusabilmektedir. Modifiye bir seker grubu örnegin 2'-O-metil ve 2'-O-metoksietil arasIdan seçilebilmektedir.
Modifiye bir nükleotid, RNA veya DNA heterosiklik bazlarEile hidrojen baglarEl/aratamayan heterosiklik bir baz içeren bir nükleotid olabilmektedir.
Nükleotidçi bagI modifikasyonu örnegin fosforotioat, metilfosfonat, fosfotriester, fosforoditioat veya fosfoselenat bago arasIan seçilmektedir.
Mevcut bulus ayniIz'amanda bulusun ilgili RNA sekanslarII ekspresyonundan sorumlu olan deoksiribonükleik asit (DNA) sekanslarlîile de ilgilidir. SEKANS KIMLIK NO: 1 RNA sekansII ekspresyonuna olanak saglayan DNA sekansünevcut bulusta SEKANS KIMLIK NO: 5 olarak belirtilen olan sekanstlÜ SEKANS KIMLIK NO: 2 sekansII ekspresyonuna olanak saglayan ise mevcut bulusta SEKANS KIMLIK NO: 6 olarak belirtilen sekanstB SEKANS KIMLIK NO: 3 sekansII ekspresyonuna olanak saglayan ise mevcut bulusta SEKANS KIMLIK NO: 7 oalrak belirtilen sekanstlEive SEKANS KIMLIK NO: 4 sekansII ekspresyonuna olanak saglayan ise mevcut bulusta SEKANS KIMLIK NO: 8 olarak belirtilen sekanstlü Bulusun bir amaclîbyrlîla, SEKANS KIMLIK NO: 5, SEKANS KIMLIK NO: 6, SEKANS KIMLIK NO: 28, VE SEKANS KIMLIK NO: 30 sekanslarIEilçeren grup içinden seçilmis olan ve bulusa göre ilgili bir RNA sekansII ekspresyonuna olanak saglamasülle karakterize edilen sentetik veya izole bir DNA sekansüle ilgilidir.
Tüm snoRNA'lar gibi, bulusa göre DNA'lar da kimyasal olarak modifiye edilebilmektedir (yukarlöhki olasEkimyasal modifikasyonlara bakim Bulus aynthamanda mevcut metinde belirtilen bulusa göre ilgili bir nükleik asit sekansIIZI içermesi ile karakterize edilen, rekombinant ekspresyon kaseti ile de ilgilidir. Ekspresyon kaseti terimi, isletimsel bir sekilde baglEbIan, düzenleyici bir bölge ve bulusa göre ilgili bir RNA sekansII ekspresyonuna olanak saglayan bir nükleik asit sekanslîçeren bir nükleik asit yaplîlElü belirtmektedir. “Isletimsel sekilde baglm ifadesi, (ilgili RNA sekansII ekspresyonundan sorumlu olan) nükleik asit sekansIIIîl ekspresyonu ve/veya ilgili RNA sekansII birlesmesi transkripsiyonel bir promotörün kontrolü altlEL'Ia gerçeklesecek sekilde elemanlari birlestirildigi anlam. gelmektedir. Tipik olarak promotör sekansüekspresyon kontrolü ile uyumlu olarak nükleik asit sekansIdan uzakta, bu sekanlel yukar-a bulunmaktadB Ara sekanslar, ilgili RNA sekansII birlesmesi ve/veya ekspresyonunu engellemedikleri sürece düzenleyici elemanlar ve kodlaylEEl sekans arasIa bulunabilmektedir.
Bulusun baska bir amaclÇlbir konak organizmada veya bir konak hücrede bulusa göre ilgili RNA sekansEI ekspresyonuna olanak saglayan, daha önce belirtildigi üzere bir kaset veya bir nükleik asit içeren vektörü (ekspresyon vektörü) ile ilgilidir. Vektör dairesel veya dairesel olmayan, tek veya çift sarmalIDJir RNA veya bir DNA olabilmektedir. Burada tipik olarak bir plazmit, bir virüs, bir viral vektör (örnegin bir adenoviral vektör, bir retroviral vektör, bir adeno-bagIü/iral vektör, bir Ientiviral vektör, bir poksvirüs vektör, bir herpetik vektör, vs. araslBUan seçilebilmektedir), bir kozmit veya yapay bir kromozom söz konusudur. Burada avantajIEblmasEiaç-an, ökaryot bir hücre, tercihen bir hayvan hücresi, tipik olarak bir insan hücresi, tercihen intestinal veya ovaryen kaynaklElbir hücreyi dönüstürebilen bir vektör söz konusudur. Bu tür vektörler teknikte uzman kisiler tarafIan bilinmektedir ve özellikle Bulusa göre ilgili bir RNA sekansII ekspresyonuna olanak saglayan tercih edilen bir vektör, örnegin bir plazmit, bir kozmit, bir viral vektör veya bir virüs arasIan seçilebilmektedir. Özellikle drosophilada kullanüâbilen tercih edilen bir vektör pChs-Gal4 vektörüdür; burada Gal4 transkripsiyon faktörünün yukar-, örnegin MyolA-Gal4, escargot-Gal4, Su(H)-GBE- Gal4, Delta-Gal4 gibi belirli bir doku içinde belirli bir genin ekspresyonunu düzenlemesiyle bilinen özel bir DNA sekansüsokulmaktadE Paralel olarak, ilgili efektörü geni, burada snoRNA'yEliçeren bir ikinci vektör (pUAS-snoARN) tercihen, düzenleyici UAS (Upstream Activating Sequence) sekanslarII asag- yerlestirilmektedir; bu sekanslar P[GAL4] transkripsiyon faktöründen bilinmektedir. Bu iki vektörden her biri bir hayvan transjenez ile dahil edilmektedir. Bu iki hayvan sarmaIlII kesismektedir. Bu sistem su sekilde adlandEllBwaktadlB ikili P[GAL4] ekspresyonu sistemi (Brand and Perrimon, 1993; Elliott and Brand, 2008). DolayElîLla, daha açlEçasEMyolA-GaM, escargot-Gal4, Su(H)-GBE-Gal4, Delta- Gal4 vektörleri bir promotör ve intestinal hücrelerde söz konusu RNA sekansII elGpresyonunu destekleyen düzenleyici elemanlar Içermekteyken, nanos-Gal4, veya MTD- (maternal-Tubulin)-Gal4 vektörleri ise bir promotör ve yumurtalllZlarda söz konusu RNA sekansII ekspresyonunu destekleyen düzenleyici elemanlar içermektedir.
Bulus vektöri ayri& bir replikasyon kaynagübir seçilim geni, bir baglayüîgen ve/veya bir rekombinasyon sekansÇ] vs. içerebilmektedir. Vektörler, örnegin kElflhylEÇl baglaylîlZl klonlaylElJreplikasyon, vs. enzimlerini kullanan, teknikte uzman kisiler tarafIan iyi bilinen, klasik moleküler biyoloji teknikleri ile olusturulabilmektedir. Bulus kapsamlEda özel vektör örnekleri deneysel k-ida verilecektir. Bu vektörler örnegin ikili P[GAL4] ekspresyonu sistemi (yukari bahsedilmistir) (Brand and Perrimon, 1993; Elliott and Brand, 2008) kapsayabilmektedir.
Bulus aynElzamanda bulusa göre bir vektör veya bir yapIZi/ardlüla dönüstürülmüs veya bulusa göre bir RNA sekanslZiçeren bir hücre ile de ilgilidir. Hücre tercihen intestinal veya ovaryen bir hücredir. Daha tercih edilen sekilde, burada bir intestinal kök hücre, bir enteroblast, bir enterosit, bir entero-endokrin hücresi, bir besleyici hücre veya bir ovosit söz konusudur.
Bulus aynüamanda, bulusa göre ilgili RNA sekansII ekspresyonunun, in vitro, ex V/'vo veya in Viva, tipik olarak güçlendirilmesi, onarllîhasü'eya modüle edilmesi için, devamlÜ/eya sülü bir sekilde, bulusa göre bir ürünün, bulusa göre bir hücre veya bir vektörün, bir DNA sekansIlEl, tipik olarak bir RNA sekansII kullan HBiaslilülçermektedir.
Bulusun öte yandan genomu (tipik olarak SEKANS KIMLIK NO: 7 veya SEKANS KIMLIK NO: 8), SEKANS KIMLIK NO: 3 ve SEKANS KIMLIK NO: 4 sekanslarIan birisi veya digerinin ekspresyonunun önlenmesi veya modifiye edilmesi, örnegin arttlBlB1aslZlveya azaltHBiasÇl tercihen ekspresyonun bozulmasu için, teknikte uzman kisiler tarafIan iyi bilinen teknikler yardIilýla genetik olarak modofiye edilmis olan bir transjenik fare ile ilgilidir.
Fare avantajlüilmasüç-an, teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen teknikler yardIilîla, örnegin CRE/LOX sistmeinin kullanlßiaslýla, homolog rekombinasyon (knock-in, knock-out, knock-down) ile genetik olarak modifiye edilmektedir.
Bulus aynüamanda bulusa göre bir RNA sekansübir DNA sekansübir yapübir vektör veya bir hücre içeren bilesimler ile ilgilidir.
Bulusun RNA sekanslarün vitro olarak çok dirençlidir ve çok stabildir. Bununla birlikte, tedavi edilecek bir süjeye uygulanmaslîrllurumunda bulusa göre bilesimler ayrlEla avantajlElbir sekilde diyetetik veya farmasötik planda kabul edilebilir bir destek içerebilmektedir. göre bir hücre veya bir vektör, bir yapÇlbir RNA sekansElçeren bilesimi risksiz bir sekilde yutmasEl ve sindirimesine olanak saglayan ve söz konusu sekansü özellikle besinin sindirilmesinen kaynaklanan, terapötik etkisini üretmeden önce sekansElbozabilecek olan tüm agresyonlara karsElkoruyabilen bir vehikül anlasllEwaktadlEl yollarlîitlan biris dogrultusundai bu tür bir sekanslîlçeren bulusa göre bir hücre veya bir vektör, bir yapÇl bir RNA sekansIEiçeren bir bilesimin risksiz bir sekilde uygulanmalela olanak saglayan bir vehikül anlaslEhaktadIEl AvantajlEbir sekilde, mevcut bilesim vehikülü, bulusa göre ekspresyon vektörünün veya yap-El, ilgili RNA'nI tedavi edilecek olan süjenin hücrelerine, ideal olarak mevcut metinde belirtildigi üzere özel hücrelerine nüfuz etmesini kolaylastlElnaktadlElve/veya etkililigine zarar verebilen olasEbir bozulmadan RNA'nlEI, ekspresyon yaplîlîleya vektörünü korumaktadlEl Vehikülün yanßlß, vehikül içindeki aktif madde oranII seçilmesi genellikle, tedavi edilecek süjenin özelliklerine, uygulama biçimine, aktif maddenin kimyasal özelliklerine ve çözünebilirlige göre belirlenmektedir.
Farmasötik planda kabul edilebilir, kullanllâbilir vehiküller veya destekler arasIan özellikle, bulusun nükleik asitleri ile kompleksler olusturan, kitosan veya atelokolajen gibi dogal veya poli(L-lizin), polietilenimin (PEI) veya dendrimerler gibi sentetik polimerlerden, hedef hücrenin spesifik bir antikoru ile kaplanmlg immünolipozomlar gibi hücreler türünün hedeflenmesine olanak saglayan bir ligandla kaplamlgi lipozomlar (Zheng ve ark., 2009), lipozomlar, katyonik lipozomlar, galaktosile Iipozomdan, polimerlerden olusan bir nanaopartikül içine yerlestirilmis olan lipozomlar (Carmona ve ark., 2009) veya polikatyonlar ve polianyonlardan olusan çok katmanlEiiilmIerden bahsedilebilmektedir.
Laktoz, sodyum sitrat, kalsiyum karbonat, dikalsiyum fosfat, ve magnezyum stearat, sodyum asitler ve amidon gibi bozunma maddeleri gibi yardIicünaddeIer tabletlerin hazEIianmasEiÇIn kullanllâbilmektedir. Bir pastilin hazlEIlanmasEilçin yüksek moleküler aglEHlKlEglikol polietilenler ve laktozun kullanüîhasüavantajllß Sulu asilüllâr, asüîilîlîldestekleyen maddeler veya emülsifite edici maddeler içermektedir. Sükroz, etanol, polietilen glikol, propilen glikol, gliserol ve kloroform gibi seyrelticiler veya bunlari karlglEilarüla kullanilâbilmektedir.
AynEl zamanda alüminyum tuzlarEl (örnegin alüminyum hidroksit, alüminyum fosfat, alüminyum sülfat), yüzey aktif maddeler (lisilesitin, poliolplüronikler, polianyonlar, peptitler ve emülsiyonlar gibi) adjuvantlar, tamamlanmlg veya tamamlanmamlgl Freund adjuvantü MPL-TDM (Monofosforil A Iipit, dikorinomI-coiat trehaloz sentetik) adjuvantl: tirozin, alüminyum, StimulonTM gibi sponinler ve sitokinler, bilesimin etkisinin gelistirilmesi için eklenebilmektedir.
Bulusun RNA sekanslarüürünün kontrollü veya uzatüIhlS bir saIInElsaglayabilen, enjekte edilebilir mikroküreler, biyoaslEbbiIir partiküller, polimerik bilesikler (poliaktik asit veya poliglikolik asit gibi) gibi maddeler, bilyeler veya lipozomlar ile hazlEllanabilmektedir.
Diyetetik planda kabul edilebilir destek örnekleri örnegin sekerler, saponinler, vs. içermektedir.
Bilesim ayrlEb, tercihen bir laminopati tedavisinde, özellikle Hutchinson-Gilford sendromu veya HGPS (ayriEla progeria adßltia bilinmektedir ve insani erken ve hlîllîyaslanmasldan olusmaktadlE) tedavisinde, obezite, diyabet, kanser, dejeneratif bir hastalilZl özellikle nörodejeneratif bir hastaligiI (örnegin bir Iökodistrofi veya SPG35 olarak belirlenen kallt3al Spastik parapleji), stres ve infertilite tedavisinde kullanllâbilen bir maddeden seçilmis bir ya da daha fazla diger aktif bilesenler içerebilmektedir.
Obezitenin tedavisinde kullanüân bir aktif bilesen örnegin leptin veya bunun türevlerinden birisi olabilmektedir.
Diyabetin tedavisinde kullanüân bir aktif bilesen örnegin insülin veya bunun türevlerinden birisi olabilmektedir.
Kanser tedavisinde kullanllân bir aktif bilesen örnegin; DNA replikasyonu inhibitörü (özellikle enterkalant veya alkilant bilesiklerin DNA baglama maddeleri gibi), anti-metabolit bir madde (DNA polimeraz inhibitörü veya bir topoizomeraz I veya II inhibitörü gibi), bir antimitojenik madde (örnegin bir alkaloid) ve bir kanser tümörünün büyümesini engelleyen bir madde (tirosinaz inhibitörü veya bir monoklonal antikor gibi) arasian seçilmis olan konvansiyonel bir sitotoksik kemoterapi maddesi olabilmektedir.
Bulusa göre RNA (mevcut metinde açiKlanan bulusa göre bir baska ürün yardllýla eksprime edilen veya bulunan) ve diger aktif bilesik veya bilesikler, gerektigi takdirde aynlIbiIesim içinde es zamanllîrblarak veya slûllîblarak uygulanabilmektedir.
Bulusun ürünleri (nükleik asit sekanslarüvektörler, hücreler, bilesimler) teknikte uzman kisiler taraflEUan bilinen klasik protokollere göre intravenöz, oral, dilaltüparenteral, rektal, topik, transdermik, derialtümukoz, intramusküler, intrapulmoner, intranazal, vajinal, vs. yoluyla bir uygulama için uyarlanabilmektedir.
Tercih edilen sekilde ürün, oral yolla bir uygulama için uygundur ve katEl/eya slîEformda bulunmaktadlEI Ürün örnegin bir besin, bir tabler, bir kapsül, bir ilaç, bir draje, bir pastil, granüller veya içilebilir bir çözelti seklinde bulunabilmektedir. Parenteral yolla gerçeklestirilen bir uygulama durumunda tercihen slîElbir çözelti, bir emülsiyon veya bir süspansiyon seklinde bulunmaktadlü Intravenöz, intradermik veya deriaItElyoIIa gerçeklestirilen bir uygulamada durumunda, tipik olarak enjekte edilebilir bir çözelti seklinde bulunmaktadE Ilgili nükleotidik sekans aynEl zamanda, süjenin derisi içinden veya kaslarIa, elektroporasyon ile uygulanabilmektedir.
Dozaj (veya terapötik planda etkili miktar, arzu edilen etkilere (baska bir ifadeyle yasam süresinin uzatilmasüyaslanmanl zararlüetkilere karsÇlstrese karsÜ/e/veya infertiliteye karsEl savasma) ulasllBiasEiçin teknikte uzman kisiler tarafldan kolayca belirlenebilmektedir. Ürün spesifik dozu, arzu edilen uygulama ve ilgili süjeye uygun olmak zorundadß Bu süjenin aglEllEglÇlsagllEl durumu, cinsiyeti, besin düzeni, uygulama yolu, absorpsiyon ve ekskresyon oranIZlve bir ya da daha fazla diger aktif moleküllerin olasEbirlesimi gibi birçok faktöre baglIlÜ Bir insan süjeye, tek bir dozda ya da daha fazla dozda uygulanan ürüün toplan günlük dozu örnegin, kilo baslEla lpg ve 20 mg civarIEkla, tercihen 100u ve 5 mg araleUa bulunabilmektedir. Uygulamalar haftaIiKl veya günlük olarak, hatta günde birçok kez tekrarlanarak gerçeklestirilebilmektedir. RNA'lar veya bunlarEiçeren bulusa göre bilesimler, 0,05 ila 20 mg RNA, tercihen 0,1 ila 5 mg arasIa bulunan üniterdoz seklinde uygulanabilmektedir. Özel bir yapllândlElna biçiminde, bulusun ilgili bir RNA sekansÇl örnegin vaksinal olarak terapötik bir bilesim içinde kullanllfhaktadlEI Baska bir özel yapilândüina biçimindei bulusun ilgili bir RNA sekansükozmetik bir bilesim içinde kullanliîhaktadlü Bulus ürünlerinin uyqulanmasEl Mevcut bulus özellikle, ilaç olarak bir kullan! için bulusa göre ilgili bir DNA sekansEveya bir RNA sekansIEiçeren veya bunlardan olusan, mevcut metinde açllZIandlgiEüzere bir ürün ile Bulus aynüamanda i) bir yaslanma mekanizmasi bagllîblan fonksiyonel veya belirgin bir patoloji, bir anomali, bir bozukluk veya bir rahatslîllgll önlenmesi ya da tedavi edilmesi için, ii) bir süjenin yasam süresinin uzatllBiasEiçin veya iii) bir süjenin stres direncinin arttlEIBiasEl için bir kullanIia yönelik, bulusa göre bir ürün veya bir bilesim ile ilgilidir. Özel bir yönde mevcut bulus, i) bir yaslanma mekanizmasi baglEblan fonksiyonel veya belirgin bir patoloji, bir anomali, bir bozukluk veya bir rahatsl2[gll önlenmesi ya da tedavi edilmesi için, ii) bir süjenin yasam süresinin uzatllhiaslîçin veya iii) bir süjenin stres direncinin arttlîllîhasüiçin tasarlanmlglfarmasötik bir bilesimin preparasyonuna yönelik, terapötik planda etkili bir miktarda bu tür bir ürünün kullanilBiasEile ilgilidir.
Baska bir özel yönde mevcut bulus, komzetik bir bilesimin preparasyonuna yönelik bu tür bir ürünün kullanilhiaslýla ilgilidir.
Bu dokümanda kullanIlgiEüzere “tedavi"terimi, semptomlar. iyilesmesi veya kaybolmaslZl yaslanma sürecinin veya hastaligin ilerlemesinde bir rahatlama, hastallgll gelisiminde bir durma veya hastaliglI geçmesine atlflia bulunmaktadß Bulus sahipleri, yaslanma süreci veya süreçlerinde bir gecikme ve bu süreç(ler) ile iliskili patolojiler ve zararliltkilere karsl3avasmada, bulusa göre RNA sekanslarII sasllltkisini ortaya koymustur.
Bulus sahipleri, SEKANS KIMLIK NO: 1 snoRNA:T28$-1153 sekansII drosophila'da aslHJ ekspresyonunun, söz konusu drosophila'nI yasam süresini sasiEiIlîEbir sekilde iki kat. çiEardiglIüanlEhmlStlE Bulus sahipleri özellikle, snoRNA:\P28S-1153 için mutant sineklerin, 40 günlük vahsi türde sineklerinkinden daha fazla nöro-dejeneratif lezyonlar sergiledigini kanltlhmlgtlîl (Sekil 12). Ayrlîia snoRNA:W28S-1153'ü aslîiEleksprese eden sinekler daha az beyin Iezyonuna sahiptir, hatta hiç beyin Iezyonuna sahip degildir; bu da nörodejeneratif patolojiler kars-a bulusa göre snoRNA'nI koruyucu özelligini ortaya koymaktadiB Öte yandan bulus sahipleri, snoRNA:\P285-1153'ü aslEEhksprese eden 40 günlük sineklerin, vahsi sineklerden daha iyi duyu-motor performanslarEl sergiledigini ve böylece yaslanma mekanizmalarlElailiskin zararlßtkilere karsERorunduklarIEkanlflhmEtlîl(SekiI 13).
Bulus sahipleri, bulusa göre ilgili bir RNA sekansII aslElZdakspresonunun, bir süjenin yasam süresinin uzatlißîasl, yaslanma mekanizmalar.. geciktirilmesine ve bu mekanizmalara iliskin zararlEletkilere karslîlsavasllfhas- olanak sagladigiIElgöstermistir. Bulus sahipleri özellikle bu aslEElekspresyonun nörokoruyucu oldugunu ve özellikle de dejeneratif bir hastaligllEl, özellikle nörodejeneratif bir hastal[g]liîi, tipik olarak örnegin fa2h geninin bir ya da daha fazla mutasyonu tarafIan tetiklenen nöorudejeneratif hastalliZlar gibi beyinde bir demiyelinizasyonu tetikleyen demir birikmesine iliskin nörodejeneratif hastalllZlarI önlenmesi veya tedavi edilmesine olanak saglad[glIlIkan[HhmlStlE Bulus özellikle Iökodistropiler (tipik olarak fa2h geninin mutasyonlar- baglEblanlar) veya kaliBal spastik paraplejinin (tipik olarak SPG35 kalit3al spastik paraplejinin) tedavi edilmesine olanak saglamaktadE Bulus öte yandan diyabet, obezite, kanserin önlenmesi veya tedavi edilmesi ya da fertilite veya kElfliliZl problemine karsüsavasllBialeb olanak saglamaktadß (Sekil 14) ve ayriEia tedavi edilen süjenin lokomotor aktivitelerinin muhafaza edilmesini desteklemektedir. bir canlünlasllBiaktadlB Tercihen süje yetiskin bir süjedir. Süje bir drosophila gibi bir böcek veya bir hayvan, örnegin bir memeli (tercihen bir primat veya bir insan) ya da bir kemirgen (tercihen bir fare veya bir sigian) olabilmektedir.
Tercih edilen sekilde süje i) ilgili RNA sekanslüekprese etmemektedir veya söz konusu RNA sekansII anormal bir versiyonunu eksprese etmektedir, ii) saptanabilir bir hücresel proliferasyon veya Delta/Notch bozulmasIan sorumlu olan açin:) termik bir sok, oksidatif bir stres (örnegin Parakuata maruz kalma) veya bir stres (intestin seviyesinde) gibi stres kosullar_ maruz kalan bir süjedir (özellikle cinsel olgunluga erismis bir süjedir, tercihen yaslü bir süjedir) ve/veya iii) tipik olarak dejeneratif bir hastallEl özellikle bir nörodejeneratif hastaI[El progeria gibi bir Iaminopati, obezite, diyabet, kanser veya bir fertilite sorunu (özellikle infertilite veya kEiîliiKD olmak üzere yasllüga baglßlan veya yaslEElgiEi destekledigi bir hastallEtan muzdarip olan bir süjedir. Özel bir yapllândlülna biçiminde, bulustan faydalanmaya elverisli olan süjenin genomu i)mevcut metinde açlKland[giELizere ilgili bir RNA sekansIEEksprese etmemektedir, ii) söz konusu ilgili RNA sekansII anormal bir versionunu eksprese etmektedir veya iii) söz konusu ilgili RNA sekansII anormal bir ekspresyonu (baska bir ifadeyle fonksiyonel olmayan bir ekspresyonu) veya eksprese edilmemesinden sorumlu olan bir mutasyon içeren bir DNA sekansEIgermektedir.
DNA sekansII normal (vahsi) versiyonu örnegin SEKANS KIMLIK NO: 5, SEKANS KIMLIK NO: 26, SEKANS KIMLIK NO: 28, VE SEKANS KIMLIK NO: 30 arasIdan seçilebilmektedir.
DNA sekansII normal versionunu etkileyemeye elverisli olan, baska bir ifadeyle bulusa göre ilgili bir RNA sekansII ekspresyonunu engellemeye elverisli olan bir mutasyon tipik olarak bir ya da daha fazla nükleotidin çiKlarllüiaslZIeklenmesi ve/veya ikame edilmesi arasIan seçilmektedir. yoklugunda yasamasElkosuluyla biyolojik tür olarak programlanmEolan yasam süresine atfflia bulunmaktadlü “Maksimal uzun ömür" veya “maksimal yasam süresi" belirli bir türün bireylerinin ulasabilecegi maksimal yasam süresine karsiIJEI gelmektedir. Uygulamada, bir popülasyonun üyelerinden birisi tarafIan ulasllân maksimal yas ile bir süjenin maksimal uzun ömrü tahmin edilmektedir. “Ortalama ömür" veya “ortalama yasam süresi" hayatta kalan belirli bir popülasyonun %50'sinin ulastlgllîyastE bilinen bir yöntem, maksimal ömrün veya ortalama ömrün referans aliEmas- Eger bir tedavi, bir grup kontrol süjesine göre süje grubunun maksimal veya ortalama ömrünü önemli oranda arttlîbr ise yasam süresinin uzadigiüieya yaslanmanlgeciktigi varsayilBiaktadEI Drosophila cinsel olgunluga ortalama bir günlükken erismektedir. Ortalama yasam süresi ise yaklasllZl olarak 30 gündür. Maksimal yasam süresi, Drosophila'nItürü veya soyuna ve yasam ya da büyüme kosullar. göre yaklasllZl olarak 60 ila 80 gün arasIda bulunmaktadlEl Fare cinsel olgunluga ortalama olarak, dogumdan 42 gün sonra erismektedir. Ortalama yasam süresi ise 832 gündür. Insan cinsel olgunluga 9 ila 14 yas arasIa ulasmaktadlEl Ortalama ömür erkekler için 73 ylIZIve kadIarda ise 79 yila Bugüne kadar bilinen maksimal yasam süresi 122 yiEB ay ve 14 gündür. fonksiyonlarII azalmaleb kadar, kademeli ve spontan degisimler sürecidir. Yaslanma, pozitif gelisim ve olgunluk bilesenini ve negatif azalma bilesenini içermektedir.
Bulusun ilgili RNA sekanslarü bir süjenin maksimal veya ortalama ömrünü (veya yasam süresini) arttlEnaktadlE Tercih edilen sekilde bu sekanslar, örnegin cinsiyet ve/veya yasla (baska bir ifadeyle minimum bir yas veya maksimum bir yas veya bir yas arallglEIile) belirlenen, bir süjenin veya yetiskin süjelerden olusan bir alt popülasyonun yasam süresini uzatmaktad Eve yaslanmasligeciktirmektedir.
Mevcut bulus yardIilýla, tipik olarak Drosophila'nI yasam süresinin, yaslanma kosullarEl iyilestirilerek, yaklaslKl olarak %50, hatta %100 oranIia uzatllü1asDöngörülebilmektedir ancak bu fare ve özellikle insan [kapsayan memelilerde de geçerlidir.
Mevcut bulusun RNA sekanslarElyardIilýla aynElzamanda “yaslanmanI zararlEletkilerine” karsüisavasmak mümkündür. Mevcut bulus kapsamIa bu ekspresyon, yaslanmanI negatif bilesenini, baska bir ifadeyle süjenin düsüse geçmesini belirtmektedir. Yasla gelen, fizyolojik kapasitelerin asamaIIZIolarak düsüsü, bir organdan digerine ve bir süjeden digerine degismektedir. Bir süjenin fizyolojik düsüsü, çevredeki bir uyaran ve hassasllgll artmasEl/e hastallElar ve bozukluklara karsüsavunmasEllgb karsHJKI gelen bir kapasite azalmasIEl tetiklemektedir. YaslanmanI zararllltkileri, belirli bir süjenin zayühtüfhas- etkide bulunan ve ölümüne zemin hazlIllamaya uygun olan arzu edilmeyen degisikliklerin birikmesini kapsamaktadlü Bu degisiklikler gelisime, dogal yaslanma sürecine, olaslîgenetik anomalilere, çevreye, süjeyi etkileyen veya etkilemis olan hastallElara katki bulunabilmektedir. Öte yandan, mevcut bulus yardnlýla, dejeneratif hastalllZIarlEl, özellikle de nörodejeneratif hastallElarIa, tipik olarak merkezi ve/veya çevresel sinir sitemini etkileyen dejeneratif hastalllZlarI önlenmesi veya tedavi edilmesi mümkündür.
Tercih edilen bir yapllândlîiina biçiminde bulus, bu asmkspresyonun nörokoruyucu oldugunu ve özellikle fa2h geninin bir ya da daha fazla mutasyonu tarafIan tetiklenen nöorudejeneratif hastallkîlar gibi beyinde bir demiyelinizasyonu tetikleyen demir birikmesine iliskin nörodejeneratif hastalllZlarI önlenmesi veya tedavi edilmesine olanak sagladiglIEl kanlfliamlîstü Bulus böylece lökodistropiler (tipik olarak fa2h geninin mutasyonlar. bagIEl olanlar) veya kallEal spastik paraplejinin (tipik olarak SPG35 kallt3al spastik paraplejinin) tedavi edilmesine olanak saglamaktadlEl Diger yapllândlElna biçimlerinde bulus, miyopati, Hunter hastallglÇl konjenital diskeratoz, Prader-Willi sendromu, Alzheimer hastallglü Parkinson hastal[g]l,__lHuntington hastallgüplak skleroz, amyotropfik lateral sklrezo (SLA) arasIan seçilen bir patolojinin önlenmesi veya tedavisi edilmesine olanak saglamaktadEl Baska bir yapllândlüna biçiminde mevcut bulus, Hutchinson-Gilford sendromu (veya progeria), Mandibloakral displazi (MAD), Emery-Dreifuss kas distrofisi, Werner atipik sendormu, restriktif dermatofati, Ietal fetal akinezi ve LIRLLC (Generalized Iipoatrophy, insulin-resistant diabetes, Ieukomelanodermic papules, liver steatosis, and hypertrophic car- diomyopathy) gibi laminopatinin, tercihen Hutchinson-Gilford sendromunun önlenmesi veya tedavi edilmesine olanak saglamaktadlEl Baska bir yapllândüna biçiminde mevcut bulus diyabet veya obezitenin önlenmesi veya tedavi edilmesine olanka saglamaktadE Aynlîzamanda neoplazik süreç veya kansesin önlenmesi veya tedavi edilmesine de katki bulunmak mümkündür. Kanser tipik olarak karsinom, sarkom, lenfoma, melanom, pediatrik bir tümör, lösemi arasiEtlan seçilen bir kanserdir. Burada örnegin meme kanseri, yumurtaIlE kanseri, endometriyum, prostat, özefagus, kolon, rektum, böbrek, akciger, tiroid kanseri, osteosarkom, melanom, lösemi, nöroblastom, vs. söz konusu olabilmektedir. Özel bir yaplIândlElna biçiminde mevcut bulus, özellikle kolon kanseri ve mide kanseri gibi serbest radikaller taraflEtlan tetiklenen bir kansere karsßavasmak için faydalIE Öte yandan bulusa göre bir ürün yardilýla klîlEllllZl veya infertilite problemlerine karsü savasmak da mümkündür. “Infertilite” veya “klîlHllîl' ile üreme zorlugu, hatta imkanslîllglIZI anlasllîhaktadlîl Bu kullanIi kapsamlEtla süje tipik olarak cinsel olgunluguna erismis ve örnegin prematüre gibi üreme zorluklarlsîla karsEkarslýla olan bir kadIlEl Tipik olarak süje klîlü az dogurgan veya dogurganllKta erken azalma veya prematüreye sahiptir. Bulusa göre ilgili RNA sekanslarü tedavi edilen süjenin infertilitesinin tedavi edilmesine veya dogurganllglII onarllhnasÇl arttlîlîhaslZI güçlendirilmesi veya uyarllüias. olanak saglamaktadlB Mevcut bulus aynüamanda, mevcut metinde açllZlandlglEiIizere, bir yaslanma mekanizmasi bagllîtblan ya da bir strese baglEMan fonksiyonel veya belirgin bir bozukluk, zararlübir etki, bir hasar, bir anomali veya bir patolojinin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
Bir test bilesiginin önleyici veva terapötik etkisinin degerlendirilmesine olanak saglayan yontemler Bulus sahipleri aynElzamanda, bir stresin veya yaslanmanI zaralüetkilerine karsÇl aynEl zamanda bu tür bir strese iliskin patolojilere karslZlveya yaslanma mekanizmalela karsIZI savasmak amacMa veya infertileteye karslleavasmak amaclîla bir bilesigin terapötik veya kozmetik etkisinin degerlendirilmesine olanak saglayan bir yöntemi açlElamaktadlEl verilen savasta potansiyel olarak yer alan her türlü bilesik anlasllIhaktadlEl Burada örnegin dogal veya kimyasal bir molekül, bir metal, bir irradyan madde, vs. söz konusu olabilmektedir.
Bir bilesik, olaslZlterapötik etkisi Için, baska bir ifadeyle örnegin açHZlandlglElüzere bir laminopati, bir dejeneratif hastallEl veya bir kanserin, bir stres veya yaslanmanI zararllZI etkileri veya patolojilerin önlenmesi, tedavi edilmesi veya tedavi edilmesinin desteklenmesine yönelik kapasiteleri için, diyabet veya obezitenin önlenmesi, tedavi edilmesi veya tedavisinin desteklenmesi için veya infertilitenin önlenmesi, tedavi edilmesi veya tedavisinin desteklenmesi için test edilebilmektedir.
Bir bilesik ayrlEla olasElkozmetik etkisi, baska bir ifadeyle süjenin fiziksel görünüsünün iyilestirilmesi ve yaslanma mekanizmasEla baglßlarak süjenin belirgin bir rahatslîllg'llEla karsEI savasUBiasI yönelik kapasitesi için test edilebilmektedir. Bilesik örnegin örnegin, epidermisin, vücut klIJJZl/e/veya kIaI damar sisteminin, tlEliaklarlEl, dudaklarlEl, dlg genital organlarlEl, dislerin veya mukozanI kozmetik tedavisinde etkili olabilmektedir.
AçllZlanan yöntem asag-ki asamalarübermektedir: i) bulusa göre RNA sekanslßksprese etmeyen veya söz konusu RNA sekansII anormal bir verisyonunu eksprese eden bir hücre, bir hücre popülasyonu veya bir dokunun veya bulusa göre bir transjenik farenin maruziyeti, ii) test bilesiginin söz konusu fenotip üzerinde veya söz konusu hücreler veya söz konusu doku veya söz konusu transjenik fare üzerinde etkilerinin eger mevcut ise degerlerindirilmesi ve iii) söz konusu test bilesiginin kozmetik veya terapötik etkisinin belirlenmesi, söz konusu RNA sekanlellEl ekspresyonu ve/veya aktivite onarIiÇlsöz konusu test bilesiginin etkisi ile dogru orantUJBilü Söz konusu test bilesiginin kozmetik veya terapötik etkisi, bir kontrol degeri referans alIrak degerlendirilebilmektedir veya belirlenebilmektedir. Bu kontrol degeri, söz konusu RNA sekansIEbksprese etmeyen veya bunun anormal bir versiyonunu eksprese eden bir hücre, bir hücre popülasyonu veya bir dokuda ya da bulusa göre bir transjenik farede söz konusu RNA sekansII ekspresyonu ve/veya aktivitesi seviyesinden baslayarak hesaplanabilmektedir.
Eger test bilesigine tabi tutulmus hücrede, hücre popülasyonunda, dokuda veya transjenik farede mevcut söz konusu RNA sekansII ekspresyonu ve/veya aktivitesi, bulusun transjenik faresinde veya söz konusu RNA sekansII anormal versiyonunu eksprese etmeyen veya eden hücrede, hücre popülasyonunda veya dokuda RNA sekansII ekspresyon ve/veya aktivitesinden daha büyüktür, dolaylîlîla test bilesigi bir kozmetik veya terapötik etkiye sahiptir.
AçllZlanan bir ikinci yöntem asaglâbki asamalarübermektedir: i) bulusa göre RNA sekansIElçeren bulusa göre bir hücrenin, bulusa göre bir hücreyi içeren bir hücre popülasyonu ya da bir dokunun maruziyeti, ii) test bilesiginin söz konusu hücrenin fenotipi, söz konusu hücre popülasyonu veya söz konusu doku üzerindeki etkilerinin degerlendirilmesi ve iii) söz konusu test bilesiginin kozmetik veya terapötik etkisinin belirlenmesi, söz konusu RNA sekansII ekspresyonu ve/veya aktivite artEÇlsöz konusu test bilesiginin etkisi ile dogru orantÜJBilEI Bu yönteme göre, bir kontrol degeri, söz konusu RNA sekanslßksprese eden bir hücre veya bir hücre popülasyonunda söz konusu RNA sekansII ekspresyon ve/veya aktivitesi seviyesinde hesaplanabilmektedir.
Bu durumda, eger test bilesigine tabi tutulmus hücrede veya hücre popülasyonunda mevcut söz konusu RNA sekansII ekspresyonu ve/veya aktivitesi, söz konusu RNA sekansIEl eksprese eden hücrede veya hücre popülasyonunda RNA sekanlellEl ekspresyon ve/veya aktivitesinden daha büyüktür, dolaylîlsîla test bilesigi bir kozmetik veya terapötik etkiye sahiptir.
RNA sekanlelI ekspresyonu ve/veya aktivitesi seviyesindeki ölçüm, teknikte uzman kisiler tarafIdan bilinen teknikler yardIilýla, tipik olarak kantitatif veya immünohistokimyasal PCR (ilgili snoRNA taraflEUan düzenlenen genler/proteinlere karsüyönlendirilen antikorlarI renklendirilmesi) ile gerçeklestirilebilmektedir.
Terapötik etkinin degerlendirilmesi ayrlîla örnegin hücrelerin yasam süresinin belirlenmesi, hücresel bölünmelerin say-I ölçülmesi, vs. ile gerçeklestirilebilmektedir.
Tercih edilen sekilde, test bilesigine maruz blElikUân hücre veya hücre popülasyonu intestinal veya ovaryen kaynaklIlEl Tercih edilen hücreler mevcut metinde bahsedilen hücreler araletlan, tipik olarak enteroblastlar, enterositler, enteroendokrin hücreleri, intestinal kök hücreler, besleyici hücreler, tipik olarak ovaryen oda besleyici hücreler, ovosit, ovoblast, vs. araleUan seçilebilmektedir.
Mevcut bulusun diger yönleri ve avantajlarüklîlflbylîlîcblmayan ve örnek amaçllîilarak verilen asagßhki örnekler ve sekillerin okunmaslîla ortaya çlElacaktE SEKILLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1: P[Gal4]4C Iokusunun genomik bölgesinin haritasÇlgençlik snoRNA'sII konumu ve F4'ün ç[lZbr[I31asl:l Sekil 2: A)H/ACA kutusunun («H/ACA box») motifi, B) Psödo-üridinilasyon semasü(AIlEtü Sekil 3: Disi farelerin ömrü. Gün say_ göre canlElsineklerin say-eki kümülatif düsüs (0/0 olarak). Cent-CS: vahsi türde kontrol sinekleri. F4= mutant F4, G5= snoRNA genomik transgenini taslýlan sinekler G5, F4;G5= vahsi fenotipinin (parantez içinde: sineklerin saylîlgîl onarllüiaslîliçin, F4 mutantElgenetik bazda snoRNA G5'in genomik transgenini taslýan sinekler.
Sekil 4: 3 günlük sinekler üzerinde uygulanan strese (termik sok, açI[El parakuat) karslîl direnç testi.
A) Termik Sok: F4 mutantlarEkontroIlerden (yalnlîta disiler) daha dirençlidir. snoRNA (G5)'i aslEllJeksprese eden sinekler, transgen (F4;G5) ile donatUBnlgl F4 mutant sinekleri, kontrol sineklerinden (erkekler ve disiler) daha dirençlidir.
B) Açlüît F4 mutantlarEkontrollerden (erkekler ve disiler) daha dirençlidir. snoRNA (G5)'i aslEllIksprese eden sinekler daha dirençlidir (sadece disiler). Transfen (F4;G5) ile donatHBilgl olan F4 mutant disi sinekler, kontrol sinieklerine benzerdir, dolaylglîila transgen ile vahsi fenotipin restorasyonu mevcuttur.
C) Parakuat: F4 mutantlariîlkontrollerden (erkekler ve disiler) daha dirençlidir. snoRNA (G5)'i asiEiZleksprese eden sinekler daha dirençlidir (sadece disiler). Transfen (F4;G5) ile donatilîhg olan F4 mutant sinekler, kontrol sinieklerine benzerdir, dolaylîlîla transgen ile vahsi fenotipin restorasyonu mevcuttur.
Sekil 5: Intestin ve yumurtaIHZiar Üzerinde in si'tu hibridasyon.
A) vahsi türde (Canton-S), kontrol sinekleri üzerinde, snoRNA intestin epitelyal hücrelerde eksprese edilmistir. Mavi: dapi ile çekirdekte DNA'nI boyanmasEIKlEinEEl snoRNA'nI boyanmasEiSnoRNA'nI boyanmasII (kiElniZIihoktalar) çekirdeginkinden (mavi) ayrEi/e tamamlaylEEbldugu görülmektedir, bu da çekirdegin nükleol içinde bulundugunu göstermektedir.
B) mutanf F4'te (snoRNA'nI çiiZiarlEhasm maviye boyama (dapi) görülmektedir ancak hiç kiîiiniZEiboyama görülmemektedir; çünkü snoRNA çiiZbrllîhlgtlEl ve dolayiglîla eksprese edilmemektedir.
C) vahsi türde (Canton-S), kontrol sinekleri. snoRNA, yumurtallK] besleyici hücrelerde eksprese edilmistir.
D) F4 mutant sinekleri. snoRNA yumurtalitha eksprese edilmemistir.
Sekil 6: Bir GFP (UAS-GFP) baglayIElîgeninin ekspresyonunu yöneten, ayrEGal4 dört numune soyu araciIJEIýb, intestin epitelyal hücrelerinde snoRNA'nI hedeflenen ekspresyonu. In situ hibridasyon ile snoRNA'nI ekspresyonu (kiîiinlZEl/e/veya turuncu) (sol sütun: a1,b1,c1,d1,e1), dapi ile çekirdegin boyanmasEi(mavi) (ikinci sütun: a2,b2,c2,d2,e2), immüno-isaretleme ile GFP'nin ekspresyonunun (FITC ile ortaya çiElarilân anti-GFP antikoru (yesil) (üçüncü sütun: a3,b3,c3,d3,e3) saptanmasiîi Sag sütun (a4,b4,c4,d4,e4) kolokalizasyonu gösteren önceki 3 görüntünün üst üste yerlestirilmesi. snoRNA'nI sadece enterositlerde eksprese edildigini gösteren, sadece (A) (MyolA- Gal4)'de çift isaretleme oldugu görülebilmektedir. A) MyolA-Gal4'ün (MyolA-Gal4; UAS- mCD8-GFP) kontrolü aItIa, snoRNA'nI enterositlerde hedeflenen ekspresyonu. B) F4 mutant genetik arka planda (MyolA-Gai4, F4 / F4; UAS-snoRNA-SM/+) MyolA-Gal4 tarafIan enterositlerde hedeflenen ekspresyonu. C) Intestinal kök hücreleri (ISC'Ieri) isaretleyen esg-Gal4 (esg-Gal4, UAS-GFP) kontrolü altiEUa intestinde hedeflenen ekspresyon. D) Enteroblastlarljisaretleyen, Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-Gal4;UAS-mCDB-GFP) kontrolü altIda intestinde hedeflenen ekspresyon. E) Intestinal kök hücreleri (ISC'leri) isaretleyen Delta-Gal4 (Dl-Gal4,UAS-GFP) kontrolü altHa intestinde hedeflenen ekspresyon.
Sekil 7: snoRNA'nI diger hücre türlerinde ektopik bir sekilde eksprese edilebildigini gösteren, snoRNAnI ekspresyonunu yöneten (UAS-8M), diger üç ayrlZGaI4 kontrol hattEl aracüîigilýla, diger intestin epitelyum hücresi türlerinde snoRNA'nI hedeflenen ekspresyonu.
A)esg-Gal4 (esg-Gal4, F4/F4;UAS-8M/+) kontrolü aItIda hedeflenen ekspresyon.
B)Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-Gal4, F4/F4;UAS-8M/+) kontrolü aItIa hedeflenen ekspresyon.
C)Delta-Gal4 (Delta-GaI4,F4/F4;UAS-8M/+) kontrolü aItIa hedeflenen ekspresyon.
Sekil 8: 3 günlük sineklerin baglEaklarIa snoRNA'nI hedeflenen ekspresyonunu (F4 mutantI genetik arka planlEtla snoRNA'nI yeniden eksprese edilmesi) takiben çesitli streslere karsljlirenç.
A)AçllKt MyolA-Gal4 kontrolü aItIda snoRNA'nlEl (UAS-8M) hedeflenen ekspresyonu.
Iki kontrol hattiEla göre snoRNA'yIZ(My0, F4/F4; 8M /+) eksprese eden sineklerde direncin belirgin bir artlSElardE B)AçllKt esg-Gal4 kontrolü altIa snoRNA'nI (UAS-BM) hedeflenen ekspresyonu. Iki kontrol hatt- göre snoRNA'yEtesg,F4/F4; 8M) eksprese eden sineklerde direncin belirgin bir artlglîlardß C)Açlll.
Iki kontrol hatti göre snoRNA'yü(Su(H),F4/F4 ; 8M) eksprese eden sineklerde direncin belirgin bir artlglSlardE D)36°C'lik termik sok: Su(H)-Gal4 kontrolü altlEtla snoRNA'nI (UAS-8M) hedeflenen ekspresyonu. Iki kontrol hatti göre snoRNA'yEKSu(H),F4/F4;8M) eksprese eden sineklerde direncin belirgin bir artlgüardlîl Sekil 9: A) Genomu bilinen on iki Drosophila türünde homolojiler; B) Drosophila'nI12 türünün konsensüs yaplîlZl Sekil 10: Kromozom 11 üzerinde insan homologu.
Sekil 11: Mus muscu/us(fare-1 ve fare 2)'de 2 homolog gen.
Sekil 12: Beyin histolojisi: 40 günlük sineklerdeki beyinde görülebilen nörodejenerasyon. Kontrol sinekleri (Canton-S yabani tür) (al), nörodejenerasyon lezyona sahiptir. Mutant genetik arka planda snoRNA'ylîksprese sinekler (kurtarllüilgl F4; GS) (b1) snoRNA'yDIGS) (b2) aslEllksprese eden sinekler gibi CS ve F4'ten daha az lezyona sahiptir. Enterositlerde (Myo, F4/F4; UAS-snoRNA) (CZ) özellikle snoRNA'yIZI yeniden eksprese eden F4 mutant sinekleri ayrlEla eksprese etmeyenlerden daha az lezyona sahiptir (Myo, F4/F4) (cl). (d)'de, bu çesitli genotipler için, genç sineklerdeki (4 günlük) ve yaslElsineklerdeki (40 günlük) IezyonlarI ölçümü. Tüm bu sonuçlar, snoRNA'nI ekspresyonunun, yaslEIsineklerdeki nörodejeneratif Iezyonlara karsEl korudugunu göstermektedir (0, +, ++, +++ = saylgl alan ve alanlar. göre lezyonlarI siddeti derecesi).
Sekil 13: Video izleme ile ölçülen bir duyu-motor parametresi (lokomotor aktivite), burada 7 saatlik kaylEl süsßda kat edilen mesafe ile gösterilmektedir. 40 günlük sinekler genç 4 günlük sinekler ile karsilâstlîllüilgtlîl A) Disilerin kat ettigi mesafe. B) Erkeklerin kat ettigi mesafe.
Sekil 14: Sineklerin dogurganllglüA) disi/ gün ve B) 17 günde disi bas. blîehkllân yumurta sayEm Toplamda F4 mutantlarühafif bir gecikmeyle kontrollerden (CS) daha az yumurta bßkmßtß F4 mutantIdaki (F4;G4 - ayrlîla F4; 4M olarak da adlandlîlIllJ transgenin (snoRNA) ekspresyonu dogurganllgllîlazaltmaktadE Transgenin (G4 - ayrlEla 4M olarak da adlandlEIJB aslBElekspresyonu dogurganllglübßküân yumurta sayEIarttIElnaktadIE Sekil 15: Intestinal epitelyumunun semasEaAllEtÜ/apllân: Jiang and Edgar, Exp. Cell.
A) Yetiskin Drosophila'da intestinal epitelyum rejenerasyon modeli.
B) Drosophila'da (embriyo, larva, pupa, yetiskin) ve memelilerde entero endokrin hücrelerde Notch fonksiyonunun modeli. DI = Delta, N = Notch, NO = Notch sinyalinin yoklugu. Bu sema açRa Drosophila'nI intestinal epitelyumu ve insanlEki arasIaki mükemmel benzerligi göstermektedir.
Sekil 16: Drosophila'da intestinal homeostazü/e rejenerasyonu (midgut) düzenleyen retro-kontrol mekanizmasEtAIIEtEl/apllân: Jiang and Edgar, Exp. Cell. Res., 2011).
(Sekil 15 ile aynElklgaltma).
Sekil 17: Gençlik snoRNA'süCG9339 geninin (skywalker) alternatif birlesiminde yer almaktadlü KarsllâstlîrlnalERT-PCR'Ier, F4 mutantIa, bu genlerden bazilârII Vahsi Tür sineklere (Control-CS) göre dogru bir sekilde birlesip birlesmediginin arastlEllüiasEl için bazEpotansiyel hedef genlerde gerçeklestirilmistir. Digerleri araleUa, CG9339 geni (300-bp fragmenti), kullanllân RNA'nI DNA izleri tarafIdan kontamine edilmediginin kanthnmasümacMa bir iç kontrol olarak ve ayrlEla RNA ile bir kontrol (önceden RT olmadan) olarak kullanllBiISIIEI F4 mutantIa (ok) CG9339 geninin (skywalker) küçük 345-bp transkripsiyonunun bulunmad [g]- dikkat edilmelidir.
Sekil 18: Gençlik snoRNA'sÇl diger iki genin RNA seviyesi düzenlemede rol oynamaktadB klarsicht ve CG30502 (fa2h) geni. A) Klarsicht geni için, bir 464-pb fragmentinin amplifikasyonu (bir eksondan olusmaktadlg, F4 mutantlEUa yabani tür kontrol sineklerine (Canton-S) klýlasla daha az ürün transkripsiyonu oldugunu göstermektedir. B) faZh geni için, bir 429-pb fragmentinin amplifikasyonu (bir eksondan olusmaktadlî), F4 mutantlEUa yabani tür kontrol sineklerine (Canton-S) klglasla daha az transkripsiyon oldugunu göstermektedir.
Sekil 19: K/ars/cht'in rolünü açlKlayan model. A) klarsicht, KASH alanlZlaraclIlglüla, nükleer membran. iç yüzeyinde bulunan Iamina ile etkilesime geçmektedir (sunlara göre: Patterson ve ark., 2004). B) Nükleer IaminanI yap-Eye islevini gösteren sematik görünüm. Laminalar, nükleer membranI iç yüzeyinde bulunmaktadlEl ve çekirdegin stabilitesini muhafaza etmektedir, kromatini düzenlemektedir ve nükleer gözenekleri (NPC) baglamaktadlü Laminalar ile etkilesime giren çesitli proteinler de aynüamanda sematik oalrak gösterilmistir (sunlara göre: Coutinho ve ark., Immunity Sekil 20: Gençlik snoRNA'sII memelilerdeki ortolog sekanslarü farelerde ve insanlarda eksprese edilmistir (Farelerin ve insan homologlarII RT-PCR ile saptanmasm Bu snoRNA'IarI ekspresyonu, bunlarI fonksiyonel olma olasiElElarII çok yüksek oldugunu göstermektedir. Insanlarda, 159 bp snoRNA (SEKANS KIMLIK NO: 2) baglîsakta, beyinde ve daha üsük olarak yumurtallElarda ve böbreklerde (daha hassas bir sekilde kümülbir yIE isaretiyle) ekprese edilmistir. Farelerde, 129 hp snoRNA-1 (SEKANS KIMLIK NO: 3) sadece beyinde eksprese edilmistir. Tersine, 122 bp snoRNA-2 (SEKANS KIMLIK NO: 4) baglEakta, beyinde ve yumurtal[lZIarda eksprese edilmistir ancak böbreklerde eksprese edilmemistir.
Sekil 21: Gençlik snoRNA'sEI(mutanf F4) için mutasyona ugrayan sinekler yag hipertrofisi sergilemektedir. 40 günlük yaslElsineklerde, 40 gün boyunca, kendi kontrollerine klýbsla önemli degisiklikler gözlemlenmistir. Bu lezyonlar, apoptozda olan hücreleri isaretleyen aktive edilmis anti-kaspaz-3 antikor isareti ile gösterilmistir. A) Kontrol sinekleri “CS". Beyaz noktalüçizgi ile çevrilmis olan yag gövdesi oldukça homojen ve pürüzsüzdür. B) F4 mutant sinekleri: büyük hücre kümeleri fark edilmektedir (beyaz ok). C) snoRNA transgenini (GS) taslýian sineklerde: agregat içermeyen yag kütlesi, “CS" kontrolünün yag gövdesine benzemektedir. D) F4 mutantI genetik arka planIa (F4; GS) G5 transgenini taslýhn sineklerde, bu sinekler sadece birkaç agregata sahiptir ve bu agregatlar daha küçüktür, bu da transgenin mutasyona baglEiolarak yag vücut lezyonlarIEIklîmen kurtardigilü gösterimektedir. Bu sonuçlar karbonhidrat ve yag metabolizmasiEUa bozulma oldugunu göstermektedir.
DENEYSEL KISIM 1) P[GAL genetik ve moleküler karakterizasyonu.
Bu deney, Drosophila'da Iokomotor davranlsîla ilgili nöral bazlarI arastiEIlBiaslZl/e merkezi kompleksin ve özellikle elipsoid gövdenin yaplgEle islevi arasiühaki iliskinin arastEilIBwasiElI bir parçasi& Bu baglamda, P[GAL4] enhancer-trap çizgilerinin bir kütüphanesinin taranmasÇl elipsoid gövdesinde spesifik olarak eksprese edilen P[GAL4]4C hattII tanIiIanmas- izin vermistir (Sekil 1). Özellikle tetanoz toksininin hedeflenen ekspresyonu olan farklEgenetik yaklasIiIar, bu nöronlarI bloke edilmesinin Iokomotor aktivitede kusurlar yarattlgJIEl göstermistir (Martin ve ark., 2002). Ikinci bir adida, bu nöronlarEldaha ayriEtlüEblarak karakterize etmek ve lokomotor aktiviteye dahil olan sinir agEilçindeki fonksiyonlarlüiaha iyi belirlemek için, P[GAL4]4C hattII yerlestirme Iokusu genetik ve moleküler olarak karakterize edilmistir. Bir PCR-kurtarma islemi gerçeklestirildi ve 2R kromozomu üzerinde P[GAL4]4C'nin P eleman sokulma noktasII gösterilmesine izin verilmistir (Right: baska Daha sonra, bu iki genin ilgili fenotipini ve fonksiyonunun gösterilebilmesi amacisîla, P elemanII yeniden eksizyonu (su sekilde adlandiîilân genetik bir yaklasIi ile: jump-out veya revertant) bu genlerin mutasyonlarEiüretiImistir. Böylece F4 olarak adlandiBlân 632 baz çiftinin (pb) küçük bir çllîlarliiiaslllde edilmistir (Sekil 1). snoRNA:T28S-1153, Huang ve ark. tarafIan gerçeklestirilen, Drosophila'nI genomunda potansiel tüm küçük nükleoler RNA (snoRNA)'larI sistematik taramasEkapsamIa 67331 pozisyonunda (Sekil 1) bu Iokusta önceden tanIilanmlstlEl Bununla birlikte, ilgili makale herhangi bir belirli snoRNA'yEbylEli etmemektedir ve herhangi bir fonksiyonu snoRNA: `&'285-1153 ile iliskilendirmemektedir.
Mevcut bulus baglamlEda, küçük F4 çlEarmasElolmayan bu snoRNA, yaplgial olarak ve fonksiyonel olarak hassas bir sekilde konumlandülßilsrlîlve karakterize edilmistir. Bu snoRNA, böylece içermektedir. 2) F4'ün çtliartlînasII fenotipik karakterizasyonu: yasam süresinin klElalmaslIl P[GAL4]4C hattII isaretlenmis halka nöronlarIiaki tetanoz toksininin hedeflenen ekspresyonu araclügllýla, sineklerin lokomotor aktivitesinin ölçülmesi amacEla yapllân çallsina ile paralel olarak, bulus sahibi, bu sineklerin çok kisa bir ömre sahip oldugunu gözlemlemistir ve P[GAL4]4C/UAS-tetanoz-toksin sineklerinin ve aynüamanda F4 sineklerinin (lokus 4C'de mutasyona ugramis) söz konusu yasam süresinin hassas bir sekilde belirlenmesine karar vermistir. Dolaylglýla F4 sinekleri kisa bir ömre sahiptir ve bu, snoRNA'nI çllîarllîhasII yasam süresini (uzun ömür) (vahsi tür kontrol sineklerine göre yaklaslkîl olarak %30 oranla) etkileyebilecegini düsündürmektedir (Sekil 3). Bulus sahipleri ayrlEia, bu etkinin sineklerin cinsiyetine göre farklEbldugunu, etkinin kad larda erkeklerden çok daha belirgin oldugunu gözlemlemistir. 3) Vahsi fenotipin onarmnaslîl"kurtarma" veya “kurtarE”) amacüla snoRNAnI (gençlik) genomik bölgesini barIdEbn bir transjenik hattI genezi.
F4 mutantII fenotipinin asIIa snoRNA'nlEl çKbrUBiasIann kaynaklandlglll gösterilmesi amaciyla, snoRNA'ylJSekiI 1) ve bunun düzenleyici sekanslarIEilçeren bölgeden (66377'den 68100'e) 1723 bp'nin genomik bir DNA sekansIüiçeren transjenik bir Drosophila hattEI üretilmistir. Daha açlKÇasÇIl723 bp bölgesinin bir genomik DNA fragmenti PCR ile amplifiye edilmistir ve Xba1 restriksiyon alanEhracHJgllîLla pCaSper-4 vektörü içine sokulmustur (bu vektör herhangi bir promotör/düzenleyici sekans içermemektedir). Transjenik sinekler daha sonra standart bir teknige göre üretilmistir ve aynEtransgeni eksprese eden fakat genomun farkllîylerlerine yerlestirilmis sinek soylarßlde edilmistir (bag Iislîleklemeler: G4, GS).
Daha sonra, transgenin fonksiyonel olup olmadlglll ve F4 mutasyonunu kurtarlillîl kurtarüâmayacagII (baska bir ifadeyle vahsi fenotipin onarlllül onarüüiadglm yani F4'ün çüZlarllB1aslîblmadan gözlemlenene esdeger olan bir yasam süresinin onarl[l`p`l onarllBiadlglII dogrulanmasElamaclîLla, bulus sahibi, standart genetik çaprazlama (F4;G4 ve F4;GS) ile genetik mutant F4 kapsamlütla bu transjenik hatlarEkullanmlgtlE Bu nedenle, transgenin, yasam süresindeki azalmadan sorumlu mutasyondan dolaylZl fenotipi kurtabildigi kanltllanabilmektedir (Sekil 3) (örnegin baklßllîl F4'e karsElF4; GS). Üstelik vahsi türde (normal) bir genom içine yerlestirilen bu transgen (bu snoRNA'nI aslîllîlekspresyonuna karslllKl gelmektedir, çünkü iki endojen kopyasD/erine snoRNA'nI 4 kopyasEl/ardlî) (GS) yasam süresini arttlElnaktadlEl(hatta F4;G5 durumunda yasam süresini ikiye katlamaktadlîl veya G5 için yaklasIEl olarak %30 oran-a arttlîilnaktadli) (Sekil 3). Bu deney, bu snoRNA'ylZl eksprese eden (veya ekspresyon seviyeisnde modifiye eden) hayvanI yasam süresinin arttlîllâbilecegini açllZça göstermektedir. KlgbcasÇlbu genin mutasyonuna karsHJKl gelen veya esdeger olan bölgede küçük bir genomik çllZlarma (F4 olarak adlandlEIlân 632 baz çifti) (Sekil 1), yasam süresini klglaltlîlken (bu snoRNA'nI genomik DNA'sEIçeren bir transgen yoluyla) gen terapisi sadece aynülnutasyonu kurtarmakla kalmaz, aynüamanda tedavi edilen kisinin yasam süresini önemli ölçüde uzatmaktadlEl(ikiye katlamaktadlE) (Sekil 3).
Günümüzde genellikle uzun ömre etki eden genlerin genellikle stres direncini arttlElilglütabul edilmektedir. Bulus sahibi, bu snoRNA'nI asmkspresyonunun, açllEl termik sok ve oksidatif stres (parakuatI yol açt[gl[)]gibi stres kosullarültia ilgili süjenin yasam süresini etkili bir sekilde arttlübilecegini dogrulamlgtßve onaylamlgtlEI(Sekil 4).
A) Elma karsü'lirenç testleri (termik sok: heat-shock testi) Erkekler ve disiler 3 gün boyunca besin içeren standart tüplerde bir araya getirilmektedir. 3 günlük olduklarlîida erkekler ve disiler, besin içeren standart bir tüpte 20 sineklik gruplara ayrEbIarak daglEllBiaktadE Sineklerin temrik soka maruz bßkllfhasüçin, sinekleri içeren tüpler 36°C'de bir inkübatöre yerlestirilmektedir. Ölü sineklerin saylgElher 6 saatte bir sayUBiaktadlE Termik sok için (36°C), Sekil 4A'da, F4 mutant sineklerin (sadece disiler) kontrol sineklerinden daha dirençli oldugu görülmektedir. Bununla birlikte, GS sinekleri (erkekler ve disiler), F4 mutantIa (F4;G5 sinekleri) içindeki G5 transgeni ekspresyonunun kontrolsinekleri ve F4 mutant sineklerinden çok daha fazla dirençli olmasIan dolayüF4 mutant ve kontrollerden daha dirençlidir B) açlllil testi tüplerde bir araya getirilmektedir. 3 günlük olduklariTitla erkekler ve disiler, kurumanI önlenmesi amaclýla filtrasyon kagIEl/e 400 uL su içeren bir tüp içine 20 sinekten olusan gruplar halinde ayrßlarak daglîllhaktadß Sinekler 24°C'de nemli bir odada tutulmaktad lElve ölü sineklerin saylîElher 6 saatte bir sayilîriaktadlrîi AçliEl için, Sekil 4B'de, F4 mutant sineklerinin (erkekler ve disiler) kontrol sineklerinden daha dirençli oldugu görülmektedir. Üstelik G5 sinekleri (disiler) hala daha dirençli iken, F4 mutantIaki (F4; GS) transgenin ekspresyonu, normal hayatta kalmaylîadisilerde) onarmaktadlEl C) oksidatif strese karslîlirenç (Parakuat) Parakuat (1,1'-dimetiI-4,4'-bipiridiniyum diklorür) NADH'Elazaltmaktadlîj bu, ROS (reaktif oksijen türleri) üretmek için oksijen ile etkilesime giren parakuat stabil radikallerini üretmektedir. Sonuç olarak, ROS'Iar hücrelerde hasara neden olmaktadE(Rzezniczak ve ark., 2011). Önceki iki testte oldugu gibi, erkekler ve disiler 3 gün boyunca besin içeren standart tüplerde bir araya getirilmektedir. 3 günlük olduklarIda erkekler ve disiler, 6 saat boyunca açlllZl çekmeleri amacüla, standart bir bos tüpte 20 sineklik gruplara ayrD olarak daglfllüiaktadlü Daha sonra sinekler, besin alIiIlîlesteklemek Için % 1 sukroz içinde 20mM seyreltilmis bir filtre kagIEive 450ul Parakuat içeren bir tüpe aktarllBiaktadlE Sinekler 24°C'de nemli bir odada tutulmaktadlElve ölü sineklerin saylgEHier 6 saatte bir sayllüîaktadlîl Oksidatif stres Için, Sekil 4C'de, F4 mutant sineklerin (sadece disiler, erkekler için büyük bir egilim vardiE) kontrol sineklerinden daha dirençli oldugu görülmektedir. Benzer sekilde, disi G5 sinekleri kontrol sineklerine göre daha dirençlidir ve F4 mutantlar. benzerken, F4 mutantIaki (F4; GS) transgenin ekspresyonu, sineklerin hayatta kalmalelEl(kontrol sineklerine esdeger) iyilestirmektedir.
KlîacasÇIF4 mutant sinekleri kontrol sineklerine göre daha dirençli Iken, aslElßkspresyon (GS) bu direnci daha da artlElnaktadlEl(disiIerde erkeklerden daha belirgin ve tutarlElbir etki vardlg.
DahasÇI her iki testte de (açIIKl ve oksidatif stres), F4 mutantIa (F4; GS) transgenin ekspresyonu özellikle disilerde, sineklerin hayatta kalmasIEiiyilestirmektedir. Bu nedenle, F4 mutasyonunun yasam süresini klîialttfgilîyasam süresinin aksine, F4 mutasyonu, üç günlük genç sineklerde gerçeklestirilen üç stres testinde direnci arttlîilnlgtlîlve bu etki snoRNA'nI genomik transgeni ile iyilestirilebilmektedir (iki testte). Sonuç olarak, “genç” snoRNA'nI ekspresyonunun (bastlEna, azaltma veya artis.) modülasyonu, test edilen süjelerin yasam süresini degistirmektedir. ) snoRNA'nI uzay-zaman ekspresyon profilinin belirlenmesi (in situ hibridasyon) Ilgili snoRNA hangi hücreler ve/veya dokularda ekprese edildigi ve etki ettiginin belirlenmesi amaclýla, bu snoRNA'nI uzay-zaman ekspresyon profili, anti-sense snoRNA sondasü kullanarak, yetiskin sinekte, in situ hibridizasyon (HIS) ile bulus baglamIa belirlenmistir.
Isaretlemenin güçlendirilmesi için tiramid kullanHBilStlE Hem erkek hem de disilerde, 5A) ve F4 mutantlEUa yoktur (Sekil SB). Daha spesifik olarak, baglîsagl çesitli hücre tipleri için spesifik olan P[Gal4] hatlarIlEl, çift isaretleme ile bir araya getirilmesi, gençlik snoRNA'sIlEl, baglEsak epitelyumunu olusturan ana ve çogunluk hücreleri olan enterositlerin nükleolunda spesifik olarak eksprese edildigini göstermistir (Sekil 6A) ancak diger hücre tiplerinde eksprese edilmemistir (Sekil 68, C, D, E). Üstelik kadIarda, yumurtalllZlarda ve daha özel olarak da besleyici hücrelerde (nurse cells) (Sekil 5C ve 5D) eksprese edilmistir. 6) Intestin epitelyumunun diger hücre türlerinde snoRNA'nI hedeflenen ekspresyonu.
Diger üç farkIElGal4 hattükullanilârak intestin epitelyumundan baska hücre türlerinde snoRNA'nI (UAS-8M) hedeflenen ekspresyonu (ektopik) gerçeklestirilmistir: instestinal kök hücreleri (ISC'Ier) hedefleyen esg-Gal4 (esg-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+) ve Delta-Gal4 (Delta- Gal4,F4/F4;UAS-8M/+) ve enteroblastlarüedefleyen Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-Gal4, F4/F4 ; UAS-8M/+) (Sekil 7). Bu sonuçlar sunlarügöstermektedir: 1) snoRNA'nI diger hücre tiplerinde ektopik olarak eksprese edilebilecegi, 2) bu ektopik ekspresyonun belirli strese karslîdirenci arttliîllgiE(Sekil 8). Klîlacaslîbu sonuçlar snoRNA'nI bagEak epitelyumundan baska hücre türlerinde de eksprese edildiginde koruma saglayabildigini göstermektedir. 7) Strese karsEldirencin kurtarmnasla neden olan snoRNA'nI hedeflenen (selektif) ekspresyonu.
Bulus sahibi, iki bagIiIislZyaklasla, intestin hücrelerinde hedeflenen bir ekspresyonun, stres direnci fenotipinin onarHB1asEilçin yeterli oldugunu göstermistir. Genomik transjenik hatlardan (uzun ömürlülügü arttßnlar: G5, ayrlEla snoRNA'nI baglßak hücrelerinde ekspresyon edildigi ve uzun ömürlülügün düzenlenmesi Için bir baska bagslîl ekleme (G4) uyglanan in situ hibridizasyon teknigi ile snoRNA'nI intestinal hücrelerde eksprese edildigi ve uzun ömrün düzenlenmesi için intestinal hücrelerde snoRNA'nI ekspresyonunun yeterli oldugu kanEIhnabiImektedir.
Bu birinci sonucun dogrulanmasüimaclEa snoRNA sadece, P[Gal4] çift ekspresyon sistemini kullanarak intestinal hücrelerde hedeflenmektedir. Ilgili snoRNA'nI (sadece 148 pb) Gal4 düzenleyici elemanlar. (Upstream Activating Sequence: UAS) kontrolü aItIa yerlestirildigi plazmidik bir vektör (p[UAS-snoARN]) yapllândlîlllîhlgtlîl Daha sonra transjenik sinek hatlarü (UAS-snoRNA: 4M, SM ve 8M) üretilmistir. Hedeflenen ekspresyon için özellikle intestinal hücrelerde eksprese edilmesiyle bilinen, bir transgen (pChs-Gal4) (plazmidik vektör hatlarü MyolA-Gal4, esg-Gal4 (escargot-Gal4), Su(H)GBE-Gal4, ve DI-Gal4 (Delta-Gal4)) bariün transjenik farelerin “pilot” olarak adlandlElllân hatlarEkuIIanühilStBUiang and Edgar, 2011; Takashima ve ark., 2011). Daha sonra, bu çesitli transgenler, F4 mutantügenetik arka plan. yerlestirilmistir ve in situ hibridizasyon ile, snoRNA'nlEI, hedeflenmis ekspresyonundan (esg-Gal4,F4/F4;UAS-snoARN-8M) (MyolA-Gal4,F4/F4;UAS-snoARN-8M) (Su(H)-GBE- Gal4,F4/F4 ;UAS-snoARN-8M) (F4/F4; Delta-Gal4,/UAS-snoARN-8M) sonra çesitli intestinal hücre türlerinde (Sekiller 6 ve 7) iyi bir sekilde eksprese edildigi gösterilmistir. Sonuçlar, bu hedeflenmis ekspresyonun (F4 mutantIa) gerilim direnci fenotipini (açllEJ ve termik sok) büyük ölçüde onard [glllgöstermektedir (Sekil 8).
Bu deneyler, bu snoRNA'IarI intestinal hücrelerde ve daha özel olarak enterositlerde manipüle edilmesinin stres direncini yeniden saglamak için gerekli ve yeterli oldugunu açllZça göstermektedir. Bu deneyler, Drosophila'da gerçeklestirilmis olsa dahi bagli-sagi epitelyal hücrelerinde yeniden ekspresyonun (ekspresyon veya kurtarmanIonarHEIlveya snoRNA'nI aslElDekspresyonunun, memelilerde ve özellikle insanlarda yasam süresinde bir artlSa yol açabilecegini düsündürmektedir. 8) Fare ve insan. da içinde bulundugu memelilerde ve diger drosophila türlerinde gençlik sekansII homologlarII tan milanmaslîl Sekans homolojisi arastlElnalarlÇlgenomu erisilebilir olan diger 11 Drosophila türünde bu snoRNA'IarI mevcut oldugunu göstermistir (Sekil 9A) (12 Drosophila türünün konsensüs yap_ bakIlîl Sekil 98). Üstelik homoloji ile ve RNA yapEEl aracülgllîla arastlElna (“INFERNAL" yaz[[[lîliIl:l homologun tannlanmas olanak saglamaktadIE (Sekil 10). Farelerde iki homolog Drosophila'da oldugu gibi, bu genin ve/veya sentetik bir analogun (oral uygulama ile ya da enjeksiyon ile) insanda yasam süresini uzatabilmesi oldukça mümkündür. Bu tür bir ekspresyon aynElzamanda çesitli dejeneratif hastalllglarI zararIEletkilere karsElkoruma saglamaktadm 9) Nöro-dejenerasyon ve nöro-korumada snoRNA'nI rolü F4 sinekleri azalmlî bir yasam süresine sahiptir, snoRNA (G5)'i asiElEéksprese eden sinekler daha uzun süre yasamaktadlü yaslßinekler (40 günlük), nöro-dejenerasyon lezyonlarlEl olaslîl varlgII (beyinde az ya da çok uzunlukta ve az ya da çok sayElb bosluklar. varllg'lIlEl) dogrulanmasßmaclýla incelenmistir. Genel olarak, kontrol sineklerinde (Canton-S), sineklerin yaklasllîl olarak %60'Elezy0nlara sahiptir (ancak CS sineklerinin %50'sinin, 40 günlükken zaten öldügünün altEÇizilmelidir) (Sekil12) [daha açlEçasElyarüantitatif bir analiz için Sekil 12d'ye bakIIZ). F4 mutantlarlEUa sineklerin tümü (%100) lezyonlara sahiptir ve bu lezyonlar genellikle kontrol sineklerinkinden daha siddetlidir (bosluklarlEl boyu ve saylED] F4;G5 sinekleri açllZJ bir sekilde daha az bosluga sahiptir (yaklaslEl olarak sineklerin sadece %10'u), bu bosluklar ayrlEia daha küçüktür. Son olarak GS sineklerinde, CS kontrol sinekleri ile aynEl sinek yüzdesi (%40) lezyonlara sahiptir ancak bu lezyonlar net bir sekilde daha siddetlidir (Sekil 12d). Klglacaslîlgenomik transgen (F4;G5), nöro-dejenerasyon fenotipini (klginen) kurtarmaktayken, snoRNA (G5)'in aslElJekspresyonu ise nöro-dejenerasyona karsEkoruma saglamaktadß ) Duyu-motor parametrelerinin korunmasIda snoRNA'nI rolü.
Benzer bir sekilde, eger nöro koruma snoRNA taraflîidan saglanlîbr ise duyu-motor parametreleri gibi bazEfizyolojik parametreler üzerindeki etkilerin arastlîllhiasllmaclýla, 40 günlük sineklerin lokomotör aktivitesi (video izleme ile) ölçülmüstür (Martin, 2004) daha sonra 4 günlük genç sineklerinki ile karsüâstlîlliilgtlîlßekil 13). Ilk olarak 4 günlük sinekler ve 40 günlük sinekler arasIa büyük bir fark gözlemlenmistir; 40 günlük sinekler, 4 günlük sineklerin kat ettigi yoldan yaklasllZJ olarak üç kat daha az bir mesafe kat etmistir. Bununla birlikte 40 günlük yasllleineklerde, snoRNA (G5)'i aslElüeksprese eden sinekler, kontrol sineklerinden (Canton-S), mutant F4'Ierden ve genetik mutant arkaplanlda (F4;G5) snoRNA'yEI eksprese edenlerden daha çok yürümüstür. Bu etki erkeklerde disilerde oldugundan daha belirgindir. Klghcaslîl40 günlük yasllZbineklerde, snoRNA'yEbslElEbksprese eden sineklerin, kontrol sineklerinden daha iyi duyu-motor performanslarElsergiledikleri görülmektedir. Bu sonuçlar, yaslanma mekanizmalar. iliskin zararlEletkiler kars-a snoRNA'nI koruyucu niteligini göstermektedir. 11) Yumurtalllillarda snoRNA'nI fonksyionunun arastlEBnaslIl dogurganlI (üreme) üzerindeki rolü Disilerde snoRNA, yumurtallklarda ve daha açüîçasüiesleyici hücrelerde eksprese edilmistir (Sekil 5C,D). Bulus sahipleri aynEI zamanda, mutant sineklerinin (F4) dogurganIiKJ modifikasyonlarl (üreyici fenotip) sahip oldugunu göstermistir. F4 sinekleri, kontrol sineklerinden (CS) biraz daha çok yumurta bükmlgtü (Sekil 14). Genetik mutant arka planlEUa (F4;G4) snoRNA'yEltaslýlan sinekler daha az yumurta blEaklElken (dogurganIlKl azallüken), snoRNA (G4)'ü aslEEbksprese eden sinekler ise kontrol sineklerinden daha çok yumurta blükmlStlEl (Sekil 14). Bu sonuçlar, disilerin dogurganllgllîlüzerindeki etkisi ve yumurtalllZlarda snoRNA tarafIan uygulanan etkinin inkar edilemez oldugu göstermektedir. 12) snoRNA ile tedavi (oral veya enjeksiyon yoluyla uygulama). snoRNA oral (per os) yolla ya da enjeksiyon yoluyla uygulanabilmektedir. Örnegin Inhalasyon ve Iokal/deriaItEluygulama gibi diger uygulama yollarElda kullanilân vektör türüne göre kullanüâbilmektedir. Bulus kapsamlda gerçeklestirilen deneyler ile kanlîlbndlglü üzere, snoRNA'nI oral olarka uygulanmasÇlin vitro direnci ve stabilitesi, intestinal duvar hücreleri (enteroblastlar, enterositler, ISC'Ier) üzerinde bölgesel etki etme kapasitesi hesaba katllârak mümkündür. Daha önce de açiElandlgiEüzere ilgili snoRNA'nI uygulanmasü daha iyi bir endokrinyen veya metabolik denge muhafaza edilerek agresyonlara karslZlntestinal duvarI korunmasllmaclýla, aksi takdirde mevcut olmayan bir ekspresyona (veya baska bir ifadeyle mevcut bir mutasyonun kurtarilüialela) olanak saglayabilmektedir veya ihtiyaç oldugunda bir asiîlßkspresyona olanak saglayabilmektedir. 13) Kanser tedavisi.
Drosophila'da oldugu gibi memelilerde, de/ta/notch genlerinin, intestin (bag Bak) progenitör hücrelerinin farklllâsmasIEijüzenlenmektedir, Wnt sinyalizasyonu yolu, ISC'Ierin muhafaza edilmesi ve proliferasyonuna katklZ'lla bulunmaktadß Aynl3ekilde, sitokin sinyalizasyonu yolu (Upd/Jak/Stat) ve EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) yolu, ISC'lerin proliferasyonunu Deneylerimiz, bulusa göre ilgili snoRNA'nI note/7, delta, JNK, EGFR, vs. genleri gibi bazEl genleri düzenleyebildigini kanlfllamlStlEl(Sekil 15), burada düzenlemenin ortadan kaldlBlIhasü intestinal epitelyumun hiper-proliferasyonuna ve dolaylgMa kanserlere yol açabilmektedir (Jiang and Edgar, 2011; Takashima ve ark., 2011). Bulusa göre ilgili snoRNA özellikle, EGFR'nin ekspresyonu düzenleme kapasitesi sayesinde kanseri önleyebilmekte veya tedavi edebilmektedir; Drosophila'da ve memelilerde intestindeki ISC'Ierin proliferasyonunun düzenlenmesinde EFGR'nin sinyalizasyonu yolu nitekim özellikle iyi bir sekilde korunmaktadlEl (Sekil 16) [güncel olarka birçok terapi, kolon kanserinin tedavisi için klinik çallglnalar sßslda kullanliîhaktadlEI özellikle anti-EGFR monoklonal iki antikor (Cetux/mab ve Pan/tumumab) (Amado ve ark., 2008; Di Nicolantonio ve ark., 2008)]. 14) Insan. erken ve hlîlElyaslanmasIdna olusan, progeria adima da bilinen, Hutchinson-Gilford (HGPS) sendorumunda ilgili snoRNA'riI (gençlik) uygulanmasü Gençlik snoRNA'lelEl k/arsi'cht geninin birlesmesini (birlesen RNA miktarID] düzenledigini kanlflladIKl (Sekil 18A). Bu genin çekirdegin iç membranElaltIa bulunan ve progeriada (insanlEUa hlîIü/e erken yaslanmalela yol açan hastalik) yer alan bir protein olan Iamina ile etkilesime girdigi kanltllanmlgtlîl(Patterson ve ark., 2004) (Sekil 188). Progeria, yaklasllîl olarak 8 milyonda 1 kiside görülen nadir bir hastallKtIEl(Scaffidi and Misteli, 2006 ; Broers ve snoRNA'sÇIfenotipi (uzun ömürdeki etkisi) ve k/arsi'cht geninin düznelemesinde aldigllîilol ile, Hutchinson-Gilford sendromu (veya progeria), Mandibloakral displazi (MAD), Emery-Dreifuss kas distrofisi, Werner atipik sendormu, restriktif dermatofati, Ietal fetal akinezi ve LIRLLC (Generalized Iipoatrophy, insulin-resistant diabetes, Ieukomelanodermic papules, liver steatosis, and hypertrophic cardiomyopathy) (Hutchison, 2002 ; Broers ve ark., 2006), gibi olanak saglamaktadlEl ) YaglElasit 2-hidroksilaz (fa2h) geninin birlesmesinin düzenlenmesinde ve sonuç olarak bu gene iliskin çesitli nöro-dejenerasyonlar sekillerinde ilgili (“gençlik") snoRNA'nI uygulanmaslIl Gençlik snoRNA'sII yag asidi 2-hidroksilaz veya "yaglüasit 2-hidroksilaz ”(faZ/7)'I kodlayan Bu gen, yag asitlerinin biyosentez sürecinde ve daha özellikle sfingolipidler ve seramidler gibi kompleks lipidlerin metabolik süreçlerinde yer aImaktadlEl(Carvalh0 ve ark., 2010). Insanda bu faZh geni, beyinde demir birikimine iliskin olanlar gibi çesitli nöro-dejenerasyon sekilleri (demiyelinizasyon), bazüökodistrofiler ve son olarak kallt3al Spastik parapleji (SPG35) ile snoRNA'sÇlfenotipi (mutant F4'te gözlemlenen yag hipertrofisi ve/veya uzun ömürde oynad [glü rol) ve faZh geninin düzenlenmesinde yer almaslîgeregi, yukar- bahsedilen nörodejeneratif hastaIIara karsüreni bir tedavi perspektifi sunmaktadlEl 16) Intestin ve beyin (beyin-intestin ekseni) arasIdaki nöro-endokrinyen ve metabolik iliski.
Daha önce bahsedildigi üzere snoRNA (F4) mutantlarü sefalik kapsülde beyine etrafia, abdomen seviyesinde görülebilen, yag hipertrofisine sahiptir (Sekil 21). Üstelik, trigliseritlerin ölçülmesi, bu hipertrofinin (“obez” olarak adlandlEIIân sineklerin niteliginin) dogrulanmalela olanak saglamlîstlEl Bu fenotip, intestinde snoRNA'nI ekspresyonu, nöro-dejeneratif lezyonlar ve yasam süresinin artlglîhrasia nöroendokrinyen ve/veya metabolik bir iliskiyi ortaya koymaktadlE Daha özel olarak bu metabolik pertürbasyon, Insülin sinyalizasyonu yoluyla bir dahil olmayEbrtaya koymaktadü bu yol, Drosophila'larI uzun ömründe uyguland[gl:üzere Fontana ve ark., 2010). Anti-kaspaz-3 aktive'ye karsElyönlendiriIen immüno-histokimyasal isaretlemeler, yetiskin Drosophila'larda, beyin çevresinde bulunan yagI F4 mutantlarlElzla siddetli bir sekilde pertürbe edildigi (baska bir ifadeyle hipertrofiye edildigini); aynüamanda kurtarma (ekspresyonun onarILIl (F4;G5) slBileUa snoRNA'nI (transgenler GS) aslEIlIl ekspresyonu taraflîidan korundugununun gösterilmesine olanak saglamEtE (Sekil 21). Bu sonuçlar, snoRNA'nlEl, yag alterasyonlaillîleksprese etmesinden ve dolaylîlýla obeziteden organizmayü korudugunu göstermistir. Üstelik mutant F4 ve insülin reseptörü (InR) mutasyonlar. iliskin genetik etkilesim deneyleri (çift mutantlar), snoRNA'nI mutasyonunun, insülin reseptörü mutasyonunun fenotipini en az lEUan klîlnen kurtarabildigini göstermistir (bakIlZI sekil 21 ve onun açllZIamasDZI Bu sonuçlar, insülin sinyalizasyonu yolu, snoRNA ve uzun Ömür arasIaki baglarI (dogrudan veya dolayIDZl var olugunu göstermistir. Önceki sonuçlar, snoRNA'nI mutasyonu ve/veya deregülasyonununi lipitlerin ve karbonun (glüsitlerin) hidratlarII metabolizmasIEEbozdugunu göstermistir.
Gençlik snoRNA'süiiöylece obezite gibi diyabette yeni bir tedavi perspektifi sunmaktadlEl 17) Insanda ve farelerde ilgili (“gençlik") snoRNA'sII ekspresyonu.
Bir RT-PCR yaklasnüile, gençlik snoRNA'leb (ilk olarak drosophila'da tanllanmlgtlg, memeli|erde ekprese edilen homolog sekanslarI ve daha özellikle ortolog sekans varllgIEl kanElhdlE(Sekil 20). Insanda intestin, beyinde ve daha düsük olarak yumurtallKlar ve böbreklerde eksprese edilmektedir. Farelerde 129 hp snoRNA'sEaSEKANS KIMLIK NO: 3) sadece beyinde eksprese edilmektedir ve 122 hp snoRNA- 2 (SEKANS KIMLIK NO: 4) intestin, beyinde ve yumurtallElarda eksprese edilmektedir ancak böbreklerde eksprese edilmemektedir. Bu veriler, farelerde oldugu gibi insanda da bu snoRNA'Iar fonksiyonel ekspresyonunu desteklemektedir.
REFERANSLAR - Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson SD, Chang DD (2008). Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol, 26, 1626-1634.
- Bai H, Kang P, Tatar M. (2012). Drosophila insulin-Iike peptide-6 (dilp6) expression from fat body extends lifespan and represses sécrétion of Drosophila insulin-like peptide-Z from the brain. Aging Cell., 11, 978-985.
- Brand AH, Perrimon N (1993) Targeted gene expression as a means of altering cell fates ancl generating dominant phenotypes. Development 118, 401-415 - Broers JL, Ramaekers FC, Bonne G, Yaou RB, Hutchison C] (2006). Nuclear lamins: - Carvalho M, Schwudke D, Sampaio JL, Palm W, Riezman I, Dey G, Gupta GD, Mayor S, Riezman H, Shevchenko A, Kurzchalia TV, Eaton S. (2010) Survival stratégies of a sterol - Cau P, Navarro C, Harhouri K, Roll P, Sigaudy S, Kaspi E, Perrin S, De Sandre-Giovannoli A, Lévy N. (2014). Nuclear matrix, nuclear envelope and prématuré aging syndromes in a - Cohen M, Lee KK, Wilson KL, Gruenbaum Y. (2001). Transcriptional repression, apoptosis, human disease and the functional évolution of the nuclear lamina. Trends Biochem Sci., 26, 41-47.
Coutinho HDl, Falcâo-Silva VS, Gonçalves GF, da Nobrega RB (2009). Molecular ageing in progeroid syndromes: Hutchinson-Gilford progeria syndrome as a model. Immun Ageing, 20, 6:4.
Dick, K. J., Al-Mjeni, R., Baskir, W., Koul, R., Simpson, M. A., Patton, M. A., Raeburn, S., Crosby, A. H. (2008). A novel Iocus for an autosomal recessive hereditary spastic Dick, K. J., Eckhardt, M., Paisan-Ruiz, C., Alshehhi, A. A., Proukakis, C., Sibtain, N. A., Maier, H., Sharifi, R., Patton, M. A., Bashir, W., Koul, R., Raeburn, S., Gieselmann, V., Houlden, H., Crosby, A. H. (2010). Mutation of FA2H underlies a complicated form of Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, Saletti P, De Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, Bardelli A (2008). Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol, 26, 5705-5712.
Elliott DA, Brand AH. (2008) The GAL4 system: a versatile system for the expression of genes. Methods Mol Biol, 420, 79-95.
Fontana L, Partridge L, Longo VL (2010). Extending healthy life span - from yeast to Huang ZP, Zhou H, He HL, Chen CL, Liang D, Qu LH. (2005) Genome-wide analyses of two families of snoRNA genes from Drosophila melanogaster, demonstrating the Hutchison CJ. (2002). Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nat Rev Mol Cell Biol., 3, 848-858.
Jiang H, Edgar BA (2011). Intestinal stem cells in the adult Drosophila midgut. Exp Cell Kruer MC1, Paisan-Ruiz C, Boddaert N, Yoon MY, Hama H, Gregory A, Malandrini A, Woltjer RL, Munnich A, Gobin S, Polster BJ, Palmeri S, Edvardson S, Hardy J, Houlden H, Hayflick SJ. (2010). Defective FA2H Ieads to a novel form of neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA). Ann Neurol., 68, 611-618.
Martin, JR, Faure, P, Ernst, R (2002). The Power Law Distribution for Walking-Time Martin, JR (2004). A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video- tracking paradigm. Behav. Process., 67, 207-219.
Partridge L, Alic N, Bjedov I, Piper MD (2011). Ageing in Drosophila: the role of the insulîn/Igf and TOR signalling network. Exp Gerontol., 46, 376-381.
Patterson K1, Molofsky AB, Robinson C, Acosta S, Cater C, Fischer JA. (2004) The functions of Klarsicht and nuclear Iamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol Biol Cell., 15, 600-610.
Pierson TM1, Simeonov DR, Sincan M, Adams DA, Markello T, Golas G, Fuentes-Fajardo K, Hansen NF, Cherukuri PF, Cruz P, Mullikin JC, Blackstone C, Tifft C, Boerkoel CF, Gahl WA. (2012) Exome sequencing and SNP analysis detect novel compound heterozygosity in yagllîisit hidroksilaz-associated neurodegeneration. EurJ Hum Genet., 20, 476-479.
Rzezniczak TZ, Douglas LA, Watterson JH, Merritt TJ. (2011) Paraquat administration in Drosophila for use in metabolic studies of oxidative stress. Analytical Biochem., 419, 345- Scaffidi P, Misteli T. (2006) Lamin A-dependent nuclear defects in human aging. Science, Schneider SA, Bhatia KP. (2010) Three faces of the same gene: FA2H links neurodegeneration with brain iron accumulation, leukodystrophies, ancl hereditary spastic paraplegias. Ann Neurol., 68, 575-577.
Takashima S, Adams KL, Ortiz PA, Ying CT, Moridzadeh R, Younossi-Hartenstein A, Hartenstein V (2011). Development of the Drosophila entero-endocrine Iineage and its specification by the Notch signaling pathway. Dev Biol, 353, 161-172.
Tatar M, Kopelman A, Epstein D, Tu MP, Yin CM, Garofalo RS (2001). A Mutant Drosophila Insulin Receptor Homolog That Extends Life-Span and Impairs Neuroendocrine Function. Science, 292, 107.
Uytterhoeven V, Kuenen S, Kasprowicz J, Miskiewicz K, Verstreken P (2011). Loss of skywalker reveals synaptic endosomes as sorting stations for synaptic vesicle proteins.
SEKANS LISTESI Ulusal Bilimsel Arastrrma Merkezi <120> SNO ARN Bilesimleri & Kullanrmlarr Bl365PCOO <160> 37 PatentIn versiyon 3.5 <210> 1 <211> 148 <212> RNA <213> Drosophila melanogaster <400> l aaagcguuagauauuaaacugugguugaauucacaaaauaggccacaguuaugcaauaaa cgcuagaaaaaaaacgguaguauuuaauaacguguugacuaacaucugcggauaagaagc <210> 2 <211> 159 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 guaaguguagccuagaaauuggggcuggauuugaaaauuagccccaauucugcaauuuuc accgcaauaaaagcuucuccaguuauacauggugauuggucuugaugggcuauuguggac agaggagggugcuagguugggguggacggggccacagcu <210> 3 <21l> 129 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 3 aaagggguugaagaaugguauggauucagaaugaacuaucagagaaacuccagagccagc aggaaacauuauagagccuuugcuacaauguccuguuucuuucuuggcuuuuaguucugu <210> 4 <211> l22 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 gaaagcauuuaauauuuaccaauaguuuauuccgagcuaggguaaagcagucagugcuag aaaaaugagaaaacacaauacauaagaccucucaaggggagaugcuguuacuguauauac <210> 5 <211> 147 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 5 aaagcgttagatattaaactgtggttgaattcacaaaataggccacagttatgcaataaa cgctagaaaaaaacggtagtatttaataacgtgttgactaacatctgcggataagaagct <210> 6 <211> 159 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gtaagtgtagcctagaaattggggctggatttgaaaattagccccaattctgcaattttc accgcaataaaagcttctccagttatacatggtgattggtcttgatgggctattgtggac agaggagggtgctaggttggggtggacggggccacagct <210> 7 <211> 129 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 aaaggggttgaagaatggtatggattcagaatgaactatcagagaaactccagagccagc aggaaacattatagagcctttgctacaatgtCCtgtttctttcttggcttttagttctgt <210> 8 <2ll> 122 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gaaagcatttaatatttaccaatagtttattccgagctagggtaaagcagtcagtgctag aaaaatgagaaaacacaatacataagacctctcaaggggagatgctgttactgtatatac <210> 9 <211> 149 <212> RNA <213> Drosophila simulans <400> 9 aaagcguuagguauaaaccugugguugaauucacaaaauaggccacaguuaugcaauaaa cgcuagaaaaaaaacgguaguauuuaauaacguguugacuaacaucugcggauaaaacag <210> 10 <211> 149 <212> DNA <213> Drosophila simulans <400> 10 aaagcgttaggtataaacctgtggttgaattcacaaaataggccacagttatgcaataaa cgctagaaaaaaaacggtagtatttaataacgtgttgactaacatctgcggataaaacag <210> 11 <211> 149 <212> RNA <213> Drosophila sechellia <400> 11 aaagcguuagguauuaaccugugguuuaauucacaaaauaggccacaguuaugcaauaaa cgcuagaaaaaaaacgguaguauuuaauaacguguugacuaacaucugcggauaaaauag <210> 12 <211> 149 <212> DNA <213> Drosophila sechellia <400> 12 aaagcgttaggtattaacctgtggtttaattcacaaaataggccacagttatgcaataaa cgctagaaaaaaaacggtagtatttaataacgtgttgactaacatctgcggataaaatag <210> 13 <211> 147 <212> RNA <213> Drosophila yakuba <400> 13 caagcguuguauaauauuaaacuguggaaacuucacaaauaggccacaguuaugcaagaa acgcuagaaaaacuugguaguauuuaauaacgugcugacuaacgucugcggauaaaagcu <210> 14 <211> 147 <212> DNA <213> Drosophila yakuba <400> 14 caagcgttgtataatattaaactgtggaaacttcacaaataggccacagttatgcaagaa acgctagaaaaacttggtagtatttaataacgtgctgactaacgtctgcggataaaagct <210> 15 <211> 148 <212> RNA <213> Drosophila erecta <400> 15 caugcguugaauaauauuaaacuguggacgaauucccaaauaagccacaguuaugcaaga aacgcuagaaaaaauagguaguauuuaauaacgugcugacuaacaucugcggauaagagc <210> 16 <211> 148 <212> DNA <213> Drosophila erecta <400> 16 catgcgttgaataatattaaactgtggacgaattcccaaataagccacagttatgcaaga aacgctagaaaaaataggtagtatttaataacgtgctgactaacatctgcggataagagc <210> 17 <211> 148 <212> RNA <213> Drosophila ananassae <400> 17 uuaggcguucaaaacauuaaacguuggcugauuuaugauuaggcuaguguuaugcacgca acgcuagagaaaauugguaguauuuaauaaugcguugguggcaaaucuaucgauuuugau <210> 18 <211> 148 <212> DNA <213> Drosophila ananassae <400> 18 ttaggcgttcaaaacattaaacgttggctgatttatgattaggctagtgttatgcacgca acgctagagaaaattggtagtatttaataatgcgttggtggcaaatctatcgattttgat <210> 19 <211> 145 <212> RNA <400> 19 cauggcgcucaaacauuaaucgguggccugauccacacgucggccacauuuaugcacgca gcgccagauaauaguaggcagcauuuaauaauguauugguuccaaaugacucagacuuuu <210> 20 <211> 145 <212> DNA <400> 20 catggcgctcaaacattaatcggtggcctgatccacacgtcggccacatttatgcacgca gcgccagataatagtaggcagcatttaataatgtattggttccaaatgactcagactttt <210> 21 <211> 145 <212> RNA <213> Drosophila persimilis <400> 21 cauggcgcucaaacauuaaucgguggccugauccacacgucggccacauuuaugcacgca gcgccagauaauaguaggcagcauuuaauaauguauugguuccaaaugacucagacuuuu <210> 22 <211> 145 <212> DNA <213> Drosophila persimilis <400> 22 catggcgctcaaacattaatcggtggcctgatccacacgtcggccacatttatgcacgca gcgccagataatagtaggcagcatttaataatgtattggttccaaatgactcagactttt <210> 23 <211> 149 <212> RNA <213> Drosophila willistoni <400> 23 <210> 24 <211> 149 <212> DNA <213> Drosophila willistoni <400> 24 <210> 25 <211> 141 <212> RNA <213> Drosophila mojavensis <400> 25 <210> 26 <211> 141 <212> DNA <213> Drosophila mojavensis <400> 26 <210> 27 <211> 142 <212> RNA <213> Drosophila virilis <400> 27 uuaugcguucaacaguaaauugucgccgauagauuacuaggcgacaguuaugcaaggcaa cgcuagaauaagcagacgacauuuaauaaugcauuggccgacaaacuccacggccuuugc <210> 28 <211> 142 <212> DNA <213> Drosophila virilis <400> 28 ttatgcgttcaacagtaaattgtcgccgatagattactaggcgacagttatgcaaggcaa cgctagaataagcagacgacatttaataatgcattggccgacaaactccacggcctttgc <210> 29 <211> 141 <212> RNA <213> Drosophila grimshawi <400> 29 uugugcguucgacaguaaauuuucgaugacuguagauaggcgaaaauuaugcaaggcaac gcuagaccaauuagaugacgacauuuaauaaugcauuggccgauuaacucagaucuugca <210> 30 <211> 141 <212> DNA <213> Drosophila grimshawi <400> 30 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> Ir56d geninde hedeflenen sekans <400> 31 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> buttonhead geninde hedeflenen sekans <400> 32 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> klarsicht geninde hedeflenen sekans <400> 33 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> CG3262 geninde hedeflenen sekans <400> 34 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <400> 35 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> CG9339 geninde hedeflenen sekans <400> 36 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> yapay sekans <220> <223> CG40006 geninde hedeflenen sekans <400> 37

Claims (1)

  1. ISTEMLER Ilaç olarak kullanIi için, SEKANS KIMLIK NO: 1 sekansübunun bir ortolog sekansül'eya fonksiyonel planda bir analog sekansüçeren izole veya sentetik RNA sekansEl Söz konusu ortolog sekanlel insan kaynaleolmasElve SEKANS KIMLIK NO: 2 sekansIan olusmasEl/eya fare kaynaklEblmasEl/e SEKANS KIMLIK NO: 3 ve SEKANS KIMLIK NO: 4 arasIdan seçilen bir sekanstan olusmasüle karakterize edilen, Istem 1'e göre kullanl için RNA sekansEl Söz konusu sekansI küçük bir nükleoler RNA (snoRNA) olmasEile karakterize edilen, Istem 1 veya 2'ye göre kullanl için RNA sekansü Fonksiyonel planda söz konusu analog sekanlel; Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG3262, me/anogaster geninin birlesmesine olanak saglamasEile karakterize edilen, Istem 1'e Bir süjenin yasam süresinin uzatilmasi: bir strese karsEldirencin arttlîllBwasEl/eya bir süjede yaslanmanIzararlüztkilerine karsünücadele edilmesinde kullanIi için Istemler 1 ila 4'ten herhangi birisine göre RNA sekansü Bir süjede dejeneratif bir hastal[g]lEI, özellikle nörodejeneratif bir hastal[g]EI, bir laminopatinin, diyabetin, obezitenin veya bir kanserin önlenmesi veya tedavisinde kullanIi için Istemler 1 ila 5'ten birisine göre RNA sekanslîl Kanserin serbest radikaller tarafIan tetiklenen bir kanser oldugu, Istem 6'ya göre kullanIi için RNA sekansEl Bir süjenin dogurganlEglII uyarllü'iaslîlveya infertilitenin tedavisinde kullanllIhasEliçin Istemler 1 ila 3'ten birisine göre RNA sekanslZI Süjenin bir hayvan veya bir böcek, tipik olarak bir memeli, tercihen bir insan, daha tercihen Istemler 1 ila 3'ten birisine göre RNA sekansIlZlekprese etmeyen ya da söz konusu RNA sekansEI anormal bir versiyonunu eksprese eden bir süje, açllKl termik bir sok veya oksidatif bir stres gibi stres kosullar. tabi tutulan bir süje ve/veya dejeneratif bir hastaIIKi bir Iaminopati, diyabet, obezite, bir kanser veya bir dogurganlllZl probleminden muzdarip bir süje olmasEile karakterize edilen, Istemler 5 ila 8'den birisine göre kullanIi için RNA sekanslîl Istemler 1 ila 3'ten birisine göre RNA sekanslüaksprese etmeyen veya söz konusu RNA sekansII anormal bir versiyonunu eksprese eden süjenin genomunun, bir mutasyon içeren bir DNA sekansIEbarIlîiinaslîl söz konusu sekanlel, SEKANS KIMLIK NO: 5, SEKANS KIMLIK NO: 6, SEKANS KIMLIK NO: 7 ve SEKANS KIMLIK NO: 8 arasIan seçilmis vahsi durumda olmasü/e söz konusu mutasyonun tercihen bir ya da daha fazla baz çiftinin çlKlarllB'iasü ikame edilmesi veya eklenmesi araleUan seçilmesi ile karakterize edilen, Istem 9'a göre kullanIi için RNA sekanslîl Istemler 1 ila 10'dan birisine göre kullanIi için bir RNA sekansIEkodlayan DNA sekansEI Intestinal veya ovaryen hücreler içinde tercihen söz konusu RNA sekansII ekspresyonunu destekleyen düzenleyici elemanlar ve/veya bir promotör içeren, örnegin bir plazmit, bir kozmit, bir viral vektör veya bir faj arasßtlan seçilen, Istemler 1 ila 4'ten birisine göre kullanIi için bir RNA sekansII ekspresyonuna olanak saglayan vektör. Istem 12'ye göre kullan! için bir vektör yardIilsîla dönüstürülen veya Istemler 1 ila 4'ten birisine göre kullanIi için bir RNA sekansEiberen hücre. Farmasötik veya diyetetik planda kabul edilebilir bir destek ve Istem 13'e göre bir hücre veya Istem 12'ye göre bir vektör, Istemler 1 ila 4'ten birisine göre bir RNA sekansEiÇeren bilesim. Söz konusu RNA sekansII in vitro veya ex w'i/o ekspresyonunun onarlmiasElveya modüle edilmesi için, devamlüleya sEaIEliiir sekilde, Istemler 1 ila 10'dan birisine göre bir RNA sekansÇlIstem 12'ye göre bir vektör, Istem 13'e göre bir hücre veya Istem 14'e göre bir bilesimin kullanlßiasü SEKANS KIMLIK NO: 3 ve SEKANS KIMLIK NO: 4 sekanslarlEldan birisi ve/veya digerinin, söz konusu sekanslardan birisi ve/veya digerinin ekspresyonunun önlenmesi veya modifiye edilmesi için modifiye edildigi genoma sahip olan transjenik fare.
TR2018/07186T 2013-11-07 2014-11-07 Sno rna, bileşimleri ve kullanımları. TR201807186T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1360889A FR3012739A1 (fr) 2013-11-07 2013-11-07 Sno arn, compositions et utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807186T4 true TR201807186T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=51871027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07186T TR201807186T4 (tr) 2013-11-07 2014-11-07 Sno rna, bileşimleri ve kullanımları.

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9951332B2 (tr)
EP (1) EP3066199B1 (tr)
JP (2) JP6879738B2 (tr)
KR (1) KR102269438B1 (tr)
CN (1) CN106232816B (tr)
AU (1) AU2014345581B2 (tr)
BR (1) BR112016010342B1 (tr)
CA (1) CA2929732A1 (tr)
DK (1) DK3066199T3 (tr)
EA (1) EA037923B1 (tr)
ES (1) ES2671326T3 (tr)
FR (1) FR3012739A1 (tr)
HU (1) HUE037525T2 (tr)
NO (1) NO3066199T3 (tr)
PT (1) PT3066199T (tr)
TR (1) TR201807186T4 (tr)
WO (1) WO2015067727A1 (tr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3012739A1 (fr) * 2013-11-07 2015-05-08 Centre Nat Rech Scient Sno arn, compositions et utilisations
CN112020557A (zh) * 2018-03-27 2020-12-01 罗切斯特大学 用于假尿苷化的核酸分子
CN111826432A (zh) * 2019-04-18 2020-10-27 南京大学 细胞去服务化状态的分子标记物检测及其调控方法
WO2021175966A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Ninovax Products for suppressing or reducing the expression or activity of a snorna and uses thereof in the treatment of cancer
CN116694759B (zh) * 2023-02-17 2023-12-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Scarna12基因调节细胞增殖与存活中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2268749A1 (en) 1996-10-21 1998-04-30 Mcgill University Structural and functional conservation of the c. elegans clock gene clk-1
US6303768B1 (en) 1998-08-07 2001-10-16 California Institute Of Technology Methuselah gene, compositions and methods of use
FR2882062B1 (fr) 2005-02-14 2007-06-15 Commissariat Energie Atomique Vecteurs d'expression stable et de longue duree de sirna et leurs applications
FR3012739A1 (fr) * 2013-11-07 2015-05-08 Centre Nat Rech Scient Sno arn, compositions et utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
ES2671326T3 (es) 2018-06-06
EA037923B1 (ru) 2021-06-07
CN106232816A (zh) 2016-12-14
US9951332B2 (en) 2018-04-24
EP3066199A1 (fr) 2016-09-14
WO2015067727A1 (fr) 2015-05-14
BR112016010342B1 (pt) 2023-01-31
HUE037525T2 (hu) 2018-09-28
JP6879738B2 (ja) 2021-06-02
AU2014345581B2 (en) 2021-03-11
JP2017502650A (ja) 2017-01-26
AU2014345581A1 (en) 2016-06-23
JP2020010707A (ja) 2020-01-23
EA201690951A1 (ru) 2016-10-31
KR102269438B1 (ko) 2021-06-24
US20160298112A1 (en) 2016-10-13
FR3012739A1 (fr) 2015-05-08
PT3066199T (pt) 2018-06-05
KR20160079112A (ko) 2016-07-05
CN106232816B (zh) 2021-08-06
BR112016010342A2 (pt) 2017-12-12
NO3066199T3 (tr) 2018-08-18
DK3066199T3 (en) 2018-06-06
CA2929732A1 (fr) 2015-05-14
EP3066199B1 (fr) 2018-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Megat et al. Nociceptor translational profiling reveals the Ragulator-Rag GTPase complex as a critical generator of neuropathic pain
US11957703B2 (en) Modulating Nudix homology domain (NHD) with nicotinamide mononucleotide analogs and derivatives of same
Li et al. Preventing age-related decline of gut compartmentalization limits microbiota dysbiosis and extends lifespan
Dötsch et al. p63 and p73, the ancestors of p53
Xiao et al. RNA-binding protein HuR regulates Paneth cell function by altering membrane localization of TLR2 via post-transcriptional control of CNPY3
Ting et al. The mechanisms by which pardaxin, a natural cationic antimicrobial peptide, targets the endoplasmic reticulum and induces c-FOS
Haghayeghi et al. Pellino enhances innate immunity in Drosophila
TR201807186T4 (tr) Sno rna, bileşimleri ve kullanımları.
Ganner et al. CBP-1/p300 acetyltransferase regulates SKN-1/Nrf cellular levels, nuclear localization, and activity in C. elegans
Denton et al. Drosophila as a model to understand autophagy deregulation in human disorders
Phan et al. CD14-dependent modulation of NF-κB alternative splicing in the lung after burn injury
JP2012171895A (ja) 毛細血管拡張性失調症治療薬及びその用途
Valenti et al. The increase in maternal expression of axin1 and axin2 contribute to the zebrafish mutant ichabod ventralized phenotype
Alcalay et al. Regulation of cell proliferation and differentiation in the kidney
Paul et al. Maintenance of proteostasis by Drosophila Rer1 is essential for competitive cell survival and Myc-driven overgrowth
Cruz Cruz The Role of MDM2 in Mouse Development and its Implication in the Pathogenesis of Cancer and Developmental Diseases
Cruz The Role of MDM2 in Mouse Development and its Implication in the Pathogenesis of Cancer and Developmental Diseases
Wu Mitochondrial DNA Stress in Immunity and Cancer
Brazill Modulating Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy and Sensory Dysfunction in Drosophila
Hütz The role of the transcription factor SOX2 in tumorigenesis and development of the stomach
KR20190133385A (ko) Pfd-6의 발현 또는 활성 측정을 통한 노화 조절 관련 물질의 스크리닝 방법
Kuhrs Analysis of" Drosophila" Fragile Site-associated (FSA) in Hedgehog Signalling
Zhan Genetic screening and characterization of modifiers in a Drosophila ALS model of TDP-43 neurotoxicity
Kim et al. Ovarian tumors in Rbp9 mutants of Drosophila induce an immune response
Zhang The Effect of Transcription Factor Zhangfei/CREBZF on Osteosarcoma Cells and the Mechanisms Responsible